Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang gen kháng côn trùng để chuyển vào cây trồng

Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang gen kháng côn trùng để chuyển vào cây trồng

MỞ ĐẦU Mức độ gia tăng dân số nhanh chóng đã đẩy toàn nhân loại phải đối mặt với thách thức lớn lao, đó là khắc phục sự đói nghèo. Vấn đề làm sao để tăng sản lượng nông nghiệp, cung cấp lương thực ổn định cho con người luôn là mối quan tâm đặc biệt của nhiều quốc gia trên thế giới. Tình hình lương thực bấp bênh còn khá phổ biến ở nhiều nơi. Bên cạnh những nguyên nhân chính như nông nghiệp chưa được coi trọng đúng mức, đất đai chưa được sử dụng hợp lý, thì sâu bệnh, đặc biệt là côn trùng, là một trong những tác nhân gây thiệt hại chủ yếu cho mùa màng. Theo thống kê của Dean & Adang [65], Oerke & đtg [154], những tổn thất mùa màng nghiêm trọng trên toàn cầu do sâu bệnh gây ra ước tính chiếm từ 35 đến 42% tổng sản lượng nông nghiệp hàng năm, trong đó thiệt hại do côn trùng chiếm từ 13-16%. Mức độ thiệt hại có khi lên tới 70% nếu như cây trồng không được áp dụng các biện pháp bảo vệ. Hiện nay, rất nhiều loại thuốc trừ sâu hoá học đang được sử dụng để phòng trừ sâu bệnh với chi phí tốn kém, gây ô nhiễm môi trường và gây độc hại cho sức khoẻ con người, vật nuôi. Để cải thiện tình hình này, chúng ta cần ứng dụng những kỹ thuật tiên tiến trong bảo vệ cây trồng nhằm xây dựng một nền nông nghiệp sạch, bền vững. Việc tạo ra các giống cây trồng biến đổi di truyền (Genetically Modified Crops, GMOs) có khả năng kháng sâu bệnh và côn trùng nói riêng nhờ kỹ thuật tạo dòng phân tử, kỹ thuật chuyển gen thực vật được quan tâm nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn nhằm nâng cao năng suất cây trồng và đem lại lợi ích tối đa cho nền nông nghiệp. Hơn nữa, các tiến bộ đạt được còn khắc phục được những hạn chế khi sử dụng các biện pháp trừ sâu hoá học cũng như các biện pháp sinh học truyền thống, nâng mức độ an toàn cho con người, vật nuôi và cải thiện môi trường sinh thái. Bằng các kỹ thuật di truyền mới này, triển vọng tạo ra các giống cây trồng mang những đặc tính mong muốn trong thời gian tương đối ngắn đã trở thành hiện thực. Đến nay hàng loạt gen mã hoá protein có hoạt tính diệt côn trùng gây hại (gen kháng côn trùng) như 1 gen cry của vi khuẩn Bacillus thuringiensis, gen mã hoá các chất ức chế proteaza và ỏ-amylaza… được chuyển vào thực vật nhờ các phương pháp thích hợp với sản phẩm là những cây trồng có khả năng tự kháng sâu bệnh. Trên thế giới, khá nhiều phương pháp chuyển gen thực vật đã được nghiên cứu và áp dụng thành công, như phương pháp vi tiêm, sử dụng súng bắn gen, xung điện. Trong đó, phương pháp có giá trị thực tiễn cao và được sử dụng rộng rãi nhất là phương pháp biến nạp gen thông qua vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens. Với ưu điểm như ít tốn kém, dễ áp