KỸ THUẬT CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT - CÔNG NGHỆ SINH HỌC PPTX

Nguyên lý chung: Giữ lại các gen Vir cần thiết cho quá trình vận chuyển TDNA gắn vào NST tế bào thực vật. Giữ lại vùng bờ trái (LB), bờ phải (RB) và thay thế các gen cần thiết vào vùng TDNA.Agrobacterium tumefaciens và A. rhizogenes là hai loài vi khuẩn sống trong đất gây ra bệnh khối u hình chóp (crown gall) (Hình 1và hình 2 ) và bệnh lông rễ (hairy root) ở các vị trí tổn thương của thực vật hai lá mầm.Chỉ rất ít thực vật một lá mầm thuộc họ Liliaceae và Amaryllidaceae là dễ bị bệnh khối u hình chóp. Lý do giới hạn vật chủ này hiện nay còn chưa được biết. Một lần khởi đầu, sự sinh trưởng khối u có thể tiếp diễn khi vắng mặt vi khuẩn và mô khối u có thể được sinh trưởng vô trùng bằng nuôi cấy mô trong các môi trường thiếu sự bổ sung auxin và cytokinin ngoại sinh mà bình thường là cần thiết để xúc tiến sự sinh trưởng của mô thực vật in vitro. Mô khối u tổng hợp amino acid mới và các dẫn xuất của đường được biết chung là opine. Loại opine tổng hợp trong khối u (ví dụ như nopaline, octopine, agrocinopine, mannopine và agropine) phụ thuộc vào dòng Agrobacterium khởi đầu sự hình thành khối u. Octopine và nopaline là hai loại opine có nguồn gốc từ arginine và dễ dàng phát hiện nhất trong mô khối u hình chóp. Do đó nhiều dòng Agrobacterium tumefacien phổ biến được thiết kế theo kiểu octopine hoặc nopaline. Agropine, một dẫn xuất của đường được tìm thấy phổ biến trong các khối u lông rễ gây ra bởi A. rhizogenes. Agrobacterium chịu trách nhiệm đối với sự hình thành khối u dị hóa một cách có chọn lọc opine mà nó tổng hợp được và sử dụng opine như là một nguồn cacbon và nitơ.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HUẾ

Huế, ngày 22 tháng 9

Kỹ thuật

chuyển gen

Một số khái niệm cơ bản

Chuyển gen là đưa một đoạn DNA Chuyển gen

ngoại lai vào genome của một cơ thể đa bào, sau đó đoạn DNA này

sẽ có mặt ở hầu hết các tế bào

và di truyền lại cho đời sau

Gen chuyển ( Gen chuyển Transgene) là gen ngoại Transgene

lai được chuyển từ một cơ thể sang một cơ thể mới bằng kỹ thuật

di truyền

Thực vật chuyển gen Thực vật chuyển gen là thực vật

có gen ngoại lai (gen chuyển) xen vào trong DNA genome của

nó

Page  4

Tuy nhiên để chuyển gen vào thực vật (vật chủ) một

cách có hiệu quả thì, các cấu trúc di truyền cần được thiết kế thích hợp cho sự hợp nhất và biểu hiện của gen ngoại lai Cấu trúc di truyền phải

mang một gen chỉ thị chọn lọc gen chỉ thị chọn lọc hoặc sàng lọc sàng lọc.

Một cấu trúc di truyền cơ bản bao gồm : trình tự

khởi động (promoter), gen mã hóa (coding gene)

lá mầm và promoter ubiquitin của ngô thích hợp cho sự biểu hiện promoter ubiquitin

mạnh của cây một lá mầm cây một lá mầm.

Một số khái niệm cơ bản

MỤC ĐÍCH QUÁ TRÌNH

CHUYỂN GEN Ở THỰC

VẬT

Mục đích quá trình chuyển gen

 Nghiên cứu làm sáng tỏ chức năng của

một gen được quan tâm hay từng phần của gen đó.

 Làm thay đổi mức độ biểu hiện của một

gen nội bào.

 Chuyển các gen quy định các tính trạng

mong muốn vào tế bào để thu nhận được thu nhận được

các tính trạng mới ở tế bào và cây được

chuyển gen

Cà chua chuyển gen kháng vật ký sinh (bên phải) và cà

chua đối chứng (bên trái)

Quy trình chuyển gen

Quy trình chuyển gen

Biến nạp vào mô hoặc tế bào

Các nguyên tắc sinh học cơ bản của việc chuyển gen

 Không phải toàn bộ các tế bào đều thể

hiện

hiện tính toàn năng tính toàn năng.

