Phương pháp chuyển gen vào cây trồng bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Phương pháp chuyển gen vào cây trồng bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tài liệu, giáo án, bài giảng , luận văn, lu...

MỤC LỤC

Trang

LỜI MỞ ĐẦU 2

I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Khái niệm thực vật chuyển gen

1.2 Cơ sở khoa học

1.2.1 Nguyên lý chuyển gen vào thực vật

1.2.2 Những lợi ích của cây chuyển gen

1.2.2.1.Tăng sản lượng :

1.2.2.2 Tăng lợi nhuận nông nghiệp và giảm chi phí sản xuất

1.2.2.3.Cải thiện môi trường

1.2.2.4 Tác dụng trong y học

1.2.3 Những nguy cơ tiềm ẩn của cây chuyển gen

1.2.3.1.Những nguy cơ tiềm ẩn trong việc phát triển những kỹ thuật mới

II Các phương pháp chuyển gen vào thực vật

2.1 Biến nạp gián tiếp thông qua Agrobacterium

2.1.1 Đặc điểm của vi khuẩn Agrobacterium

2.1.2 Cấu trúc tế bào vi khuẩn Agrobacterium .

2.1.3 Cơ chế tác dụng của Agrobacterium

2.1.4.Qui trình chuyển gen bằng Agrobacterium

2.1.5 Ưu và nhược điểm của phương pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium

2.1.5.1 Ưu điểm

2.1.5.2 Nhược điểm

III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Ứng dụng

3.1.1 Trong nông nghiệp

3.1.2 Trong y học

3.2 Thành tựu

3.2.1 Trên thế giới

3.2.2 Ở Việt Nam

4.Kết luận

Tài liệu tham khảo

LỜI MỞ ĐẦU

Việc sử dụng một khối lượng lớn nhiên liệu hoá thạch giúp chúng ta có được đời sốngtiện nghi và hạnh phúc nhưng cũng dẫn đến sự trả giá đắt như hiện tượng ấm lên toàn cầu, sự ônhiễm và hủy hoại môi trường Do nhiều điều kiện bất lợi của môi trường như sự nhiễm vikhuẩn, virus, các loại côn trùng, sự nhiễm mặn, khô hạn, nhiệt độ cao, … Ngay ở Mỹ, sảnlượng nông nghiệp giảm hơn ¼ so với tối đa theo lý thuyết Ngày nay, các loại cây trồngkháng virus, côn trùng hay kháng thuốc trừ cỏ đã được tạo ra bằng việc áp dụng chuyển cácgen mong muốn vào thực vật, đã mang lại những cải thiện quan trọng trong năng suất Các gencải thiện sự tăng trưởng của thực vật trong môi trường axit hoặc kiềm và đất nhiễm mặn đãđược cô lập [9] Bên cạnh đó vấn đề vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh đang là một vấn đềnghiêm trọng với sức khỏe của loài người Cây trồng chuyển gen là hệ thống sản xuất vắc xinthay thế có hiệu quả, vì chúng có thể biểu lộ nhiều loại prôtêin, cũng như thực hiện các thayđổi cần thiết để các loại prôtêin đó hoạt động Hệ thống cây trồng cũng ít khi chứa các loại vikhuẩn có thể là nguồn bệnh đối với động vật, Và việc sản xuất đại trà các loại vaccin trên câytrồng cũng dễ hơn [12]

Nhiều phương pháp khác nhau đã được phát minh để đưa gen vào tế bào và mô độngvật và thực vật Kỹ thuật đơn giản nhất là chuyển DNA trần bằng vi tiêm (microinjection),xung điện (electroporation), súng bắn gen Các phương pháp phức tạp và hiệu quả hơn baogồm sử dụng các phức hợp lipid-DNA (liposome), vector virus, tế bào gốc phôi, chuyển gen

gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium, chuyển gen bằng súng bắn gen Phương pháp để đưa gen mới vào tế bào thực vật bằng việc sử dụng Agrobaterium Phát kiến về việc

Agrobaterium tumefaciens có khả năng chuyển gen vào thực vật đã biến loài này trở thành một

trong những công cụ quan trong nhất của Công nghệ sinh học thực vật A tumefaciens là loài

vi khuẩn đất có khả năng chèn gen của mình vào thực vật và sau đó sử dụng bộ máy thực vật

để biểu hiện các gene này dưới dạng hợp chất dinh dưỡng cho chúng [8]

