2.2.1.Phương pháp cộng hợp TTX với protein mang TT bằngFormaldehyde
Dựa trên cơ sở nghiên cứu của Johnson H.M. (1964) [14] và Qin – Hui Xu [21],[22],[23]. Cơ chế cộng hợp TTX với TT theo đường Formaldehyde được tiến hành theo sơ đồ1.
Sơ đồ 1: Qui trình cộng hợp TTX với TT theo con đ ường formaldehyde.
Sinh hóa trên chuột Chuẩn bị dung dịch TTX Cộng hợp Ly giải Định lượng TTX đã cộng hợp Ủ Tính hiệu suất cộng hợp - Formaldehyde 35% - dung dịch TT - 37oC - 72 giờ - túi thẩm tích - dung dịch đệm PBS - 24 giờ ở 4oC
Thuyết minh quy trình - Chuẩn bị dung dịch TTX:
TTX đông khô được hoà tan trong 1ml nước cất lắc cho đến khi tan hoàn toàn. Lấy 5l dung dịch TTX pha loãng trong nước cất với tỷ lệ 1/100 để định lượng hàm lượng TTX có trong dung dịch bằng phương pháp sinh hoá trên chuột.
- Cộng hợp:
+ Lấy một thể tích dung dịch TTX trong đó có chứa TTX 500g (1.565
M) cho vào lọ penicilin. Tiếp tục bổ sung dung dịch TT có chứa 6mg TT (40nM). Cuối cùng cho thêm Formaldehyde 35% để được tỷ lệ cuối cùng 1,7%. Hỗn hợp sẽ đượctrộn đều trên máy khuấy từ.
+ Ủ: hỗn hợp cộng hợp đ ược đặt trong tủ ấm khuấy nhẹ ở nhiệt độ 37oC trong 72 giờ.Giaiđoạn này giúp cho phản ứng gắn kết hóa học được diễn ra giữa TTX-Formaldehyde và Tetanus toxoid (TT).
+ Ly giải: Hỗn hợp sau khi cộng hợp được cho vào túi thẩm tích có đường kính lỗ bán thấm là 3500 dalton, hỗn hợp được ly giải3 lần trong dung dịch đệm PBS pH = 7,0. (0.5 lít dung dịch PBS/ lần). Quá trình ly giải thực hiện trong 24 giờ ở 4oC. Mục đích của quá trình ly giải là loại bỏ phần TTX tự do không gắn kết ra khỏi hỗn hợp. Trong quá trình ly giải các phân tử TTX tự do có trọng lượng phân tử nhỏ (MW = 319) nên dễ dàng đi qua lỗ bán thấm và ra ngoài dung dịch, TT và cộng hợp TTX-TT có trọng lượng phân tử lớn, khôngqua được nên nằm lại trong túi.
-Xác định hàm lượng TTX đã cộng hợp:
+ Sau khi đã tách TTX tự do ra khỏi, dung dịch cộng hợp đ ược đưa đi xác định hàm lượng TTX – TT. Việc định lượng được thực hiện bằng phương pháp sinh hóa trên chuột.
+ Tính hiệu suất gắn kết: hiệu suất gắn kết cho thấy được hiệu quả gắn kết của TTX với protein mang. Hiệu suất này được tính theo công thức 2.1.