 Các cây khác nhau có phản ứng Các cây khác nhau có phản ứng

không giống nhau với sự xâm nhập của một gen ngoại lai.

 Cây biến nạp chỉ có thể được tái sinh Cây biến nạp chỉ có thể được tái sinh

từ các tế bào có khả năng tái sinh và có khả năng thu nhận gen biến nạp vào genome

Nguyên tắc sinh học cơ bản của chuyển

 Thành tế bào ngăn cản Thành tế bào ngăn cản sự xâm nhập của DNA

Dựa vào các gen đánh dấu

Gen đánh dấu bao gồm cácGen đánh dấu bao gồm các gen chỉ thị chọn lọc gen chỉ thị chọn lọc

và sàng lọc

CácCác gen chỉ thị chọn lọc gen chỉ thị chọn lọc có tác dụng mã hóa các mã hóa các

protein khử độc các nhân tố ức chế trao đổi chất

như chất kháng sinh hay chất diệt cỏ

CácCác gen chỉ thị sàng lọc gen chỉ thị sàng lọc thường được sử dụng là thường được sử dụng là

các gen β - glucuronidaseβ - glucuronidase (gusA), luciferase), luciferase và và

gần đây hơn là gen mã hóa protein phát huỳnh quang xanh lục (green fluorescent) của sứa

Page  13

Gen chỉ thị chọn lọc phổ biến

 Gen npt II : Gen mã hóa cho neomycin npt II neomycin phosphotransferase, đây là một enzyme vi sinh vật có khối lượng phân tử 25kD, xúc tác cho phản ứng phosphoryl hóa phosphoryl

một số loại kháng sinh gốc aminoglycoside kháng sinh gốc aminoglycoside như neomycin neomycin, kanamycin và G148 G148 Trong phản ứng này, nhóm phosphate Ɣ Ɣ phosphate

của ATP được gắn vào phân tử chất kháng sinh làm nó trở ATP

nên bất hoạtbất hoạt do ngăn trở sự liên kết của kháng sinh với

ribosome

 Gen bar : là tên gọi của một gen mã hóa cho enzyme

phosphinothricin acetyltransferase (PATPAT), có tác dụng làm mất

độc tính của phosphinothrcin phosphinothrcin (PPT), là hoạt chất chính của

thuốc trừ cỏ như Bialaphos Bialaphos và Basta Basta Gen bar được tạo dòng

đầu tiên từ một dòng vi khuẩn Streptomyces hygroscopius Streptomyces hygroscopius.

Page  14

Các gen chỉ thị sàng lọc phổ biến

Gen gus A : là gen mã hóa cho sinh tổng hợp enzyme β- gus A sinh tổng hợp enzyme β-

glucuronidase β-glucuronidase β-glucuronidase là một hydrolasehydrolase xúc

tác cho sự phân giải các β-glucuronide β-glucuronide, sản phẩm phân giải có màu chàm đặc trưng, dễ nhận biết và thường dùng để nhận biết sự tồn tại của gen gus A là X-Gluc gus A X-Gluc (5 -

bromo -4 -chloro - 3 - indolyl - β - D - glucuronide

bromo -4 -chloro - 3 - indolyl - β - D - glucuronide) Dung

dịch X-Gluc X-Gluc không màu dưới tác động của enzyme β - β -

glucuronidase sẽ chuyển sang màu xanh chàm màu xanh chàm.

Gen lacZ : là gen mã hóa cho enzyme β-galactosidase lacZ enzyme β-galactosidase có

khối lượng phân tử 116 kD Gen lacZ ở lacZ E.coli được dùng E.coli

rất phổ biến trong công nghệ gen và đã có sẵn của hệ

thống phương pháp kiểm tra rất nhạy với thuốc thử X- Gal Sự tồn tại của lacZ trong tế bào thực vật đã được lacZ

