so sánh hiệu suất cộng hợp độc tố cá nóc (tetrodotoxin) với toxoid tetanus bằng hai phương pháp formaldehyde và fluorosulfonyl benzoic acid

Do đó, đểđem lại hiệu quả cho công đoạn ban đầu của quy trình nghiên cứu sản xuất khángthể kháng độc tố cá Nóc, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “So sánh hiệu suất cộng hợp độc tố c

Trang 1

MỞ ĐẦU

Nước ta nằm ở khu vực Đông Nam Á có bờ biển dài trên 3000km Sốlượng cũng như chủng loại cá Nóc rất phong phú Ngư dân vùng biển suốt từQuảng Ninh đến Kiên Giang đã đánh bắt hàng ngàn tấn cá Nóc mỗi năm Sảnlượng cá Nóc đánh bắt được sử dụng với nhiều mục đích khác nhau như làm thựcphẩm hàng ngày, làm mắm, làm chả cá, làm khô cá….đưa vào tiêu thụ trên thịtrường Người dân sử dụng loại thực phẩm này là nạn nhân của các vụ ngộ độcthương tâm, đã có nhiều gia đình tử nạn do nhiễm độc tố cá Nóc Tỷ lệ chết dongộ độc cá Nóc chiếm khoảng 45% số ca chết do ngộ độc thực phẩm hàng năm.Đặc biệt là khô cá nóc, cá nóc đông lạnh, chả cá nóc thường xảy ra vào thángtrước và sau tết âm lịch Ngộ độc cá nóc tươi thường xảy ra tại các tỉnh ven biển,vào mùa cá nóc (từ tháng 3 đến tháng 10, nhiều nhất là từ tháng 4 đến tháng 7).Hiện nay vẫn chưa có một loại thuốc giải độc đặc hiệu nào cho các ca ngộđộc cá Nóc Trước tình hình ngộ độc ngày càng gia tăng, việc sản xuất ra mộtloại thuốc đặc hiệu là rất cần thiết Với lĩnh vực miễn dịch có thể tìm ra phương

án cho vấn đề này Dựa trên đối tượng độc tố được chiết xuất từ cá Nóc làTetrodotoxin ( thành phần độc tố chính gây chết) có thể sản xuất kháng độc tố cáNóc Mở ra một hướng điều trị mới cho bệnh nhân khi bị ngộ độc do loại độc tốnày Kháng thể kháng độc tố cá nóc đặc hiệu sẽ trung hoà lượng độc tố trong cơthể bệnh nhân giúp bệnh nhân giải độc

Viện Vacxin Nha Trang đang tiến hành nghiên cứu thử nghiệm sản xuấthuyết thanh kháng độc tố cá Nóc Để sản xuất được kháng huyết thanh cần thiếtphải có một kháng nguyên có chất lượng sử dụng để gây miễn dịch Do đó, đểđem lại hiệu quả cho công đoạn ban đầu của quy trình nghiên cứu sản xuất khángthể kháng độc tố cá Nóc, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:

“So sánh hiệu suất cộng hợp độc tố cá Nóc (Tetrodotoxin) v ới Toxoid

Tetanus bằng hai phương pháp Formaldehyde và Fluorosulfonyl benzoic acid”

Đề tài thực hiện nhằm mục tiêu: Sản xuất kháng nguyên nhân tạo (antigen)độc tố cá Nóc với hiệu suất cao để nghiên cứu gây miễn dịch sản xuất kháng độc

tố Tetrodotoxin

Trang 2

Chương 1

TỔNG QUAN

Trang 3

1.1 Khái quát về kháng nguyên

có thể liên kết được với các đại phân tử như protein

Nói một cách đầy đủ hơn, kháng nguyên là một chất gây ra đáp ứng miễndịch (tính sinh kháng thể hay tính gây mẫn cảm) và rồi phản ứng với các sảnphẩm của đáp ứng này (tính đặc hiệu)

Kháng nguyên không có một đặc tính hoá học riêng biệt nào và chúng lànhững hoá chất tự nhiên, cũng như là các sản phẩm tổng hợp không có trong tựnhiên Bằng chứng độc nhất nói lên một chất thực là một kháng nguyên khichứng minh được có đáp ứng miễn dịch chống lại nó Điều này có thể thực hiệnđược trên súc vật bằng cách tiêm kháng nguyên, đôi lúc phải tiêm tá chất (mẫncảm thực nghiệm) hoặc nếu ở người thì khi có xuất hiện kháng thể sau bị nhiễmkhuẩn, uống thuốc (mẫn cảm ngẫu nhiên hay do thầy thuốc) Dẫu sao bìnhthường hệ thống miễn dịch không có đáp ứng với những chất của bản thân Nên

để có thể chứng minh là có đáp ứng thì đôi khi phải sử dụng những biện pháp đặcbiệt như ở súc vật thì mẫn cảm với tá chất, tiêm các chất của bản thân đã bị thoáihoá nhẹ, hay qua nghiên cứu các bệnh tự miễn ở người

Trang 4

đường khác nhau quyết định Đó là những polysaccharide với cấu trúc phân tử đadạng và do đó có tính kháng nguyên mạnh.

1.1.2.2 Lipid

Phần lớn các chất này gồm một chuỗi đơn điệu CH2 kỵ nước nên không cótính kháng nguyên Những ví dụ về kháng nguyên lipid là do chúng có thêm phầnglucid hay protid Như trường hợp chất cardiolipin chiết từ ty lạp thể, mà người

ta thấy có kháng thể tương ứng trong bệnh giang mai, nó rất hay dùng để pháthiện bệnh này vì nhạy và ít tốn tiền

1.1.2.3 Protein

Khi có trọng lượng phân tử lớn hơn 4000 dalton thì các polypeptid hayprotein là những kháng nguyên tốt nhất Chất vasopressin có trọng lượng phân tử

1000 với 9 acid amin là chất nhỏ nhất gây được mẫn cảm mà cho đến nay người

ta biết Cấu trúc rất phức tạp của chúng làm cho chúng có nhiều nhóm quyết địnhkháng nguyên khác nhau

1.1.2.4 Axit nucleic

Rất khó có được kháng thể chống axit nucleic khi mẫn cảm cho con vật.Ngược lại trong một số bệnh tự mẫn luput ban đỏ rải rác cấp, người ta thấy cónhiều loại kháng thể chống axit nucleic