dụng trên các đối tượng cây trồng nên phương pháp này rất phù hợp với điều kiện của các nước đang phát triển như Việt Nam [1]. Nhiều nơi trên thế giới, kỹ thuật chuyển và biểu hiện gen kháng côn trùng nói riêng và gen có lợi nói chung vào cây trồng thông qua phương pháp này đã và đang là công cụ hỗ trợ chính trong chọn giống thực vật. Ở nước ta, nghiên cứu chuyển gen thực vật mới chỉ bắt đầu, chủ yếu tại các phòng thí nghiệm của Viện Công nghệ Sinh học và Viện Sinh học Nhiệt đới (thuộc Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia), Viện Di truyền Nông nghiệp và Viện Nghiên cứu Lúa đồng bằng sông Cửu Long (thuộc Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn). Hầu hết các nghiên cứu sử dụng gen chỉ thị và một số gen khác trên các vectơ plasmit được thiết kế sẵn. Tuy nhiên, phần lớn các vectơ tái tổ hợp và các kết cấu gen được các nhà sáng chế và công ty/ cơ quan đăng ký sở hữu trí tuệ dưới dạng các sáng chế hoặc các giải pháp hữu ích. Về khía cạnh sở hữu trí tuệ, để được quyền sử dụng mỗi thành phần trong vectơ tái tổ hợp, thông thường người nhận phải liên lạc với các nhà sáng chế, cơ quan hoặc công ty sở hữu để ký các hợp đồng chuyển giao nguyên liệu (Material Transfer Agreement, MTA). Qua các hợp đồng này, chúng ta thường chỉ được sử dụng nguyên liệu cho mục đích nghiên cứu với rất nhiều ràng buộc về khía cạnh xuất bản, sản phẩm nghiên cứu, sở hữu, chuyển giao . Rõ ràng, để có được những vectơ mang gen tái tổ hợp có giá trị do nước ngoài thiết kế, bên cạnh những chi phí lớn, còn có nhiều khó khăn phức tạp trong chuyển giao nguyên liệu và công nghệ. Do vậy, một yêu cầu cấp bách đặt ra là chúng ta phải tự thiết kế được các vectơ chuyển gen thực vật nói chung và vectơ mang đoạn khởi động đặc hiệu để điều khiển biểu hiện gen kháng côn trùng 2 nhm mc ớch chuyn v biu hin cỏc gen ny trong cỏc i tng cõy trng nc ta. Trờn c s ý ngha lý lun v thc tin ca hng nghiờn cu ny, chỳng tụi ó tin hnh ti: To chng vi khun Agrobacterium tumefaciens mang gen khỏng cụn trựng chuyn vo cõy trng, vi cỏc mc ớch v ni dung nghiờn cu chớnh sau õy: Mục đích nghiên cứu Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử và công nghệ gen để nghiên cứu các đoạn khởi động đặc hiệu thực vật và gen có hoạt tính kháng côn trùng. Trên cơ sở đó, thiết kế các vectơ Ti-plasmit và tạo chủng A. tumefaciens phục vụ công nghệ chuyển gen nhằm mục đích nâng cao tính kháng sâu bệnh của cây trồng. Nội dung nghiên cứu Su tập và phân lập các đoạn khởi động đặc hiệu thực vật và gen có hoạt tính kháng côn trùng. Thiết kế các vectơ Ti-plasmit mang gen kháng côn trùng dới sự điều khiển của đoạn khởi động cơ định hoặc đoạn khởi động đặc hiệu thực vật trong tế bào E. coli. Tạo các chủng A. tumefaciens mang các vectơ Ti-plasmit chứa gen kháng côn trùng để chuyển vào cây trồng. Thiết kế vectơ và biểu hiện gen kháng côn trùng trong tế bào