X-khẳng định Vì vậy trước khi kiểm tra sự có mặt của gen

lacZ ngoại lai

lacZ ngoại lai, cần phải bất hoạt gen lacZ nội sinh bằng glutaraldehyde

Chuyển gen qua trung gian

Chuyển gen trực tiếp

1

2

Phương pháp chuyển gen ở thực vật

Phương pháp này được thực hiện nhờ vi khuẩn

tạo khối u ở thực vật, chủ yếu qua T-plasmid Dựa vào cơ chế vi khuẩn Argobacterium sau Argobacterium

khi xâm nhiễm vào tế bào , chúng gắn các đoạn T-DNA vào bộ máy di truyền của tế bào T-DNA

thực vật, dẫn đến sự rối loạn dưỡng chất nội sinh, tạo ra khối u (trường hợp A.tumefaciens) A.tumefaciens

hay rễ tơ (A.rhizogenes) Khả năng chuyển gen A.rhizogenes

này đã được khai thác để chuyển gen ngoại lai vào thực vật theo ý muốn

Chuyển gen qua trung gian

Page  19

Vi khuẩn Agrobacterium

Agrobacterium tumefaciens và Agrobacterium và Agrobacterium

rhizogenes là hai loài gây bệnh cho thực vật được sử dụng như các vector tự nhiên để mang các gen ngoại lai vào mô và tế bào thực vật

A.tumefaciens A.tumefaciens có chứa 1 plasmid lớn kích thước

khoảng 200kb gọi là

khoảng 200kb gọi là Ti-plasmid Ti-plasmid chính là tác

nhân gây bệnh cho cây Khi cây bị nhiễm

A.tumefaciens qua các vết thương, biểu hiện là các khối u hình thành ngay ở chỗ lây nhiễm Sự hình thành khối u sau đó có thể tiếp tục mà không cần có sự có mặt của VK (nguyên nhân là

do A.tumefaciens đã chuyển một đoạn DNA của Ti-plasmid xâm nhập vào hệ gen của cây bị bệnh).

Đặc điểm quan trọng của plasmid plasmid là chúng có thể liên

kết vào NST nhưng cũng có thể tồn tại bên ngoài NST một cách độc lập

Các plasmid của Argobacterium được sử dụng vào Argobacterium

công nghệ gen thực vật có 2 dạng vector cis và

trans

trans Đây là 2 dạng vector rất thuận lợi để tái tổ

hợp gen ngoại lai và chuyển vào tế bào thực vật

Dạng cis Dạng cis chỉ sử dụng Ti-plasmid và tế bào vật chủ

là Argobacterium tumefanciens Argobacterium tumefanciens mà không có không có sự tham gia của vi khuẩn và các plasmid khác

Dạng trans Dạng trans là dạng mà sử dụng hai hay nhiều loại

plasmid và vi khuẩn cùng lúc

Page  22

Ti - plasmi

Bản đồ các dạng Ti-plasmid

A.Dạng tự nhiên ban đầu B.Dạng Cis C.Dạng Trans

A.Dạng tự nhiên ban đầu B.Dạng Cis C.Dạng Trans

Page  24

 Mặc dù hệ thống chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium Agrobacterium

là

là có có hiệu quả đối với một số loài nhưng không phải tất cả thực không phải tất cả thực

vật có thể biến nạp bằng con đường này Đặc biệt là lớp một lá mầm bao gồm các cây ngũ cốc chính trên thế giới như lúa, lúa

mì và ngô là

mì và ngô là không không được biến nạp dễ dàng nhờ

A.tumefaciens

 Để khai thác và sử dụng A.tumefaciens Để khai thác và sử dụng A.tumefaciens như một vector

chuyển gen các nhà khoa học đã

chuyển gen các nhà khoa học đã loại bỏ loại bỏ các gen gây khối u và

gen mã hóa opine của T - DNA và thay thế và thay thế vào đó là marker

chọn lọc , trong khi vẫn duy trì, trong khi vẫn duy trì vùng bờ phải và bờ trái của T- vùng bờ phải và bờ trái của

T-DNA và các gen vir. Gen chuyển được xen vào vùng giữa các vùng bờ của T-DNA Nó sẽ được chuyển vào tế bào và trở nên hợp nhất với NST tế bào thực vật

 Một vài yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp là : loại

mô được biến nạp, giai đoạn phát triển của mô, mức độ khởi

đầu của vi khuẩn A.tumefaciens sử dụng, môi trường để nuôi cấy mô sau khi biến nạp, marker được sử dụng để chọn lọc thể biến nạp, loại vector sử dụng và kiểu gen của thực vật.