Trongđó:
H%: Hiệu suất quá trình cộng hợp
m1: Hàm lượng TTX sau khi cộng hợp và ly giải m2: Hàm lượng TTXđưa vào cộng hợp
2.2.2. Phương pháp cộng hợp TTX với protein mang TT bằng
Fluorosulfonyl benzoic acid
Trong phân tử TTX có chứa nhóm chức alcohol bậc 1. Ứng dụng tính chất của nhóm chức này để tạo ra kháng nguyên nhân tạo theo con đường Fluorosulfonyl benzoic acid (FSuBA), sơ đồ phản ứng như sau:
(TTX)-CH2OH + F -SO2-C6H4-COOH (TTX)-CH2-O-SO2-C6H4-COOH ChấtA
(EDC: 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) Carbodiimide) (2.1) m1
m2
H% = x 100%
Hình 2.3: TTX đông khô banđầu Hình 2.4: Dung dịch cộng hợp sau ly giải
(I)
EDC
Sulfo-N-Hydroxysuccinimide (II) (TT)-NH-OC-C6H4-SO2-O-CH2-(TTX) (TT)-NH2 + HOOC-C6H4-SO2-O-CH2-TTX
Sơ đồ 2:Quy trình cộng hợp bằng Fluorosulfonyl benzoic a cid
Sinh hóa trên chuột Chuẩn bị dung dịch TTX Cộng hợp bước 1 Đông khô Ủ Tách FSuBA dư Cộng hợp bước 2 Ủ Ly giải Định lượng TTX đã cộng hợp Tính hiệu suất cộng hợp - 2 -propanol - Fluorosulfonyl benzoic acid -Đệm phosphate - EDC - Sulfo-N- Hydroxysuccinimide - Dung dịch TT - nhiệt độ phòng - 2 giờ Sắc kí lọc gel - nhiệt độ phòng -qua đêm - túi thẩm tích - dung dịch PBS - 24h, 4oC
Thuyết minh quy trình - Chuẩn bị dung dịch.
TTX đông khô 1mg được hoà tan trong 1,25 ml đệm phosphate pH = 7 lắc chođến khi tan hoàn toàn. Lấy 5l dung dịch TTX pha loãng với nước cất với tỷ lệ 1/100 để định lượng hàm lượng TTX có trong dung dịch bằng phương pháp sinh hoá trên chuột.
- Cộng hợp bước 1:
+ Lấy một thể tích dung dịch TTX trong đó có chứa TTX 500g (1.565
M) cho vào lọ penicilin. Bổ sung 250l 2-propanol (VTTX/Vpropanol = 5/1) và 250l (2.5M) dung dịch Fluorosulfonyl benzoic acid 10M/ml, khuấy nhẹ dung dịch trong 2 phút.
+ Ủ : Dung dịch được lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ. Mục đích của giai đoạn này là tạo ta phản ứng gắn kết giữa TTX với Fluorosulfonyl benzoic acid.
+ Tách Fluorosulfonyl benzoic acid (FSuBA) dư: sau khi gắn kết, lượng Fluorosulfonyl benzoic acid dư đư ợc tách ra bằng phương pháp sắc kí lọc gel. Dung dịch sau phản ứng cho vào cột sắt ký Gel sắc ký Bio-Gel P-2 thu mẫu 5ml/tube đo OD ở bước sóng 260nm để xác định gốc Sulfonyl. Đồng thời dùng phương pháp sinh hoá trên chuộtđể xácđịnh TTX-Sulfonyl.
+ Đông khô: Thu peak mẫu có chứa TTX-sulfonyl, tiến hành đông khô. (chất A).
- Cộng hợp bước 2:
+ Chất gắn kết A sau khi đông khô đ ược hòa tan trong 1ml dung dịch đệm phosphate pH 6.5, thêm dung dịch TT theo tỷ lệ phân tử TTX:TT = 40:1. Bổ sung thêm dung dịch EDC và Sulfo-N-Hydroxysuccinimide theo tỷ lệ phân tử TTX : EDC = 1: 87 và TTX : Sulfo-N-Hydroxysuccinimide = 1: 28. Hỗn hợp dung dịch được khuấy đều.
+Ủ:Dung dịch trên đượckhuấy nhẹ vàủ ở nhiệt độ phòng qua đêm. Trong quá trình này xảy ra phảnứng gắn kết giữa chất A và TT.
+ Ly giải: dung dịch sau khi ủ đ ược lấy ra đưa vào túi thẩm tích có đường kính lỗ bán thấm là 3500 dalton vàđược ly giải trong 24 giờ ở 4oC. Quá trình thẩm tích sẽ loại được TTX tự do.
+ Định lượng TTX đã cộng hợp: hàm lượng TTX đã cộng hợp được xác định bằng phương pháp sinh hóa trên chu ột.
+ Tính hiệu suất cộng hợp: hiệu suất gắn kết cho thấy đ ược hiệu quả gắn kết của TTX với protein mang. Hiệu suất n ày được tính theo công thức 2.1.
