Phương pháp chuyển gen vào cây trồng bằng vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

MỤC LỤC Trang LỜI MỞ ĐẦU I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái niệm thực vật chuyển gen 1.2 Cơ sở khoa học 1.2.1 Nguyên lý chuyển gen vào thực vật 1.2.2 Những lợi ích chuyển gen 1.2.2.1.Tăng sản lượng : 1.2.2.2 Tăng lợi nhuận nông nghiệp giảm chi phí sản xuất 1.2.2.3.Cải thiện môi trường 1.2.2.4 Tác dụng y học 1.2.3 Những nguy tiềm ẩn chuyển gen 1.2.3.1.Những nguy tiềm ẩn việc phát triển kỹ thuật II Các phương pháp chuyển gen vào thực vật 2.1 Biến nạp gián tiếp thông qua Agrobacterium 2.1.1 Đặc điểm vi khuẩn Agrobacterium 2.1.2 Cấu trúc tế bào vi khuẩn Agrobacterium 2.1.3 Cơ chế tác dụng Agrobacterium 2.1.4.Qui trình chuyển gen Agrobacterium 2.1.5 Ưu nhược điểm phương pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium 2.1.5.1 Ưu điểm 2.1.5.2 Nhược điểm III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Ứng dụng 3.1.1 Trong nông nghiệp 3.1.2 Trong y học 3.2 Thành tựu 3.2.1 Trên giới 3.2.2 Ở Việt Nam 4.Kết luận Tài liệu tham khảo LỜI MỞ ĐẦU Việc sử dụng khối lượng lớn nhiên liệu hoá thạch giúp có đời sống tiện nghi hạnh phúc dẫn đến trả giá đắt tượng ấm lên tồn cầu, nhiễm hủy hoại môi trường Do nhiều điều kiện bất lợi môi trường nhiễm vi khuẩn, virus, loại côn trùng, nhiễm mặn, khô hạn, nhiệt độ cao, … Ngay Mỹ, sản lượng nông nghiệp giảm ¼ so với tối đa theo lý thuyết Ngày nay, loại trồng kháng virus, côn trùng hay kháng thuốc trừ cỏ tạo việc áp dụng chuyển gen mong muốn vào thực vật, mang lại cải thiện quan trọng suất Các gen cải thiện tăng trưởng thực vật môi trường axit kiềm đất nhiễm mặn cô lập [9] Bên cạnh vấn đề vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh vấn đề nghiêm trọng với sức khỏe loài người Cây trồng chuyển gen hệ thống sản xuất vắc xin thay có hiệu quả, chúng biểu lộ nhiều loại prơtêin, thực thay đổi cần thiết để loại prôtêin hoạt động Hệ thống trồng chứa loại vi khuẩn nguồn bệnh động vật, Và việc sản xuất đại trà loại vaccin trồng dễ [12] Nhiều phương pháp khác phát minh để đưa gen vào tế bào mô động vật thực vật Kỹ thuật đơn giản chuyển DNA trần vi tiêm (microinjection), xung điện (electroporation), súng bắn gen Các phương pháp phức tạp hiệu bao gồm sử dụng phức hợp lipid-DNA (liposome), vector virus, tế bào gốc phôi, chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium, chuyển gen súng bắn gen Phương pháp để đưa gen vào tế bào thực vật việc sử dụng Agrobaterium Phát kiến việc Agrobaterium tumefaciens có khả chuyển gen vào thực vật biến lồi trở thành cơng cụ quan Công nghệ sinh học thực vật A tumefaciens lồi vi khuẩn đất có khả chèn gen vào thực vật sau sử dụng máy thực vật để biểu gene dạng hợp chất dinh dưỡng cho chúng [8] Tuỳ thuộc vào đối tượng chuyển gen mà người ta lựa chọn phương pháp chuyển gen phù hợp Nhiều nhà khoa học tin chuyển gien trồng cách hiệu rẻ tiền để sản xuất vaccine thuốc hàng loạt Công nghệ sinh học giới phát triển với tốc độ chóng mặt, riêng nơng nghiệp có 60 triệu gieo trồng giống biến đổi gen như: ngô, lúa, đậu tương, bông, hoa hướng dương, khoai tây, đu đủ Cây trồng chuyển gen với suất chất lượng cao đem lại lợi ích khổng lồ cho quốc gia có cơng nghệ sinh học tiên tiến Đồng thời giảm việc sử dụng thuốc trừ sâu, phân bón hóa học vốn làm suy kiệt tài nguyên thiên nhiên phá vỡ cân sinh thái, ảnh hưởng nghiêm trọng đến khí hậu tồn cầu Những nghiên cứu cho phép tạo loại lương thực “thế hệ đầu tiên” có khả chống lại stress môi trường hạn hán, thay đổi nhiệt độ đột ngột hay đất nhiễm mặn Cùng với phát triển mạnh mẻ công nghệ sinh học, chắn vaccine thực vật hướng nghiên cứu đắng triển vọng nhằm nâng cao giá trị trồng biến đổi gen việc ngăn chặn lây lan bệnh truyền nhiễm người động vật qui mơ mở rộng tồn giới [22] I TỔNG QUAN TÀI LIỆU: 1.1 Khái niệm thực vật chuyển gen Cây chuyển gen thực vật mang nhiều gen đưa vào nhân toạ thay thơng qua lai tạo Những gen tạo đưa vào (gen chuyển) phân lập từ lồi thực vật có quan hệ họ hàng từ loài khác biệt hoàn toàn Thực vật tạo gọi “chuyển gen” thực tế tất thực vật “chuyển gen” từ tổ tiên hoang dại chúng trình hố, chọn lọc lai giống có kiểm soát thời gian dài [3] 1.2 Cơ sở khoa học Hiện việc tạo trồng chuyển gen phải qua bước: - Chọn lựa nhân đoạn gen kháng nguyên vi khuẩn vi rút gây bệnh - Thử nghiệm thành công vectơ biểu gen tái tổ hợp - Chuyển thành công gen vào nhiều loài đối tượng thực vật - Gia tăng tốc độ khối lượng protein tái tổ hợp sản sinh trồng [22] 1.2.1 Nguyên lý chuyển gen vào thực vật Kỹ thuật đưa gen lạ (một đoạn DNA, RNA) vào tế bào vật chủ làm cho gen lạ tồn plasmid tế bào chủ gắn gen tế bào chủ, tồn tái với gen tế bào chủ Gen lạ tế bào chủ hoạt động tổng hợp protein đặc hiệu, gây biến đổi đặc điểm có làm xuất đặc điểm chuyển gen Thông tin di truyền acid deosyribonucleic (DNA) tồn dạng : - DNA thể bậc cao có DNA nhân DNA quan tử - DNA thể vi sinh vật - DNA plasmid Một cấu trúc di truyền đặc trưng bao gồm: Gen khởi đầu(promoter), gen mã hoá(coding gen), gen kết thúc (terminator) Các gen mã hố đưa vào mô thực vật nhờ vectơ plasmid Các mẫu vật (các phận mô dùng để biến nạp) thích hợp cho biến nạp gen mẫu vật