1.1.2.5 Các chất tổng hợp

Các chất có cấu trúc tổng hợp khác nhau có thể trở thành kháng nguyên khichúng có trọng lượng phân tử đủ lớn hay khi chúng liên kết được với nhữngprotein mang tải Người ta đã chú ý nhiều đến các cấu trúc tổng hợp để xác địnhtính kháng nguyên và tính đặc hiệu của chúng Thuốc có thể là kháng nguyên gây

ra những phản ứng dị ứng thấy trong bệnh lý người

1.1.2.6 Các siêu kháng nguyên

Đó là trường hợp đặc biệt khi các phân tử không cần kết hợp với phức hợpchủ yếu hoà hợp mô lớp II để được trình diện như thông lệ mà lại tác dụng thẳngvới trình tự peptid của một số TRC đặc biệt có chuỗi V Cho nên những phân tử

ấy không cần được nhận biết một cách đặc hiệu mà vẫn tác dụng lên nhiều clôn

Trang 5

tế bào T có mang cấu trúc như chuỗi  của TRC Người ta thấy đặc tính này ởcác enterotoxin của liên cầu trùng và nucleocapsid của virus dại.

Có thể mở rộng khái niệm siêu kháng nguyên tới các phân tử có nguồn gốc vikhuẩn, có những tính đặc hiệu khác nhau mà có thể liên kết với các globulinmiễn dịch màng để hoạt hoá tế bào lympho B

Tình trạng mất phản ứng sau khi có những thay đổi cực nhỏ về cấu trúc hoáhọc của kháng nguyên, đã chứng minh tính đặc hiệu ấy Đối với các polyosid chỉcần thay đổi một trong những thành phần sau đây cũng đủ để thay đổi tính chấtđặc hiệu: một chức đường, liên kết giữa hai chức đường Đối với peptid vàprotein thì chỉ một thay đổi nhỏ cũng làm biến tính đặc hiệu: ví dụ đổi một acidamin bằng một acid amin khác, acid amin D th ế cho acid amin tự nhiên L

Tính đặc hiệu của phản ứng miễn dịch đã được các công trình của K.Landsteiner (1930 - 1934) chứng minh qua các kháng nguyên nhân tạo gồm mộtprotein gắn với những phân tử nhỏ tổng hợp mà ông ta gọi là “hapten” Chỉ cầnbiến đổi vị trí của một gốc hay thay đổi gốc đó bằng một gốc khác là đáp ứngmiễn dịch vẫn có thể phân biệt được

2 Phản ứng chéo

Đối lại với quy luật tính đặc hiệu của phản ứng miễn dịch thì lại có ngoại lệgọi là “phản ứng chéo” khi hai kháng nguyên có nguồn gốc khác nhau nhưng lạiphản ứng với cùng một kháng thể Ngoại lệ đó là do:

Trang 6

- Có một cấu trúc giống hệt: thực vậy ở các loài khác nhau vẫn có thể cónhững nhóm quyết định kháng nguyên chung vì lý do tiến hoá hay ngẫu nhiên.

Ví dụ như những chất của nhóm máu A và B với chất của một số vi khuẩn vô hại

ở ruột, chúng có cấu trúc giống nhau đến mức chính là các vi khuẩn gây ra sảnxuất kháng thể tự nhiên chống A và chống B ở những người có nhóm máu O.Trong trường hợp này cá thể có nhóm máu O sản xuất những kháng thể dị loạithực ra là để chống vi khuẩn nhưng đồng thời cũng là kháng thể đồng loài nếuđứng trên phương diện truyền máu hay khía cạnh khi không có hoà hợp mẹ -thai

- Có một cấu trúc tương tự: có thể lấy ví dụ nhóm B và kháng nguyên giả Bxuất phát từ kháng nguyên A1 Đặc trưng của nhóm máu A1 là có một ose tậncùng là N – acetylgalactosamin và của kháng nguyên B là galactose Trong ungthư đại tràng khi có nhiễm vi khuẩn thì chất N - acetylgalactosamin có thể bị mấtacetyl bởi men desacetylase của vi khuẩn mà đổi thành galatosamin Khi ấykháng nguyên A1được nhận biết bởi một số kháng thể chống B trên nên được gọi

là “giả B” Những kháng thể chống B ấy không phân biệt mỗi OH của galactose

và NH2 của galactosamin

3 Nhóm quyết định kháng nguyên hay epitop

Phần của kháng nguyên được nhận biết bởi hệ thống miễn dịch được gọi lànhóm quyết định kháng nguyên hay là epitop Thụ thể hay receptor đối với khángnguyên nằm trên tế bào lympho T được gọi là TCR (T cell receptor), và trên tếbào B được gọi là vị trí kháng thể hay paratop Kích thước của một nhóm quyếtđịnh kháng nguyên là 5 đến 6 gốc -ose đối với một kháng nguyên glucid, hay 5đến 6 acid amin đối với một kháng nguyên lẫn lộn Trên cùng một kháng nguyênthường có nhiều epitop vì cấu trúc ấy hoặc được nhắc đi nhắc lại nhiều lần hoặc

vì có nhiều môtýp khác nhau có thể nhận biết được

4 Kho tư liệu miễn dịch

Tất cả số nhóm quyết định kháng nguyên mà một hệ thống miễn dịch có thểnhận biết được, hình thành kho tư liệu miễn dịch của mỗi cá thể Theo nhữnghiểu biết về các phần thay đổi trong cấu trúc của globulin miễn dịch thì bộ gencon người có khoảng 107 khả năng tạo các kháng thể khác nhau Ngoài ra khi

Trang 7

cùng một kháng thể mà lại có thể nhận biết nhiều quyết định kháng nguyên khácnhau với mức ái tính thay đổi, thì hệ thống miễn dịch ấy được coi như là đã “bịthoái hoá”.