2.2.3. Phương pháp sinh hóa trên chu ột
Để xác định hàm lượng của TTX, dùng phương pháp thử nghiệm sinh học trên chuột cho độc tố PSP (AOAC, 1990): một đ ơn vị chuột (Mouse Unit - MU) ở đây được tính toán là lượng độc tố tối thiểu có thể giết chết chuột nhắt trắng (Swiss), trọng lượng 20g trong vòng 30 phút. Liều chết của TTX đối với chuột được tính là 4500 MU/mg (Kawabata 1978), tức là 1 MU tương đương 0,22 g TTX [3].
- Chọn chuột nhắt trắng trọng lượng 20g.
- Tiêm vào ổ bụng chuột với liều tiêm lần lượt là: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 và 100l. Theo dõi trong vòng 30 phút. Nếu chuột chết trong khoảng từ 20 đến 100 l, tiến hành tính kết quả. Nếu chuột chết ở liều tiêm 10l thì phải pha loãng mẫu 10 lần và tiến hành tiêm theo liều tiêm trên và cứ thế xác định được hàm lượng TTX. Nếu ở liều tiêm 100l chuột còn sống thì tiến hành tăng liều tiêm từ 110, 120, ....200lđể xácđịnh liều gây chuột chết.
- Hàm lượng TTX được tính theo công thức 2.2
Trongđó: m: Hàm lượng TTX (2.2) m (g) = VLD (l)x C V (l)x 0,22 (g)
V: Thể tích dung dịch cần xácđịnh hàm lượng TTX có trong đó VLD: Thể tích dung dịch TTX gây chết 1 chuột trong 30 phút (1MU) 0,22: Là hàm lượng TTX tươngđương 1MU
C: Độ pha loãng của dung dịch cần xácđịnh hàm lượng TTX
Chuột trước khi tiêm TTX Chuột chết do nhiễm độc TTX Hình 2.5: Hình ảnh trong quá trình thử nghiệm trên chuột
Chương 3
3.1 Kết quả cộng hợp bằng phương pháp Formaldehyde
Chúng tôi tiến hành làm thí nghiệm cho đề tài bằng phương pháp cộng hợp TTX với TT qua con đường Formaldehyde trên ba lô thí nghiệm là lô 1A, 1B và 1C. Kết quả thí nghiệm thuđược như sau:
Bảng 3.1. Kết quả thí nghiệm của 3 lô cộng hợp bằng phương pháp Formaldehyde.
Lô số Hàm lượng TTX ban
đầu (g) Hàm lượng TTXđã gắn kết với TT (g) Lô thí nghiệm 1A 500 25,45 Lô thí nghiệm 1B 1250 40,75 Lô thí nghiệm 1C 827 26,05
Qua kết quả được trình bàyở bảng 3.1 hàm lượng TTXđưa vào tiến hành làm thí nghiệm trên 3 lô 1A, 1B và 1Cđược xácđịnh bằng phương pháp sinh hoá trên chuột lần lượt là 500g, 1250 g và 827 g. Sau khi tiến hành cộng với protein mang là tetanus toxoid (TT) thông qua đường formaldehyde ở pH = 6.4 trong thời gian 72 giờ ở 370C, sau đó được ly giải bằng túi thẩm tích Spectra/Por R trong dung dịch đệm PBS (pH = 7+0.2) trong 24h. Cộng hợp sau ly giải được tách ra vàđượcđịnh lượng hàm lượng cộng hợp TTX-TT bằng phương pháp trên chuột. Kết quả cộng hợp thu được của 3 lô thí nghiệm lần lượt tương ứng là 25,45g; 40,75g và 26,05 g (tính theo hàm lượng của TTX). Từ kết quả thực tế này chúng tôi thấy rằng: ở lô 1A cứ 500g TTX đưa vào cộng hợp chỉ có 25,45g TTXđược cộng hợp với TT. Tương tự như vậy với lô 1B và 1C cứ 1250
g và 827 g thì chỉ có 40,75g và 26,05 g TTX được cộng hợp với TT và được sử dụng làm kháng nguyên. 5.09 3.26 3.15 0 1 2 3 4 5 6 Hiệu suất cộng hợp (%)
Lô 1A Lô 1B Lô 1C
Hình 3.1: Biểu đồ so sánh hiệu suất của 3 lô cộng hợp bằng Formaldehyde. Qua kết quả ở hình 3.1 Hiệu suất cộng hợp của 3 lô trong cùng một phương pháp có sự khác nhau. Ở lô thí nghiệm 1A chúng tôi sử dụng độc tố của Nhật Bản (lô 7455) có độ sạch (99,8%) hiệu suất cộng hợp đạt 5,09%. Còn lô thí nghiệm 1B và 1C chúng tôi sử dụng độc tố của Phòng nghiên cứu Viện Vacxin tinh chế, độ sạch 80-85%, có hiệu suất cộng hợp thấp h ơn chỉ đạt 3,26% và 3,15%. Điều này cho thấychất lượng của độc tố đãảnh hưởng đếnhiệu suất cộng hợp. Như vậy trong cùng một điều kiện thì hiệu suất cộng hợp tỷ lệ thuận với độ sạch của độc tố.
