Phương pháp chuyển gen vào cây trồng bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Phương pháp chuyển gen vào cây trồng bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tài liệu, giáo án, bài giảng , luận văn, lu...

MỤC LỤC Trang LỜI MỞ ĐẦU 2 I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Khái niệm thực vật chuyển gen 1.2. Cơ sở khoa học 1.2.1. Nguyên lý chuyển gen vào thực vật 1.2.2. Những lợi ích của cây chuyển gen 1.2.2.1.Tăng sản lượng : 1.2.2.2. Tăng lợi nhuận nông nghiệp và giảm chi phí sản xuất 1.2.2.3.Cải thiện môi trường 1.2.2.4. Tác dụng trong y học 1.2.3. Những nguy cơ tiềm ẩn của cây chuyển gen 1.2.3.1.Những nguy cơ tiềm ẩn trong việc phát triển những kỹ thuật mới II. Các phương pháp chuyển gen vào thực vật 2.1. Biến nạp gián tiếp thông qua Agrobacterium 2.1.1. Đặc điểm của vi khuẩn Agrobacterium 2.1.2. Cấu trúc tế bào vi khuẩn Agrobacterium 2.1.3. Cơ chế tác dụng của Agrobacterium 2.1.4.Qui trình chuyển gen bằng Agrobacterium 2.1.5. Ưu và nhược điểm của phương pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium 2.1.5.1. Ưu điểm 2.1.5.2. Nhược điểm III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Ứng dụng 3.1.1. Trong nông nghiệp 3.1.2. Trong y học 3.2. Thành tựu 3.2.1 Trên thế giới 3.2.2. Ở Việt Nam 4.Kết luận Tài liệu tham khảo 1 LỜI MỞ ĐẦU Việc sử dụng một khối lượng lớn nhiên liệu hoá thạch giúp chúng ta có được đời sống tiện nghi và hạnh phúc nhưng cũng dẫn đến sự trả giá đắt như hiện tượng ấm lên toàn cầu, sự ô nhiễm và hủy hoại môi trường. Do nhiều điều kiện bất lợi của môi trường như sự nhiễm vi khuẩn, virus, các loại côn trùng, sự nhiễm mặn, khô hạn, nhiệt độ cao, … Ngay ở Mỹ, sản lượng nông nghiệp giảm hơn ¼ so với tối đa theo lý thuyết. Ngày nay, các loại cây trồng kháng virus, côn trùng hay kháng thuốc trừ cỏ đã được tạo ra bằng việc áp dụng chuyển các gen mong muốn vào thực vật, đã mang lại những cải thiện quan trọng trong năng suất. Các gen cải thiện sự tăng trưởng của thực vật trong môi trường axit hoặc kiềm và đất nhiễm mặn đã được cô lập [9]. Bên cạnh đó vấn đề vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh đang là một vấn đề nghiêm trọng với sức khỏe của loài người. Cây trồng chuyển gen là hệ thống sản xuất vắc xin thay thế có hiệu quả, vì chúng có thể biểu lộ nhiều loại prôtêin, cũng như thực hiện các thay đổi cần thiết để các loại prôtêin đó hoạt động. Hệ thống cây trồng cũng ít khi chứa các loại vi khuẩn có thể là nguồn bệnh đối với động vật, Và việc sản xuất đại trà các loại vaccin trên cây trồng cũng dễ hơn [12]. Nhiều phương pháp khác nhau đã được phát minh để đưa gen vào tế bào và mô động vật và thực vật. Kỹ thuật đơn giản nhất là chuyển DNA trần bằng vi tiêm (microinjection), xung điện (electroporation), súng bắn gen. Các phương pháp phức tạp và hiệu quả hơn bao gồm sử dụng các phức hợp lipid-DNA (liposome), vector virus, tế bào gốc phôi, chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium, chuyển gen bằng súng bắn gen. Phương pháp để đưa gen mới vào tế bào thực vật