THÀNH PHẦN hóa học cây lưỡi rắn

Hedyotis corymbosa (L.) Lamk có tên thường gọi là lưỡi rắn, thuộc họ cà phê (Rubiaceae). Cây Lưỡi rắn có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, được sử dụng rộng rãi và phổ biến ở Việt Nam, Trung Quốc và Ấn Độ để chữa các bệnh truyền nhiễm do virut, ung thư, viêm gan, chữa rắn cắn, sốt cao, đau nhức xương khớp, thấp khớp. Như đã biết, tác dụng chữa bệnh của dược liệu được quy định bởi hoạt tính sinh dược học của các hợp chất hóa học có chứa trong cây, với mong muốn góp phần tìm hiểu về cây lưỡi rắn, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu hóa thực vật cây lưỡi rắn (Hedyotis corymbosa ( L.) Lamk)”.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Hà Nội – 2014

Cán bộ hướng dẫn: PGS TS Nguyễn Văn Đậu Th.S Trần Thanh Hà

khoa học tự nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội, người đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này.

Em xin chân thành cảm ơn Thạc sĩ Trần Thanh Hà – Khoa Hóa Thực Vật- Viện Dược liệu Việt Nam, người đã luôn giúp đỡ tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất giúp em hoàn thành khóa luận này.

Em cũng xin chân thành cảm ơn các anh chị trong khoa Hóa Thực Vật- Viện Dược liệu Việt Nam đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khóa luận này.

Đồng thời, em cũng xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn tới tất cả các thầy

cô giáo của khoa hoá học đã mang đến cho em nguồn kiến thức trong thời gian

em học tập tại khoa.

Hà Nội, tháng 6 năm 2014

Sinh viên

Nguyễn Thị Bích Ngọc

Các phương pháp sắc kí:

CC: Sắc kí cột (Column Chromatography)

TLC: Sắc kí lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)

Các phương pháp phổ:

IR: Phổ hồng ngoại (Infrared Spectrometry)

MS: Phổ khối lượng (Mass Spectrometry)

1H-NMR: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

13C-NMR: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13

Các dung môi:

EtOAc: Etyl axetat

MeOH: Metanol

MỞ ĐẦU

Việt Nam có thảm thực vật vô cùng phong phú với hơn 12.000 loài bao gồm 2.500 chi và 300 họ, trong đó các loài được sử dụng làm thuốc chiếm khoảng 26-30% Từ các chất có hoạt sinh học có nguồn gốc thiên nhiên, người ta tìm cách biến đổi cấu trúc hóa học của chúng thành các chất có hoạt tính sinh học mới cao hơn,

ưu việt hơn những loại thuốc sản xuất hoàn toàn bằng con đường tổng hợp Vì vậy, việc nghiên cứu các hợp chất tự nhiên rất quan trọng trong đánh giá tài nguyên thiên nhiên nhằm sử dụng chúng một cách có hiệu quả

Hedyotis corymbosa (L.) Lamk có tên thường gọi là lưỡi rắn, thuộc họ cà

phê (Rubiaceae) Cây Lưỡi rắn có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, được sử dụng rộng rãi và phổ biến ở Việt Nam, Trung Quốc và Ấn Độ để chữa các bệnh truyền nhiễm

do virut, ung thư, viêm gan, chữa rắn cắn, sốt cao, đau nhức xương khớp, thấp khớp Như đã biết, tác dụng chữa bệnh của dược liệu được quy định bởi hoạt tính sinh dược học của các hợp chất hóa học có chứa trong cây, với mong muốn góp phần tìm hiểu về cây lưỡi rắn, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu hóa thực

vật cây lưỡi rắn (Hedyotis corymbosa ( L.) Lamk)”

Khóa luận gồm những nội dung sau:

1. Tách chiết và khảo sát sự có mặt của các lớp chất có trong cây lưỡi rắn (Hedyotis

corymbosa (L.) Lamk)

2. Phân tách các phần chiết và phân lập một số thành phần chính

3. Sử dụng các phương pháp vật lý hiện đại để xác định cấu trúc phân tử của các chất

có hoạt tính sinh học đã phân lập được

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. THỰC VẬT HỌC

1.1.1. Họ cà phê (Rubiaceae) [1, 10]

Họ Cà phê, danh pháp khoa học: Rubiaceae Juss., là một họ thực vật có hoa

trong bộ Long đởm (Gentianales)