3.2. Kết quả cộng hợp bằng ph ương pháp Fluorosulfonyl benzoic acid
Cũng như ở phương pháp cộng hợp với Formaldehyde chúng tôi cũng xây dựng 3 lô thí nghiệm 2A, 2B v à 2C cho phương pháp c ộng hợp TTX với TT thông qua con đường Fluorosulfonyl benzoic acid. Ở giai đoạn 1 gắn TTX với Fluorosulfonyl benzoic acid chúng tôi thu được kết quả như sau:
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Tube ODnm 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Hàm lượng TTX/tube (microgam) OD260 OD280 Hàm lượng TTX đã gắn kết(mirogam)
Hình 3.2: Kết quả chạy sắc kí lọc gel sau khi gắn TTX với Fluorosulfonyl benzoic acid của thí nghiệm 2A (TTX của Nhật Bản lô 7455)
Sau khi chúng tôi tiến hành cộng hợp TTX với Fluorosulfonyl benzoic acid, chúng tôi tiến hành chạy sắc ký lọc gel với mục đích là loại bỏ phần Fluorosulfonyl benzoic acid dư không gắn kết với TTX. Chúng tôi tiến hành xác định Fluorosulfonyl benzoic acid bằng phương pháp đo quang ph ổ ở OD ở bước sóng 260nm, bên cạnh đó chúng tôi cũng tiến h ành đo OD ở bước sóng 280nm để xác định các thành phần tạp chất khác. Song chúng tôi tiến h ành xác định hàm lượng độc tố bằng ph ương pháp sinh hoá trên chu ột. Kết quả được trình bày trong hình 3.2 và 3.3.
Qua hình 3.2 ta thấy ở đường biểu diễn OD260nm xuất hiện 2 peak. Peak 1 từ tube 12 đến 19 và peak 2 từtube 20 - 23. Bên cạnh đó ta thấy từ tube 12 đến 19 vừa có peak của hàm lượng TTX gây chết chuột. Nh ư vậy peak 1 có chứa hàm lượng TTX - Fluorosulfonyl benzoic acid có trọng lượng phân tử lớn hơn Fluorosulfonyl benzoic acid nên sẽ ra khỏi cột trước, còn Fluorosulfonyl benzoic acid có trọng lượng phân tử nhỏ hơn nên ra khỏi cột sau đó peak 2. Có 8 tube thu được có chứa chất gắn kết, mỗi tube là 5ml vậy chúng tôi đã thu được 40 ml dung dịch TTX-sulfo. Từ tube 20 (peak 2) hấp phụ bước sóng 260nm tăng cao điều này cho thấy một lượng Fluorosulfonyl benzoic acid đư ợc tách ra khỏi hợp
chất. Một điều đáng lưuý là peak có bước sóng 280nm có thay đ ổi nhưng không đáng kể, điều này đúng vớicông bố độ sạch của TTX Nhật Bản.
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 Tube ODnm 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Hàm lượng TTX/tube (microgam) OD260 OD280 Hàm lượng TTX/tube
Hình 3.3: Kết quả chạy sắc kí lọc gel sau khi gắn TTX với Fluorosulfonyl benzoic acid của thí nghiệm 2B (TTX của Phòng nghiên cứu Viện vacxin tinh chế).