Tuỳ thuộc vào đối tượng chuyển gen mà người ta lựa chọn phương pháp chuyển genphù hợp Nhiều nhà khoa học tin rằng chuyển gien cây trồng là cách hiệu quả hơn và rẻ tiềnhơn để sản xuất vaccine và thuốc hàng loạt

Công nghệ sinh học trên thế giới phát triển với tốc độ chóng mặt, riêng trong nôngnghiệp đã có hơn 60 triệu ha gieo trồng bằng các giống cây biến đổi gen như: ngô, lúa, đậutương, bông, hoa hướng dương, khoai tây, đu đủ Cây trồng chuyển gen với năng suất và chấtlượng cao đã đem lại lợi ích khổng lồ cho những quốc gia có nền công nghệ sinh học tiên tiến.Đồng thời giảm được việc sử dụng thuốc trừ sâu, phân bón hóa học vốn làm suy kiệt tàinguyên thiên nhiên và phá vỡ cân bằng sinh thái, ảnh hưởng nghiêm trọng đến khí hậu toàncầu Những nghiên cứu hiện nay cho phép tạo ra các loại cây lương thực “thế hệ đầu tiên” cókhả năng chống lại các stress của môi trường như hạn hán, sự thay đổi nhiệt độ đột ngột hayđất nhiễm mặn Cùng với sự phát triển mạnh mẻ của công nghệ sinh học, chắc chắn vaccinetrong thực vật sẽ là một hướng nghiên cứu đúng đắng và đấy triển vọng nhằm nâng cao giá trịcủa cây trồng biến đổi gen trong việc ngăn chặn sự lây lan của các bệnh truyền nhiễm ở người

và động vật cũng như qui mô mở rộng trên toàn thế giới [22]

I TỔNG QUAN TÀI LIỆU:

1.1 Khái niệm thực vật chuyển gen

Cây chuyển gen là một thực vật mang một hoặc nhiều gen

được đưa vào nhân toạ thay vì thông qua lai tạo Những gen được

tạo đưa vào (gen chuyển) có thể được phân lập từ những loài thực

vật có quan hệ họ hàng hoặc từ những loài khác biệt hoàn toàn

Thực vật tạo ra được gọi là “chuyển gen” mặc dù trên thực

tế tất cả thực vật đều được “chuyển gen” từ tổ tiên hoang dại của

chúng bởi quá trình thuần hoá, chọn lọc và lai giống có kiểm soát

trong một thời gian dài [3]

1.2 Cơ sở khoa học

Hiện nay trong việc tạo cây trồng chuyển gen phải qua các bước:

- Chọn lựa và nhân bản đoạn gen kháng nguyên của vi khuẩn và vi rút gây bệnh

- Thử nghiệm thành công các vectơ biểu hiện gen tái tổ hợp

- Chuyển thành công gen vào nhiều loài đối tượng thực vật

- Gia tăng tốc độ và khối lượng protein tái tổ hợp được sản sinh trong cây trồng [22]

1.2.1 Nguyên lý chuyển gen vào thực vật

Kỹ thuật đưa một gen lạ (một đoạn DNA, RNA) vào tế bào vật chủ làm cho gen lạ tồntại ở các plasmid trong tế bào chủ hoặc gắn bộ gen tế bào chủ, tồn tại và tái bản cùng với bộgen của tế bào chủ Gen lạ trong tế bào chủ hoạt động tổng hợp các protein đặc hiệu, gây biếnđổi các đặc điểm đã có hoặc làm xuất hiện những đặc điểm mới của các cơ thế chuyển gen Thông tin di truyền acid deosyribonucleic (DNA) tồn tại ở 3 dạng chính :

- DNA của cơ thể bậc cao trong đó có các DNA nhân và DNA cơ quan tử

- DNA của cơ thể vi sinh vật

- DNA của plasmid

Một cấu trúc di truyền đặc trưng bao gồm:

Gen khởi đầu(promoter), gen mã hoá(coding gen), và gen kết thúc (terminator) Các gen mãhoá có thể đưa được vào mô thực vật nhờ các vectơ plasmid

Các mẫu vật (các bộ phận của cây hoặc mô dùng để biến nạp) thích hợp nhất cho biến nạp gen

là những mẫu vật đòi hỏi thời gian nuôi cấy trước và sau khi biến nạp ngắn nhất

- Lựa chọn gen cần được biểu hiện (gen quan tâm) và đưa vào một Best regards,vector thíchhợp