địi hỏi thời gian ni cấy trước sau biến nạp ngắn - Lựa chọn gen cần biểu (gen quan tâm) đưa vào Best regards,vector thích hợp - Lựa chọn đối tượng thực vật thích hợp để chuyển gen - Chuyển vector tái tổ hợp mang gen quan tâm vào thực vật lựa chọn phương pháp chuyển gen - Kiểm tra biểu gen quan tâm phận ăn thực vật - Thử nghiệm khả đáp ứng miễn dịch vaccine sản xuất từ thực vật - Sử dụng vaccine thử nghiệm thành công cách ăn tươi dạng thức ăn chế biến Thiết kế vector biểu hiện: Điểm quan trọng thiết kế vector biểu promoter, phải promoter khoẻ, có lực mạnh với RNA-polymerase vật chủ hoạt động promoter điều hoà cách dễ dàng Trong nhiều nghiên cứu gần đây, với mục đích biểu kháng nguyên vaccine phận ăn thực vật, người ta thiết kế promoter đặc hiệu mơ thực vật, ví dụ promoter đặc hiệu mơ củ mơ hạt protein sản xuất củ hạt Tuỳ thuộc vào mục đích ứng dụng, thiết kế phương thức biến nạp thích hợp cho genotype khác Trong nghiên cứu bản, người ta thường tập trung tìm hiểu theo cấu trúc chức cấu trúc gen biến nạp, khảo sát promoter chế phân tử thực vật để chuyển gen thành cơng vào lồi khác [22] 1.2.2 Những lợi ích chuyển gen 1.2.2.1.Tăng sản lượng : Cây chuyển gen tăng đáng kể sản lượng thu hoạch, với diện tích đất canh tác thu nhiều lương thực Ví dụ: Mỹ, năm 1999, có 66 triệu ruộng ngô tránh sâu đục thân [9] 1.2.2.2 Tăng lợi nhuận nơng nghiệp giảm chi phí sản xuất Thực vật với khả tự bảo vệ chống lại trùng cỏ dại giúp giảm liều lượng nồng độ thuốc trừ sâu sử dụng Giảm sử dụng thuốc trừ sâu cải thiện đáng kể chất lượng nước vùng sử dụng thuốc Thực vật kháng thuốc diệt cỏ làm cho việc sử dụng biện pháp khơng cày đất yếu tố quan trọng việc bảo tồn đất đai trở nên phổ biến Ví dụ: người trồng cải dầu chuyển gen Canada phải cày cấy so với trồng cải dầu truyền thống [24] 1.2.2.3.Cải thiện môi trường Một lợi ích to lớn trồng chuyển gen mơi trường chúng giúp làm giảm đáng kể lượng thuốc trừ sậu sử dụng, với tỷ lệ phụ thuộc vào loại trồng đặc điểm đưa vào trồng Cây chuyển gen cịn có lợi ích tiềm tàng mơi trường Chúng giúp bảo tồn nguồn lợi tự nhiên, sinh cảnh động vật, thực vật địa Thêm vào đó, chúng góp phần giảm xói mịn đất, cải thiện chất lượng nước, cải thiện rừng nơi cư ngụ động vật hoang dại [14] 1.2.2.4 Tác dụng y học Những chuyển gen hệ thứ làm giảm chi phí sản xuất Ngày nay, nhà khoa học hướng dẫn tạo chuyển gen hệ thứ hai có đặc điểm tăng giá trị dinh dưỡng có tính trạng thích hợp cho cơng nghiệp chế biến Lợi ích trồng hướng trực tiếp vào người tiêu dùng Một số ví dụ như: Lúa gạo giầu vitamin A sắt, khoai tây tăng hàm lượng tinh bột vacxin ăn ngô khoai tây, giống ngơ trồng điều kiện nghèo dinh dưỡng, dầu ăn có lợi cho sức khoẻ từ đậu nành cải dầu [17] Ưu điểm vaccine thực vật chuyển gen Dể dàng tăng qui mô sản xuất dể thu sinh khối Tính ổn định cao,dễ bảo quản sử dựng Các kháng nguyên biểu thực vật ổn định nhiệt độ phòng chúng sản xuất bao bọc mô thực vật mà cụ thể chứng định vị lưới nội chất, thể Golgi bề mặt tế bào Nhờ tính ổn định mà chúng trở nên dể dàng bảo quản sử dụng thực vật mà không cần giữ lạnh vaccine tiêm Tính ăn Loại vaccine thực vật mơ thực vật bao bọc, hạn chế phân huỷ dịch tiêu hoá đường ruột ổn định, bền vững thể Nên vaccine ăn tươi (quả lá) nấu chín (hạt củ) Tính an tồn Vì vaccine sản xuất thực vật vaccine đơn vị sử dụng gen mã hoá cho phần protein vỏ virus mà không cần đến virus sống vaccine giảm độc lực hay virus chết vaccine bất hoạt Do vaccine khơng trở lại thành virus gây bệnh cho người động vật, đồng thời tránh nguy nhiễm mầm bệnh tiềm tàng từ vaccine Do đó, khơng cần tách chiết tinh kháng nguyên vaccine Vaccine ăn kích thích sản xuất kháng thể hệ thống thể dịch hiệu vaccine tiêm Ta biết hầu hết vi sinh vật gây bệnh xâm nhập vào thể qua bề mặt nhầy đường tiêu hố, hơ hấp đường tiết niệu Khi vaccine ăn vào thể theo đường miệng cảm ứng hệ thống miển dịch thể dịch sản xuất kháng thể chống lại vi sinh vật gây bệnh, tiếp hệ thống thể dịch lại tác động vào hệ thống miển dịch cũa tế bào, tạo globulin miển dịch tăng cường khả bảo vệ sớm hiệu cho thể Khi tiêu hía vaccine ăn được, kháng nguyên giải phong ruột non Với ưu điểm nỗi bật vaccine việc sản xuất vaccine ăn đuợc xem hệ thống sản xuất vaccine lý tưởng đơn giản giá thành thấp [22] 1.2.3 Những nguy tiềm ẩn chuyển gen 1.2.3.1.Những nguy tiềm ẩn việc phát triển kỹ thuật Mối nguy hiểm việc vơ tình đưa chất gây dị ứng làm giảm dinh dưỡng vào thực phẩm Khả phát tán gen biến nạp trồng sang họ hàng hoang dại Sâu bệnh có nguy tăng cường tính kháng với chất độc tiết từ chuyển gen Nguy chất độc tác động tới sinh vật sinh vật cần diệt [2] Các chuyển gen đánh giá cẩn thận ảnh hưởng tới môi trường trước đưa thị trường Chúng nhà chức tránh đánh giá tuân theo quy tắc chuyên gia môi trường khắp giới đưa Hội đồng nghiên cứu quốc gia Mỹ năm 1989; Tổ chức hợp tác phát triển kinh tế năm 1992; phủ Canada năm 1994 Có ảnh hưởng khơng mong muốn như: - Ảnh hưởng lên sinh vật sinh vật cần diệt mơi trường - Cây chuyển gen có tồn mơi trường lâu bình thường xâm chiếm nơi cư ngụ - Khả gen phát tán ý muốn từ chuyển gen sang loài khác [18] II Các phương pháp chuyển gen vào thực vật Các phương pháp biểu gen dựa