Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang gen kháng côn trùng để cải thiện hiệu quả chuyển gen vào cây trồng

Vectơ tạo dòng

Đây là các plasmit nằm ngoài nhiễm sắc thể có kích thớc nhỏ và chứa gen chọn lọc đợc sử dụng để tạo dòng các đoạn ADN. Chúng đợc phát hiện đầu tiên ở vi khuẩn, sau đó không ngừng đợc cải tiến với nhiều đặc tính quý: (1) Plasmit thế hệ thứ nhất nh ColE1, pSC101 nguồn gốc tự nhiên có rất ít các đặc tính cần thiết; (2) Plasmit thế hệ thứ hai nh pBR322 đợc thiết kế nhân tạo trên cơ sở tập trung các tính trạng quý của plasmit tự nhiên và đợc sử dụng để biến nạp gen quan tâm vào E. Tuy nhiên, trong một vài trờng hợp, plasmit có thể không bền vững khi protein tái tổ hợp có hoạt tính.

Vectơ biểu hiện

Bevan đã tạo ra vectơ hai nguồn mang vùng T-ADN cải biến với đoạn biên phải, trái, gen nptII và vùng MCS từ M13mp19 giúp gắn gen quan tâm dễ dàng [39]. An đã thiết kế vectơ biểu hiện pGA492 mang gen cat khuyết đoạn khởi động nhằm nghiên cứu chức năng của các yếu tố điều khiển trong tế bào thực vật [30]. Cho tới nay, rất nhiều Ti-plasmit thế hệ mới đợc thiết kế và sử dụng với các u điểm nh dễ tạo dòng gen quan tâm, dễ chuyển từ tế bào E.

Đoạn khởi động gen

Các gen kháng côn trùng có thể biểu hiện đợc thành protein cần phải có mặt các tín hiệu điều khiển thích hợp ở những vị trí nhất định. Ngoài ra, những yếu tố điều khiển phía trên nằm trớc gen cấu trúc cũng tham gia vào quá trình kiểm soát biểu hiện gen về số lợng, thời gian và không gian. Nó đóng vai trò điều khiển quá trình phiên mã nhờ khả năng đảm bảo các vị trí nhận biết cho enzym ARN polymeraza, cho các yếu tố hoạt hoá và khởi động [25].

Nh vậy, các đoạn khởi động có thể đợc chia làm hai loại chính: đoạn khởi động không đặc hiệu hay còn gọi là đoạn khởi động cơ định (constitutive promoter) và đoạn khởi động đặc hiệu với các yếu tố cis chuyên biệt.

Đoạn kết thúc gen

Gen chỉ thị

Tuy nhiên, sự an toàn của các gen kháng kháng sinh nh nptII dới sự điều khiển của các đoạn khởi động đặc hiệu thực vật của Calgene đã đợc nghiên cứu chứng minh và đợc Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dợc phẩm Mỹ (US Food and Drug Administration - FDA) chấp thuận [82], [83]. Cũng cần nhấn mạnh rằng, sở dĩ các gen chọn lọc có mặt trong các cây trồng chuyển gen là do: (i) Gen quan tâm đầu tiên đợc thiết kế trong vectơ vi khuẩn (nh E. coli) có chứa gen kháng kháng sinh, sau đó nhờ các phơng pháp biến nạp, vectơ hoàn chỉnh đợc sử dụng để đa gen quan tâm vào cây trồng; (ii) Gen kháng kháng sinh chọn lọc vi khuẩn nằm trong vùng T-ADN sẽ đợc chuyển đồng thời vào cây nhờ A. Ngoài ra, trong khi các thể biến nạp thu đợc nhờ khả năng sống sót và sinh trởng trên môi trờng có chất chọn lọc nh kháng sinh hoặc thuốc diệt cỏ, các tế bào không nhận đợc gen chuyển thì bị ảnh hởng bởi tác.

Nhằm tránh sử dụng các gen kháng kháng sinh chọn lọc trong vi khuẩn, ngời ta đã sử dụng các gen chỉ thị chọn lọc thay thế nh hệ thống Cre/ lox cho phép loại bỏ các chỉ thị chọn lọc sau biến nạp vào tế bào thực vật [60], [132].