- Lựa chọn đối tượng thực vật thích hợp để chuyển gen

- Kiểm tra biểu hiện của gen quan tâm trong những bộ phận ăn được của thực vật

- Thử nghiệm khả năng đáp ứng miễn dịch của vaccine sản xuất từ thực vật

- Sử dụng vaccine đã thử nghiệm thành công bằng cách ăn tươi dưới dạng thức ăn đã chế biến

Thiết kế vector biểu hiện:

Điểm quan trọng nhất trong thiết kế vector biểu hiện là promoter, đây phải là promoterkhoẻ, có ái lực mạnh với RNA-polymerase của vật chủ và hoạt động của promoter được điềuhoà một cách dễ dàng Trong nhiều nghiên cứu gần đây, với mục đích biểu hiện kháng nguyênvaccine trong các bộ phận ăn được của thực vật, người ta đã thiết kế promoter đặc hiệu môthực vật, ví dụ promoter đặc hiệu mô củ hoặc mô hạt thì protein sẽ được sản xuất trong củhoặc hạt Tuỳ thuộc vào mục đích ứng dụng, có thể thiết kế một phương thức biến nạp thíchhợp cho từng genotype khác nhau Trong những nghiên cứu cơ bản, người ta thường tập trungtìm hiểu theo cấu trúc và chức năng của các cấu trúc gen biến nạp, khảo sát các promoter vàcác cơ chế phân tử ở thực vật để có thể chuyển gen thành công vào các loài khác nhau [22]

1.2.2 Những lợi ích của cây chuyển gen

1.2.2.1.Tăng sản lượng :

Cây chuyển gen có thể tăng đáng kể sản lượng thu hoạch, do vậy với diện tích đất canhtác ít hơn vẫn có thể thu được nhiều lương thực hơn

Ví dụ: ở Mỹ, năm 1999, đã có 66 triệu ruộng ngô tránh được sâu đục thân [9]

1.2.2.2 Tăng lợi nhuận nông nghiệp và giảm chi phí sản xuất

Thực vật với khả năng tự bảo vệ chống lại côn trùng và cỏ dại có thể giúp giảm liềulượng và nồng độ của các thuốc trừ sâu sử dụng

Giảm sử dụng thuốc trừ sâu cải thiện đáng kể chất lượng nước ở những vùng sử dụngthuốc Thực vật kháng thuốc diệt cỏ làm cho việc sử dụng biện pháp không cày đất đó là mộtyếu tố quan trọng trong việc bảo tồn đất đai đã trở nên phổ biến

Ví dụ: người trồng cải dầu chuyển gen ở Canada đã ít phải cày cấy hơn so với khi trồng câycải dầu truyền thống [24]

1.2.2.3.Cải thiện môi trường

Một trong những lợi ích to lớn của cây trồng chuyển gen đối với môi trường đó làchúng giúp làm giảm đáng kể lượng thuốc trừ sậu được sử dụng, với tỷ lệ phụ thuộc vào loạicây trồng và các đặc điểm mới đưa vào cây trồng đó

Cây chuyển gen còn có lợi ích tiềm tàng đối với môi trường Chúng giúp bảo tồn các nguồn lợi

tự nhiên, sinh cảnh và động vật, thực vật bản địa Thêm vào đó, chúng góp phần giảm xói mòn

1.2.2.4 Tác dụng trong y học

Những cây chuyển gen thế hệ thứ nhất đã làm giảm chi phí sản xuất Ngày nay, các nhàkhoa học đang hướng dẫn tạo ra những cây chuyển gen thế hệ thứ hai có đặc điểm tăng giá trịdinh dưỡng hoặc có những tính trạng thích hợp cho công nghiệp chế biến Lợi ích của nhữngcây trồng này hướng trực tiếp hơn vào người tiêu dùng Một số ví dụ như: Lúa gạo giầuvitamin A và sắt, khoai tây tăng hàm lượng tinh bột vacxin ăn được ở ngô và khoai tây,những giống ngô có thể trồng được trong điều kiện nghèo dinh dưỡng, dầu ăn có lợi cho sứckhoẻ hơn từ đậu nành và cải dầu [17]

Ưu điểm của vaccine trong thực vật chuyển gen

Dể dàng tăng qui mô sản xuất và dể thu sinh khối

Tính ổn định cao,dễ bảo quản và sử dựng

Các kháng nguyên biểu hiện trong thực vật ổn định ngay ở nhiệt độ phòng do chúng đượcsản xuất và được bao bọc bởi các mô thực vật mà cụ thể là chứng được định vị trong lưới nộichất, thể Golgi hoặc bề mặt tế bào Nhờ tính ổn định này mà chúng trở nên dể dàng bảo quản

và sử dụng ngay trong thực vật mà không cần giữ lạnh như các vaccine tiêm

Vaccine ăn được kích thích sản xuất kháng thể của hệ thống thể dịch hiệu quả hơn vaccinetiêm