bằng việc sử dụng Agrobaterium. Phát kiến về việc Agrobaterium tumefaciens có khả năng chuyển gen vào thực vật đã biến loài này trở thành một trong những công cụ quan trong nhất của Công nghệ sinh học thực vật. A. tumefaciens là loài vi khuẩn đất có khả năng chèn gen của mình vào thực vật và sau đó sử dụng bộ máy thực vật để biểu hiện các gene này dưới dạng hợp chất dinh dưỡng cho chúng [8]. Tuỳ thuộc vào đối tượng chuyển gen mà người ta lựa chọn phương pháp chuyển gen phù hợp. Nhiều nhà khoa học tin rằng chuyển gien cây trồng là cách hiệu quả hơn và rẻ tiền hơn để sản xuất vaccine và thuốc hàng loạt. Công nghệ sinh học trên thế giới phát triển với tốc độ chóng mặt, riêng trong nông nghiệp đã có hơn 60 triệu ha gieo trồng bằng các giống cây biến đổi gen như: ngô, lúa, đậu tương, bông, hoa hướng dương, khoai tây, đu đủ Cây trồng chuyển gen với năng suất và chất lượng cao đã đem lại lợi ích khổng lồ cho những quốc gia có nền công nghệ sinh học tiên tiến. Đồng thời giảm được việc sử dụng thuốc trừ sâu, phân bón hóa học vốn làm suy kiệt tài nguyên thiên nhiên và phá vỡ cân bằng sinh thái, ảnh hưởng nghiêm trọng đến khí hậu toàn cầu. Những nghiên cứu hiện nay cho phép tạo ra các loại cây lương thực “thế hệ đầu tiên” có khả năng chống lại các stress của môi trường như hạn hán, sự thay đổi nhiệt độ đột ngột hay đất nhiễm mặn Cùng với sự phát triển mạnh mẻ của công nghệ sinh học, chắc chắn vaccine trong thực vật sẽ là một hướng nghiên cứu đúng đắng và đấy triển vọng nhằm nâng cao giá trị của cây trồng biến đổi gen trong việc ngăn chặn sự lây lan của các bệnh truyền nhiễm ở người và động vật cũng như qui mô mở rộng trên toàn thế giới [22]. 2 I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU: 1.1. Khái niệm thực vật chuyển gen Cây chuyển gen là một thực vật mang một hoặc nhiều gen được đưa vào nhân toạ thay vì thông qua lai tạo. Những gen được tạo đưa vào (gen chuyển) có thể được phân lập từ những loài thực vật có quan hệ họ hàng hoặc từ những loài khác biệt hoàn toàn. Thực vật tạo ra được gọi là “chuyển gen” mặc dù trên thực tế tất cả thực vật đều được “chuyển gen” từ tổ tiên hoang dại của chúng bởi quá trình thuần hoá, chọn lọc và lai giống có kiểm soát trong một thời gian dài [3]. 1.2. Cơ sở khoa học Hiện nay trong việc tạo cây trồng chuyển gen phải qua các bước: - Chọn lựa và nhân bản đoạn gen kháng nguyên của vi khuẩn và vi rút gây bệnh. - Thử nghiệm thành công các vectơ biểu hiện gen tái tổ hợp. - Chuyển thành công gen vào nhiều loài đối tượng thực vật. - Gia tăng tốc độ và khối lượng protein tái tổ hợp được sản sinh trong cây trồng [22]. 