E. coli. Tạo kháng thể kháng protein có hoạt tính diệt côn trùng phục vụ cho nghiên cứu và giám định cây chuyển gen. Những đóng góp mới của luận án Bản luận án này có những đóng góp mới về khoa học và thực tiễn nh sau: 1. Đã nhân, tạo dòng và đọc trình tự đoạn khởi động của gen mã hoá sucroza synthaza (sucrose synthase) ở giống lúa C71 có khả năng điều khiển sự biểu hiện gen đặc hiệu ở bó mạch. Đây là đoạn khởi động gen đầu tiên đợc phân lập và đọc 3 trình tự từ một giống lúa Việt Nam. Trình tự của đoạn khởi động này đã đợc đăng ký trong các Ngân hàng trình tự gen quốc tế. 2. Đã tạo đợc một kết cấu gen mới đó là gen cryIA(c) dới sự điều khiển của đoạn khởi động đặc hiệu bó mạch C71S-P nhằm mục đích chuyển vào các giống lúa Việt Nam tạo khả năng kháng sâu đục thân lúa. 3. Đã thiết kế thành công 4 vectơ Ti-plasmit mới, cung cấp nguyên liệu cho các nghiên cứu chuyển gen vào cây trồng và nghiên cứu đoạn khởi động. Trong đó, gen cryIA(c) dới sự điều khiển của đoạn khởi động Ubiquitin hoặc đoạn khởi động của gen mã hoá sucroza synthaza ở giống lúa C71 đã đợc đa vào vectơ Ti- plasmit cải tiến và vectơ chuyển gen thế hệ mới nhất sử dụng hệ thống chọn lọc tích cực (Positive Selection System). 4. Đã hoàn thiện và sử dụng phơng pháp xung điện và phơng pháp phối ba bố mẹ để tạo 4 chủng A. tumefaciens mới, trên cơ sở các chủng LBA4404 và EHA105, mang các vectơ Ti-plasmit chứa gen kháng côn trùng để chuyển vào cây trồng. 5. Lần đầu tiên trong điều kiện Việt Nam đã thành công trong việc biểu hiện gen cryIA(c) tổng hợp hoá học bằng vi khuẩn E. coli. Protein CryIA(c) tái tổ hợp sau khi tinh chế đã đợc dùng để sản xuất kháng thể kháng CryIA(c) nhằm mục đích sử dụng làm công cụ kiểm tra sự có mặt của sản phẩm gen cryIA(c) ở các cây trồng đợc chuyển gen. 6. Các vectơ Ti-plasmit mới đã và đang đợc Viện Công nghệ Sinh học chuyển vào lúa và các loại cây trồng quan trọng khác. Ngoài ra, 2 chủng A. tumefaciens mới cũng đã đợc chuyển giao cho Viện Nghiên cứu Ngô (thuộc Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn) nhằm triển khai các nghiên cứu hợp tác chuyển gen cry vào cây ngô Việt Nam. 4 Chơng 1. Tổng quan tài liệu 1.1 Vi khuẩn đất A. tumefaciens và phơng pháp chuyển gen vào cây trồng 1.1.1 A. tumefaciens và hiện tợng biến nạp gen thực vật trong tự nhiên Những năm đầu thế kỷ 20, Smith và Townsend đã phát hiện ở một số cây hai lá mầm xuất hiện những khối u và tác nhân gây bệnh chính là vi khuẩn đất A. tumefaciens. Đến cuối những năm 1960, mối quan hệ giữa khối u và vật liệu di truyền của loài vi khuẩn này đã đợc Braun và Schilperoort khám phá. A. tumefaciens có khả năng xâm nhiễm thực vật, kích thích tạo khối u ngay tại các vết thơng của cây chủ. Trong tự nhiên, A. tumefaciens chủ yếu tấn công cây hai lá mầm, đặc biệt là nhóm thực vật có hoa. Một vài loài cây một lá mầm thuộc họ hành tỏi và thuỷ tiên mẫn