Ta biết rằng hầu hết các vi sinh vật gây bệnh đều xâm nhập vào cơ thể qua bề mặt nhầytrong đường tiêu hoá, hô hấp và đường tiết niệu Khi vaccine ăn vào cơ thể theo đường miệng

nó sẽ cảm ứng hệ thống miển dịch thể dịch sản xuất các kháng thể chống lại vi sinh vật gâybệnh, tiếp đó hệ thống thể dịch lại tác động vào hệ thống miển dịch cũa tế bào, tạo ra cácglobulin miển dịch tăng cường khả năng bảo vệ sớm và hiệu quả cho cơ thể Khi tiêu híavaccine ăn được, kháng nguyên được giải phong trong ruột non

Với những ưu điểm nỗi bật của vaccine thì việc sản xuất vaccine ăn đuợc xem là hệ thống sảnxuất vaccine lý tưởng đơn giản và giá thành thấp [22]

1.2.3 Những nguy cơ tiềm ẩn của cây chuyển gen

1.2.3.1.Những nguy cơ tiềm ẩn trong việc phát triển những kỹ thuật mới

Mối nguy hiểm trong việc vô tình đưa những chất gây dị ứng hoặc làm giảm dinhdưỡng vào thực phẩm Khả năng phát tán những gen biến nạp trong cây trồng sang họ hànghoang dại Sâu bệnh có nguy cơ tăng cường tính kháng với các chất độc tiết ra từ cây chuyển

Các cây chuyển gen được đánh giá cẩn thận về ảnh hưởng tới môi

trường trước khi đưa ra thị trường Chúng được các nhà chức tránh

đánh giá tuân theo các quy tắc do các chuyên gia môi trường trên

khắp thế giới đưa ra Hội đồng nghiên cứu quốc gia Mỹ năm 1989;

Tổ chức hợp tác phát triển kinh tế năm 1992; chính phủ Canada

năm 1994 Có những ảnh hưởng không mong muốn như:

- Ảnh hưởng lên các sinh vật không phải là sinh vật cần diệt trong

môi trường đó

- Cây chuyển gen có tồn tại trong môi trường lâu hơn bình thường hoặc xâm chiếm những nơi

cư ngụ mới

- Khả năng gen phát tán ngoài ý muốn từ cây chuyển gen sang loài khác [18]

II Các phương pháp chuyển gen vào thực vật

Các phương pháp biểu hiện gen dựa trên thực vật đã được phát triển từ cuối những năm

1970 đầu 1980 Hiện nay, có thể xếp những phương pháp này vào hai nhóm chính sau: Chuyểngen ổn định tức là gen quan tâm được bảo tồn qua nhiều thế hệ do gắn vào hệ gen vật chủ

(chuyển gen vào nhân hoặc plastid) và biểu hiện gen tạm thời dựa trên Agrobacterium và

vector virus thực vật, theo nguyên tắc có thể sử dụng bất kỳ phương pháp chuyển gen vào thựcvật nào cũng có thể tạo ra thực vật chứa vaccine ăn được, tuy nhiên hiện nay người ta chỉ mới

tạo thành công vaccine ăn nhờ súng bắn gen và nhờ vi khuẩn Agrobacterium [22].

2.1 Biến nạp gián tiếp thông qua Agrobacterium

2.1.1 Đặc điểm của vi khuẩn Agrobacterium

A tumefaciens là loài vi khuẩn đất, có dạng hình gậy, kích thước 2.5-3.0 x 0.7-0.8mm, dạng

đơn bào, không tạo ra bào tử, có vỏ và lông roi, là vi khuẩn háo khí, nhuộm gram (-) ,khuẩnlạc tròn và rìa nhẵn.Khuẩn lạc màu trắng kem, nhẵn, bóng, tròn, nhỏ, rìa đều đặn và có màuxanh da trời nhạt sau đó đậm dần trên môi trường chỉ thị D2M

Vi khuẩn A tumefaciens không có khả năng khử arginine,

không phân giải gelatin; có thể phân giải các loại đường, tinh

bột, tryptophan, tạo NH3 và H2S, khử oxydase Agrobacterium

không thể tạo gây khối u (chuyển T-DNA) ở nhiệt độ trên

290C và khoảng pH baz Lý do là hệ thống protein vir đặc biệt

là virA rất nhạy cảm với nhiệt độ, chúng bất hoạt ở 290C và

biến tính ở 320C, hiệu suất chuyển gene cao nhất ở 220C và

khoảng pH từ 5.2 - 5.7, điều này được giải thích do thụ thể

nhận biết ký chủ của Agrobacterium (ChvE-VirA)được hoạt

hóa bằng proton của hợp chất phenolic và nó bị bất hoạt trong

môi trường baz Một khi protein Vir A bị bất họat thì tế bào vi khuẩn sẽ mất khả năng hoạt hóatoàn bộ hệ thống protein vir dẫn đến mất khả năng chuyển gen [9].