1.2.1. Nguyên lý chuyển gen vào thực vật Kỹ thuật đưa một gen lạ (một đoạn DNA, RNA) vào tế bào vật chủ làm cho gen lạ tồn tại ở các plasmid trong tế bào chủ hoặc gắn bộ gen tế bào chủ, tồn tại và tái bản cùng với bộ gen của tế bào chủ. Gen lạ trong tế bào chủ hoạt động tổng hợp các protein đặc hiệu, gây biến đổi các đặc điểm đã có hoặc làm xuất hiện những đặc điểm mới của các cơ thế chuyển gen. Thông tin di truyền acid deosyribonucleic (DNA) tồn tại ở 3 dạng chính : - DNA của cơ thể bậc cao trong đó có các DNA nhân và DNA cơ quan tử. - DNA của cơ thể vi sinh vật. - DNA của plasmid. Một cấu trúc di truyền đặc trưng bao gồm: Gen khởi đầu(promoter), gen mã hoá(coding gen), và gen kết thúc (terminator). Các gen mã hoá có thể đưa được vào mô thực vật nhờ các vectơ plasmid. Các mẫu vật (các bộ phận của cây hoặc mô dùng để biến nạp) thích hợp nhất cho biến nạp gen là những mẫu vật đòi hỏi thời gian nuôi cấy trước và sau khi biến nạp ngắn nhất. - Lựa chọn gen cần được biểu hiện (gen quan tâm) và đưa vào một Best regards,vector thích hợp - Lựa chọn đối tượng thực vật thích hợp để chuyển gen - Chuyển vector tái tổ hợp mang gen quan tâm vào thực vật đã lựa chọn bằng các phương pháp chuyển gen 3 - Kiểm tra biểu hiện của gen quan tâm trong những bộ phận ăn được của thực vật - Thử nghiệm khả năng đáp ứng miễn dịch của vaccine sản xuất từ thực vật - Sử dụng vaccine đã thử nghiệm thành công bằng cách ăn tươi dưới dạng thức ăn đã chế biến. Thiết kế vector biểu hiện: Điểm quan trọng nhất trong thiết kế vector biểu hiện là promoter, đây phải là promoter khoẻ, có ái lực mạnh với RNA-polymerase của vật chủ và hoạt động của promoter được điều hoà một cách dễ dàng. Trong nhiều nghiên cứu gần đây, với mục đích biểu hiện kháng nguyên vaccine trong các bộ phận ăn được của thực vật, người ta đã thiết kế promoter đặc hiệu mô thực vật, ví dụ promoter đặc hiệu mô củ hoặc mô hạt thì protein sẽ được sản xuất trong củ hoặc hạt. Tuỳ thuộc vào mục đích ứng dụng, có thể thiết kế một phương thức biến nạp thích hợp cho từng genotype khác nhau. Trong những nghiên cứu cơ bản, người ta thường tập trung tìm hiểu theo cấu trúc và chức năng của các cấu trúc gen biến nạp, khảo sát các promoter và các cơ chế phân tử ở thực vật để có thể chuyển gen thành công vào các loài khác nhau [22]. 1.2.2. Những lợi ích của cây chuyển gen 1.2.2.1.Tăng sản lượng : Cây chuyển gen có thể tăng đáng kể sản lượng thu hoạch, do vậy với diện tích đất canh tác ít hơn vẫn có thể thu được nhiều lương thực hơn. Ví dụ: ở Mỹ, năm 1999, đã có 66 triệu ruộng ngô tránh được sâu đục thân [9]. 1.2.2.2. Tăng lợi nhuận nông nghiệp và giảm chi phí sản xuất Thực vật với khả năng tự bảo vệ chống lại côn trùng và cỏ dại có thể giúp giảm liều lượng và nồng độ của các thuốc trừ sâu sử dụng. Giảm sử dụng thuốc trừ sâu cải thiện đáng kể chất lượng nước ở những vùng sử dụng thuốc. Thực vật kháng thuốc diệt cỏ làm cho việc sử dụng biện pháp không cày đất đó là một yếu tố quan trọng trong việc bảo tồn đất đai đã trở nên phổ biến. Ví dụ: người trồng cải dầu chuyển gen ở Canada đã ít phải cày cấy hơn so với khi trồng cây cải dầu truyền thống [24]. 1.2.2.3.Cải thiện môi trường Một trong những lợi ích to lớn của cây trồng chuyển gen đối với môi trường đó là chúng giúp làm giảm đáng kể lượng thuốc trừ sậu được sử dụng, với tỷ lệ phụ thuộc vào loại cây trồng và các đặc điểm mới đưa vào cây trồng đó Cây chuyển gen còn có lợi ích tiềm tàng đối với môi trường. Chúng giúp bảo tồn các nguồn lợi tự nhiên, sinh cảnh và động vật, thực vật bản địa. Thêm vào đó, chúng góp phần giảm xói mòn đất, cải thiện chất lượng nước, cải thiện rừng và nơi cư ngụ của động vật hoang dại [14]. 