Các loài thuộc họ Rubiaceae là loại cây gỗ, cây bụi hoặc nửa bụi, đôi khi là cây thân thảo hay dây leo Lá mọc đối, luôn có lá kèm với nhiều hình dạng khác nhau Hoa thường tập hợp thành cụm hình xim, đôi khi hình đầu, mẫu 5 hoặc 4 Đài

và tràng đều hợp, tràng có tiền khai hoa thường vặn, đôi khi van hay lợp Trong một vài trường hợp số thùy của tràng có thể lên tới 8-10 Số nhị thường bằng với số thùy tràng và nằm xen kẽ giữa các thùy, dính vào ống tràng hoặc họng tràng Bộ nhụy gồm hai lá noãn dính nhau thành bầu dưới, hai buồng Một vòi nhụy mảnh, đầu nhụy hình đầu hay chia hai Mỗi buồng của bầu chứa một đến nhiều noãn đảo hay thẳng Quả mọng, hạch hay quả khô (quả mở hoặc quả phân thành những hạch nhỏ) Hạt thường có phôi thẳng có nội nhũ hoặc đôi khi không có

Trên thế giới, họ Cà phê (Rubiaceae) là một trong năm họ có nhiều loài nhất trong nhóm thực vật có hoa, với khoảng 13.000 loài 5[10], được phân bố trong 620 chi và được chia làm 3 phân họ: Cinchonoideae, Ixoroideae, Rubioideae Chúng được tìm thấy ở tất cả các lục địa, kể cả nam cực, với một vài loài của chi Coprosma, Galium, và Sherardia (Goevarts et all 2006); nhưng phần lớn phân bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới

Một vài chi phân bố rộng rãi trong vùng ôn đới Chúng phân bố ở nhiều kiểu môi trường sống khác nhau Tính đa dạng trong họ này là rất lớn, với các kiểu dạng sống khác nhau (từ các dạng cây bụi, cây thân thảo nhỏ đến cây gỗ lớn), nhiều kiểu hoa thích nghi với các kiểu thụ phấn khác nhau, các dạng quả khác nhau với nhiều loại cơ chế phát tán

Ở Việt Nam, theo các tài liệu đã công bố mới nhất về họ Cà phê (Rubiaceae) cho thấy, họ này có khoảng 93 chi và 450 loài, phân bố rộng khắp cả nước.[1]

1.1.2. Chi Hedyotis L..[12, 23]

Chi Hedyotis L. gồm khoảng 500- 600 loài, là những cây thân thảo, thuộc họ

Cà Phê (Rubiaceae) Chúng thường mọc ở vùng đất cát, dọc theo bờ sông và các

vùng duyên hải.Chi Hedyotis chủ yếu mọc ở những vùng có khí hậu nhiệt đới và ấm

áp Chúng thường là cây thân thảo, hơi vuông, cao từ 30-85 cm Lá nhỏ, phiến lá hẹp, có gân giữa, gân phụ không nổi rõ Hoa màu trắng hay vàng, mọc thành từng

cụm ở nách lá hay đỉnh nhánh Có khoảng 70 loài thuộc chi Hedyotis ở Việt Nam.[12, 22]

1.1.3. Cây Lưỡi rắn (Hedyotis corymbosa L.).[1,4,6,36]

Cây Lưỡi rắn có tên gọi khác là đơn dòng, xương cá, nọc sởi, vương thái tô, mai hồng, xà thiệt thảo.[1,4,6]

Tên khoa học: Hedyotis corymbosa L., Oldenlandia corymbosa L.; thuộc

Giới Plantae; Ngành Magnoliophyta; Lớp Magnoliopsida; Bộ Gentianales; Họ

Rubiaceae; Chi Hedyotis L

Cây Lưỡi răn là cây thân thảo nhỏ, sống hàng năm, cao 20-30cm, cành nhiều Thân nhẵn, hơi vuông, mềm yếu, mọc thẳng hay bò, khi non màu lục, sau màu xám gốc Lá mọc đối, hình mác hẹp, dài 1-3cm, rộng 2mm gốc thuôn, đầu nhọn, mặt trên xanh sẫm, mặt dưới nhạt, mép nguyên, chỉ gân rõ, cuống rất ngắn hoặc không

có cuống; lá kèm nhỏ, chia thùy ở đầu Cụm hoa mọc ở kẽ lá thành xim, gồm 2-5 hoa (thường là 3), màu trắng hoặc hơi hồng; đài 4 răng nhọn; tràng cánh hợp thành ống hình trụ ; nhị 4 đính ở họng tràng; bầu hạ 2 ô Quả nang, hình bán cầu, có đài tồn tại; hạt nhiều, hình tam giác.[35] Mùa hoa quả : tháng 5-6, đôi khi quanh năm

Cỏ lưỡi rắn hoa trắng còn có tên bạch hoa xà thiệt thảo Tên khoa học:

Hedyotis diffusa Willd. Bạch hoa xà thiệt thảo thuộc họ Cà Phê (Rubiaceae)[6] Lưỡi

rắn và bạch hoa xà thiệt thảo tương đối giống nhau Nhưng có điểm khác biệt là bạch hoa xà thiệt thảo ít phân cành hơn Lá mọc đối, gốc và đầu lá nhọn, dài 1-3,5cm, rộng 1-3mm Hoa mọc đơn độc hoặc đôi ở kẽ lá, hoa màu trắng, cuống hoa ngắn Do đó cần phân biệt rõ để tránh nhầm lẫn

Hình 1: Cây lưỡi rắn ( Hedyotis corymbosa L.)