Page  25

Vùng T-DNA

Vùng T-DNA đó là một đoạn DNA có kích thước đó là một đoạn DNA có kích thước

khoảng 25kb trong đó có chứa đoạn gen mã hóa cho quá trình sinh tổng hợp auxin, cytokinin, opine là các gen gây nên khối u ( oncogenes ) Trong Ti-plasmid,vị trí của T- DNA được giới hạn bằng RB và LB.

Vùng Vir là vùng phụ trách khả năng lây nhiễm.

Page  26

Tạo thực vật chuyển gen bằng phương pháp gián tiếp qua Agrobacterium

Chuyển gen trực tiếp

Có nhiều phương pháp sử dụng như

lyposome , điện biến nạp (electroporation),

vi tiêm , bắn gen , dùng silicon carbide,

chuyển gen trực tiếp vào protoplast

Page  28

Chuyển gen bằng vi đạn (Bắn

gen)

Đây là phương pháp hiện đang được sử dụng phổ biến tại

các phòng thí nghiệm công nghệ sinh học thực vật ở trong nước và trên thế giới Nguyên lý của nó là sử dụng các viên đạn có kích thước hiển vi, có tỷ trọng cao

để đạt tốc độ cao xuyên qua vỏ và màng tế bào, đưa lớp DNA bọc ngoài tiếp cận với bộ máy di truyền của tế bào

Hạt tungsten hoặc vàng có đường kính 1 -1,5 μm được

dùng làm vi đạn Vi đạn được trộn với DNA theo 1 tỉ lệ thích hợp cùng với các chất phụ gia và sau khi kết tủa bao quanh vi đạn, hỗn hợp được làm khô trên một đĩa kim loại mỏng kích thước 0,5 - 0,8 cm Đĩa kim loại sẽ được gắn vào đầu một viên đạn lớn vừa khít với nòng súng bắn gen Khi bắn áp suất hơi đẩy viên đạn lớn đi với tốc độ cao xuyên vào tế bào Một tỷ lệ DNA ngoại lai hội nhập với DNA tế bào và biểu hiện, thực hiện quá trình biến nạp gen

Page  29

s

Sơ đồ súng bắn gen

Page  30

Sơ đồ nguyên lý hoạt động của súng bắn gen

Page  31

Thao tác chuyển gen bằng phương thức dội bom

Ưu điểm

Có thể chuyển gene vào nhiều loại tế bào

và mô.

Bắn một lần được nhiều tế bào.

Quá trình chuyển gen nhanh, thao tác đơn

giản.

Các vector mang gene tái tổ hợp đơn giản

và chỉ cần một lượng vector nhỏ.

Nhược điểm

- Đòi hỏi thiết bị đắt tiền (không phải

phòng thí nghiệm nào cũng có thể đầu tư).

- Có thể gây ra sự xáo trộn trật tự của

đối tượng chuyển gen.

- Tần số biến nạp ổn định thấp.

vách tế bào tạo protoplast protoplast Protoplast có thể được duy trì

trong môi trường được nuôi cấy như các tế bào sinh trưởng một cách độc lập hoặc với môi trường đặc hiệu, vách tế bào có thể được tạo thành và toàn bộ các cây có thể được tái sinh từ tế bào này Quá trình chuyển gen này được thực hiện một cách trực tiếp bằng một cơ chế vật lý đơn giản,

đơn giản, không cần có vector không cần có vector Phương pháp chuyển gen này rất có hiệu quả, đặc biệt đối

với những loài thực vật mà phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium không thể thực hiện được.Tuy nhiên việc tạo protoplast không đơn giản, tốn nhiều công sức, bị ảnh hưởng của nhiều yếu tố môi trường Với phương pháp các nhà khoa học đã thành công vào một số cây một lá mầm như loài lúa phụ Japonica (Datta,1990), ngô (Doon, 1990), lúa mì (Vassil, 1992)

Ưu điểm

- Hiệu quả chuyển gen

cao, ổn định nếu quá trình biến nạp thành công.

- Không đỏi hỏi thiết bị đắt

tiền.

- Tần số chuyển gene rất thấp do không kiểm soát

được quá trình chuyển gene.

- Dễ xảy ra hiện tượng dung hợp TB trần, gây khó

khăn trong việc phân tích biểu hiện gene.