4 1.2.2.4. Tác dụng trong y học Những cây chuyển gen thế hệ thứ nhất đã làm giảm chi phí sản xuất. Ngày nay, các nhà khoa học đang hướng dẫn tạo ra những cây chuyển gen thế hệ thứ hai có đặc điểm tăng giá trị dinh dưỡng hoặc có những tính trạng thích hợp cho công nghiệp chế biến. Lợi ích của những cây trồng này hướng trực tiếp hơn vào người tiêu dùng. Một số ví dụ như: Lúa gạo giầu vitamin A và sắt, khoai tây tăng hàm lượng tinh bột vacxin ăn được ở ngô và khoai tây, những giống ngô có thể trồng được trong điều kiện nghèo dinh dưỡng, dầu ăn có lợi cho sức khoẻ hơn từ đậu nành và cải dầu [17]. Ưu điểm của vaccine trong thực vật chuyển gen Dể dàng tăng qui mô sản xuất và dể thu sinh khối Tính ổn định cao,dễ bảo quản và sử dựng Các kháng nguyên biểu hiện trong thực vật ổn định ngay ở nhiệt độ phòng do chúng được sản xuất và được bao bọc bởi các mô thực vật mà cụ thể là chứng được định vị trong lưới nội chất, thể Golgi hoặc bề mặt tế bào. Nhờ tính ổn định này mà chúng trở nên dể dàng bảo quản và sử dụng ngay trong thực vật mà không cần giữ lạnh như các vaccine tiêm. Tính ăn được Loại vaccine trong thực vật này được chính mô trong thực vật bao bọc, hạn chế được sự phân huỷ của dịch tiêu hoá ở đường ruột và ổn định, bền vững trong cơ thể. Nên vaccine này có thể ăn tươi (quả lá) hoặc nấu chín (hạt củ) Tính an toàn Vì vaccine được sản xuất trong thực vật là vaccine dưới đơn vị sử dụng gen mã hoá cho một phần protein vỏ virus mà không cần đến virus sống như vaccine giảm độc lực hay virus chết như vaccine bất hoạt. Do đó vaccine này không trở lại thành virus gây bệnh cho người và động vật, đồng thời nó cũng tránh được nguy cơ nhiễm mầm bệnh tiềm tàng từ vaccine. Do đó, không cần tách chiết và tinh sạch kháng nguyên vaccine. Vaccine ăn được kích thích sản xuất kháng thể của hệ thống thể dịch hiệu quả hơn vaccine tiêm Ta biết rằng hầu hết các vi sinh vật gây bệnh đều xâm nhập vào cơ thể qua bề mặt nhầy trong đường tiêu hoá, hô hấp và đường tiết niệu. Khi vaccine ăn vào cơ thể theo đường miệng nó sẽ cảm ứng hệ thống miển dịch thể dịch sản xuất các kháng thể chống lại vi sinh vật gây bệnh, tiếp đó hệ thống thể dịch lại tác động vào hệ thống miển dịch cũa tế bào, tạo ra các globulin miển dịch tăng cường khả năng bảo vệ sớm và hiệu quả cho cơ thể. Khi tiêu hía vaccine ăn được, kháng nguyên được giải phong trong ruột non. Với những ưu điểm nỗi bật của vaccine thì việc sản xuất vaccine ăn đuợc xem là hệ thống sản xuất vaccine lý tưởng đơn giản và giá thành thấp [22]. 1.2.3. Những nguy cơ tiềm ẩn của cây chuyển gen 1.2.3.1.Những nguy cơ tiềm ẩn trong việc phát triển những kỹ thuật mới Mối nguy hiểm trong việc vô tình đưa những chất gây dị ứng hoặc làm giảm dinh dưỡng vào thực phẩm. Khả năng phát tán những gen biến nạp trong cây trồng sang họ hàng hoang dại. Sâu bệnh có nguy cơ tăng cường tính kháng với các chất độc tiết ra từ cây chuyển gen. Nguy cơ những chất độc này tác động tới sinh vật không phải sinh vật cần diệt [2]. 