2.1.2 Cấu trúc tế bào vi khuẩn Agrobacterium

Agrobacterium tumefaciens có chứa nhiễm sắc thể

và một plasmid lớn kích thước khoảng 200 kb gọi là

Ti-plasmid chính là tác nhân truyền bệnh cho cây Khi cây bị

nhiễm A.tumefaciens qua các vết thương, biểu hiện rỏ nhất

là các khối u được hình thành ở ngay chổ lây nhiểm sự

hình thành khối u sau đó có thể được tiếp tục mà không

cần thiết phải có sự hiện diện của vi khuẩn Khả năng có

được do A.tumefaciens đã chuyển một đoạn DNA của

Ti-plasmid xâm nhập vào hệ gen của cây bị bệnh [16]

Ti-plasmid

Ti-plasmid là một plasmid lớn 200kb, chúng được duy trì ổn định trong

Agrobacterium ở nhiệt độ dưới 300C Trên Ti-plasmid có đoạn T- AND có được giới hạnbằng bờ phải (right border) và bờ trái (left border) Trình tự nucleotid của bờ phải và bờ tráitương tự nhau Đoạn này được gọi là T-AND vì đây là đoạn sẽ được chuyển vào tế bào thựcvật gắn vào bộ NST và gây ra bệnh khối u T-DNA của vi khuẩn được chuyển vào tế bào thựcvật và hợp nhất với gen nhân (tế bào thực vật) T-DNA ổn định trong gen nhân.Vị trí hợpnhất của T-DNA vào DNA thực vật là hoàn toàn ngẫu nhiên

Vùng vir: là vùng chứa các Gene vir (virulence gene) mã hóa cho các protein thực hiện việc

cắt, chuyển và gắn T-DNA vào genome thực vật

Vùng CON:vùng mã hóa chức năng tiếp hợp

Vùng ORI :vùng mã hóa chức năng tái bản và

khởi điểm tái bản [16]

A Ti-plasmid kiểu octopine (pTiAch5) và

kiểu nopaline

(pTiC58) cho thấy vị trí tương đối và kích

thước của các vùng chức năng chính

Các vị trí tô đậm chỉ các vùng tương đồng

lớn của 2 plasmid

CON: vùng mã hóa chức năng tiếp hợp

ORI: vùng mã hóa chức năng tái bản và

khởi điểm tái bản

B Bản đồ của vùng T kiểu nopaline và

octopine cho thấy các vùng chức năng

chính, các vùng tương đồng và các sản

phẩm phiên mã

Ti-plasmid kiểu octopine và nopaline

T-DNA

Đó là một đoạn DNA có kích thước 25 kb trong đó chứa gen mã hóa cho sinh tổng hợpauxin, cytokinin, opine là các gen gây khối u (oncogenes) Trong Ti-plasmid, vị trí của T-DNAđược giới hạn bằng RB và LB Ngoài T-DNA, trên Ti-plasmid còn có các vùng DNA mã hóa

cho việc tái sinh plasmid (replication), cho khả năng lây nhiễm và tiếp hợp (vùng vir), cho việc

tiêu hóa opine (opine catabolism) Trong các vùng DNA của Ti-plasmid, ngoài T-DNA, đượcnghiên cứu nhiều hơn cả là vùng DNA