1.1.3.2 Tính sinh kháng thể

Tính sinh kháng thể là khả năng của một kháng nguyên tạo ra một đáp ứngmiễn dich Đáp ứng này có thể là tế bào hay dịch thể, dương tính (gây mẫn cảmtức có sinh kháng thể) hay âm tính (gây dung nạp tức không sinh kháng thể).Tính sinh kháng thể là đặc tính đầu tiên của kháng nguyên nói ở trên Việc địnhnghĩa của cả hai từ sau đây cho phép hiểu rõ hơn khái niệm ấy

1 Hapten

Một hapten là một “phân tử nhỏ (tự nhiên hay nhân tạo) một mình không cókhả năng gây ra đáp ứng miễn dịch nhưng vẫn được nhận biết bởi các sản phẩmcủa đáp ứng này” Từ này đã được Landsteiner tạo ra năm 1930 khi ông ta chứngminh là những chất có cỡ khổ nhỏ bản thân không gây mẫn cảm được một convật nhưng ngược lại nó vẫn phản ứng với huyết thanh của con vật đã được mẫncảm với kháng nguyên toàn bộ, nghĩa là một kháng nguyên bao gồm cả chấtmang tải lẫn hapten Như vậy hapten có tính chất đặc hiệu nhưng không có tínhchất sinh kháng thể Dẫu sao từ hapten không hoàn toàn đồng nghĩa với nhómquyết định kháng nguyên Thực vậy hapten có thể bé hơn, bằng hay lớn hơnepitop và như thế không tương ứng hoàn toàn về cấu trúc nhóm quyết định khángnguyên

2 Chất mang tải (carrier)

Chất mang tải là một phần của kháng nguyên, nói chung là protein, liên kếtvới hapten làm cho nó trở nên sinh kháng thể được

Người ta đã giải thích sự cần thiết phải có tính chất mang tải như sau: khángnguyên được hấp thu và tiêu đi một phần bởi tế bào trình diện kháng nguyên,phần này phải được biểu lộ trên bề mặt của nó, kết hợp với phức hợp hoà hợp môlớp II Như vậy là phải có một sự bổ cứu giữa chất mang tải và phức hợp hoà hợpmô

1.1.3.3 Những đặc tính khác

Trang 8

Đó là những đặc tính phụ và không thường xuyên nhưng đã mang lại nhữngthay đổi về chất lượng và số lượng trong đáp ứng miễn dịch.

1 Tính gây dị ứng

Một số kháng nguyên dễ gây ra sản xuất kháng IgE hơn và do đó mà gây ra dịứng týp tức khắc Cho đến ngày nay người ta chưa biết những đặc trưng của tínhtrạng ấy Các dị nguyên chính được biết là phấn hoa, nọc của một số sâu bọ cócánh màng, súc vật…Đáp ứng miễn dịch chuyển thẳng từ IgM sang IgE Tínhchất này phụ thuộc vào cơ địa của cá thể

2 Tính gây dung nạp

Một số kháng nguyên lại dễ tạo ra tình trạng dung nạp hơn là một số khác.Như vậy khó mà gây được sự mẫn cảm đối với loại kháng nguyên ấy Nó cũngphụ thuộc vào cơ địa

3 Tính tá chất

Một số tá chất cho phép tăng cường độ của đáp ứng miễn dịch đối với khángnguyên đã kết hợp với nó Một số kháng nguyên bản thân đã có tính kích thíchấy

4 Tính gây phân bào

Ngoài đáp ứng miễn dịch đặc hiệu, kháng nguyên có thể kéo theo một tìnhtrạng tăng  - globulin huyết chung bằng kích thích sự phân chia của tế bàolympho B Điều này hay thấy trong quá trình nhiễm khuẩn hay khi tiêmpolysaccharid của vi khuẩn đường ruột (LPS), chất này hay được dùng trong thựcnghiệm với mục đích gây phân bào

1.1.4 Ứng dụng của kháng nguy ên

1.1.4.1 Ứng dụng trong sản xuất vacxin.[1], [4], [6]

Vacxin là chất liệu chế từ các vi sinh vật hoặc các kháng nguyên đặc hiệucủa chúng để đưa vào cơ thể người gây miễn dịch chủ động cho cộng đồng đểphòng bệnh truyền nhiễm do các vi sinh vật tương ứng gây ra [4,tr 44]

Trang 9

Như vậy, nguyên lý của vacxin là gây ra trong cơ thể sống một đáp ứng chủđộng của hệ thống miễn dịch nhằm tạo ra kháng thể dịch thể hay tế bào chống lạinhững nhóm quyết định kháng nguyên của yếu tố có khả năng gây bệnh và nhờ

đó làm mất khả năng này

1.1.4.2 Ứng dụng sản xuất kháng huyết thanh

Nguyên lý của kháng huyết thanh: khi cơ thể mắc bệnh cấp mà chưa có miễndịch thì có thể sử dụng kháng thể có trong huyết thanh của vật khác hay củangười khác mà đưa vào tạm thời thay thế để qua khỏi lúc nguy hiểm.[1, tr.357]Kháng huyết thanh chứa kháng thể đặc hiệu lấy từ huyết thanh súc vật hoặcngười ở đây đã được gây miễn dịch cao độ với kháng nguyên của chính mầmbệnh [4, tr.44]

Tính đặc hiệu rất cao của các kháng thể ri êng biệt khi liên kết với một khángnguyên, thậm chí một kháng thể chỉ liên kết với một quyết định kháng nguy ên(hoặc là epitop) đã tạo cho chúng một phương tiện lí tưởng và có giá trị cao trongcác nghiên cứu sinh học, y học và sinh học phân tử Các epitop có thể tồn tại nhưnhững phân tử riêng biệt và là những chất hóa học hữu c ơ (chẳng hạn 2,4 D,penicillin…) Chúng cũng có mặt trong các đại phân tử nh ư protein,glycoprotein, lipoprotein, polysaccharid, A DN, ARN Các epitop cũng có thể làmột phần cấu trúc tế b ào của vi khuẩn, nấm mốc v à vi rút Nói chung, các khángthể có thể được sản xuất dễ dàng, thậm chí chỉ cần một l ượng nhỏ kháng nguyêncũng có khả năng gây đáp ứng miễn dịch [6, tr 128]

Kháng nguyên còn có ứng dụng to lớn trong sản xuất kháng huyết thanh Cáckháng nguyên là vi khuẩn bất hoạt, một phần của vi khuẩn, có thể là giải độc tố,độc tố thô…được đưa vào cơ thể súc vật gây miễn dịch sinh kháng thể đặc hiệu.Huyết thanh chứa kháng thể đặc hiệu này sẽ được sử dụng để chữa bệnh

Trước đây người ta dùng huyết thanh lấy từ ngựa, cừu được mẫn cảm chống

vi khuẩn gây bệnh, rồi dùng gamma – globulin chiết tách từ những huyết thanh

có kháng thể ấy Ngày nay với kỹ thuật tế bào lai, người ta đã có huyết thanh đơnclon chỉ chống một nhóm quyết định kháng nguyên quan trọng sinh bệnh màthôi Ví dụ huyết thanh idiotyp chống tự kháng thể thấy trong bệnh đái đường tựmẫn, huyết thanh chống interleukin – 6 để chống viêm [1,tr.358-359],[5,tr.22]