cảm yếu với A. tumefaciens [34]. Hoàn toàn khác với mô và tế bào thực vật bình thờng, khối u do A. tumefaciens sinh ra phát triển rất mạnh ngay trong điều kiện thiếu hoocmon sinh trởng (auxin và cytokinin). Sở dĩ nh vậy vì A. tumefaciens đã chuyển một đoạn ADN (Transfer DNA - T-ADN) sang tế bào thực vật và T-ADN điều khiển quá trình sinh tổng hợp các hợp chất đó. Ngoài ra, các khối u cũng sinh tổng hợp opin là các axit amin (amino acid - aa) đặc biệt và các dẫn xuất của đờng. Dạng opin đợc tổng hợp có thể là nopalin, octopin, agrocinopin, mannozapin và agropin phụ thuộc vào từng chủng Agrobacterium. Trong đó, octopin và nopalin là hai dạng opin phổ biến. Opin đợc vi khuẩn sử dụng thay cho nguồn cacbon và nitơ nhờ hoạt động của gen chuyển hoá opin trên plasmit gây khối u thực vật (Tumour inducing plasmid - Ti-plasmit) [44], [109]. Cơ chế phân tử của sự hình thành khối u đã đợc quan tâm nghiên cứu nhằm tìm ra phơng thức phòng trừ bệnh cho cây. Tuy nhiên, khi phát hiện ra Ti-plasmit và khả năng tự chuyển T-ADN vào genom thực vật, ngời ta đã đặc biệt chú ý và khai 5 thác khả năng sử dụng chúng nh một vectơ tự nhiên để chuyển các gen quan tâm vào thực vật nhằm tạo cây trồng mang những tính trạng mong muốn [34], [37], [54]. 1.1.1.1 Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmit Zaenen & đtg, Đại học Ghent (Bỉ) là nhóm tác giả đầu tiên phát hiện A. tumefaciens mang một cấu trúc di truyền ngoài nhiễm sắc thể chứa hầu hết các gen liên quan đến sự hình thành khối u. Tuy nhiên, họ nghĩ rằng đó là bản sao của một loại virut xâm nhiễm vi khuẩn. Thực tế, yếu tố di truyền này chính là một plasmit khổng lồ với kích thớc khoảng 200 kb. Các chủng vi khuẩn có quan hệ gần gũi, nh vi khuẩn tạo nốt sần ở rễ (Rhizobium trifolii) và ở lá (Phyllobacterium myrsinacearum) cũng có khả năng hình thành khối u ở thực vật khi bị nhiễm Ti- plasmit. Điều đó khẳng định vai trò quan trọng của yếu tố lây nhiễm nằm trên Ti- plasmit đối với sự hình thành khối u ở cây chủ [54]. Ti-plasmit (hình 1.1) đợc tìm thấy ở tất cả các chủng A. tumefaciens gây nhiễm và tồn tại bền vững ở nhiệt độ dới 30 0 C. Đây là một phân tử ADN mạch vòng, sợi kép và tồn tại trong tế bào nh một đơn vị sao chép độc lập. Phân tích di truyền cho thấy, Ti-plasmit dạng octopin và dạng nopalin là hai dạng phổ biến nhất, đều có 4 vùng tơng đồng, trong đó vùng T-ADN và vùng gây độc (Virulence Region - vùng VIR), liên quan trực tiếp tới sự hình thành khối u ở thực vật. Hai vùng còn lại chứa gen mã hoá cho việc sao chép plasmit (Origin of replication) và chuyển nạp (Conjugative transfer) [34]. Trên Ti-plasmit, chỉ có vùng T-ADN đợc chuyển từ vi khuẩn sang genom của cây bị bệnh và tồn tại bền vững ở đó [87]. Tuy nhiên, vùng này lại không mã hoá những sản phẩm làm trung gian cho quá trình chuyển T-ADN mà cần có sự trợ giúp đặc biệt của các gen gây khối u nằm