5 Các cây chuyển gen được đánh giá cẩn thận về ảnh hưởng tới môi trường trước khi đưa ra thị trường. Chúng được các nhà chức tránh đánh giá tuân theo các quy tắc do các chuyên gia môi trường trên khắp thế giới đưa ra. Hội đồng nghiên cứu quốc gia Mỹ năm 1989; Tổ chức hợp tác phát triển kinh tế năm 1992; chính phủ Canada năm 1994. Có những ảnh hưởng không mong muốn như: - Ảnh hưởng lên các sinh vật không phải là sinh vật cần diệt trong môi trường đó. - Cây chuyển gen có tồn tại trong môi trường lâu hơn bình thường hoặc xâm chiếm những nơi cư ngụ mới . - Khả năng gen phát tán ngoài ý muốn từ cây chuyển gen sang loài khác [18]. II. Các phương pháp chuyển gen vào thực vật Các phương pháp biểu hiện gen dựa trên thực vật đã được phát triển từ cuối những năm 1970 đầu 1980. Hiện nay, có thể xếp những phương pháp này vào hai nhóm chính sau: Chuyển gen ổn định tức là gen quan tâm được bảo tồn qua nhiều thế hệ do gắn vào hệ gen vật chủ (chuyển gen vào nhân hoặc plastid) và biểu hiện gen tạm thời dựa trên Agrobacterium và vector virus thực vật, theo nguyên tắc có thể sử dụng bất kỳ phương pháp chuyển gen vào thực vật nào cũng có thể tạo ra thực vật chứa vaccine ăn được, tuy nhiên hiện nay người ta chỉ mới tạo thành công vaccine ăn nhờ súng bắn gen và nhờ vi khuẩn Agrobacterium [22]. 2.1. Biến nạp gián tiếp thông qua Agrobacterium 2.1.1. Đặc điểm của vi khuẩn Agrobacterium A. tumefaciens là loài vi khuẩn đất, có dạng hình gậy, kích thước 2.5-3.0 x 0.7-0.8mm, dạng đơn bào, không tạo ra bào tử, có vỏ và lông roi, là vi khuẩn háo khí, nhuộm gram (-) ,khuẩn lạc tròn và rìa nhẵn.Khuẩn lạc màu trắng kem, nhẵn, bóng, tròn, nhỏ, rìa đều đặn và có màu xanh da trời nhạt sau đó đậm dần trên môi trường chỉ thị D2M. Vi khuẩn A. tumefaciens không có khả năng khử arginine, không phân giải gelatin; có thể phân giải các loại đường, tinh bột, tryptophan, tạo NH3 và H2S, khử oxydase. Agrobacterium không thể tạo gây khối u (chuyển T-DNA) ở nhiệt độ trên 29 0 C và khoảng pH baz. Lý do là hệ thống protein vir đặc biệt là virA rất nhạy cảm với nhiệt độ, chúng bất hoạt ở 29 0 C và biến tính ở 32 0 C, hiệu suất chuyển gene cao nhất ở 22 0 C và khoảng pH từ 5.2 - 5.7, điều này được giải thích do thụ thể nhận biết ký chủ của Agrobacterium (ChvE-VirA)được hoạt hóa bằng proton của hợp chất phenolic và nó bị bất hoạt trong 6 môi trường baz. Một khi protein Vir A bị bất họat thì tế bào vi khuẩn sẽ mất khả năng hoạt hóa toàn bộ hệ thống protein vir dẫn đến mất khả năng chuyển gen [9]. 