Hình 2: Cây bạch hoa xà thiệt thảo (Hedyotis diffusa Willd.)

Trong số khoảng 60 loài thuộc chi Hedyotis L. ở Việt Nam, Lưỡi rắn thuộc

nhóm những loài cây có kích thước nhỏ, phân bố tương đối phổ biến ở vùng đồng bằng, trung du và miền núi thấp Trên thế giơi vùng phân bố của cây cũng bao gồm hầu hết các nước trong khu vực nhiệt đới ở Nam Á và Đông Nam Á như Ấn Độ, Xrilanca, Malaysia, Thái Lan, Indonesia, Campuchia, Lào và đảo Hải Nam Trung Quốc Ngoài ra cây còn có ở châu Phi.[36]

Lưỡi rắn là loại cây ưa sáng và ưa ẩm, thường mọc thành đám, đôi khi thuần loại trên các bãi hoang, ruộng cao, nương rẫy Cây có thể sống được trên nhiều loại đất, sinh trưởng phát triển nhanh trong hè – thu và tàn lụi trước mùa đông Cây ra hoa quả nhiều, khi già quả tự mở để hạt phát tán ra xung quanh Do đó, trong tự nhiên lưỡi rắn thường mọc tương đối tập trung.[6]

Cây Lưỡi rắn được thu hái quanh năm, nhưng tốt nhất vào mùa hè, mùa thu, lúc cây có hoa, phơi khô hay sao vàng.[6]

1.2. ỨNG DỤNG

1.2.1. Tác dụng chữa bệnh.[2,6,14,28]

Cây Lưỡi rắn có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, được sử dụng rộng rãi và phổ biến ở Việt Nam, Trung Quốc và Ấn Độ để chữa các bệnh truyền nhiễm do

virut, ung thư, viêm gan, chữa rắn cắn, sốt cao, đau nhức xương khớp, thấp khớp Theo kết quả nghiên cứu của J M Sasikumar và cộng sự, dịch chiết từ cây Lưỡi rắn có tác dụng chống lại các gốc tự do – là nguyên nhân gây ra nhiều bệnh mạn tính như ung thư, tiểu đường, xơ vữa động mạch, viêm khớp Lưỡi rắn chứa các hoạt chất (axit oleanolic, axit ursolic) đã được chứng minh có tác dụng ức chế sự phát triển của khối u, tăng cường miễn dịch, hỗ trợ hệ thống tạo máu ở lách, hồi phục mô tổn thương sau quá trình xạ trị.[6,14,28]

Toàn cây có tác dụng thanh nhiệt, giải độc; axit geniposidic trong cây có tác dụng tẩy xổ.[6]

Theo kinh nghiệm dân gian, cây được dùng tươi để giải độc, chữa rắn cắn rất

có hiệu quả Ngoài tác dụng chữa rắn cắn, cây còn chữa sốt cao, sốt cách nhiệt, đau nhức xương, thấp khớp Ở Đài Loan, cây cũng được dùng làm thuốc hạ sốt Ở Philipines, dùng làm thuốc kiện vị, bổ thần kinh và chữa đau răng Ở Malaysia, cây được giã nát, đắp ngoài để là lành vết thương Ở Trung Quốc và Ấn Độ, cây được dùng như một vị thuốc cổ truyền để chữa các rối loạn về gan, đau lá lách và sưng gan, vàng da Các nghiên cứu gần đây cho thấy Hedyotis corymbosa có tác dụng bảo vệ gan chống lại sự ngộ độc paracetamol Ngoài ra, cây còn chữa sốt rét, ung thư ruột, bỏng, đầy hơi, tiêu chảy, kiết lị; rễ trị đau dạ dày.[2,6]

Ở châu Phi, người ta sử dụng nhựa để điều trị chướng cổ, sưng và được dùng như thuốc giảm đau; còn rễ được sử dụng như chất kích thích bộ phận sinh dục, chống trầm cảm.[2,26]

1.2.2 Một số bài thuốc từ cây lưỡi rắn.[6]

1.2.2.1 Chữa rắn cắn.

Khi bị rắn độc cắn, lập tức đặt garô phía trên vết rắn cắn cho nọc độc khỏi lan nhanh vào tuần hoàn của cơ thể, tiếp đó lấy một sợi tóc căng thẳng gạt đi gạt lại trên bề mặt vết thương để làm bật những răng phụ của rắn còn cắm trong da, nặn cho máu chảy ra Sau đó lấy 100 g cây tươi rửa sạch, giã nát, vắt lấy nước cốt cho uống, dùng bã đắp lên vết thương, băng lại, khi uống thuốc nên cởi dây garô Ngày uống 2-3 lần Những lần sau tăng liều lượng lên 200 g Sau khi uống thuốc, người

bị nạn thấy đỡ đau nhức, ngủ được.[6]