- Tái sinh tế bào trần sau chuyển gene khó khăn.

Nhược điểm

Page  36

Kỹ thuật xung điện

Kỹ thuật xung điện (electroporation) là một phương Kỹ thuật xung điện (electroporation)

pháp cơ học được sử dụng để đưa các phân tử phân cực vào trong tế bào chủ qua màng tế bào Trong phương pháp này một xung điện cao thế trong từng khoảng khắc (vài phần nghìn dây) có khả năng làm rối loạn cấu trúc màng kép phospholipid, tạo ra các lỗ thủng tạm thời cho phép các phân tử DNA ngoại lai từ môi trường xâm nhập vào bên trong tế bào

Kỹ thuật xung điện Kỹ thuật xung điện dựa trên trạng thái tương đối yếu của

các tương tác kỵ nước của phospholipid kép phospholipid kép và khả năng

tự động tập hợp lại của nó sau khi bị rối loạn (Purves,2001) Vì vậy, một xung điện chớp nhoáng có thể

gây rối loạn ở các vị trí của màng một cách tạm thời tạm thời, làm cho các phân tử phân cực có thể đi qua, nhưng sau đó màng có thể đóng lại một cách nhanh chóng và tế bào không bị ảnh hưởng gì cả

Page  37

Các tế bào chủ và DNA ngoại lai được tạo thành dịch

huyền phù và cho vào trong một cuvette nhựa có điện cực

Để tạo ra xung điện cao thế trong một thời gian ngắn

người ta sử dụng một thiết bị gọi là máy xung gen

Máy xung điện Sơ đồ bố trí mạch điện

Khi công tắc thứ nhất đóng, tụ điện nạp điện vào và tích

một điện áp cao Khi công tắc thứ hai đóng, điện áp này phóng qua dịch huyền phù tế bào Một xung điện kỹ thuật cần thiết cho kỹ thuật này là khoảng 10000 -

100000 v/cm (thay đổi tùy theo kích thước của tế bào) trong vài phần triệu giây đến một phần ngàn giây Xung điện này làm rối loạn phospholipid kép của màng tế bào

và tạo ra các lỗ tạm thời Khả năng điện của tế bào lúc tăng cùng lúc tăng lên 0,5 - 1v Vì vậy các phân tử đã được nạp điện này đi qua màng tế bào thông qua các lỗ bằng cách thức như điện di

Kỹ thuật xung điện

Sơ đồ plasmid chứa DNA ngoại lai đi qua các lỗ tạm thời

trên màng tế bào chất

Ưu điểm

- Ph ng pháp này có th th c hi n v i các mô in vivo ươ ể ự ệ ớ

còn nguyên v n ẹ

- Ðo n DNA ngo i lai đ c bi n n p có kích th c l n ạ ạ ượ ế ạ ướ ớ

- Ðo n DNA ngo i lai đ c bi n n p có kích th c l n ạ ạ ượ ế ạ ướ ớ

Triển vọng, hướng nghiên cứu và

một số thành tựu bước đầu

Hướng nghiên cứu chính

• Cây trồng chuyển gen kháng các nấm gây bệnh

Nấm bệnh là tác nhân gây hại cho cây trồng rất nặng, nhất là các nước nhiệt đới có độ ẩm cao Các enzyme làm thoái hóa các thành phần chính của vỏ tế bào nấm chitin và β- 1,3 glucan là loại đang được chú ý Sự biểu hiện đồng thời của cả hai gen chitinase và glucanase làm cho cây có tính kháng nấm cao hơn một gen độc lập.

Protein ức chế ribosome (ribosomal inhibition protein - RIP) cũng biểu hiện tính kháng nấm của cây tốt 1

Hướng nghiên cứu chính

• Cây trồng chuyển gen kháng các vi khuẩn gây bệnh

Đối với bệnh vi khuẩn, hướng nghiên cứu tạo giống mới bằng

công nghệ gen chỉ mới bắt đầu.Về cơ bản có 3 hướng :

 Gen mã hóa α- thionin - cystein được chuyển giao sang cây

thuốc lá cũng phòng ngừa được vi khuẩn Pseudomonas syringae

 Chuyển gen sản xuất protein làm giảm độc tố của vi khuẩn

là hướng có nhiều hứa hẹn

2