Trang 10

Ngoài ra kháng nguyên còn có ứng dụng trong các phản ứng kháng nguyên –kháng thể sử dụng trong các kỹ thuật miễn dịch: kỹ thuật ELISA,…

1.2 Độc tố cá Nóc Tetrodotoxin (TTX)

1.2.1 Công thức, cấu tạo của TTX [2],[3],[7],[13]

Tetrodotoxin (TTX) còn g ọi là độc tố cá Nóc, là một chất độc thần kinhmạnh, có khả năng gây độc rất cao, tỷ lệ gây tử vong gấp 10 lần nọc độc rắn cạpnong, từ 10 đến 100 lần nhện độc và gấp 10 000 lần so với mức độ độc của cyanua.Liều gây độc được xác định là 1 – 4 mg Liều gây chết chuột LD50 = 8 – 10 g/kgthể trọng [7]

TTX là một hợp chất hữu cơ phi protein, có tên là anhydrotetrodotoxin – 4 –epitetrotoxin hay axit tetronic, có công th ức phân tử là C11H17O8N3- được công

bố năm 1964 tại “Hội nghị quốc tế về hoá học của các chất trong tự nhi ên” được

tổ chức tại Tokyo, bởi nhóm nghi ên cứu Ritsuda Kasuke (Đại học Tokyo), nhómnghiên cứu Hida Yoshimasa (Đại học Nagoya), ông Mosher, ông Wood – Ward.Công thức cấu tạo của TTX ở h ình 1.1

Trong phân tử TTX có một nhóm Guanidin tích điện d ương gồm ba nguyên

tử Nitơ và một vòng pyrimidin hợp nhất với những vòng bổ sung tạo thành một

hệ có năm vòng tất cả Hệ thống vòng này có chứa các nhóm hydroxyl vốn cókhả năng làm cho phức liên kết giữa TTX và kênh Na ổn định được ở bề mặt liênpha nước Vùng liên kết giữa TTX và kênh Na là cực kỳ hẹp (d = 10-10nm) TTXrất giống cation Na+ đã hydrat hoá nên sẽ đi vào được cửa (miệng) của phức hệ

Hình 1.1 Cấu trúc phân tử TTX

Trang 11

peptid tạo nên kênh Na, ở đây TTX liên kết với một gốc glutamat của phức hệpeptid và sau đó giữ chặt lấy chỗ dựa của m ình ngay cả khi phức hệ peptid thayđổi độ bền Dù có các thay đổi về hình thể của phức, TTX sau này vẫn được gắnkết với lỗ của kênh Na bằng liên kết tĩnh điện.

- Tính bền: Độc tố cá Nóc rất ổn định trong dung dịch có độ axit nh ưng lại dễ bịphân giải trong dung dịch kiềm Độc tố sẽ giảm đi nếu đun sôi với dung dịchnatri cacbonat hoặc ammoniac 0,2% và sẽ biến đổi ngay lập tức nếu đun sôi vớidung dịch Natrihydroxit 0,1% Nếu ngâm trong dung dịch kiềm với pH 14 trong

1 giờ sẽ phân giải hoàn toàn

- Tính kháng nhiệt: Độc tố cá Nóc có tính kháng nhiệt cao, chịu đ ược nóng và độkhô mà không mất đi độc tính Khi đun sôi độc tố ở nhiệt độ cao v à kéo dài thìcũng không làm giảm độc tính được trên 30%

- Tính liên kết: Có tính liên kết cao, chống lại được các tia cực tím và các tiachiếu của ánh nắng mặt trời, để tia cực tím trực tiếp 48 giờ độc tính cũng khôngthay đổi Để dưới ánh nắng mặt trời 1 năm, độc tính cũng không thay đổi

- Rất dễ thẩm thấu vào màng nhầy của động vật

- Độc tố cá Nóc với cơ thể con người:

+ Liều gây chết: 1,0 - 2,0 mg

+ Không bị phân giải bởi các men ti êu hóa

+ Thời gian hấp thụ, phân hủy v à bài tiết trong cơ thể rất lâu còn ngộ độc sau khi

ăn thì rất ngắn

Trang 12

1.2.3 Cơ chế gây độc của Tetrodotoxin [2],[3],[7]

Hình 1.2 Cơ chế tác động của TTX đối với kênh ion Na+[25]

Dòng ion natri di chuyển vào trong tế bào thần kinh là bước cần thiết để dẫntruyền các xung thần kinh nhằm kích thích các sợi thần kinh và chạy dọc theo sợitrục thần kinh Bình thường tế bào sợi trục thần kinh chứa nồng độ K+ cao vànồng độ Na+ thấp tạo ra điện thế âm Sự kích thích sợi trục thần kinh mang lại thếhoạt động phát sinh từ dòng ion Na bên trong tế bào, khi đó sinh ra hiệu điện thếdương nhiều hơn Kênh truyền dẫn ion Na được hình thành bởi chuỗi peptid đơnvới bốn đơn vị lặp lại mà mỗi đơn vị chứa 6 vòng xoắn ốc

Tetrodotoxin rất đặc hiệu với kênh dẫn ion Na và không tác động lên kênhdẫn K+ Sự cầm giữ vững chắc của TTX vào phức hệ protein tạo kênh Na đượcthể hiện bằng thời gian chiếm giữ của TTX tại phức Nếu như Na+ đã đượchydrat hoá thường liên kết thuận nghịch với kênh trong khoảng một nano giây(10-9s) thì TTX lại liên kết và lưu lại trong kênh hàng chục giây Do kích thướclớn nên phân tử TTX chặn không cho ion Na+ có cơ hội để đi vào kênh do đó sựvận động của ion Na+ chấm dứt và kéo theo điện thế hoạt động dọc theo màngdây thần kinh cũng ngừng Như vậy TTX đã phong toả một cách chính xác cánhcổng điện thế của kênh Na ở mặt ngoài của màng dây thần kinh Chỉ một mgTTX hoặc ít hơn một số lượng có thể đặt vừa đầu một đinh ghim là đủ để giếtchết một người trưởng thành Nói cách khác, tetrodotoxin đã khoá đường dẫn

Trang 13

xung thần kinh dọc theo sợi trục thần kinh gây tê liệt hô hấp và cơ vận động nênlàm nạn nhân tử vong.