1.2.2.2 Chữa sốt rét.

Cây lưỡi rắn, thường sơn, mã tiền thảo, mỗi vị 6g sắc nước uống.[6]

1.3. THÀNH PHẦN HÓA HỌC [1,5-7,13,16,20,21,24,25,27,31,33]

Qua nghiên cứu hóa thực vật, phần chiết metanol của cây Hedyotis

corymbosa L., người ta phát hiện được một số lớp chất có trong cây như: flavonoit,

axit phenolic, anthocyanin, quinon, ankaloit, tannin, saponin và iridoit.[27]

1.3.1 Irioit glycosit.

Một số irioit glycosit được phân lập tử Hedyotis corymbosa L. được tổng kết

sau đây: Geniposide, deacetylasperulosid, asperulosid, axit asperulosidic, benzoyldeacetyl asperulosidic methyl este, axit deacetyl asperulosidic, scandosid methyl este, 10- o- benzoyl scandosid methyl este, 10- o- p- hydroxybenzoyl scandosid methyl este, 10- o- p- coumaroyl scandosid methyl este.[6,21,24,25]

CH 2 OH

OH OH OH

OH

O C

H 3 C O

Asperulosid

O COOH

CH 2

H

H

O O

CH2OH

OH OH OH

OH H

O C

H 3 C O

axit asperulosidic

O COOCH3

OH

OH H

O Bz

10- O- Benzoyldeacetyl asperulosidic methyl este

O COOH

CH2

H

H

O O

CH2OH

OH OH OH

OH H

HO

axit deacetyl asperulosidic

O COOH

CH2

H

H

O O

CH2OH

OH OH OH

H HO

HO

scandosid methyl este

O COOCH 3

CH2

H

H

O O

CH2OH

OH OH OH

H HO

O C O

10- o- benzoyl scandosid

methyl este

O COOCH3

OH

H HO

O C O HO

10- o- p- hydroxybenzoyl scandosid methyl este

O COOCH3

CH 2

H

H

O O

CH2OH

OH OH OH

H HO

O C O C C HO

tự tổng hợp được phenol Flavonoit tham gia vào tất cả các quá trình trao đổi chất, sinh tổng hợp và quá trình enzym Về mặt cấu tạo, flavonoit là các polyphenol có tính axit, đính nhóm hydroxy tự do ở các vòng.[7]

Trong thực vật, flavonoit tồn tại chủ yếu ở hai dạng: dạng tự do (aglycol) và dạng liên kết với glucid (glycozit) Trong đó, dạng aglycol thường tan trong các dung môi hữu cơ như ete, axeton, cồn nhưng hầu như không tan trong nước, còn dạng glycozit thì tan trong nước nhưng không tan trong các dung môi không phân cực như axeton, benzen, cloroform. [7]

Hoạt tính sinh học của flavonoit: Có tác dụng với khối u và một số dạng ung thư như enpatin (3,5,3'-trihydroxy-6,7,4'-trimetoxyflavon), enpatoretin (3,3'-dihydroxy -5,6,7,4'-tetrametoxyflavon) Nâng cao tính bền của thành mạch máu như rutin Có tác dụng estrogen như glycozit quecrcetin và kaempferol- 3-3-ramnogalacto-7-ramnorid. [7]

Flavonoit có hoạt chất chống oxy hóa Một số hoạt độ tính của flavonoit bao gồm: chống dị ứng, chống ung thư, chất chống oxy hóa, chống viêm và chống virus, chống dị ứng, chống co giật… Các flavonoit quercetin được biết đến với khả năng của nó để làm giảm sốt, eszema, viêm xoang và bệnh suyễn Đặc biệt, flavonoit còn

có hoạt tính vitamin P, làm bền những mao mạch và giảm tính giòn của thành mạch

Do khả năng ức chế quá trình oxy hoá nên chúng có hiệu ứng chống u lành tính và u

ác tính Các flavonoit còn được ứng dụng rộng rãi để điều trị các bệnh nhiễm trùng như chống viêm loét dạ dày, viêm mật cấp tính và mãn tính, viêm gan, thận, thương hàn, lị [7]

Từ cây Hedyotis corymbosa, các nhà khoa học đã phân lập đc: Quercetin;

3’-Methoxy quercetin; 3’, 4’-Dimethoxy quercetin; rutin; Cyanidin; pelargonidin.[21]

OH O OH

OH OCH 3

OH O OH

Một số triterpenoit phân lập được từ Hedyotis corymbosa bao gồm: axit

oleanolic, axit ursolic Axit ursolic có tác dụng ức chế cyclooxygenase- 2 và cyclooxygenase- 1 là các enzym xúc tác sinh tổng hợp prostaglandin (in vitro) Axit ursolic và axit oleanolic có tác dụng bảo vệ gan, chống ung thư, hạ mỡ máu

Axit ursolic có tác dụng sinh học: lợi tiểu, chống ung thư, chống viêm loét

và xơ hoá, ức chế hoạt động của virus HIV, ức chế protein kinase C, kìm hãm HIV-1 protease.[33]