thực vật phát triển từ cuối năm 1970 đầu 1980 Hiện nay, xếp phương pháp vào hai nhóm sau: Chuyển gen ổn định tức gen quan tâm bảo tồn qua nhiều hệ gắn vào hệ gen vật chủ (chuyển gen vào nhân plastid) biểu gen tạm thời dựa Agrobacterium vector virus thực vật, theo nguyên tắc sử dụng phương pháp chuyển gen vào thực vật tạo thực vật chứa vaccine ăn được, nhiên người ta tạo thành công vaccine ăn nhờ súng bắn gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium [22] 2.1 Biến nạp gián tiếp thông qua Agrobacterium 2.1.1 Đặc điểm vi khuẩn Agrobacterium A tumefaciens lồi vi khuẩn đất, có dạng hình gậy, kích thước 2.5-3.0 x 0.7-0.8mm, dạng đơn bào, khơng tạo bào tử, có vỏ lơng roi, vi khuẩn háo khí, nhuộm gram (-) ,khuẩn lạc trịn rìa nhẵn.Khuẩn lạc màu trắng kem, nhẵn, bóng, trịn, nhỏ, rìa đặn có màu xanh da trời nhạt sau đậm dần mơi trường thị D2M Vi khuẩn A tumefaciens khơng có khả khử arginine, khơng phân giải gelatin; phân giải loại đường, tinh bột, tryptophan, tạo NH3 H2S, khử oxydase Agrobacterium tạo gây khối u (chuyển T-DNA) nhiệt độ 290C khoảng pH baz Lý hệ thống protein vir đặc biệt virA nhạy cảm với nhiệt độ, chúng bất hoạt 29 0C biến tính 320C, hiệu suất chuyển gene cao 22 0C khoảng pH từ 5.2 - 5.7, điều giải thích thụ thể nhận biết ký chủ Agrobacterium (ChvE-VirA)được hoạt hóa proton hợp chất phenolic bị bất hoạt môi trường baz Một protein Vir A bị bất họat tế bào vi khuẩn khả hoạt hóa tồn hệ thống protein vir dẫn đến khả chuyển gen [9] 2.1.2 Cấu trúc tế bào vi khuẩn Agrobacterium Agrobacterium tumefaciens có chứa nhiễm sắc thể plasmid lớn kích thước khoảng 200 kb gọi Tiplasmid tác nhân truyền bệnh cho Khi bị nhiễm A.tumefaciens qua vết thương, biểu rỏ khối u hình thành chổ lây nhiểm hình thành khối u sau tiếp tục mà khơng cần thiết phải có diện vi khuẩn Khả có A.tumefaciens chuyển đoạn DNA Tiplasmid xâm nhập vào hệ gen bị bệnh [16] Ti-plasmid Ti-plasmid plasmid lớn 200kb, chúng trì ổn định Agrobacterium nhiệt độ 30 0C Trên Ti-plasmid có đoạn T- AND có giới hạn bờ phải (right border) bờ trái (left border) Trình tự nucleotid bờ phải bờ trái tương tự Đoạn gọi T-AND đoạn chuyển vào tế bào thực vật gắn vào NST gây bệnh khối u T-DNA vi khuẩn chuyển vào tế bào thực vật hợp với gen nhân (tế bào thực vật) T-DNA ổn định gen nhân.Vị trí hợp T-DNA vào DNA thực vật hoàn toàn ngẫu nhiên Vùng vir: vùng chứa Gene vir (virulence gene) mã hóa cho protein thực việc cắt, chuyển gắn T-DNA vào genome thực vật Vùng CON:vùng mã hóa chức tiếp hợp Vùng ORI :vùng mã hóa chức tái khởi điểm tái [16] A Ti-plasmid kiểu octopine (pTiAch5) kiểu nopaline (pTiC58) cho thấy vị trí tương đối kích thước vùng chức Các vị trí tơ đậm vùng tương đồng lớn plasmid CON: vùng mã hóa chức tiếp hợp ORI: vùng mã hóa chức tái khởi điểm tái B Bản đồ vùng T kiểu nopaline octopine cho thấy vùng chức chính, vùng tương đồng sản phẩm phiên mã Ti-plasmid kiểu octopine nopaline T-DNA Đó đoạn DNA có kích thước 25 kb chứa gen mã hóa cho sinh tổng hợp auxin, cytokinin, opine gen gây khối u (oncogenes) Trong Ti-plasmid, vị trí T-DNA giới hạn RB LB Ngoài T-DNA, Ti-plasmid cịn có vùng DNA mã hóa cho việc tái sinh plasmid (replication), cho khả lây nhiễm tiếp hợp (vùng vir), cho việc tiêu hóa opine (opine catabolism) Trong vùng DNA Ti-plasmid, T-DNA, nghiên cứu nhiều vùng DNA phụ trách khả lây nhiễm gọi vùng vir Sản phẩm hoạt động gen nằm vùng vir tác động kích thích hợp chất phenol tiết từ vết thương loạt protein đặc hiệu virE2, virB, virD, virD2, virC1 Các protein nhận biết vết thương chủ thích hợp (hầu hết hai mầm), kích thích sản sinh đoạn T-DNA, bao bọc che chở đoạn DNA giúp chúng tiếp cận với hệ gen chủ cách an toàn Khi nhiễm A tumefaciens, TDNA nạp vào hệ gen chủ bắt đầu hoạt động sản sinh auxin, cytokinin opine, toàn sinh trưởng bị rối loạn, tế bào phân chia vô tổ chức tạo khối u Opine vi khuẩn sử dụng loại “thức ăn” nhờ gen chuyển hóa opine Ti-plasmid thay đổi hình thái thực vật chúng tạo nhiều rễ tơ (hairy roots) bị nhiễm bệnh Trên thực tế Agrobacterium gây hại hai mầm, người ta cho chúng đưa T-DNA vào hệ gen hai mầm Gần đây, nhiều tác giả chứng minh nhiễm vi khuẩn, mầm sản xuất opine khai thác khả biến nạp gen vi khuẩn Agrobacterium vào mầm [4] Bản đồ dạng Ti-plasmid A: dạng tự nhiên ban đầu, B: dạng cis, C: dạng trans Phương thức chuyển T-DNA vào gen thực vật 2.1.3 Cơ chế tác dụng Agrobacterium Cơ chế gây bệnh Agrobacterium sau xâm nhiễm vào tế bào, chúng gắn đoạn T-DNA vào máy di truyền tế bào thực vật, dẫn đến rối loạn chất sinh trưởng nội sinh, tạo khối u Khả chuyển gen khai thác để chuyển gen ngoại lai vào máy di truyền tế bào thực vật theo ý muốn Để gắn T-DNA vào tế bào thực vật, vi khuẩn A tumefaciens phải tiếp xúc với thành tế bào thực vật bị tổn thương Quá trình thực nhờ gen chvA chvB Gen chvB mã hóa protein liên quan đến hình thành β-1,2 glucan mạch vịng, gen chvA xác định protein vận chuyển, định vị màng tế bào vi khuẩn Protein vận chuyển giúp vận chuyển β-1,2 glucan vào khoảng thành tế bào màng sinh chất β1,2 glucan giữ vai trò quan trọng để vi khuẩn Agrobacterium tiếp xúc với thành tế bào thực vật Nếu khơng có tiếp xúc này, khơng có dẫn truyền T-DNA Các sản phẩm protein