Cũng như ở phương pháp cộng hợp với Formaldehyde chúng tôi cũng xây dựng 3 lô thí nghiệm 2A, 2B v à 2C cho phương pháp c ộng hợp TTX với TT thông qua con đường Fluorosulfonyl benzoic acid. Ở giai đoạn 1 gắn TTX với Fluorosulfonyl benzoic acid chúng tôi thu được kết quả như sau:
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Tube ODnm 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Hàm lượng TTX/tube (microgam) OD260 OD280 Hàm lượng TTX đã gắn kết(mirogam)
Hình 3.2: Kết quả chạy sắc kí lọc gel sau khi gắn TTX với Fluorosulfonyl benzoic acid của thí nghiệm 2A (TTX của Nhật Bản lô 7455)
Sau khi chúng tôi tiến hành cộng hợp TTX với Fluorosulfonyl benzoic acid, chúng tôi tiến hành chạy sắc ký lọc gel với mục đích là loại bỏ phần Fluorosulfonyl benzoic acid dư không gắn kết với TTX. Chúng tôi tiến hành xác định Fluorosulfonyl benzoic acid bằng phương pháp đo quang ph ổ ở OD ở bước sóng 260nm, bên cạnh đó chúng tôi cũng tiến h ành đo OD ở bước sóng 280nm để xác định các thành phần tạp chất khác. Song chúng tôi tiến h ành xác định hàm lượng độc tố bằng ph ương pháp sinh hoá trên chu ột. Kết quả được trình bày trong hình 3.2 và 3.3.
Qua hình 3.2 ta thấy ở đường biểu diễn OD260nm xuất hiện 2 peak. Peak 1 từ tube 12 đến 19 và peak 2 từtube 20 - 23. Bên cạnh đó ta thấy từ tube 12 đến 19 vừa có peak của hàm lượng TTX gây chết chuột. Nh ư vậy peak 1 có chứa hàm lượng TTX - Fluorosulfonyl benzoic acid có trọng lượng phân tử lớn hơn Fluorosulfonyl benzoic acid nên sẽ ra khỏi cột trước, còn Fluorosulfonyl benzoic acid có trọng lượng phân tử nhỏ hơn nên ra khỏi cột sau đó peak 2. Có 8 tube thu được có chứa chất gắn kết, mỗi tube là 5ml vậy chúng tôi đã thu được 40 ml dung dịch TTX-sulfo. Từ tube 20 (peak 2) hấp phụ bước sóng 260nm tăng cao điều này cho thấy một lượng Fluorosulfonyl benzoic acid đư ợc tách ra khỏi hợp
chất. Một điều đáng lưuý là peak có bước sóng 280nm có thay đ ổi nhưng không đáng kể, điều này đúng vớicông bố độ sạch của TTX Nhật Bản.
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 Tube ODnm 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Hàm lượng TTX/tube (microgam) OD260 OD280 Hàm lượng TTX/tube
Hình 3.3: Kết quả chạy sắc kí lọc gel sau khi gắn TTX với Fluorosulfonyl benzoic acid của thí nghiệm 2B (TTX của Phòng nghiên cứu Viện vacxin tinh chế).
Từkết quả trình bày ởhình 3.3 thấy rằng đường biểu diễn của bước sóng hấp thụ OD260nmcó 4 peak khác nhau. Peak 1 từ tube 5 đến tube 7, peak 2 từ tube 8 đến 9, peak 3 từ tube 10 đến 17 và peak 4 từ tube 18 đến 22. Bên cạnh đó bằng phương pháp kiểm tra sinh hoá trên chuột xác định được peak chứa độc tố TTX từ tube 10 đến 17 trùng với peak 3 của OD260nm. Từ kết quả này cho thấy rằng từ tube 10 đến tube 17 có chứa hàm lượng TTX-Fluorosulfonyl benzoic acid. Mỗi tube thu 5ml dung dịch, ở đây thu đ ược 8 tube như vậy chúng tôi đã thu 40 ml dung dịch có chứa chất gắn kết TTX - Fluorosulfonyl benzoic acid
Cũng từ hình 3.3 chúng tôi xét đường biểu diễn OD280nm. Xuất hiện 3 peak khác nhau, peak 1 từ tube 5 đến tube 7, peak 2 từ tube 8 đến 9 và peak 3 từ tube 10 đến 16. Từ kết quả này cho thấy từ tube 10 đến 17 ngoài TTX-Fluorosulfonyl benzoic acid có thể còn chứa các thành phần khác có khả năng gắn với Fluorosulfonyl benzoic acid.
Xét trên cả 2 đường biểu diễn OD260nm và OD280nm chúng tôi thấy rằng peak1 và 2 của đường biểu diễn OD260nm đồng thời cũng có sự hiện diện của peak 1 và 2 của đường biểu diễn hấp thụ bước sóng 280nm, điều này cho thấy trong thành phần nguyên liệu đầu của TTX đưa vào cộng hợp còn một ít tạp chất là protein có kích thư ớc lớn. Các protein n ày đã gắn với Fluorosulfonyl benzoic acid tạo ra hợp chất protein - Fluorosulfonyl benzoic acid và đã ra khỏi cột trước. Cuối cùng còn một phần Fluorosulfonyl benzoic acid dư có kích thư ớc nhỏ ra sau cùngở peak 4 của đường biểu diễn OD260nm.