Axit oleanolic có tác dụng sinh học: chống viêm khớp, chống độc, chống rối loạn gan và tăng cường hệ miễn dịch của cơ thể Gần đây, hoạt tính kháng HIV được phát hiện do khả năng ngăn cản quá trình sao mã của virus HIV-1 ở tế bào H9

1.3.4 Axit phenolic.

Từ cây Hedyotis corymbosa người ta đã phân lập được: Gallic axit; Vanillic

axit; Syringic axit; p- Hydroxy benzoic axit; p-Coumaric axit; ferulic axit; gentisic axit; caffeic axit.[20]

Vanillic axit

p- Hydroxy benzoic axit

Gentisic axit Caffeic axit

1.3.5 Steroit

Steroit là những hợp chất thiên nhiên có bộ khung cacbon stenan gồm bốn vòng ngưng tụ với nhau, chứa các mạch bên và các nhóm chức khác nhau như: -CO, -CHO, -COOH, -OH Steroit tồn tại trong động, thực vật dưới dạng glycozit hoặc liên kết với các cacbon axit amin. [7]

Các steroit tham gia vào các quá trình sinh học trong cơ thể sống Cho đến nay, người ta đã biết đến hàng chục nghìn steroid và trong số đó có hàng trăm chất được sử dụng trong y học. [7]

Một số steroit đã được phân lập từ Hedyotis corymbosa: β- sitosterol;

stigmasterol, ɣ- sitosterol

Năm 1964, từ các bộ phận trên mặt đất cây Hedyotis corymbosa mọc ở Hong

Kong, W H Hui và C N Lam đã cô lập được stigmasterol, ɣ- sitosterol.[13]

Năm 2000, từ cây Hedyotis corymbosa thu hái ở Mỹ Tho (Việt Nam), Tôn

Nữ Liên Hương cũng đã cô lập được stigmasterol ( hiệu suất trên cây khô 0.01%), β- stitosterol (hiệu suất trên cây khô 0.09%).[5]

Anthraquinon còn có tác dụng phòng ngừa sỏi niệu vì nó có thể kết hợp các ion canxi trong nước tiểu thành hợp chất tan và được thải ra ngoài. [7]

Anthraquinon glycozit được sử dụng làm thuốc nhuận tràng do chất này được các vi khuẩn đường ruột chuyển thành aglycon

Năm 2001, từ cây Hedyotis corymbosa thu hái ở Từ Liêm ( Hà Nội), Lại

Kim Dung và các cộng sự đã phân lập được methoxyanthraquinone.[3]

3-hydroxy-2-formyl-1-methoxyanthraquinone

1.3.7 Cacbohydrat.

Tại Trung Quốc, từ dịch chiết nước của Hedyotis corymbosa L., người ta đã

tìm thấy một số polysaccharit như rhamnozơ, arabinozơ, zylozơ, mannozơ, galactozơ và glucozơ.[16,31]

1.3.8 Ancaloit

Từ phần trên mặt đất của cây Hedyotis corymbosa L., người ta phân tách

được 0.12% ancaloit là bifloron (kết tinh dạng bột màu vàng) và biflorin (protopin) (kết tinh dạng bột màu trắng); hai ancaloit này có thể chuyển hóa qua nhau.[31]

Biflorin

1.4. TÁC DỤNG DƯỢC LÝ.[9,14,17-20,24,28,30,31,33-35,37]

1.4.1. Tác dụng chống sốt rét.

Hedyotis corymbosa L đã được sử dụng trong thời cổ đại như một thuốc

chống sốt rét Những nghiên cứu về khả năng chống sốt rét của nó dựa trên độ nhạy

chloroquine (MRC- pf- 20) và xu hướng đề kháng của cây Plasmodium falciparum

Họ đã phát hiện ra rằng dịch chiết metanol có thể ngăn chặn sinh vật ký sinh ở IC50

là 10.8 mg/ml Khi được kết hợp với các dịch chiết của Andrographis paniculata, sẽ

tăng cường khả năng kháng sốt rét Tác dụng được đẩy mạnh hơn khi dùng thêm curcumin.[18,31]

1.4.2. Tác dụng chống oxi hóa.

Tháng 2 năm 2010, ở Ấn Độ, Dịch chiết metanol của phần trên không cây

Hedyotis corymbosa L được sàng lọc cho các hoạt đông chống oxi hóa bằng việc

sử dụng thí nghiệm làm giảm cường độ huỳnh quang chất DPPH, thí nghiệm làm phai màu cation ABTS, khả năng loại bỏ các gốc tự do OH và tác dụng ngăn cản gốc tự do NO sử dụng quá trình thí nghiệm đã được tạo ra Tổng lượng hợp chất phenol và flavonoit cũng được xác định Cây cho 210 mg axit galic tương ứng trong 100g lượng chất Phenols và 55 mg quercetin tương ứng trong 100g lượng flavonoit Dịch chiết đã cho thấy tác dụng chống gốc tự do đối với DPPH, ABTS, NO và OH với các giá trị EC50 là 82, 150, 130 và 170 ug/ ml FRP tăng cùng với sự tăng nồng