trên vùng VIR và trên nhiễm sắc thể vi khuẩn (chv genes). Vùng VIR dài khoảng 40 kb đảm nhận chức năng gây nhiễm. ở Ti- plasmit dạng octopin, vùng VIR chứa tới 24 gen gây độc. Sản phẩm protein do các gen này mã hoá đã kích thích sự tách biệt T-ADN, bao bọc che chở và giúp chúng tiếp cận với genom của cây chủ. Ngoài các gen vir, các gen trên nhiễm sắc thể của 6 A. tumefaciens (nh chvA và chvB) cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhập của A. tumefaciens vào thành tế bào thực vật [34], [109]. Hình 1.1. Bản đồ Ti-plasmit dạng octopin 1.1.1.2 Cấu trúc và chức năng của đoạn T-ADN Trong genom của cây bị khối u, số lợng bản sao của T-ADN dao động từ một vài đến hơn 10. Chúng có thể nằm trên cùng một locut hoặc tách rời và gắn với các vùng khác nhau trên genom thực vật một cách ngẫu nhiên. ở cà chua, 7 đoạn T- ADN đã gắn vào 5 nhiễm sắc thể thực vật, trong khi ở Crepis capillaris, T-ADN chỉ đợc tìm thấy trên 3 nhiễm sắc thể [109]. Kết quả phân tích trình tự gen trên T-ADN ở các Ti-plasmit khác nhau cho thấy, T-ADN đợc giới hạn bởi một đoạn trình tự lặp lại gần nh hoàn toàn từ khoảng 25 bp và gọi là đoạn biên. Chúng là dấu hiệu nhận biết cho quá trình chuyển và xâm nhập của T-ADN vào tế bào thực vật. ở đoạn biên phải (Right Border - RB) có yếu tố điều khiển cis cần cho quá trình chuyển T-ADN. Đoạn biên trái (Left Border - 7 LB) gián tiếp tham gia vào quá trình chuyển T-ADN và là dấu hiệu để quá trình này kết thúc bình thờng [147], [152]. ở Ti-plasmit dạng nopalin, T-ADN xâm nhập vào genom thực vật ở dạng một đoạn liên tục dài 22 kb. Trong khi, ở Ti-plasmit dạng octopin, đoạn T-ADN này chỉ dài 13 kb. ở một số mô thực vật, khối u lại chứa một đoạn ADN kích thớc 8 kb [208]. T-ADN mang rất nhiều gen nh: (1) Các gen mã hoá những enzym cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp opin; (2) Các gen gây khối u nh tms1, tms2, tmr mã hoá cho các enzym liên quan đến quá trình sinh tổng hợp auxin và cytokinin [34], [109]. 1.1.1.3 Quá trình chuyển T-ADN vào tế bào thực vật Các tế bào cây bị tổn thơng sẽ tiết ra các hợp chất dẫn dụ hoá học vi khuẩn nh acetosyringon, -hydroxy-acetosyringon. Dới tác dụng của các hợp chất này, A. tumefaciens nhận biết rồi bám vào thành tế bào chủ và chuyển T-ADN vào tế bào thực vật. Quá trình này đợc sự trợ giúp đặc biệt của các gen vir và đoạn biên phải, trái [32], [34]. Cũng chính các hợp chất này, với vai trò cảm ứng, giúp cho các gen vùng VIR hoạt động và tăng cờng biểu hiện. Khi vi khuẩn xâm nhiễm tế bào thực vật qua vết thơng, sản phẩm gen virA sẽ nhận biết sự có mặt và tơng tác với các phân tử acetosyringon rồi truyền thông tin ngoại bào này vào trong tế bào dẫn đến sự hoạt động của các protein VirG. Tiếp theo, VirG lại kích hoạt các gen gây độc khác nh virB, virC, virD và virE cũng nh tăng cờng mức độ phiên mã của virG [34], [44], [144]. Sau đó, virD