- Triệu chứng ngộ độc cá Nóc : Sự bắt đầu của triệu chứng th ường diễn ra từ

10-45 phút sau khi ăn độc tố vào bụng, nhưng có thể trì hoãn lâu khoảng 3 giờ, phụthuộc vào sự khác nhau giữa từng ng ười và lượng độc tố tiêu thụ Đầu tiên là mấtcảm giác ở môi và lưỡi, sau đó tê liệt cử động và mất cảm giác, huyết áp tụtxuống do động mạch vành bị rãn, cảm giác thấy khó thở do t ê liệt, ý thức vẫnbình thường cho đến lúc trước khi chết, nhưng cuối cùng cũng sẽ mất ý thức vàsau đó ngừng thở do bị tê liệt hoàn toàn trung khu hô h ấp Tình trạng tê liệtthường kèm theo ỉa chảy, buồn nôn, mất điều h òa, chóng mặt, đau đầu

- Cấp cứu ngộ độc do cá nóc: Hiện nay vẫn chưa có thuốc đặc hiệu và giải độc.Nguyên tắc cấp cứu và xử trí cơ bản là:

+ Khi mới ở độ I: Gây nôn, sử dụng thuốc lợi tiểu để loại bớt độc tố, rửa dạ dàycho uống than hoạt tính và cùng lúc đó phải nhanh chóng đưa bệnh nhân đếnbệnh viện

+ Đề phòng liệt hô hấp: tiến hành hô hấp nhân tạo, hồi sức tim mạch, chống trụytim mạch

+ Chống sốc: truyền dịch, thở oxy

1.2.4 Tính miễn dịch của độc tố TTX

TTX có công thức phân tử C11H17O8N3, là một phi protein có trọng lượngphân tử nhỏ hơn 1000 ( MWTTX =319 ), và được xem như là một hapten, hoàntoàn không có tính miễn dịch, không có khả năng sinh kháng thể [3], [21], [22]

1.3 Cơ sở cộng hợp [1], [6,tr.128]

Một phân tử được gọi là kháng nguyên (antigen) khi nó có th ể liên kết với cácthành phần của cơ quan miễn dịch (kháng thể hoặc thụ thể - receptor của tế bào).Tuy nhiên phân tử kháng nguyên này có thể không gây ra đáp ứng miễn dịchtổng hợp kháng thể của nó Do đó cần phân biệt hai thuật ngữ l à phân tử có tínhkháng nguyên và phân t ử có khả năng gây ra đáp ứng miễn dịch, nghĩa l à có thểtạo ra kháng thể Từ đó tất cả các phân tử gây ra đáp ứng miễn dịch (đ ược gọi là

Trang 14

immunogen) đều là những kháng nguyên nhưng không phải tất cả các khángnguyên đều là immunogen.

Người ta cho rằng các kháng nguy ên phải có hai thuộc tính l à tính khángnguyên và tính gây ra đáp ứng miễn dịch Những kháng nguy ên chỉ có thuộc tínhkháng nguyên thường được gọi là hapten Hapten có thể coi là immunogen khôngđầy đủ Một immunogen phải “lạ” nghĩa l à không phải của bản thân (nonself) v àcần có kích thước đủ lớn, càng lớn càng dễ gây đáp ứng miễn dịch tạo ra khángthể

Những chất có phân tử l ượng thấp hơn 1000 dalton như penixilin, progesteron…không thể là immunogen Nói chung nhi ều protein lạ có phân tử l ượnglớn hơn 6000 dalton đều là những immunogen Một số chất có bản chất axitnucleic như ADN, ARN gây đáp ứng miễn dịch rất kém, chúng có thể trở th ànhimmunogen nếu được gắn với một protein mang

Do đó, để các hapten trở thành một immunogen thực sự, có khả năng gây rađáp ứng miễn dịch cần phải gắn kết nó với một đại phân tử l à protein mang Hayđây chính là quá trình cộng hợp

1.3.1 Các đặc điểm hoá học của việ c kết nối [4,tr.142]

Trong suốt thập kỷ qua nhiều phương pháp khác nhau đã được phát triển đểkết nối protein-saccharide và đang chờ phê duyệt Tiêu chuẩn của một phươngpháp hoàn hảo được sử dụng trong vacxin cộng hợp glyco là không được làmthay đổi cấu trúc polysaccharid và các thành phần protein

Phần lớn các phân đoạn polysaccharid của các oligosaccharid có chức nănghemiaxetal hoặc hemiketal Một phương pháp cộng hợp đơn giản và hiệu quả đápứng đủ các tiêu chuẩn liên kết trực tiếp saccharid qua việc giảm đường nhóm -amino

Một giải pháp hữu hiệu khác để giải quyết vấn đề này là phát triển nhiều hơncác nhóm aldehyd hoạt động tự do tại điểm cuối của các saccharid

Ở phương pháp khác, cũng đã có sự hoạt hoá không đặc hiệu ở các nhómhydroxyl qua việc sử dụng carbonyl diimidazole Sự hoạt hoá được diễn ra bởimột trình tự phức tạp theo từng bước mà các phân tử chất đệm được gắn kết tới

Trang 15

cả polysaccharid hoạt tính và một protein vỏ não mô cầu kết nối theo cùng mộtliên kết thioether, sẽ bất lợi khi tiến hành trong các dung môi hữu cơ.

là dựa vào đặc tính sinh đáp ứng miễn dịch, độ hoà tan và cách cộng hợp thíchhợp giữa protein mang và hapten Ví dụ: hai loại protein mang là KeyholeLimpet Hemocyanin (KLH) và Albumin huyết thanh bò (BSA) thường hay đượcdùng nhất Các kháng thể được tạo ra đều trực tiếp kháng lại protein mang cũngnhư hapten Vì vậy protein mang được lựa chọn cần phải liên quan đến các xétnghiệm sẽ làm Để tạo ra một immunogen tốt nhất, cần phải điều chế cộng hợp(conjugate) hapten – protein mang ở tỷ lệ phù hợp Hiện nay các chất cộng hợphapten – BSA có thể được dùng tốt bởi vì chúng không cản trở việc đo các khángthể kháng lại hapten [6,tr.130]

Các protein mang có thể được bán sẵn ở dạng đã hoạt hoá Ví dụ các proteinmang đã hoạt hoá meleimide như: KLH và BSA đã hoạt hoá maleimide,Ovalbumin đã hoạt hoá malemide của hãng hoá chất Pierce Những protein mangnày dễ dàng phản ứng với các hapten peptid chứa nhóm amid bậc nhất hoặcnhóm sulfohydril (- SH) Nếu một peptid hapten không chứa nhóm SH tự do thìngười ta có thể đưa nhóm này vào nhóm amin bậc nhất của hapten bằng một sốthuốc thử (hoá chất), ví dụ hoá chất Traut hoặc thuốc thử SATA (N –succinimdyl – S – acetylthioacetate)

Nếu một hapten peptid chỉ chứa cầu disulfid (S – S) thì có thể dùng các chấtkhử như DDT (dithiothreitol) hoặc 2 mercaptoethanol để tạo cho hapten này cónhóm tự do Vấn đề là, nếu có một hapten tổng hợp không phải peptid thì người

ra phải tìm cách thiết kế tổng hợp một peptid – hapten, để cho phép đưa 1 gốc

Trang 16

Cystein vào một đầu tận cùng C hoặc tận cùng N của peptid Những hapten nhưthế rất dễ cộng hợp với protein mang đã hoạt hoá với maleimide để tạo ra mộtimmunogen có hiệu quả cao.