độ của mẫu Tác dụng chống gốc tự do của dịch chiết được so sánh với BHT chuẩn

Sự tương quan cao giữa tổng lượng chất phenol/ flavonoit với khả năng loại bỏ các chất phản ứng với oxy khác nhau đã chỉ ra rằng các polyphenol như là các chất chống oxy hóa chính.[28,31]

Tại Trung Quốc, Lin và các cộng sự đã nghiên cứu các tác động bảo vệ gan

của các thành phần dược liệu được gọi là peh-hue-juwa-chin-cao , mà Hedyotis

corymbosa là một phần của nó Họ phát hiện ra rằng cả 3 loài cây (Hedyotis diffusa, Hedyotis corymbosa và Mollugo pentaphylla) đều làm giảm đáng kể sự tăng lên của

nồng độ enzym chuyển hóa pyruvate glutamate trong huyết thanh (SGOT), enzym chuyển hóa oxalate gluatmate trong huyết thanh (SGPT) và làm giảm những tổn hại cho gan trong vòng 24 giờ sau khi độc tố gây tổn hại cho gan vào trong bụng.[19,20,24]

Một nghiên cứu về các tác động bảo vệ gan của dịch chiết metanol của toàn

bộ cây Hedyotis corymbosa đã phát hiện ra rằng cây có khả năng bảo vệ gan tốt khi

nó làm giảm hoạt động các enzym huyết thanh, SGPT, SGOT, SAKP, bilirubin huyết thanh và một cấu trúc mô thông thường của chuột được điều trị sau khi cho dùng quá liều paracetamol.[19,20]

1.4.3. Tác dụng chống viêm

Hedyotis corymbosa L được sử dụng trong việc chữa trị các chứng viêm khác nhau bao gồm cả dạng nhiễm trùng hoặc không nhiễm trùng Một nghiên cứu trên tác dụng kháng viêm của cây này đã được thực hiện và nó đã chứng minh rằng dịch chiết ngăn chặn được bệnh phù nề bàn tay do tảo.[37]

Peh-Hue-Juwa-Chi-Cao (PHJCC) là tên thương mại thông thường dùng cho dịch chiết của cây HD, HC hoặc MP Những nghiên cứu gần đây được thực hiện để xem xét tác dụng chống viêm và bảo vệ gan của 3 dịch chiết trên ở chuột Các kết quả chỉ ra rằng, các dịch chiết của HC, HD và MP có tác dụng chống viêm.[14,31]

1.4.4. Hoạt tính chống ung thư

Nghiên cứu tác dụng chống ung thư của dịch chiết etanol của Lá cây

Parthenium hysterophorus Linn (PHL) và Oldenlandia corymbosa Lam (OCL) bằng phương pháp xét nghiệm SRB trên dòng tế bào ung thư bạch cầu ở người K562 tại Trung tâm Cao Cấp về Nghiên cứu chữa trị và giáo dục ung thư , Mumbai,

Ấn Độ.[17]

Kết quả cho thấy PHL và OCL có tác dụng chống ung thư đáng kể lên dòng

tế bào ung thư bạch cầu ở người K562 Dòng tế bào được phát triển trong môi trường RPMI 1640 chứa 10% huyết thanh thai bò và 2 Mml glutamin sử dụng phương pháp xét nghiệm SRB và ghi bằng máy Elisa tại bước sóng 540 nm và 690

Người ta đã tiến hành nghiên cứu hoạt động chống loét của Oldenlandia

corymbosa (L) từ dịch chiết cồn và dung dịch nước Các kiểm tra hóa thực vật sơ

bộ đã được thực hiện và các giá trị LD50 cho cả dịch chiết rượu và nước đã được xác định Các hoạt động chống loét của cồn (200 mg / kg p.o) và dung dịch nước (400 mg / kg p.o) được đánh giá trong Aspirin gây ra loét dạ dày.[30]

1.4.6. Tác dụng giảm đau.

Tiến hành nghiên cứu hoạt động giảm đau của Hedyotis corymbosa L từ

dịch chiết etanol trên chuột sử dụng ba mô hình khác nhau: kiểm tra tấm nóng (một thử nghiệm hoạt tính đau ở động vật), thử nghiệm gây đau quoằn quoại do axit acetic, thử nghiệm gây đau bởi formalin sử dụng ketorolac làm thuốc tiêu chuẩn Cho chuột uống 250 và 500 mg/ kg dịch chiết etanol Kết quả cho thấy, Dịch chiết etanol 250 và 500 mg/ kg có tác dụng giảm đau nhưng với 500mg/ kg có tác dụng đáng kể hơn.[35]