Nguồn gen kháng côn trùng

● Các chất ức chế proteaza (Protease Inhibitor): là các proteaza ngoại bào dạng tự do hoặc gắn màng có khả năng ức chế quá trình tiêu hoá protein của côn trùng nhờ ngăn cản sự hoạt động của các proteaza - những enzym phân huỷ protein. Các dòng lúa chuyển gen mã hoá chất ức chế proteaza của cây đậu đũa và cây khoai tây có khả năng kháng côn trùng Bộ Cánh vảy rõ rệt [72], [203], dâu tây biểu hiện chất ức chế proteaza thể hiện hoạt tính kháng mọt hại nho [88]. Côn trùng Bộ Cánh vảy và Cánh cứng có thể tăng cờng biểu hiện các proteaza hoặc sản sinh enzym mới không mẫn cảm với chất ức chế proteaza và giảm những ảnh hởng có hại của chất ức chế proteaza trong hệ tiêu hoá.

Dựa trên cấu trúc phân tử, protein này đợc phân loại thành hai nhóm: nhóm I với độc tính tơng đối thấp (gồm một chuỗi polypeptit A với phân tử lợng khoảng 23-32 kDa) và nhóm II rất độc (gồm chuỗi polypeptit A liên kết với chuỗi polypeptit B qua các cầu nối disulphit) [113].

Thiết kế vectơ mang gen kháng côn trùng thế hệ mới

Để diệt bọ cánh cứng Colorado (Leptinotarsa decemlineata) hại khoai tây, đoạn khởi động đặc hiệu lá đã đợc sử dụng thay đoạn khởi động đặc hiệu củ [120]. Hiện nay, ngoài việc phân lập gen quan tâm và tìm kiếm đoạn khởi động đặc hiệu, các nghiên cứu điều khiển hoạt động gen thông qua các đoạn khởi động này cũng là mục tiêu nghiên cứu của nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới. ở nớc ta, những vấn đề này cũng đang bắt đầu đợc tiếp cận nghiên cứu nhằm chuẩn bị nguyên liệu cho quá trình thiết kế vectơ để chuyển vào cây trồng [2], [9]. b) Cải biến vùng mang m của gen kháng côn trùng nhằm tăng hiệu quảã biểu hiện trong thực vật. Nghiên cứu của Callis & đtg trên các vectơ pACI1 I8,9A và pAI1 CI8,9A (trong đó A chỉ Adh1, IX chỉ các intron số X và C chỉ gen cat), cho thấy vị trí của đoạn intron 1 của gen mã hoá Adh1 của ngô trong gen cat có ảnh hởng quan trọng đến mức độ biểu hiện của gen. Nhìn chung, intron không đợc sử dụng phổ biến để biểu hiện các gen quan tâm do: (i) khó khăn trong việc phân lập và chuyển intron từ gen này vào gen kia mà không đồng thời đa vào các trình tự mã hoá cho các aa không mong muốn; (ii) intron làm thay đổi đoạn khởi động ảnh hởng đến quá trình biểu hiện gen; (iii) hơn nữa, intron có mặt trong gen không đảm bảo gen đó đợc tăng cờng biểu hiện. Hiện nay, vấn đề intron nào sẽ tăng cờng tối đa mức độ biểu hiện của từng gen đặc biệt trong những loài mong muốn vẫn đang tiếp tục đợc nghiên cứu [81]. Ngoài intron, các yếu tố tăng cờng thực vật khác cũng đóng vai trò quan trọng trong biểu hiện gen. Odell & đtg đã tiến hành đa đoạn trình tự 338 bp nằm trớc hộp TATA ở CaMV35S-P vào các đoạn khởi động yếu tăng mức độ biểu hiện của gen nh khi đợc điều khiển bằng CaMV35S-P nguyên vẹn [153]. d) Thiết kế cấu trúc gen kép.

Thử nghiệm các dòng bông không chứa, chứa 1 hoặc 2 gen cry cho thấy, cây bông có hoạt tính độc mạnh nhất đối với sâu hại khi đợc chuyển và biểu hiện đồng thời gen cryIA(c) và cryIIA(b) [182]. Kết quả tơng tự nhận đợc khi biểu hiện operon với 3 gen mã hoá CryIIA trong lục lạp [63]. e) Sử dụng hệ thống vectơ chọn lọc tích cực.