2.1.2. Cấu trúc tế bào vi khuẩn Agrobacterium Agrobacterium tumefaciens có chứa nhiễm sắc thể và một plasmid lớn kích thước khoảng 200 kb gọi là Ti- plasmid chính là tác nhân truyền bệnh cho cây. Khi cây bị nhiễm A.tumefaciens qua các vết thương, biểu hiện rỏ nhất là các khối u được hình thành ở ngay chổ lây nhiểm. sự hình thành khối u sau đó có thể được tiếp tục mà không cần thiết phải có sự hiện diện của vi khuẩn. Khả năng có được do A.tumefaciens đã chuyển một đoạn DNA của Ti- plasmid xâm nhập vào hệ gen của cây bị bệnh [16]. Ti-plasmid Ti-plasmid là một plasmid lớn 200kb, chúng được duy trì ổn định trong Agrobacterium ở nhiệt độ dưới 30 0 C. Trên Ti-plasmid có đoạn T- AND có được giới hạn bằng bờ phải (right border) và bờ trái (left border). Trình tự nucleotid của bờ phải và bờ trái tương tự nhau. Đoạn này được gọi là T-AND vì đây là đoạn sẽ được chuyển vào tế bào thực vật gắn vào bộ NST và gây ra bệnh khối u. T-DNA của vi khuẩn được chuyển vào tế bào thực vật và hợp nhất với gen nhân (tế bào thực vật). T-DNA ổn định trong gen nhân.Vị trí hợp nhất của T-DNA vào DNA thực vật là hoàn toàn ngẫu nhiên. Vùng vir: là vùng chứa các Gene vir (virulence gene) mã hóa cho các protein thực hiện việc cắt, chuyển và gắn T-DNA vào genome thực vật. Vùng CON:vùng mã hóa chức năng tiếp hợp Vùng ORI :vùng mã hóa chức năng tái bản và khởi điểm tái bản [16]. A. Ti-plasmid kiểu octopine (pTiAch5) và kiểu nopaline (pTiC58) cho thấy vị trí tương đối và kích thước của các vùng chức năng chính. Các vị trí tô đậm chỉ các vùng tương đồng lớn của 2 plasmid CON: vùng mã hóa chức năng tiếp hợp ORI: vùng mã hóa chức năng tái bản và khởi điểm tái bản B. Bản đồ của vùng T kiểu nopaline và octopine cho thấy các vùng chức năng chính, các vùng tương đồng và các sản phẩm phiên mã. Ti-plasmid kiểu octopine và nopaline 7 T-DNA Đó là một đoạn DNA có kích thước 25 kb trong đó chứa gen mã hóa cho sinh tổng hợp auxin, cytokinin, opine là các gen gây khối u (oncogenes). Trong Ti-plasmid, vị trí của T-DNA được giới hạn bằng RB và LB. Ngoài T-DNA, trên Ti-plasmid còn có các vùng DNA mã hóa cho việc tái sinh plasmid (replication), cho khả năng lây nhiễm và tiếp hợp (vùng vir), cho việc tiêu hóa opine (opine catabolism). Trong các vùng DNA của Ti-plasmid, ngoài T-DNA, được nghiên cứu nhiều hơn cả là vùng DNA phụ trách khả năng lây nhiễm còn gọi là vùng vir. Sản phẩm hoạt động của các gen nằm trong vùng vir dưới tác động kích thích của các hợp chất phenol tiết ra từ vết thương là một loạt các protein đặc hiệu như virE2, virB, virD, virD2, virC1 Các protein này nhận biết các vết thương ở các cây chủ thích hợp (hầu hết là cây hai lá mầm), kích thích sản sinh ra các đoạn T-DNA, bao bọc che chở các đoạn DNA này và giúp chúng tiếp cận với hệ gen của cây chủ một cách an toàn. Khi cây nhiễm A. tumefaciens, do T- DNA nạp vào trong hệ gen của cây chủ bắt đầu hoạt động và sản sinh ra auxin, cytokinin và opine, toàn bộ sinh trưởng của cây bị rối loạn, các tế bào phân chia vô tổ chức và tạo ra các khối u. Opine được vi khuẩn sử dụng như một loại “thức ăn” nhờ gen chuyển hóa opine trên Ti-plasmid. vì thế sự thay đổi hình thái chính của thực vật là chúng tạo ra rất nhiều rễ tơ (hairy roots) khi bị nhiễm bệnh. Trên thực tế Agrobacterium chỉ gây hại ở cây hai lá mầm, vì vậy người ta cho rằng chúng chỉ có thể đưa T-DNA vào hệ gen các cây hai lá mầm. Gần đây, nhiều tác giả đã chứng minh khi nhiễm vi khuẩn, các cây một lá mầm cũng có thể sản xuất opine và có thể khai thác khả năng biến nạp gen của vi khuẩn Agrobacterium vào cây một lá mầm [4]. Bản đồ của các dạng Ti-plasmid A: dạng tự nhiên ban đầu, B: dạng cis, C: dạng trans. 