phụ trách khả năng lây nhiễm còn gọi là

vùng vir Sản phẩm hoạt động của các

gen nằm trong vùng vir dưới tác động

kích thích của các hợp chất phenol tiết ra

từ vết thương là một loạt các protein đặc

hiệu như virE2, virB, virD, virD2,

virC1 Các protein này nhận biết các vết

thương ở các cây chủ thích hợp (hầu hết

là cây hai lá mầm), kích thích sản sinh ra

các đoạn T-DNA, bao bọc che chở các

đoạn DNA này và giúp chúng tiếp cận

với hệ gen của cây chủ một cách an toàn

Khi cây nhiễm A tumefaciens, do

T-DNA nạp vào trong hệ gen của cây chủ

bắt đầu hoạt động và sản sinh ra auxin,

cytokinin và opine, toàn bộ sinh trưởng

của cây bị rối loạn, các tế bào phân chia

vô tổ chức và tạo ra các khối u Opine

được vi khuẩn sử dụng như một loại

“thức ăn” nhờ gen chuyển hóa opine trên

Ti-plasmid vì thế sự thay đổi hình thái

chính của thực vật là chúng tạo ra rất

nhiều rễ tơ (hairy roots) khi bị nhiễm

bệnh Trên thực tế Agrobacterium chỉ

gây hại ở cây hai lá mầm, vì vậy người ta

cho rằng chúng chỉ có thể đưa T-DNA

vào hệ gen các cây hai lá mầm Gần đây,

nhiều tác giả đã chứng minh khi nhiễm

vi khuẩn, các cây một lá mầm cũng có

thể sản xuất opine và có thể khai thác

khả năng biến nạp gen của vi khuẩn

Agrobacterium vào cây một lá mầm [4].

Bản đồ của các dạng Ti-plasmid A: dạng tự nhiên ban đầu, B: dạng cis, C: dạng trans.

Phương thức chuyển T-DNA vào gen của thực vật

2.1.3 Cơ chế tác dụng của Agrobacterium

Cơ chế gây bệnh của các Agrobacterium là sau khi xâm nhiễm vào tế bào, chúng gắn

đoạn T-DNA vào bộ máy di truyền của tế bào thực vật, dẫn đến sự rối loạn các chất sinhtrưởng nội sinh, tạo ra khối u Khả năng chuyển gen này đã được khai thác để chuyển genngoại lai vào bộ máy di truyền của tế bào thực vật theo ý muốn

Để gắn T-DNA vào tế bào thực vật, đầu tiên vi khuẩn A tumefaciens phải tiếp xúc với thành tế bào thực vật bị tổn thương Quá trình này được thực hiện nhờ các gen chvA và chvB Gen chvB mã hóa một protein liên quan đến hình thành β-1,2 glucan mạch vòng, trong khi đó gen chvA xác định một protein vận chuyển, định vị ở màng trong của tế bào vi khuẩn Protein

vận chuyển giúp vận chuyển 1,2 glucan vào khoảng giữa thành tế bào và màng sinh chất

β-1,2 glucan giữ vai trò quan trọng để vi khuẩn Agrobacterium tiếp xúc với thành tế bào thực

vật Nếu không có sự tiếp xúc này, sẽ không có sự dẫn truyền T-DNA

Các sản phẩm protein của vùng vir có tác dụng cho việc dẫn truyền T-DNA từ vi khuẩn

vào tế bào thực vật Các loại protein đó rất cần thiết cho quá trình cắt T-DNA khỏi Ti-plasmid,cảm ứng thay đổi màng tế bào thực vật mà chúng tiếp xúc, tham gia di chuyển phần T-DNAqua màng vi khuẩn tới tế bào chất của tế bào thực vật, vận chuyển tới nhân rồi cuối cùng xâmnhập vào gen của cây chủ

Thực chất chỉ riêng T-DNA của Ti-plasmid được chuyển vào gen tế bào thực vật, mà

không còn phần nào khác Quá trình dẫn truyền chỉ do sản phẩm của các gen vir (vùng vir) và gen chv quyết định mà không liên quan đến các gen khác trên T-DNA Tuy nhiên, chuỗi DNA

25 bp (RB và LB của T-DNA) có vai trò là vị trí cảm ứng cho các sản phẩm của tổ hợp các

gen vùng vir, đặc biệt là protein từ gen virE mang chúng dẫn truyền vào tế bào thực vật.

Chúng hoạt động như các tín hiệu nhận biết và khởi động quá trình dẫn truyền Trước hết gen

virA trong tổ hợp gen vùng vir được phosphoryl hóa nhờ tác động của các hợp chất phenol

như acetosyringone giải phóng ra từ các tế bào thực vật tổn thương Sản phẩm của quá trình

này lại tiếp tục phosphoryl hóa gen virG Sản phẩm của gen virG liên tiếp làm hoạt hóa toàn

bộ các gen vir còn lại, mà hai gen cuối cùng được hoạt hóa là gen virB và virE

Trước đó, khi gen virD được hoạt hóa, sản phẩm của nó cảm ứng nhận biết RB và LB

của T-DNA và làm đứt phần T-DNA ra khỏi DNA của Ti-plasmid thành các sợi đơn Đồngthời quá trình phosphoryl hóa này cũng làm thay đổi thẩm xuất màng tế bào thực vật, màng tế