Từkết quả trình bày ởhình 3.3 thấy rằng đường biểu diễn của bước sóng hấp thụ OD260nmcó 4 peak khác nhau. Peak 1 từ tube 5 đến tube 7, peak 2 từ tube 8 đến 9, peak 3 từ tube 10 đến 17 và peak 4 từ tube 18 đến 22. Bên cạnh đó bằng phương pháp kiểm tra sinh hoá trên chuột xác định được peak chứa độc tố TTX từ tube 10 đến 17 trùng với peak 3 của OD260nm. Từ kết quả này cho thấy rằng từ tube 10 đến tube 17 có chứa hàm lượng TTX-Fluorosulfonyl benzoic acid. Mỗi tube thu 5ml dung dịch, ở đây thu đ ược 8 tube như vậy chúng tôi đã thu 40 ml dung dịch có chứa chất gắn kết TTX - Fluorosulfonyl benzoic acid
Cũng từ hình 3.3 chúng tôi xét đường biểu diễn OD280nm. Xuất hiện 3 peak khác nhau, peak 1 từ tube 5 đến tube 7, peak 2 từ tube 8 đến 9 và peak 3 từ tube 10 đến 16. Từ kết quả này cho thấy từ tube 10 đến 17 ngoài TTX-Fluorosulfonyl benzoic acid có thể còn chứa các thành phần khác có khả năng gắn với Fluorosulfonyl benzoic acid.
Xét trên cả 2 đường biểu diễn OD260nm và OD280nm chúng tôi thấy rằng peak1 và 2 của đường biểu diễn OD260nm đồng thời cũng có sự hiện diện của peak 1 và 2 của đường biểu diễn hấp thụ bước sóng 280nm, điều này cho thấy trong thành phần nguyên liệu đầu của TTX đưa vào cộng hợp còn một ít tạp chất là protein có kích thư ớc lớn. Các protein n ày đã gắn với Fluorosulfonyl benzoic acid tạo ra hợp chất protein - Fluorosulfonyl benzoic acid và đã ra khỏi cột trước. Cuối cùng còn một phần Fluorosulfonyl benzoic acid dư có kích thư ớc nhỏ ra sau cùngở peak 4 của đường biểu diễn OD260nm.
So sánh đồ thị 3.2, 3.3 với 2 peak hấp thụ 2 bước sóng OD260 và OD280 chúng tôi thấy rằng ở biểu đồ 3.2 với TTX của Nhật có độ sạch cao (99,8%) làm nguyên liệu đầu để cộng hợp thì chúng tôi thu được peak TTX-Fluorosulfonyl benzoic acid đầu tiên sau đó chỉ còn peak Fluorosulfonyl benzoic acid dư được loại bỏ. Trong khi đó ở biểu đồ 3.3 thì chúng tôi thu được 4 peak hấp thụ bước sóng 260nm và peak 3 có chứa cộng hợp TTX - Fluorosulfonyl benzoic acid. Có 2 peak ra trước có trọng lượng phân tử lớn hơn và đồng thời hấp thụ cả 2 b ước sóng 260nm và 280nm, như v ậy trong đó có chứa một số tạp chất khác protein- Fluorosulfonyl benzoic acid , protein..., peak sau cùng chỉ hấp thụ bước sóng 260nm là Fluorosulfonyl benzoic acid dư được loại thải. Điều này phản ánh đúng với thực tế làở lô 2B chúng tôi dùng TTX được tinh chế ở phòng nghiên cứu của Viện vacxin có độ sạch từ 80-85% được làm nguyên liệu đầu để cộng hợp.
Sản phẩm sau khi chạy sắc ký lọc được đông khô và tiến hành cộng hợp với protein mang là tetanus toxoid (TT). Thu đư ợc kế quả như sau:
Bảng 3.2:Kết quả thí nghiệm phương pháp cộng hợp bằng Fluorosulfonyl benzoic acid
Lô số TTX banđầu
(microgam) TTX gắn kết với protein mang TT (microgam) Lô thí nghiệm 2A 700 52,1 Lô thí nghiệm 2B 1550 77,8 Lô thí nghiệm 2C 1650 91,7
Qua kết quả được trình bày ở bảng 3.2, hàm lượng TTX đưa vào tiến hành làm thí nghiệm trên 3 lô 2A, 2B và 2C (được xác định bằng phương pháp sinh