vùng vir có tác dụng cho việc dẫn truyền T-DNA từ vi khuẩn vào tế bào thực vật Các loại protein cần thiết cho trình cắt T-DNA khỏi Ti-plasmid, cảm ứng thay đổi màng tế bào thực vật mà chúng tiếp xúc, tham gia di chuyển phần T-DNA qua màng vi khuẩn tới tế bào chất tế bào thực vật, vận chuyển tới nhân cuối xâm nhập vào gen chủ Thực chất riêng T-DNA Ti-plasmid chuyển vào gen tế bào thực vật, mà không cịn phần khác Q trình dẫn truyền sản phẩm gen vir (vùng vir) gen chv định mà không liên quan đến gen khác T-DNA Tuy nhiên, chuỗi DNA 25 bp (RB LB T-DNA) có vai trị vị trí cảm ứng cho sản phẩm tổ hợp gen vùng vir, đặc biệt protein từ gen virE mang chúng dẫn truyền vào tế bào thực vật Chúng hoạt động tín hiệu nhận biết khởi động trình dẫn truyền Trước hết gen virA tổ hợp gen vùng vir phosphoryl hóa nhờ tác động hợp chất phenol acetosyringone giải phóng từ tế bào thực vật tổn thương Sản phẩm q trình lại tiếp tục phosphoryl hóa gen virG Sản phẩm gen virG liên tiếp làm hoạt hóa tồn gen vir cịn lại, mà hai gen cuối hoạt hóa gen virB virE Trước đó, gen virD hoạt hóa, sản phẩm cảm ứng nhận biết RB LB T-DNA làm đứt phần T-DNA khỏi DNA Ti-plasmid thành sợi đơn Đồng thời trình phosphoryl hóa làm thay đổi thẩm xuất màng tế bào thực vật, màng tế bào bị mềm bị thủng Các sợi đơn T-DNA gắn vào protein gen virE tổng hợp dịch chuyển phía màng tế bào vi khuẩn Ngay sau đó, sợi T-DNA trượt từ vi khuẩn vào tế bào thực vật Cầu nối tiếp hợp hai tế bào cảm ứng sản phẩm gen virB mà thành Khi T-DNA chuyển giao vào tế bào thực vật, chúng nhanh chóng hợp gen tế bào thực vật ổn định di truyền gen bình thường khác [4] Ðể khai thác sử dụng A tumefaciens vector chuyển gen nhà khoa học loại bỏ gen gây khối u gen mã hoá opine T - DNA thay vào marker chọn lọc, trì vùng bờ phải bờ trái T-DNA gen vir Gen chuyển xen vào vùng bờ T-DNA Nó chuyển vào tế bào trở nên hợp với nhiễm sắc thể tế bào thực vật Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium kiểm tra xâm nhập bền vững, biểu di truyền gen chuyển đặc biệt Một vài yếu tố ảnh hưởng đến hiệu biến nạp loại mô biến nạp, giai đoạn phát triển mô, mức độ khởi đầu vi khuẩn A tumefaciens sử dụng, môi trường để nuôi cấy mô sau biến nạp, marker sử dụng để chọn lọc thể biến nạp, loại vector sử dụng kiểu gen thực vật [21] 10 2.1.5 Ưu nhược điểm phương pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium 2.1.5.1 Ưu điểm Hiệu suất cao Khi xem xét vị trí biểu màu xanh chàm phản ứng GUS (của chất với enzym B-Gluconidase), người ta nhận thấy Agrobacterium có xu hướng chuyển gene vào vùng mô phân sinh mạnh Đây lợi lớn phương pháp mơ phân sinh nơi mà chồi (đã “bị” chuyển gen) dễ dàng tạo thành Khai thác đặc tính này, trước tiến hành hoạt hóa vi khuẩn, người ta cịn tiến hành hoạt hóa mẫu mơ thực vật, mơ tăng sinh mạnh hiệu suất chuyển gene cao Đối với phương pháp khác bắn gen Silicon Carbide…tuy thực tất đối tượng thực vật gene mục tiêu chuyển cách ngẫu nhiên, không định hướng Gene mục tiêu bị đào thải, tồn bền vững thể thực vật phụ thuộc chặt chẽ vào hệ thống protein vir (virulent) Ở phương pháp khác, gene mục tiêu tái tổ hợp chuyên biệt nhờ trình tự IS hai đầu dễ dàng tách sau [7] 2.1.5.2 Nhược điểm Agrobacterium có phổ cơng có giới hạn, gây khối u cho khỏa tử hai mầm lại gây khối u cho mầm Lý mầm thuộc nhóm thực vật tiến hóa (tiến hóa giới thực vật), tích lũy nhiều chế kháng bệnh hai mầm vách cellulose tẩm silic làm tăng độ bền; bị thương, phần mơ bị thương có xu hướng hóa gỗ để bảo vệ, không phân chia mạnh để tái tạo tiết hợp chất phenol hai mầm Tuy nhiên, thời điểm này, người ta tìm nhiều chủng Agrobacterium có khả chuyển gene cho số mầm bắp, lúa, cỏ, mía, lan…ứng dụng tạo gạo vàng, phong lan phát sáng [6] Phương pháp có số bất lợi: plasmid Ti gắn gen ngẫu nhiên vào hệ gen thực vật, làm tăng tính khơng đồng mức độ biểu kháng nguyên chuyển gen Ngoài cách gắn gen phá vỡ biểu gen dẫn đến sinh trưởng bất thường chuyển gen Tất dịng Agrobacterium có nguồn gốc tự nhiên, mang số đặc tính chủng hoang dại [7] III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Ứng dụng 3.1.1 Trong nông nghiệp Các tính trạng biến nạp gen khoai tây gồm: kháng nấm, sâu bọ giun tròn, kháng thuốc diệt cỏ, thay đổi thành phần tinh bột, chống chịu stress chống bầm dập củ Ngoài ra, khoai tây trồng củ thay hạt, tạp nhiễm chuyển gen không truyền cho hệ Nguy lưu chuyển gen có để mọc hoang phát triển ruộng từ vụ sang vụ khác Khả lai xa nạp gen khoai tây họ hàng hoang dại thấp 12 Khoai tây kháng trùng: Khoai tây mang gen sản xuất protein kháng sâu tạo cho khả tự bảo vệ trước bọ khoai tây Colorado Giống khoai tây chuyển gen nhằm kháng virus xoăn khoai tây (PLRV) virus khoai tây Y (PVY) Loại khoai tây chuyển gen virus để tự kháng lại virus [10] Thực việc chuyển nạp hiệu lúa kiểu gen độc lập, 40 giống chuyển gen thành công Mẫu vật sử dụng phơi non callus có nguồn gốc từ hạt trưởng thành Kháng hygromycin B gen thị chọn lọc thường dùng cho lúa Kỹ thuật chuyển gen lúa thơng qua Agrobacterium có cải tiến quan trọng có hiệu Những giống lúa có suất cao, giàu dinh dưỡng, kháng sâu bệnh, chịu đất mặn, gạo cho sản lượng lượng thực cao [5] Cà chua chín chậm: Là loại thực phẩm