hỗ trợ quá trình tách T-ADN thành hai sợi đơn. Một sợi sẽ chuyển sang tế bào thực vật với đầu 5' đi trớc. Sợi đơn còn lại sẽ làm khuôn để tổng hợp nên sợi ADN bổ sung mới. Trong quá trình di chuyển, sợi ADN đơn đợc gắn với protein VirE để chui qua rất nhiều màng trớc khi vào đợc đến nhân tế bào thực vật. Protein VirB nằm trên màng tế bào vi khuẩn có nhiệm vụ chuyển trực tiếp T-ADN sợi đơn sang tế bào thực vật (hình 1.2) [209], [210]. Quá trình chuyển T-ADN này gần giống với quá trình tiếp hợp ở vi khuẩn, trong đó protein VirB tơng đơng với yếu tố F, hoạt động nh một cầu nối chuyển gen. Sau khi T-ADN qua màng tế bào, chúng đi thẳng vào nhân và kết hợp với genom thực vật ở những vị trí ngẫu nhiên. Tại đó, các gen trên T-ADN, nhờ sự điều khiển của gen thực vật, bắt đầu hoạt động và sản 8 sinh ra auxin, cytokinin và opin gây nên sự phát triển thái quá của hàng loạt tế bào lân cận dẫn đến sự hình thành khối u. Hình 1.2. Quá trình chuyển T-ADN vào tế bào thực vật [208] 1.1.2 Công nghệ gen thực vật và kỹ thuật chuyển gen nhờ A. tumefaciens 1.1.2.1 Hệ thống chuyển gen nhờ A. tumefaciens Nhìn chung, hệ thống chuyển gen này bao gồm các giai đoạn: (i) Chuyển vùng T-ADN vào genom thực vật; (ii) Biểu hiện gen quan tâm (Gene of Interest) trong tế bào thực vật; (iii) Tái sinh tế bào thực vật thành cây hoàn chỉnh. Những yếu tố quan trọng và cần thiết cho hệ thống chuyển gen này bao gồm: (1) Các gen vir; (2) Đoạn biên phải và trái; (3) Vùng T-ADN: ngoài hai đoạn biên, hầu hết các gen trên T-ADN có thể đợc loại bỏ và thay thế bằng các gen quan tâm để chuyển vào cây trồng. Đoạn T-ADN đợc cải biến di truyền này gọi là T-ADN bị vô hiệu hoá (disarmed T-DNA), mất chức năng gây khối u; (4) Vùng mang các yếu tố điều khiển cis: nh đoạn khởi động và đoạn kết thúc hỗ trợ và điều khiển sự biểu hiện các gen; (5) Các gen chỉ thị chọn lọc [71]. 9 Các loại vectơ Ti-plasmit nhân tạo: Ti-plasmit tự nhiên có kích thớc quá lớn nên rất khó để sao chép ở mức phân tử cũng nh không đơn giản để tiến hành chuyển gen. Mặt khác, chúng lại chứa các gen tổng hợp hoocmon sinh trởng thực vật và opin không cần thiết và gây khối u cho cây bị xâm nhiễm nên không đợc dùng trực tiếp làm vectơ. Trên cơ sở này, Ti-plasmit đã đợc nghiên cứu cải biến nh cắt bỏ các gen không quan trọng, lắp thêm các gen cần thiết vào vùng tạo dòng đa năng (Multi Cloning Site - MCS) tạo hai hệ thống vectơ chuyển gen hiệu quả: vectơ liên hợp (co- integrate vector) và vectơ hai nguồn (binary vector) [197]. Nhờ vậy, cây trồng đợc biến nạp Ti-plasmit cải biến vừa mang gen quan tâm, vừa có khả năng tái sinh và phát triển bình thờng [66], [90]. a) Vectơ liên hợp: đợc xây dựng trên cơ sở sự tái tổ hợp giữa vùng tơng đồng nằm trên plasmit vi khuẩn (nh vectơ của E. coli) với vùng T-ADN trên Ti-plasmit của A. tumefaciens. Trong đó, ngời ta giữ lại vùng VIR, loại bỏ vùng mã hoá