Ngoài ra người ta thường dùng giải độc tố bạch hầu - uốn ván (DT - TT,diphtherea toxoid – tetanus toxoid) làm vật tải kháng nguyên và thấy phù hợpcho trẻ em Mặt hạn chế của việc sử dụng các giải độc tố này là việc chúng bắtnguồn từ các độc tố vi khuẩn tự nhiên đã được giải độc tố bằng formaldehydelàm huỷ hoại lysin một thành phần quan trọng tham gia kết nối kháng nguyên Vìthế dùng protein bạch hầu CRM 197 từ chủng đột biến không độc là giải pháptránh được nhược điểm đó [4, tr 143]

Giải độc tố uốn ván tetanus toxoid (TT) đ ược giải độc bằng formalin Kể từnăm 1924 lần đầu tiên phát hiện formalin khử độc độc tố uốn ván v à nó vẫn được

1.3.3 Các thuốc thử tạo liên kết chéo để điều chế immunogen [6]

Có hai loại thuốc thử tạo liên kết chéo là:

- Chất gắn hai nhóm chức giống nhau (homobifuctional cross - linker) Thuốcthử này kết hợp cặp đôi qua cùng một chuỗi bên trong peptid và protein mang

Chất gắn hai nhóm chức không giống nhau (heterobifunctional cross linker) gắn cặp đôi với hai chuỗi bên khác nhau của hapten và protein mang.Việc lựa chọn thuốc thử gắn cặp đôi có ý nghĩa quan trọng Nói chung, sẽ tạo

-ra ái lực cao hơn và kháng huyết thanh có hiệu giá cao hơn, mặc dù các chất cộnghợp immunogen được tạo thành sẽ cho ra các kháng thể nhận diện được một dãycác epitop Thuốc thử đặc hiệu cao hơn chỉ nên được dùng khi cấu trúc hoá học

Trang 17

đã được biết rõ hoặc đã cải biến Tuy vậy, chúng sẽ tạo ra kháng huyết thanh cóhiệu giá và tính háo kháng nguyên thấp hơn.

1.4 Tình hình nghiên cứu cộng hợp ở trong và ngoài nước

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở Việt nam chưa có nhiều nghiên cứu sâu về các loại kháng nguy ên cộng hợp

để ứng dụng vào công tác sản xuất vacxin Đây l à một lĩnh vực của công nghệcao, đòi hỏi dây chuyền công nghệ hiện đại v à là một định hướng cho ngành sảnxuất vacxin ở Việt nam trong t ương lai [4]

Viện Nghiên Cứu Biển cũng đã tiến hành nghiên cứu cơ bản độc tố cá nócTTX Họ cũng đã chiết tách và tinh chế độc tố TTX từ các lo ài cá nóc của ViệtNam nhưng chưa có một nghiên cứu nào chuyên sâu về độc tố này cũng nhưnhững nghiên cứu ứng dụng của độc tố TTX

Viện Vacxin và sinh phẩm Y Tế Nha trang đã tinh chế được độc tố cá Nóc(TTX) với độ sạch từ 80-85% và đang ứng dụng loại độc tố này để nghiên cứusản xuất kháng thể kháng độc tố Cá Nóc

1.4.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

1.4.2.1 Tình hình nghiên cứu cộng hợp

Một phân tử hóa học nhỏ thì trơ về mặt miễn dịch học Nó đ ược làm thay đổi

về phương diện hóa học bằng liên kết hóa trị với một phân tử protein mang cótrọng lượng phân tử lớn để tạo th ành một mẫu kháng nguyên nhân tạo trước khi

nó có thể thực hiện vai trò một chất kháng nguyên Sự lựa chọn phân tử chấtmang của haptenic vaccine có tầm quan trọng cho sự sản xuất th ành công củahaptenic – specific antibody [21] Từ đó các nhà khoa học đã nghiên cứu nhiều

về cộng hợp để tạo ra các loại kháng nguyên nhân tạo sử dụng điều chế vacxin vàhuyết thanh

Công nghệ kháng nguyên cộng hợp đã được tiến hành hơn 60 năm trước.Geobel và Avery đã kết hợp polysaccharide phế cầu khuẩn type 3 với globulinhuyết thanh ngựa thông qua việc diazo hoá các phân tử thay thế ete p –aminobenzyl ở polysaccharide Ở vacxin cộng hợp đ ã hình thành đơn vị lặp lạioligosaccharide (axit cellobiur onic) của polysaccharide type 3 [4,tr.142]

Trang 18

Công nghệ vacxin cộng hợp glyco ph ù hợp cho các kháng nguy ên gia tăngkhả năng nhận biết kháng nguy ên của cơ thể non (trẻ sơ sinh đến hai tuổi) Nó

được ứng dụng cho các polysaccharide vỏ của các chủng Staphylococcus aureus,

Klebsiella và Pseudomonus aeruginosa Vacxin cộng hợp phòng viêm màng não

do H influenza type b gây ra là s ản phẩm thương mại rất thành công

Ngoài những nghiên cứu thành công trên lĩnh vực cộng hợp các Glyco vớiprotein mang, các nhà khoa h ọc cũng tiến hành nghiên cứu tạo ra các khángnguyên nhân tạo của các peptide, các hapten bằng cách cộng hợp chúng với mộtprotein mang để tạo ra các immunoge n có tính miễn dịch

Năm 1981, David M.B và Preston G.F đã áp dụng phương phápcarbodiimide để cộng hợp một hợp chất có trong l ượng phân tử nhỏ để miễndịch protein G với một protein mang [20]