chuyển gen sản xuất nước phát triển Giống cà chua có thời gian lưu quầy bán hàng dài Nó mang gen làm chậm trình trình mềm tự nhiên chín Loại giữ lâu so với giống khác, bảo quản tươi lâu Hơn nữa, thời gian lưu giữ quầy bán hàng dài tăng giá trị thương mại sau thu hoạch bảo quản, giảm giá thành sản phẩm Được trồng Canada , Nhật Mỹ Tạo cà chua với hàm lượng flavonol cao; cà chua với hàm lượng lycopene cao.Các nhà khoa học Mỹ tạo loại cà chua sống vùng đất nhiễm mặn mà cho thơm ngon, giữ lâu ngày không bị thối [11] Ngô kháng côn trùng (sâu đục thân): Là loại ngô chuyển gen sản xuất loại protein tinh thể (crystal protein) Protein cho phép ngơ có khả kháng ổn định sâu đục thân Người ta tạo ngô kháng bệnh sâu bướm Các đặc tính chất lượng nhằm nâng cao chất lượng thực phẩm: ngô với giá trị làm thức ăn gia súc cao hơn.Các trồng có lợi cho mơi trường chúng ta: ngơ với lợi ích tăng chất phốt pho; trồng chịu áp lực mơi trường, chịu thạch tín ngơ trồng đất nhiễm phèn (có nhiều tính axit) [18] 3.1.2 Trong y học Loại khoai tây chuyển đổi gien (GM), chứa vắc-xin ngừa viêm gan B, người ăn sống khoai tây GM tiêm vắc-xin viêm gan B thông thường nên vaccin khoai tây tăng cường khả miễn dịch họ.Các nhà khoa học phát triển loại khoai tây chứa văcxin chống virut papilloma (HPV) [11] 13 Gen lấy từ nguồn bệnh người chuyển vào vi khuẩn gây nhiễm thực vật Vi khuẩn nhiễm vào mẫu khoai tây mầm tạo đựơc từ mẫu mang gen bệnh người Khi ăn khoai tây gây phản ứng miễn dịch mầm bệnh Chuyển gen vào khoai tây nhờ vi khuẩn Agrobacterium Tạo dược phẩm: ngơ có lợi cho người mắc bệnh xơ nang; Hạt ngô đối tượng quan tâm để sản xuất kháng nguyên vaccine viêm gan B.; ngô với tỷ lệ vitamin E cao [1] Gạo chứa vaccine chống dịch tả Nhóm nghiên cứu giáo sư Hiroshi Kiyono thuộc khoa nghiên cứu miễn dịch, Trường đại học Tokyo đứng đầu, công bố việc phát triển loại gạo có chứa vaccine chữa bệnh dịch tả Các nhà khoa học Nhật Bản vừa tạo loại lúa chuyển gien chứa vaccine ngừa bệnh sốt mùa hè - bệnh dị ứng phấn hoa bụi gây ra.Với đồ gen lúa, người ta tìm gen điều khiển việc sản xuất loại vitamin để tạo giống lúa giàu đạm Việc giúp cải thiện tình trạng thiếu vitamin A trẻ em [23] Văcxin từ cà chua giúp chống bệnh hô hấp :Cà chua sử dụng để chứa văcxin phịng ngừa RSV - loại virut tiềm tàng gây bệnh hô hấp thường công trẻ em Cà chua biểu kháng nguyên vaccine đơn vị virus RSV, virus gây bệnh đường hô hấp nghiêm trọng trẻ sơ sinh trẻ nhỏ [13] 3.2 Thành tựu 3.2.1 Trên giới: Những thành công nhóm nghiên cứu giới chứng tỏ việc sản xuất đưa sản phẩm vaccine thực vật thị trường trở thành thực tương lai không xa Những tiến mà nhà công nghệ sinh học thực vật giới đạt tập trung vào số vấn đề 14 Hầu hết báo cáo sản xuất vaccine ăn liên quan đến phương pháp chuyển gen Agrobacterium promoter phổ biến Nguyên tắc phương pháp lợi dụng lây nhiễm Agrobacterium để vận chuyển phát tán vector virus vào thực vật, sau vector mang gen quan tâm tiến hành chép, nhân lên lây nhiễm cho toàn tế bào Sản xuất vaccine từ thực vật ghi nhận vào năm 1990 cơng trình nghiên cứu biểu protein kháng ngun bề mặt vi khuẩn Sau nhiều thành cơng khác vaccine thực vật đựơc công bố nhiều loài khác thuốc lá, rau diếp, cà chua, khoai tây…Số lượng nghiên cứu đựơc gia tăng chứng tỏ tính ưu việt thực vật hệ thống biểu hiệu cao, chi phí sản xuất thấp, an toàn mặt sinh học, sử dụng bảo quản dể dàng không cần giữ lạnh [22] Để tạo vắc-xin khoai tây, nhóm nghiên cứu Charles Arntzen thuộc ĐH Arizona (Mỹ) đứng đầu bổ sung vào khoai tây thông thường protein virus viêm gan B Khi người ăn khoai tây này, protein giúp hệ miễn dịch nhận tiêu diệt virus viêm gan B tương lai Theo Arntzen, biến thực phẩm thành nguồn vắc-xin rẻ tiền hữu ích nước nghèo khơng phải bỏ nhiều chi phí bảo quản lạnh Khoai tây chứa vaccine ăn mua kim tiêm [11] Thử nghiệm lâm sàng người ghi nhận vào năm 1997 nhóm nghiên cứu Arntzen chấp nhận Cơ quan quản lí dược phẩm thực phẩm Hoa Kì Trong thử nghiệm vaccine đơn vị độc tố E.coli LT-B này, 11 người ăn sống 50-100g khoai tây chuyển gen Kết cho thấy 10/11 người kiểm tra tạo kháng thể chống lại LTB, lượng kháng thể tương ứng với kháng thể đo người niễm E coli nồng độ 106 Như vậy, protein LT-B mô thực vật ăn không bị phân huỷ đường tiêu hố có khả miễn dịch người 15 Hiện nay, Thanavala đồng tác giả (2005) thử nghiệm giai đoạn I II vaccine viêm gan B khoai tây Khi ăn đến liều, liều 100g khoai tây sống tương đương 1mg kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B Trong đó, 33 người định ăn khoai tây chuyển gen mà khơng có tá dược, chất làm tăng khả phản ứng miễn dịch Chuẩn độ kháng nguyên kháng virus viêm gan B huyết đo số lần định ngày Kết cho thấy người ăn khoai tây không chuyển gen chuẩn độ không tăng, 33 người kiểm tra có phản ứng tạo kháng thể với nồng độ 10 mIU/mL Đến năm 2000 có kháng nguyên biểu thành công rau Trong đơn vị B nội độc tố bền nhiệt E coli (LT-B), đơn vị B độc tố tả (CL-B), protein vỏ capsid virus Norwalk kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B sản xuất khoai tây [2] 16 Mô hình phát triển vaccine thực phẩm Năm 2005, báo cáo vaccine ăn thực vật, có phân tích sâu sắc đối tượng thực vật sử dụng để sản