1.4.7. Khả năng kháng nấm.

Toàn bộ cây có khả năng chống lại hoạt động của Candida albicans và

Aspergillus nigar Hoạt động kháng nấm tối đa đã được tìm thấy trong Candida albicans Các hoạt động chống nấm là do sự có mặt của các thành phần như steroit

và glycozit.[9,33]

1.4.8. Tác dụng kháng khuẩn

Dịch chiết metanol từ Hedyotis corymbosa L được đánh giá hoạt tính kháng

khuẩn bằng phương pháp khuếch tán đĩa với gram dương và gram vi khuẩn tích cực

(Bacillus, Klebisella, Escherichia coli, Proteus, Staphylococcus aureus và

Pseudomonas) Các dịch chiết thực vật quan sát được ức chế sự tăng trưởng của cả

gram dương và gram âm đáng kể và có phổ rộng hoạt động chống vi khuẩn Thứ tự

của sự ức chế đã được tìm thấy là Proteus (22mm) < Pseudomonas (26mm) <

Bacillus (27mm) < Staphylococcus aureus (28mm) < Escherichia coli (32mm) < Klebsiella (33mm) [9,33]

1.4.9. Tác dụng gây co tử cung.

Chiết xuất etanol của Hedyotis corymbosa cho thấy ảnh hưởng đáng kể co

tử cung, quan sát thấy trong việc thử nghiệm trên tử cung riêng biệt của chuột cái Sprague Dawley Các dịch chiết được kiểm tra nồng độ khác nhau 0.014, 0.14, 0.44

và 1,40 mg / ml; được so sánh so với acetylcholine làm tiêu chuẩn và khi thiếu

etanol Nghiên cứu này cho thấy Hedyotis corymbosa có khả năng gây co tử cung

đáng kể [34]

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM

2.1 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.

Để phân tích và phân tách các phần chiết của cây đã sử dụng các phương pháp:

Sắc kí lớp mỏng (TLC): Thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel Merck

60 dày 0,25 mm trên nền nhôm Thuốc thử hiện màu là dung dịch vanilin/ H2SO4

1% và đèn tử ngoại bước sóng 265 nm và 354 nm

Sắc kí cột (CC): Sắc kí cột đựoc thực hiện dưới trọng lực của dung môi

Chất hấp phụ cho sắc kí cột là silica gel (cỡ hạt 63-100 μm), được nhồi theo phương pháp nhồi ướt

Kết tinh phân đoạn được sử dụng trong việc tinh chế các chất.

Cấu trúc của các hợp chất được khảo sát nhờ sự kết hợp các phương pháp phổ:

Phổ hồng ngoại (IR) được ghi trên máy Impac 410-Nicolet FT- IR.

Phổ khối lượng (EI-MS, 70eV) ghi trên máy Hewlett Packard HP 5890,

Serie II

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H-NMR, 13 C-NMR được ghi trên máy

Brucker Avance-500 MHz, chuẩn nội TMS (tetrametyl silan), độ chuyển dịch hoá

học được biểu thị bằng ppm, hằng số J tính theo Hz.

2.2 ĐIỀU CHẾ CÁC PHẦN CHIẾT TỪ CÂY LƯỠI RẮN.

2.2.1 Mẫu thực vật.

Mẫu nghiên cứu là toàn bộ cây Lưỡi rắn ( Hedyotis corymbosa L.), được thu

hái vào tháng 8 năm 2012 tại Bắc Giang Mẫu sau khi lấy được rửa sạch phơi trong bóng râm rồi đem sấy khô ở nhiệt độ 40-50ºC Phần nguyên liệu thu được được đem ngâm chiết với etanol 96%, sau đó được phân bố chọn lọc với các dung môi thích

hợp Các dung môi được dùng là n- hexan, etyl axetat, n- butanol.

2.2.2 Điều chế cặn chiết.

3,0 kg dược liệu khô được ngâm với etanol 96% ở nhiệt độ phòng Sau đó, lọc lấy dịch chiết Dịch chiết được gộp lại, và cất loại etanol ở 60ºC dưới áp suất thấp đến khi còn 300 ml Pha loãng dịch chiết etanol với 300 ml nước cất rồi đem

chiết lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n- hexan, etyl axetat, n- butanol Các dịch chiết n- hexan, etyl axetat, n- butanol được cất loại hết dung môi

ta thu được phần cặn chiết tương ứng

STT Phần chiết Khối lượng (g) Hiệu suất*(%)

Bảng 1: Hiệu suất các phần cặn chiết từ cây Lưỡi rắn

* Tính theo khối lượng mẫu khô ban đầu

2.3 PHÂN TÁCH PHẦN CHIẾT ETYL AXETAT TỪ CÂY LƯỠI RẮN.

Phân tích phần chiết etyl axetat (HCE) bằng TLC:

Dùng capila đưa chất lên bản mỏng tráng sẵn DC Aluflolien 60F254 Merck Sau đó tiến hành khảo sát sắc kí lớp mỏng trong các hệ dung môi sau: Diclometan/ etyl axetat; Diclometan/ metanol ; Diclometan/ axeton và etyl axetat / metanol

Sự phân tách đạt kết quả tốt khi triển khai trong hệ dung môi: etyl axetat/ metanol: 20/1 (v/v)

Bảng 2: Kết quả khảo sát phần chiết etyl axetat bằng TLC.