So sánh đồ thị 3.2, 3.3 với 2 peak hấp thụ 2 bước sóng OD260 và OD280 chúng tôi thấy rằng ở biểu đồ 3.2 với TTX của Nhật có độ sạch cao (99,8%) làm nguyên liệu đầu để cộng hợp thì chúng tôi thu được peak TTX-Fluorosulfonyl benzoic acid đầu tiên sau đó chỉ còn peak Fluorosulfonyl benzoic acid dư được loại bỏ. Trong khi đó ở biểu đồ 3.3 thì chúng tôi thu được 4 peak hấp thụ bước sóng 260nm và peak 3 có chứa cộng hợp TTX - Fluorosulfonyl benzoic acid. Có 2 peak ra trước có trọng lượng phân tử lớn hơn và đồng thời hấp thụ cả 2 b ước sóng 260nm và 280nm, như v ậy trong đó có chứa một số tạp chất khác protein- Fluorosulfonyl benzoic acid , protein..., peak sau cùng chỉ hấp thụ bước sóng 260nm là Fluorosulfonyl benzoic acid dư được loại thải. Điều này phản ánh đúng với thực tế làở lô 2B chúng tôi dùng TTX được tinh chế ở phòng nghiên cứu của Viện vacxin có độ sạch từ 80-85% được làm nguyên liệu đầu để cộng hợp.
Sản phẩm sau khi chạy sắc ký lọc được đông khô và tiến hành cộng hợp với protein mang là tetanus toxoid (TT). Thu đư ợc kế quả như sau:
Bảng 3.2:Kết quả thí nghiệm phương pháp cộng hợp bằng Fluorosulfonyl benzoic acid
Lô số TTX banđầu
(microgam) TTX gắn kết với protein mang TT (microgam) Lô thí nghiệm 2A 700 52,1 Lô thí nghiệm 2B 1550 77,8 Lô thí nghiệm 2C 1650 91,7
Qua kết quả được trình bày ở bảng 3.2, hàm lượng TTX đưa vào tiến hành làm thí nghiệm trên 3 lô 2A, 2B và 2C (được xác định bằng phương pháp sinh hoá trên chuột) lần lượt là 700g, 1550 g và 1650 g. Sau khi tiến hành cộng hợp qua 2 bước là gắn với Fluorosulfonyl benzoic acid sau đó cộng hợp với protein mang là tetanus toxoid (TT) ở pH = 5,5-6,5 trong thời gian 24 giờ ởnhiệt độ phòng, sau đó được ly giải bằng túi thẩm tích Spectra/Por trong dung dịch đệm PBS (pH = 7+0.2) trong 24h để loại bỏ TTX tự do và TTX - Fluorosulfonyl benzoic acid. Cộng hợp sau ly giải được tách ra và được định lượng hàm lượng cộng hợp TTX-TT bằng phương pháp sinh hoá trên chuột. Kết quả cộng hợp thu được của 3 lô thí nghiệm lần lượt tươngứng là 52,1g; 77,8g và 91,7g (tính theo hàm lượng của TTX). Từ kết quả thực tế trên chúng tôi thấy rằng: ở lô 2A cứ 700g TTX đưa vào cộng hợp chỉ có 52,1g TTX được cộng hợp với TT. Tương tự như vậy với lô 1B và 1C cứ 1250 g và 827 g thì chỉ có 40,75g và 26,05g TTX được cộng hợp với TT. 7.44 5.02 5.56 0 2 4 6 8 10 Hiệu suất cộng hợp (% )
Lô 2A Lô 2B Lô 2C
Hình 3.4: So sánh hiệu suất của 3 lô cộng hợp bằngFluorosulfonyl benzoic acid . Qua kết quả ở biểuđồ 3.4 hiệu suất cộng hợp của 3 lô có sự khác nhau. Ở lô thí nghiệm 2A chúng tôi sử dụng độc tố của Nhật Bản (lô 7455) có độ sạch (99,8%) hiệu suất cộng hợp đạt 7,44% cao hơn 2 lô thí nghiệm còn lại 2B và 2C là 5,02% và 5,56%. Ở 2 lô thí nghiệm 2B và 2C chúng tôi sử dụng độc tố TTX
của Phòng nghiên cứu Viện Vacxin tinh chế,độ sạch chỉ đạt 80-85%. Điều này đã được thấy ở giai đoạn 1 khi gắn TTX với Fluorosulfonyl benzoic acid tr ên biểu đồ 3.2 và 3.3. Như vậy một lần nữa khẳng định rằng, chất lượng củađộc tố đưa vào cộng hợpđãảnh hưởngđến hiệu suất của quá trình cộng hợp.