xuất vaccine, đặc biệt viêm gan siêu vi B tiêu chuẩn hệ thống thực vật đáp ứng mục đích này, là: - Mức độ biểu cao - Mức độ kháng nguyên đồng mô thực vật - Nguyên liệu thực vật phải ăn - Kháng nguyên ổn định nhiệt độ phòng bảo quản lâu dài Nhiều nghiên cứu cho thấy, hạt ngô hội tụ tiêu chuẩn hệ thống biểu hiệu cao, đối tượng mà nhóm ơng quan tâm để sản xuất kháng nguyên vaccine viêm gan B Năm 2003, họ biểu thành công đơn vị B độc tố bền nhiệt E.coli (LT-B) Họ thấy phôi mầm hạt ngô chuyển gen tập chung lượng kháng nguyên cao nhất, gấp lần so với phận khác nhân tương ứng với liều mg kháng nguyên Sau đó, năm 2005 nhóm lại biểu thành cơng kháng ngun bề mặt virus viêm gan B hạt ngô Mức độ biểu gen hạt thu từ chuyển gen hệ thứ 0,2% protein hoà tan tổng số, kháng nguyên tập trung tới 20% phơi mầm hạt Nhóm Streatfield đồng tác giả (2003) có đóng góp đáng kể việc sản xuất vaccine ăn Hiện nhóm tham gia vào dự án vaccine dựa thực vật công ty ProdiGene, chủ yếu ngô, đối tượng nghiên cứu xem lý tưởng cho sản xuất vaccine ăn Nhóm xây dựng thành công hệ thống sản xuất 17 vaccine viêm gan B ngơ sử dụng dạng bánh snack (ngô qua chế biến nghiền thành bột) [15] GS Parrot giới thiệu số thành tựu công nghệ sinh học, ứng dụng đậu nành ngô chuyển gen Mỹ Hai loài thực vật này, sau chuyển gen, có khả đề kháng sâu bệnh cho suất cao hẳn Nhóm nghiên cứu giáo sư Hiroshi Kiyono thuộc khoa nghiên cứu miễn dịch, Trường đại học Tokyo đứng đầu, công bố việc phát triển loại gạo có chứa vaccine chữa bệnh dịch tả Tiến giảm bớt khó khăn cho việc phân phối vaccine quốc gia phát triển thời gian tới Các loại vaccine tiêm thông thường không tạo phản ứng miễn nhiễm nơi có màng nhầy thể Do loại vaccine có tác dụng tốt việc chống lại tác nhân gây nhiễm thông thường qua màng nhầy, ví dụ virus Với bát cơm từ lúa chuyển gien, vừa no bụng lại vừa trị bệnh dịch tả, E coli, virus gây suy giảm hệ miễn dịch người, virus cúm SARS Các nhà nghiên cứu Nhật Bản tạo phản ứng miễn nhiễm chuột, đồng thời tránh phản ứng dị ứng với loại gạo Ngoài ra, loại gạo chuyển hố gen trữ nhiệt độ thông thường mà không gặp nguy nhiễm khuẩn [5] Mặc dù thế, việc sử dụng loại gạo biến đổi để tạo nên phản ứng vaccine nghĩa loại vaccine ăn Các nhà khoa học không muốn công chúng nghĩ ăn gạo chủng ngừa Thay vào đó, vaccine cung cấp dạng viên nhộng viên nén có chứa bột gạo xem thuốc thực phẩm [12] Các nhà khoa học Nhật Bản vừa tạo loại lúa chuyển gien chứa vaccine ngừa bệnh sốt mùa hè - bệnh dị ứng phấn hoa bụi gây ra.Các thử nghiệm chuột cho thấy loại vaccine dạng lúa ăn ngăn phản ứng miễn dịch gây dị ứng Cụ 18 thể chuột ăn lúa chuyển gien nói hắt tiếp xúc với phấn hoa, so với khơng ăn lúa (nhóm đối chứng) [19] Viện Công nghệ khoa học thực vật Thụy Sĩ thành công việc tạo giống lúa “vàng” chứa phong phú beta-caroten (vitamin A) giống lúa Quỹ Rockefeller tài trợ để triển khai số nước phát triển Với giống lúa người ta hy vọng se cứu nhiều người số 500 000 người bị mù lòa giới hàng năm [10] Loại gạo chữa dị ứng chứa vacxin ăn được:Dị ứng vấn đề sức khoẻ đáng ý, ảnh hưởng đến 15% trẻ em người lớn giới Dị ứng xảy da, máy hơ hấp ruột, nặng lên nhiều loại tác nhân bên ngồi mơi trường khác nhau, tiếp xúc với phấn hoa, sợi, số loại phân tử định có mặt thực phẩm Sử dụng loại thuốc tổng hợp phương pháp phổ biến để chữa trị dị ứng, Tuy nhiên ông Hidenori Takagi Tsukuba, Nhật Bản đồng nghiệp tìm kiếm phương pháp chữa trị khác, thơng qua tìm hiểu: loại vắc xin ăn dựa lúa gạo‘’Rice-based edible vaccine’’ nhờ vào việc biểu thị “multiple T cell epitopes”, kích thích chống lại ức chế “Th2-mediated IgE responses ” Nghiên cứu họ đăng số Kỷ yếu trực tuyến Viện hàn lâm khoa học quốc gia Khi thử nghiệm gạo chuyển gen trên chuột, nhà khoa học thấy chuột ăn loại gạo thể hàm lượng histamine thấp hơn, không phát triển tượng dị ứng phấn hoa Loại prôtêin tồn ổn định hạt gạo vòng tháng, tồn trữ phịng có nhiệt độ cao [8] Cà chua sử dụng để chứa văcxin phòng ngừa RSV - loại virut tiềm tàng gây bệnh hô hấp thường công trẻ em RSV khiến cho gần 90.000 người phải nhập viện 4.500 trẻ sơ sinh trẻ em tử vong năm Bộ Nông nghiệp Mỹ tài trợ cho nhóm nhà khoa học Đại học Illinois nhằm nâng cao tính di truyền cà chua Văcxin tạo khả bảo vệ màng nhầy cách kích thích kháng thể kháng lại protêin RSV chúng xâm nhập lần đầu vào thể qua đường mũi, họng miệng 19 Dự án triển khai nhiều năm song thử nghiệm ban đầu PTN chuột có triển vọng [13] Korban đồng tác giả biểu kháng nguyên vaccine đơn vị virus RSV cà chua, virus gây bệnh đường hô hấp nghiêm trọng trẻ sơ sinh trẻ nhỏ Các thiết kế gen (một loại mang promoter CaMV 35 S loại mang promoter đặc hiệu E-8) chứa gen mã hoá cho kháng nguyên RVS-F chuyển vào cà chua thông qua phương pháp chuyển gen Agrobacterium Sử dụng promoter đặc hiệu cho phép biểu protein tất chuyển gen Protein tạo đáp ứng miễn dịch thử nghiệm chuột [25] Các vaccine sản xuất thực vật nâng cao giá trị trồng, chuyển gen chúng trồng chế biến quy mô lớn, đáp ứng nhu cầu thuốc sinh dược phẩm Vaccine ăn mở kỉ nguyên nông nghiệp, nhà khoa học gọi “biofarming”, nơng nghiệp cải biến chất lượng (tăng cường giá trị dinh dưỡng, làm thuốc), trồng khu vực đặc biệt sử