chức năng gây khối u và thay thế bằng những đoạn ADN mới trong Ti-plasmit (hình 1.3). Nh vậy, có ba loại vectơ tham gia vào hệ thống vectơ liên hợp: (1) Ti-plasmit: các gen gây khối u đã bị vô hiệu hoá bằng cách thay thế vào đó gen kháng kanamycin của vi khuẩn (Hệ thống vectơ SEV) hoặc một đoạn trình tự của vectơ pBR322 (Hệ thống vectơ pGV); (2) Vectơ trung gian: có nguồn gốc từ pBR322 với kích thớc nhỏ và đợc sử dụng để bổ trợ chức năng không u việt của Ti-plasmit (kích thớc lớn và thiếu vùng MCS). Chúng đợc nhân lên trong E. coli và chuyển sang A. tumefaciens nhờ quá trình tiếp hợp. Do không thể sao chép trong A. tumefaciens nên chúng mang những đoạn ADN tơng đồng với T-ADN. (3) Vectơ trợ giúp: tồn tại trong E. coli, có kích thớc nhỏ, chứa các gen di động (mobilization) và gen chuyển (transfer) giúp cho quá trình tiếp hợp và chuyển gen vào A. tumefaciens [197]. Khi tiếp hợp, Ti-plasmit và vectơ trung gian đã xảy ra quá trình tái tổ hợp, gen quan tâm đợc chuyển từ E. coli sang vùng T-ADN của A. tumefaciens để tạo ra cấu trúc T-ADN liên hợp. Nh vậy, vectơ liên hợp thờng bao gồm các thành phần chính: (1) Các vị trí tạo dòng thích hợp; (2) Các gen vir; (3) Đoạn biên phải và trái; (4) Gen quan tâm; (5) Chỉ thị chọn lọc vi khuẩn hoạt động trong E. coli và A. tumefaciens; 10 [...]... tựu chuyển gen vào cây trồng nhờ A tumefaciens Một trong những thí nghiệm chuyển gen đầu tiên đã sử dụng A tumefaciens để đa gen kháng kháng sinh vào cây thuốc lá [99] Sau đó, A tumefaciens đã đợc chứng minh là một phơng tiện rất hiệu quả để đa gen quan tâm vào rất nhiều loài cây trồng quan trọng [57] 15 Chuyển gen vào cây hai lá mầm: Đến nay, trên đối tợng cây hai lá mầm, phơng pháp chuyển gen nhờ... chuyển vào genom thực vật và đợc điều khiển biểu hiện ở những mô, cơ quan đặc biệt trong những giai đoạn phát triển nhất định Số lợng gen quan tâm đợc tạo dòng, đa vào vectơ thích hợp để chuyển vào cây trồng ngày một nhiều và sản phẩm của quá trình chuyển gen là hàng loạt cây trồng mang những tính trạng mong muốn 1 2 thiết kế vectơ mang gen mã hoá protein có hoạt tính diệt côn trùng để chuyển vào cây trồng. .. vậy, hớng chiến lợc thiết kế vectơ mang gen kháng côn trùng đã mở ra triển vọng mới trong công nghệ chuyển gen nhằm tạo cây trồng tự kháng sâu bệnh Rất nhiều loài cây trồng đã nhận đợc gen kháng côn trùng và hình thành khả năng diệt côn trùng gây hại 1.2.1 Các loại vectơ chính Hiện nay có khá nhiều loại vectơ, nh plasmit, cosmit, phagơ, nhiễm sắc thể nhân tạo của vi khuẩn và nấm men Plasmit rất thông... nay là Syngenta) công bố không sử dụng các gen kháng kháng sinh để chọn lọc Ngoài ra, một hớng chiến lợc khác cũng đang đợc sử dụng trong phơng pháp chuyển gen nhờ A tumefaciens, đó là hệ thống biến nạp đồng thời gen quan tâm và gen chọn lọc, sau đó tiến hành tách riêng [82] 1.2.3 Vectơ mang gen kháng côn trùng Các