STT R f AS thường UV 365 UV 254 Vanilin/ H 2 SO 4 Vanilin/ H 2 SO 4 , t o

Phân tách cặn chiết etyl axetat bằng phương pháp sắc kí cột (CC).

Chuẩn bị mẫu: cho 30g silica gel vào một cối sứ Hoà tan 21g cặn etyl axetat trong metanol rồi dùng công tơ hút nhỏ từ từ lên silicagel Đợi cho dung môi bay hơi bớt, ta dùng chày sứ trộn đều cho đến khi silica gel tơi ra Tiếp tục tẩm chất lên silicagel, trộn đều Quá trình được lặp lại cho đến khi tẩm xong chất và silica gel đã khô tơi có màu vàng nâu

Chuẩn bị cột sắc kí:

Cân 100g silica gel (cỡ hạt 63-100 μm), cho vào cốc, đổ dung môi etyl axetat vào, khuấy cho hết bọt khí rồi nhồi vào cột, dùng quả bóp cao su gõ nhẹ cho đến khi trong cột không còn bọt khí, dùng đũa thuỷ tinh dàn đều mặt cột, sau đó đưa hỗn hợp bột tẩm mẫu chất lên cột, cho lên trên một ít bông thuỷ tinh để tránh bị khuếch tán ngược Giải hấp phụ gradien bằng hệ dung môi etyl axetat / metanol, sau khi khảo sát bằng sắc kí lớp mỏng đã thu được 300 ống nghiệm, mỗi ống nghiệm 20 ml

Sau khi khảo sát sắc kí lớp mỏng và gom các ống nghiệm chứa những chất

có giá trị Rf giống nhau đã thu được 8 phân đoạn, kí hiệu từ I đến VIII

Kết hợp xử lý kết tinh và loại màu, từ các phân đoạn I, II, IV và V ta thu được 6 chất ký hiệu là HCE1 màu trắng, HCE1.1 màu trắng, HCE1.2 màu vàng, HCE1.2 màu vàng, HCE2 màu trắng và HCE3 màu trắng

Bảng 3: Kết quả sắc kí cột phần chiết etyl axetat.

Phổ EI-MS, m/z (%): 456 (M+, 4), 248 (100), 203 (79), 133 (45), 119 (20),

69 (24), 55 (28)

Phổ 1 H-NMR (500MHz, CDCl3& CD3OD), δ: 5,26 (1H, t, J = 3,5 Hz, 12); 3,17 (1H, dd, J = 11,5; 5,0 Hz, H-3); 2,85 (1H, dd, J= 14,0; 4,0 Hz, H-18); 1,17

H-(3H, s, CH3-27); 0,98 (3H, s, CH3-23); 0,81 (3H, s, CH3-24); 0,96 (3H, s, CH3-30); 0,94 (3H, s, CH3-29); 0,94 (3H, s, CH3-29); 0,91 (3H, s, CH3-25); 0,78 (3H, s, CH3-26)

Phổ 13 C-NMR (125MHz, CDCl3& CD3OD), δ 39,6 (C-1), 27,6 (C-2), 79,5 (C-3), 37,9 (C-4), 56,5 (C-5), 19,3 (C-6), 33,5 (C-7), 40,3 (C-8), 48,7 (C-9), 37,9 (C-10), 23,8 (C-11), 123,4 (C-12), 144,9 (C-13), 42,7 (C-14), 28,6 (C-15), 24,3 (C-16), 47,4 (C-17), 42,4 (C-18), 46,9 (C-19), 31,4 (C-20), 34,7 (C-21), 33,8 (C-22), 28,6 (C-23), 15,8 (C-24), 16,2 (C-25), 17,6 (C-26), 26,4 (C-27), 181,6 (C-28), 33,5 (C-30), 23,9 (C-29)

Chất HCE1.1:

Chất bột màu trắng, ít tan trong axeton, metanol, cloruaform, kết tinh trong

hệ dung môi CH2Cl2 : MeOH, điểm nóng chảy 296-298oC, trên TLC không hiện

màu dưới UV, Rf = 0.4 hệ dung môi diclometan/ metanol (9/1,v/v), phun dung dịch

Hình 3: TLC của HCE2 thuốc thử vanillin trong H 2 SO 4 - hơ nóng.

Chất HCE3:

Tinh thể hình kim màu trắng, kết tinh lại trong metanol, nhiệt độ nóng chảy

tnc= 188- 1890C , hiện màu tím đậm với thuốc thử vanillin trong H2SO4,hơ nóng; không hiện UV