dụng đặc biệt “nhà máy” sản xuất vaccine tác nhân kháng khuẩn khác Như vậy, vấn đề tồn sản xuất vaccine ăn từ thực vật mở hướng nghiên cứu quan trọng cho nhà khoa học đường tìm kiếm vaccine giá rẻ, cung cấp đến nơi giới, đặc biệt nước phát triển Và rõ ràng lĩnh vực đầy tiềm bước vào giai đoạn phát triển sơi động, địi hỏi hợp tác nhiều nhà khoa học giới giải khó khăn Trong đó, việc chuyển giao công nghệ sản xuất vaccine ăn đến nước phát triển cần thiết quốc gia thực cần loại vaccine [24] Đặc biệt ngô mang gen chống sâu hại gieo trồng rộng rãi thu hiệu kinh tế cao rõ rệt Năm 2006 Mỹ 61% diện tích trồng ngơ trồng giống chuyển gen (GMO hay GMC-genetically modified cultures) Ngơ GMC ngồi khả chống sâu hại cịn có có thêm khả kháng thuốc trừ cỏ Ngô kháng sâu hại nhanh chóng trồng nhiều nước [12] Từ năm 1994 Công ty Calgene (Mỹ) đưa thị trường loại cà chua chuyển gen Flavr Savr Mùa hè 1996 sốt cà chua chuyển gen Flavr Savr bắt đầu bán châu Âu 20 Trong số loại biến đổi gen, đỗ tương ngơ trồng rộng rãi (chiếm 82%), sau bơng khoai tây Tính kháng thuốc trừ cỏ chiếm 74%, kháng sâu bệnh chiếm 19%, vừa kháng sâu bệnh vừa kháng thuốc trừ cỏ chiếm 7% Nhìn chung, diện tích trồng biến đổi gen tăng lên 25 lần vòng năm qua, từ khoảng 4,3 triệu năm 1996 lên đến 109 triệu năm 2000, gần gấp đơi diện tích nước Anh Trong đó, khoảng 99 triệu thuộc Mỹ Argentina Riêng Mỹ, số lượng đỗ tương biến đổi gen năm 2000 chiếm khoảng 54% tổng số đỗ tương toàn quốc (năm 1996 chiếm 7%), bơng 61%, ngơ 25% Năm 2000, có 13 quốc gia tham gia canh tác trồng biến đổi gen, nước Mỹ chiếm tỷ trọng lớn 68% Argentina, Canada Trung Quốc chiếm tỷ trọng 23%, 7%, 1% Các nước lại bắt đầu tham gia vào lĩnh vực mẻ Australia, Bulgaria, Pháp, Đức, Mexico, Rumani, Nam Phi, Tây Ban Nha Uruguay Ngoài việc chuyển vào trồng gen kháng sâu hại, gen kháng thuốc diệt cỏ người ta chuyển gen đề kháng với số bệnh virut, vi khuẩn nấm gây trồng Bên cạnh việc chuyển gen chịu lạnh cho lương thực, thực phẩm trồng nước ôn đới, đặc biệt cho thuốc khoai tây, vốn chịu lạnh Cũng có thành cơng việc chuyển gen kháng hạn kháng mặn cho trồng Các nhà nghiên cứu Viện Gần số thực vật chuyển gen dùng để thu hút kim loại nặng đất làm giải tỏa tình trạng ô nhiễm môi trường kim loại nặng [14] 3.2.2 Ở Việt Nam Tạo vắc-xin viêm gan B "ăn được" từ trái cà chua Các nhà khoa học thuộc Phòng Công nghệ Gen - Viện Sinh học Nhiệt đới TP.HCM tiến hành nghiên cứu vắcxin ngừa viêm gan B ăn từ phận ăn tươi quả, lá, thân, củ có cà chua Nước ta vùng lưu hành cao bệnh viêm gan siêu vi B (HBV) Tỷ lệ người mang mầm bệnh vào khoảng 10 15% dân số (trên 10 triệu người) Bệnh lây lan theo hướng đa dạng phức tạp, 21 dẫn đến xơ gan ung thư gan Cách tốt phòng ngừa biện pháp phòng ngừa quan trọng chủng ngừa Tại Viện Sinh học nhiệt đới TP.HCM, thuộc Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, Một nhóm nghiên cứu Phịng Cơng nghệ Gen, tiến hành nghiên cứu vắc-xin ngừa viêm gan B ăn từ phận ăn tươi quả, lá, thân, củ Trong có trái cà chua Hiện nay, giới có nhiều cơng bố khoa học, dùng cơng nghệ chuyển gien mã hóa protein HBsAg vào nhân lục lạp tế bào, vào số trồng, Theo nhóm nghiên cứu, thành phần quan trọng HBV protein HBsAg giúp cho HBV bám dính vào mảng tế bào sau vào tế bào huyết tương người bệnh Huyết tương có chứa HBsAg nguồn vật liệu quan trọng để sản xuất thuốc chủng ngừa có nguồn gốc huyết tương Các nhà khoa học chiết tách phần protein tinh khiết nghiên cứu khả đáp ứng miễn dịch thể động vật cách tiêm chích protein tinh khiết ăn trực tiếp sản phẩm chuyển gien Qua kết trên, nhóm nghiên cứu Phịng Cơng nghệ Gen - Viện Sinh học nhiệt đới nhận thấy, protein kháng nguyên HBsAg sử dụng qua đường tiêu hóa có khả tạo đáp ứng miễn dịch tốt Điều mở triển vọng nghiên cứu chuyển nạp gien vào trồng có phận ăn tươi quả, lá, thân, củ Với phương pháp chuyển gien vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, kết nghiên cứu Viện Sinh học nhiệt đới nhận số loại có cà chua mang gien mã hố kháng nguyên bề mặt vi-rút viêm gan B [25] Việt Nam đạt số thành tựu đáng ghi nhận nghiên cứu gen, việc phát gen kháng sâu thuốc diệt cỏ, gen thị liên quan đến khả chống bệnh đạo ôn, bạc lúa, nhân gen, thị phân tử ADN, nghiên cứu di truyền miễn dịch thực vật, sản xuất vacxin cho gia súc, gia cầm [5] Do giá lương thực thực phẩm ngày cao, trồng suất cịn hạn chế Vì vậy, để thúc đẩy sản xuất hàng hố lớn, cần ứng dụng hài hồ kỹ thuật (CNSH) sản xuất truyền thống người dân Bước khởi đầu, phải thông báo rộng rãi kiến thức trồng biến đổi gen tới nhà lập pháp, nhà khoa học, bà nông dân để người hiểu biết 22 trồng Việt Nam sản xuất giống lúa chịu hạn, không trồng vùng trung du thiếu nước mà lúa sống vùng miền núi khô cạn [14] 4.Kết luận Hiện nay, phương pháp chuyển gen vào trồng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (At) xem phương pháp có hiệu phương pháp mà qua kết chuyển gen (ở phân tích Southern blot) thường biểu kiểu tích hợp gen (DNA integration) tương đối đơn giản - phù hợp với mục tiêu nhà cơng nghệ gen Vì vậy,việc tạo chủng vi khuẩn At mang gen chuyển yêu cầu cần thiết [20] Như vậy, nhờ công nghệ chuyển gen, người ta tạo giống đem lại nhiều lợi ích lâu