bào bị mềm ra và bị thủng Các sợi đơn T-DNA được gắn vào protein do gen virE tổng hợp và

dịch chuyển về phía màng tế bào vi khuẩn

Ngay sau đó, sợi T-DNA được trượt từ vi khuẩn vào tế bào thực vật Cầu nối chính là

sự tiếp hợp giữa hai tế bào do cảm ứng sản phẩm gen virB mà thành Khi T-DNA đã được

chuyển giao vào tế bào thực vật, chúng nhanh chóng hợp nhất trong gen tế bào thực vật được

ổn định và di truyền như các gen bình thường khác [4]

Ðể khai thác và sử dụng A tumefaciens như là một vector chuyển gen các nhà khoa

học đã loại bỏ các gen gây khối u và gen mã hoá opine của T - DNA và thay thế vào đó là cácmarker chọn lọc, trong khi vẫn duy trì các vùng bờ phải và bờ trái của T-DNA và các gen vir.Gen chuyển được xen vào giữa các vùng bờ của T-DNA Nó sẽ được chuyển vào tế bào và trởnên hợp nhất với nhiễm sắc thể tế bào thực vật Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ

Agrobacterium đã được kiểm tra đối với sự xâm nhập bền vững, sự biểu hiện và sự di truyền

của các gen chuyển đặc biệt Một vài yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp là loại mô được

biến nạp, giai đoạn phát triển của mô, mức độ khởi đầu của vi khuẩn A tumefaciens sử dụng,

môi trường để nuôi cấy mô sau khi biến nạp, marker được sử dụng để chọn lọc thể biến nạp,loại vector sử dụng và kiểu gen của thực vật [21]

2.1.4 Quy trình chuyển gen bằng Agrobacterium

chuyển gen gián tiếp nhờ vi

khuẩn Agrobacterium

2.1.5 Ưu và nhược điểm của phương pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium

2.1.5.1 Ưu điểm

Hiệu suất cao vì Khi xem xét vị trí biểu hiện màu xanh chàm của phản ứng GUS (của

cơ chất với enzym B-Gluconidase), người ta nhận thấy Agrobacterium có xu hướng chuyển

gene vào những vùng mô đang phân sinh mạnh Đây là lợi thế lớn nhất của phương pháp này

vì mô phân sinh là nơi mà chồi con (đã “bị” chuyển gen) có thể dễ dàng được tạo thành Khaithác đặc tính này, trước khi tiến hành hoạt hóa vi khuẩn, người ta còn tiến hành hoạt hóa mẫu

mô thực vật, mô càng tăng sinh mạnh thì hiệu suất chuyển gene càng cao Đối với các phươngpháp khác như bắn gen hoặc Silicon Carbide…tuy có thể thực hiện trên tất cả các đối tượngthực vật nhưng gene mục tiêu được chuyển một cách ngẫu nhiên, không định hướng

Gene mục tiêu ít bị đào thải, nó tồn tại khá bền vững trong cơ thể thực vật do sự phụthuộc chặt chẽ vào hệ thống protein vir (virulent) Ở các phương pháp khác, gene mục tiêuđược tái tổ hợp chuyên biệt nhờ 2 trình tự IS hai đầu nhưng nó cũng có thể dễ dàng tách rangay sau đó [7]

2.1.5.2 Nhược điểm

Agrobacterium có phổ tấn công có giới hạn, nó có thể gây khối u cho cả cây khỏa tử và

cây hai lá mầm nhưng lại không thể gây khối u cho cây một lá mầm Lý do cây một lá mầmthuộc nhóm thực vật tiến hóa hơn (tiến hóa nhất trong giới thực vật), nó tích lũy nhiều cơ chếkháng bệnh hơn các cây hai lá mầm như vách cellulose tẩm silic làm tăng độ bền; hoặc khi bịthương, phần mô bị thương có xu hướng hóa gỗ để bảo vệ, chứ không phân chia mạnh để táitạo hoặc tiết hợp chất phenol như cây hai lá mầm Tuy nhiên, cho đến thời điểm này, người ta

đã tìm được nhiều chủng Agrobacterium có khả năng chuyển gene cho một số cây một lá mầm

như bắp, lúa, cỏ, mía, lan…ứng dụng tạo ra gạo vàng, phong lan phát sáng [6]