vectơ này đợc thiết kế để biến nạp vào cây trồng các gen kháng côn trùng có giá trị... pháp biến nạp, vectơ hoàn chỉnh đợc sử dụng để đa gen quan tâm vào cây trồng; (ii) Gen kháng kháng sinh chọn lọc vi khuẩn nằm trong vùng T-ADN sẽ đợc chuyển đồng thời vào cây nhờ A tumefaciens Các gen này rõ ràng là không đợc sử dụng trực tiếp để chọn lọc cây trồng chuyển gen nên không cần thiết phải có mặt trong sản phẩm cuối cùng, nhất là khi 22 các cây trồng đợc sử dụng làm thực phẩm [82] Ngoài ra,... nạp gen vào ngô [80] ở lúa, Hiei & đtg đã sử dụng chủng A tumefaciens gây độc và vectơ hai nguồn đặc biệt mang một vài gen vir Trong số rất nhiều cây chuyển gen 16 thu đợc, có khoảng 35% cây mang 1 bản sao của gen chuyển, còn lại mang từ 2 đến 4 bản sao [102] Vijayachandra & đtg đã tập trung nghiên cứu khả năng cảm ứng của các mô lúa với các gen vir nhằm tìm ra loại mô thích hợp nhất để chuyển gen vào. .. mã của gen kháng côn trùng nhằm tăng hiệu quả biểu hiện trong thực vật Hầu hết gen kháng côn trùng đợc sử dụng trong công nghệ gen thực vật có nguồn gốc từ vi khuẩn Thời kỳ đầu chúng thờng đợc đa vào cây trồng ở dạng nguyên vẹn [181] Mặc dù cây trồng biến đổi di truyền có khả năng kháng côn trùng đặc hiệu, nhng ngay sau đó ngời ta nhận thấy mức độ biểu hiện các gen tự nhiên của vi khuẩn trong thực... Monsanto) đợc đa vào thị trờng Mỹ Năm 1996, diện tích đất trồng cây chuyển gen cry ở Mỹ chiếm tới 1,2 triệu ha Hầu hết các giống này cũng đợc trồng đại trà ở các quốc gia khác nh Argentina và úc [127] Năm 2000, cây bông mang gen cry đợc trồng trên 6,8 triệu ha ở 6 quốc gia, tơng ứng 15% diện tích đất trồng cây chuyển gen toàn cầu Bảng 1.3 là diện tích đất trồng cây chuyển gen cry theo công nghệ của Công ty... (1995); mía và táo (1996); lạc, đậu và cỏ linh lăng (1997) [79], [120], [177] Ngô, bông mang gen cry là những cây chuyển gen đầu tiên đợc trồng đại trà và thơng mại hoá ở Mỹ [127] Bảng 1.2 cho thấy các cây trồng chuyển gen cry có hoạt tính diệt côn trùng Bảng 1.2 Chuyển gen cry vào cây trồng [26], [45], [120] Cây trồng Gen cryIA(a), cryIA(b) cryIA(b), cryIA(c) cryIA(c) Loại WT PM WT Cải cryIC cryIA(b)... vật, thực vật, vi sinh vật hoặc tổng hợp nhân tạo 1.2.3.1 Nguồn gen kháng côn trùng a) Gen cry mã hoá protein độc tố của Bacillus thuringiensis Trong nguồn gen kháng côn trùng, gen cry mã hoá protein tinh thể độc có hoạt tính diệt côn trùng (Insecticidal Crystal Proteins - ICPs) của Bt đợc sử dụng phổ biến nhất để chuyển và biểu hiện ở hàng loạt cây trồng quan trọng Sơ lợc về Bt: Bt là vi khuẩn hiếu khí, . Tạo các chủng A. tumefaciens mang các vectơ Ti-plasmit chứa gen kháng côn trùng để chuyển vào cây trồng. Thiết kế vectơ và biểu hiện gen kháng côn trùng. mẹ để tạo 4 chủng A. tumefaciens mới, trên cơ sở các chủng LBA4404 và EHA105, mang các vectơ Ti-plasmit chứa gen kháng côn trùng để chuyển vào cây trồng.