dài, đặc biệt hạn chế tối đa việc sử dụng phân bón hóa học ngành trồng trọt giảm thiểu nhiễm mơi trường Ngồi ra, sản xuất loại thuốc quý, chữa bệnh cho người tạo polyme sinh học dùng bao gói, vận chuyển thuận tiện tiêu hủy, làm môi trường Từ năm 1996 đến 2002, tổng diện tích trồng thực vật chuyển gen giới từ 1,7 triệu héc-ta tăng lên 58,7 triệu héc-ta, gấp 35 lần Các nước phát triển hướng mạnh vào loại trồng này, họ coi trồng xóa đói nghèo Trong số thực vật chuyển gen trồng giới, đậu tương, ngô chiếm tới 77% Các loại khác có dấu hiệu cho tương lai hứa hẹn Năm 2002, tổng giá trị thị trường tồn cầu ước tính khoảng 4,25 tỷ USD, tăng 400 triệu USD so với năm 2001 Như vậy, thực vật chuyển gen hướng công nghệ cao CNSH phục vụ nông nghiệp bắt đầu phát triển mạnh mẽ, tạo lợi nhuận đáng kể cho nông dân người tiêu dùng, bảo vệ môi trường hệ sinh thái bền vững [11] Những mối quan tâm tới sinh thái môi trường xuất phát từ chuyển gen đánh giá trước thương mại hố chúng Đồng thời cần có kiểm sốt hệ thống nơng nghiệp tốt để phát giảm thiểu mối nguy hại xảy Chúng ta cần so sánh phương pháp chuyển gen, phương pháp truyền thống phương pháp nông nghiệp khác để làm sáng tỏ mối rủi ro tương đối lợi ích việc áp dụng trồng chuyển gen Một điểm đặc trưng kỹ thuật chuyển gen đưa vào hay nhiều gen 23 xác định rõ Điều giúp cho việc thử nghiệm độc tính trồng chuyển gen dễ thực so với trồng bình thường [24] Các gen mã hóa thơng tin di truyền có mặt tất loại thực phẩm việc ăn chúng không gây ảnh hưởng xấu nào, khơng có tác hại di truyền Hiện nay, sản phẩm lương thực-thực phẩm cơng nghệ sinh học tạo có mặt thị trường Những trồng biến đổi gen giống trồng truyền thống chúng có thêm số đặc điểm cải thiện Chúng khơng có lợi cho nơng dân mà cịn cho người tiêu dùng Người nông dân gặt hái vụ mùa bội thu, người tiêu dùng quanh năm lại có nhiều loại sản phẩm để lựa chọn Ngoài ra, giống tạo cơng nghệ sinh học cịn có tiềm bảo vệ mơi trường [14] Mặc dù có sai số, có điều rõ ràng rằng, để bảo vệ môi trường chúng ta, lương thực đáp ứng nhu cầu tương lai dựa quỹ đất có Do đó, điều quan trọng phải sử dụng tất biện pháp để giải vấn đề cấp thiết Nhìn chung, việc sử dụng giống trồng chuyển gen đem lại lợi nhuận đáng kể cho nước phát triển “Thế hệ đầu tiên” giống chứng minh khả tăng suất trồng, giảm giá thành sản phẩm, tăng lợi nhuận nông nghiệp góp phần bảo vệ mơi trường Hiện nay, nghiên cứu hướng đến trồng biến đổi gen “thế hệ thứ hai”, tập trung vào việc tăng chất lượng dinh dưỡng khả chế biến Các giống trồng khẳng định giá trị chúng quốc gia có hàng triệu người dân bị thiếu hụt thực phẩm [25] 24 Tài Liệu tham khảo Tài liệu Mạng http://abeurope.dynamicweb.dk/images/files/abe_issues_paper_6.pdf http://agbiotech.com.vn/vn/?key=570&mnu=preview http://chebien.gov.vn/index.asp?m=0700&bydate=&page=8&layID=3527 http:// elearning.hueuni.edu.vn/ /htm/c4.htm http:// huyhoang86.info/diendan/chuyen-de-sinh-vat-chuyen-gen/61-lua chuyen gen chua vacxin.html http://img207.imageshack.us/img207/1924/agrobacteriumbmp3au.th.jpg http://img90.imageshack.us/img90/5112/vir9vv.th.jpg http://rd.bcentral.com/ (Theo agbiotech VietNam) http://sinhhocvietnam.com 10 http://vietsciences.free.fr/thuctap_khoahoc/thanhtuukhoahoc/thucphamchuyengen.htm 11 http://vietnamnet.vn/khoahoc/xuhuong/2005/02/374986 12 http://www.isb.vt.edu/news/2006/news06.apr.htm 13 http://www.sinhhocvietnam.com/vn/modules.php?name=News&file=article&sid=842 14 www.agbiotech.com.vn/vn/?mnu=preview&key=2312 15 www.tivituansan.com.au/Details.asp?nID=501 Tài liệu Tiếng việt 16 GS.TS.Nguyễn Quang Thạch, TS Nguyễn Thị Lý Anh,TS Nguyễn Thị Phương Thảo (2005), Giáo trình cơng nghệ sinh học nông nghiệp, Trường ĐH Nông Nghiệp I 25 17 James, C 2005 Tình trạng chuyển gien/ trồng CNSH đưa vào canh tác đại trà toàn giới năm 2005 Báo cáo tóm tắt số 34 ISAAA: Ithaca, NY 18 Nguồn tin công nghệ sinh học trồng - ISAAA 25/4/03 19 Nguyễn Lân Dũng (07/02/2008) Thực phẩm chuyển gen - Vietsciences 20 Phạm Thị Hạnh, Lê Tấn Ðức, Nguyễn Hữu Hổ, Tạo số dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, Dùng cho biến nạp gen, Viện Sinh học Nhiệt đới - Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam 21 Stanton B.Gelvin 2000 Agrobacterium and plant genes involved in T-dna transfer and integration 22 Tạp chí cơng nghệ sinh học số năm 2005 23 Tạp chí sinh lý học thực vật ngày 11/4/2003 - Plant Physiology (131, 1748-1755) 24 Trung tâm kiến thức toàn cầu trồng CNSH Tài liệu phổ biến kiến thức dạng bỏ túi Pocket K No 25.ViệtNamNet-Xử lý tin: Trọng An 26 ... nay, phương pháp chuyển gen vào trồng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (At) xem phương pháp có hiệu phương pháp mà qua kết chuyển gen (ở phân tích Southern blot) thường biểu kiểu tích hợp gen. .. chuyển vào trồng gen kháng sâu hại, gen kháng thuốc diệt cỏ người ta chuyển gen đề kháng với số bệnh virut, vi khuẩn nấm gây trồng Bên cạnh vi? ??c chuyển gen chịu lạnh cho lương thực, thực phẩm trồng. .. bắn gen Các phương pháp phức tạp hiệu bao gồm sử dụng phức hợp lipid-DNA (liposome), vector virus, tế bào gốc phôi, chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium, chuyển gen súng bắn gen Phương