Năm 1986, James V Staros và cộng sự thuộc phòng hoá sinh, trường Đại họcVanderbilt đã sử dụng N – Hydroxysulfosuccinimide (OHSu(SO3)) trong phảnứng gắn kết chất trung gian carbodiimide tan trong n ước (EDC: 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) Carbodiimide ) nhằm nâng cao hiệu quả của phản ứng gắnkết peptit với protein mang Hợp chất EDC thường được sử dụng trong các phảnứng gắn kết hay phản ứng cộng hợp để li ên kết một peptit có tính kháng nguy ênvới một protein mang , nó có tác dụng hình thành liên kết amid giữa gốccarboxylic acid và nhóm amin Tuy nhiên, tiện ích của nó bị giới hạn do hi ệu suấtgắn kết của nó là chậm Ở trong nghiên cứu này họ đã tìm ra một phương pháp

để nâng cao hiệu suất gắn kết rất lớn đó l à việc cộng thêm vào dung dịch chất N– Hydroxysulfosuccinimide (OHSu(SO3) [15],[26],[27]

Năm 1989, J.M Peeters và cộng sự thuộc phòng thí nghiệm hoá hữu cơ,Trường Đại Học Cathohc và Viện Bảo vệ sức khoẻ và môi trường cộng đồngQuốc gia – Hà Lan đã nghiên cứu cộng hợp peptide Ata-Orn-angiotensin với 2lọai protein mang là tetanus toxoid (TT) và Diphtheria toxoid (TD) với bốn chấtgắn kết khác nhau là Succimidyl 6 -(N-maleimido)-n-hexanoate (MHS),Succimidyl 4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexane-1-cacboxylate (SMCC),Succimidyl M-maleimidobezoate (MB S) hoặc Succimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate (SPDP) Người ta đã sử dụng phương pháp ELISA để so sánh tính

Trang 19

kháng nguyên cũng như tính miễn dịch của cộng hợp Kết quả nghiên cứu chothấy MHS là chất gắn kết cho hiệu suất gắn kết tương đối từ 10-71% (phụ thuộcvào pH của môi trường gắn) và có độ bền cao MHS là chất được đề nghị chon

để làm xúc tác để cộng hợp peptide với TT v à TD [17]

Năm 1990 Carla Deen và các c ộng sự thuộc phòng thí nghiệm sinh học vàdược phẩm – Hà Lan đã nghiên cứu phương pháp gắn kết một hợp chấtcarbodiimide mới cho peptid tổng hợp carbodimide là một chất gắn kết hainhóm chức không giống nhau cho phản ứng gắn kết nhóm carboxyl và amino.Trong nghiên cứu peptide tổng hợp là SAM-II được gắn với protein mang KLH(keyhole limpet hemocyamin), CCG (chicken gamma globulin), ho ặc BSA(bovine serum albumin) thông qua hợp chất Carbodiimide EDC (1 -Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) Carbodiimide) đ ể tạo ra kháng nguyên nhân tạo Người ta

đã so sánh tính miễn dịch của cộng hợp qua chất gắn kết l à EDC và chất gắn kếtđược cho là tốt MBS (N-hydroSuccimidyl M-maleimidobezoyl) bằng phươngpháp ELISA, kết quả cho thấy tính miễn dịch của kháng nguyên nhân tạo cộnghợp bằng phương pháp sử dụng chất gắn kết EDC là tương đương với phươngpháp sử dụng MBS Nghiên cứu đã chứng minh được rằng phương pháp gắn kếtpeptid với protein mang qua EDC l à một phương pháp gắn kết mới có hiệu quảnhằm tăng khả năng đáp ứng miễn dịch kháng peptit [12]

Năm 2002, Nakamura M và cộng sự tại Nhật Bản đã nghiên cứu tạo ra khángthể đa dòng chống lại độc tố mu-conotoxin GIIIA Mu-conotoxin GIIIA là mộtđộc tố peptit mạnh trong loài ốc nón, tính độc của nó gần bằng với tetrodotoxin.Kháng thể đa dòng của conotoxin GIIIA được tạo ra bằng phương pháp cộnghợp đặc hiệu mà chất kháng nguyên đã được khử độc nhưng vẫn giữ lại được vịtrí cấu trúc hoạt động của độc tố đối với kênh Na+ Protein mang được gắn với nó

là BSA (bovine serum albumin) Phương pháp nghiên c ứu này tạo ra một khángthể chống lại độc tố peptid sẽ l à ứng dụng cho những độc tố peptit khác [19]

1.4.2.2 Tình hình nghiên cứu cộng hợp độc tố tetrodotoxin (TTX)

Cá Nóc là loài cá biển có độc tính cao Hiện nay ở một số n ước Châu Á nhưNhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc… cá Nóc vẫn được xem là một thực phẩm ưathích Cá Nóc và độc tính cá Nóc đã được các nhà nghiên cứu trên Thế Giới quan

Trang 20

tâm, đặc biệt trong những năm gần đây các nhà khoa học Nhật Bản và TrungQuốc đã tiến hành nhiều nghiên cứu về ứng dụng loại độc tố này.

Năm 1964 Johnson H M là người đầu tiên công bố thành công của ông trongnghiên cứu cộng hợp độc tố TTX của lo ài ốc biển với protein mang để biến chất

có tính hapten thành m ột kháng nguyên nhân tạo thông qua tác nhân cộng hợp làformaldehyde Nghiên c ứu của ông đã mở ra một hướng mới cho việc nghiên cứu

về miễn dịch của các hapten nói chung và TTX nói riêng [14]

Tiếp đó đến năm 1989, dựa trên cơ sở nghiên cứu của Johnson H.M nhómnghiên cứu của Reachel I Huot và Tran C.Chanh thuộc Labo nghiên cứu pháttriển về virut và miễn dịch học của Đại học Texas - Mỹ cũng đã nghiên cứu cộnghợp thành công giữa độc tố TTX với protein mang là KLH (keyhole limpethemocyamin) để tạo kháng nguyên nhân tạo TTX-KLH theo đườngformadehyde Kháng nguyên này được đem gây miễn dịch trên chuột BALB/c,kết quả chuột BALB/c cho đáp ứng kháng thể kháng TTX Sau đó sử dụng láchcủa chuột có kháng thể để nghiên cứu thành công kháng thể đơn dòng khángTTX [24]

Năm 1991, nhóm nghiên c ứu của Bennett Kaufman thuộc Phòng quản lýthuốc và thực phẩm của Trung tâm nghiên cứu đánh giá sinh học - Mỹ đã nghiêncứu sản xuất kháng huyết thanh chống lại độc tố TTX trên thỏ Với khángnguyên miễn dịch nhân tạo là TTX-Formaldehyde-KLH được làm bằng phươngcộng hợp giữa TTX với protein mang KLH (keyhole linpet hemocyanin) thôngqua formaldehyde Kháng huy ết thanh này có khả năng bảo vệ được chuột khitiêm thử thách với TTX [11]