Phương pháp này có một số bất lợi: plasmid Ti gắn gen ngẫu nhiên vào hệ gen thực vật,làm tăng tính không đồng đều về mức độ biểu hiện kháng nguyên trong cây chuyển gen Ngoài

ra cách gắn gen này có thể phá vỡ biểu hiện gen dẫn đến sinh trưởng bất thường của cây

chuyển gen Tất cả các dòng Agrobacterium hiện nay đều có nguồn gốc tự nhiên, do đó nó vẫn

mang một số đặc tính của chủng hoang dại [7]

III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Ứng dụng

3.1.1 Trong nông nghiệp

Các tính trạng được biến nạp gen ở khoai tây gồm: kháng

nấm, sâu bọ và giun tròn, kháng thuốc diệt cỏ, thay đổi thành

phần tinh bột, chống chịu stress và chống bầm dập củ

Ngoài ra, khoai tây được trồng bằng củ thay vì hạt, vì vậy

sự tạp nhiễm cây chuyển gen sẽ không truyền cho thế hệ con

Nguy cơ lưu chuyển gen là có nếu để cây mọc hoang phát triển

trong ruộng từ vụ này sang vụ khác Khả năng lai xa và nạp gen

giữa khoai tây và các họ hàng hoang dại của nó là rất thấp

Khoai tây kháng côn trùng: Khoai tây mang một gen sản xuất protein kháng sâu tạo cho nókhả năng tự bảo vệ trước bọ khoai tây Colorado Giống khoai tây được chuyển gen nhằmkháng virus xoăn lá khoai tây (PLRV) và virus khoai tây Y (PVY) Loại khoai tây này đượcchuyển gen của virus để tự kháng lại virus [10].

Thực hiện việc chuyển nạp hiệu quả ở lúa trong các kiểu gen độc lập, và hiện nay hơn 40giống đã được chuyển gen thành công Mẫu vật sử dụng là phôi non và các callus có nguồngốc từ hạt trưởng thành Kháng hygromycin B là gen chỉ thị chọn lọc thường được dùng cho

lúa Kỹ thuật chuyển gen ở lúa thông qua Agrobacterium đã có những cải tiến quan trọng và

có hiệu quả Những giống lúa mới có năng suất cao, giàu dinh dưỡng, kháng sâu bệnh, chịu đấtmặn, gạo cho sản lượng lượng thực cao [5]

Cà chua chín chậm: Là loại thực phẩm chuyển gen đầu

tiên được sản xuất ở các nước phát triển Giống cà chua này có

thời gian lưu trên quầy bán hàng dài hơn Nó mang một gen

làm chậm quá trình trình mềm quả tự nhiên khi quả chín Loại

này giữ được trên cây lâu hơn so với các giống khác, vì vậy có

thể bảo quản tươi lâu hơn Hơn nữa, thời gian lưu giữ trên quầy

bán hàng dài hơn đã tăng giá trị thương mại sau thu hoạch và

bảo quản, giảm giá thành sản phẩm Được trồng ở Canada ,

Nhật bản và Mỹ Tạo ra cà chua với hàm lượng flavonol cao;

cà chua với hàm lượng lycopene cao.Các nhà khoa học Mỹ đã tạo được loại cà chua có thểsống trên các vùng đất nhiễm mặn mà vẫn cho quả thơm ngon, giữ được lâu ngày không bịthối [11]

Ngô kháng côn trùng (sâu đục thân): Là loại ngô

chuyển gen sản xuất một loại protein tinh thể (crystal protein)

Protein này cho phép cây ngô có khả năng kháng ổn định đối

với sâu đục thân Người ta cũng tạo được cây ngô kháng bệnh

sâu bướm

Các đặc tính về chất lượng nhằm nâng cao chất lượng thực

phẩm: ngô với giá trị làm thức ăn gia súc cao hơn.Các cây

trồng có lợi cho môi trường của chúng ta: ngô với các lợi ích

tăng chất phốt pho; cây trồng chịu được các áp lực về môi

trường, chịu được thạch tín ngô trồng được trên đất nhiễm

phèn (có nhiều tính axit) [18]

3.1.2 Trong y học

Loại khoai tây chuyển đổi gien (GM), chứa vắc-xin ngừa viêm gan B, do những người

ăn sống khoai tây GM đã được tiêm vắc-xin viêm gan B thông thường nên vaccin khoai tây chỉtăng cường khả năng miễn dịch của họ.Các nhà khoa học đang phát triển các loại khoai tây chứa văcxin chống virut papilloma (HPV) [11]