Năm 1995, nhóm nghiên cứu K Matsumura thuộc Viện nghiên cứu sức khoẻcủa Nhật Bản đã thành công với việc tạo ra kháng thể đ ơn dòng chống lại độc tốTTX Kháng thể được tạo ra khi gây miễn dịch bằng kháng nguyên nhân tạoTTX trên thỏ Kháng thể đơn dòng này có có thể trung hoà được độc tố TTX ở cảtrong ống nghiệm cũng như trên cơ thể sinh vật Kết quả kiểm tra khả năng bảo

vệ của kháng thể khi ti êm thử thách trên chuột là rất tốt Nghiên cứu cho thấyrằng tỷ lệ sống sót của súc vật khi tiêm với liều gây chết là rất cao [18]

Trang 21

Năm 2004 nhóm nghiên cứu Qin-Hui Xu - Viện Dược lý và Độc chất học BắcKinh - Trung Quốc đã nghiên cứu tạo ra kháng thể đa dòng bằng cách: Cho

hapten TTX cộng hợp với protein mang là TTH (Tachypleus Tridentatus

Hemocyanin) để tạo ra kháng nguyên nhân tạo TTX-TTH theo con đườngformadehyde Kháng nguyên này được gây miễn dịch trên chuột BALB\c để tạo

ra kháng thể Người ta tiêm lên chuột đã được miễn dịch và chuột không đượcmiễn dịch với liều gây chết của TTX Kết quả cho thấy rằng những chuột đượcmiễn dịch bằng kháng nguyên nhân tạo TTX-TTH còn sống và những chuộtkhông được miễn dịch thì chết Như vậy kháng nguyên nhân tạo TTX-TTH đãtạo đáp ứng miễn dịch trên chuột cho ra kháng thể đa dòng trung hoà được độc tốTTX và bảo vệ được chuột sống Qua kết quả nghiên cứu này họ đã đề xuất sảnxuất vacxin hoá học cho hapten TTX [23]

Năm 2005 nhóm nghiên cứu này tiến hành nghiên cứu vacxin haptenic củaTTX và so sánh hai loại protein mang là TTH và TT Bằng cách cộng hợp TTXlần lược với 2 loại protein mang là Tachypleus tridentatus hemocyanin (TTH) vàtetanus toxoid (TT) thông qua con đường formadehyde để tạo ra hai loại khángnguyên nhân tạo TTX – TTH và TTX – TT Sau đó dùng hai loại kháng nguyênnày đem gây miễn dịch trên chuột BALB/c Chuột sau miễn dịch được thử tháchvới TTX với liều tiêm tăng dần 600, 630, 800, 1200, 1500, 2000 v à 2400g/kg.Kết quả liều gây chết LD50 của nhóm chuột được miễn dịch với kháng nguyêncộng hợp TTX-TTH là 2020g/kg, liều gây chết LD50 của nhóm chuột đượcmiễn dịch với kháng nguyên cộng hợp TTX-TT là 1410g/kg Còn nhóm chuộtđối chứng được miễn dịch với kháng nguyên là hai loại protein mang TTH và TTđều bị chết khi tiêm TTX với liều 600g/kg Từ kết quả nghiên cứu này cho thấykhả năng tạo kháng thể kháng độc tố TTX phụ thuộc rất nhiều vào protein mang[22]

Năm 2006, vẫn là nhóm nghiên cứu của Qin-Hui Xu đã tiến hành nghiên cứuhiệu quả của protein mang tác động l ên khả năng tạo kháng thể của khángnguyên nhân tạo protein mang – TTX Dựa vào phương pháp nghiên c ứu củaJohnson H.M, nhóm này đã thành công trong việc gắn TTX với lần l ược cácprotein mang khác nhau: TTH - tachypleus tridentatus hemocyanin, LPH –limulus polyphemus hemocyanin, TT – tetanus toxoid, DT – diphtheria toxoid,

Trang 22

BSA – bovine serum albumin thông qua con đường formaldehyde Tạo ra lầnlượt các loại kháng nguy ên nhân tạo TTX-TTH, TTX-LPH, TTX-TT, TTX-DT

và TTX-BSA Sau đó tiến hành gây miễn dịch trên chuột BABL/c, kháng thể đặchiệu và hiệu lực kháng độc tố đã được phát hiện Tiến hành tiêm thử thách 3 xliều gây chết (LD) của TTX vào các nhóm chuột đã được miễn dịch thì tỷ lệ sốngcủa các nhóm chuột nh ư sau: 92%, 75%, 42%, 8% và 0% tương ứng với khángnguyên nhân tạo mang protein –TTH, - TT, - LPH, -DT và - BSA Như vậykháng thể kháng TTX đặc hiệu và hiệu lực kháng độc tố có trong huy êt thanh củachuột được miễn dịch với kháng nguy ên TTX-TTH là tốt nhất và TTX-BSA làthấp nhất Những kết quả này gợi ý để sử dụng protein mang trong haptenic TTXvaccine là rất quan trọng trong việc tìm ra kháng thể kháng TTX có hiệu lực, v à

cả hai TTH và TT được lựa chọn làm chất mang cho sự phát triển xuất sắ c củavacxin TTX thực nghiệm [21]

Thông qua việc tìm hiểu những nghiên cứu ở ngoài nước như trên, thấy rằngviệc tạo ra một kháng nguyên độc tố cá Nóc có chất l ượng là rất quan trọng đểtạo ra huyết thanh kháng độc tố cá Nóc Do đó, bước đầu nghiên cứu thử nghiệmvới mục đích tạo ra đ ược kháng nguyên nhân tạo độc tố cá Nóc với hiệu suất cao

để gây miễn dịch, chúng tôi tiến hành làm đề tài: “So sánh hiệu suất cộng hợp

độc tố cá Nóc (Tetrodotoxin) với Toxoid Tetanus bằng hai ph ương pháp Formaldehyde và Fluorosulfonyl benzoic acid”

Đề tài thực hiện với các nội dung sau:

1 Cộng hợp TTX với protein mang TT thông qua Formaldehyde

2 Cộng hợp TTX với protein mang TT thông qua Fluorosulfonyl benzoic acid

3 So sánh hiệu suất cộng hợp của hai ph ương pháp trên

4 Định lượng hàm lượng TTX bằng phương pháp sinh hóa trên chu ột

Trang 23

Chương 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU

Trang 24

2.1 Vật liệu