8 Phương thức chuyển T-DNA vào gen của thực vật 2.1.3. Cơ chế tác dụng của Agrobacterium Cơ chế gây bệnh của các Agrobacterium là sau khi xâm nhiễm vào tế bào, chúng gắn đoạn T-DNA vào bộ máy di truyền của tế bào thực vật, dẫn đến sự rối loạn các chất sinh trưởng nội sinh, tạo ra khối u. Khả năng chuyển gen này đã được khai thác để chuyển gen ngoại lai vào bộ máy di truyền của tế bào thực vật theo ý muốn. Để gắn T-DNA vào tế bào thực vật, đầu tiên vi khuẩn A. tumefaciens phải tiếp xúc với thành tế bào thực vật bị tổn thương. Quá trình này được thực hiện nhờ các gen chvA và chvB. Gen chvB mã hóa một protein liên quan đến hình thành β-1,2 glucan mạch vòng, trong khi đó gen chvA xác định một protein vận chuyển, định vị ở màng trong của tế bào vi khuẩn. Protein vận chuyển giúp vận chuyển β-1,2 glucan vào khoảng giữa thành tế bào và màng sinh chất. β- 1,2 glucan giữ vai trò quan trọng để vi khuẩn Agrobacterium tiếp xúc với thành tế bào thực vật. Nếu không có sự tiếp xúc này, sẽ không có sự dẫn truyền T-DNA. 9 Các sản phẩm protein của vùng vir có tác dụng cho việc dẫn truyền T-DNA từ vi khuẩn vào tế bào thực vật. Các loại protein đó rất cần thiết cho quá trình cắt T-DNA khỏi Ti-plasmid, cảm ứng thay đổi màng tế bào thực vật mà chúng tiếp xúc, tham gia di chuyển phần T-DNA qua màng vi khuẩn tới tế bào chất của tế bào thực vật, vận chuyển tới nhân rồi cuối cùng xâm nhập vào gen của cây chủ. Thực chất chỉ riêng T-DNA của Ti-plasmid được chuyển vào gen tế bào thực vật, mà không còn phần nào khác. Quá trình dẫn truyền chỉ do sản phẩm của các gen vir (vùng vir) và gen chv quyết định mà không liên quan đến các gen khác trên T-DNA. Tuy nhiên, chuỗi DNA 25 bp (RB và LB của T-DNA) có vai trò là vị trí cảm ứng cho các sản phẩm của tổ hợp các gen vùng vir, đặc biệt là protein từ gen virE mang chúng dẫn truyền vào tế bào thực vật. Chúng hoạt động như các tín hiệu nhận biết và khởi động quá trình dẫn truyền. Trước hết gen virA trong tổ hợp gen vùng vir được phosphoryl hóa nhờ tác động của các hợp chất phenol như acetosyringone giải phóng ra từ các tế bào thực vật tổn thương. Sản phẩm của quá trình này lại tiếp tục phosphoryl hóa gen virG. Sản phẩm của gen virG liên tiếp làm hoạt hóa toàn bộ các gen vir còn lại, mà hai gen cuối cùng được hoạt hóa là gen virB và virE. Trước đó, khi gen virD được hoạt hóa, sản phẩm của nó cảm ứng nhận biết RB và LB của T-DNA và làm đứt phần T-DNA ra khỏi DNA của Ti-plasmid thành các sợi đơn. Đồng thời quá trình phosphoryl hóa này cũng làm thay đổi thẩm xuất màng tế bào thực vật, màng tế bào bị mềm ra và bị thủng. Các sợi đơn T-DNA được gắn vào protein do gen virE tổng hợp và dịch chuyển về phía màng tế bào vi khuẩn. Ngay sau đó, sợi T-DNA được trượt từ vi khuẩn vào tế bào thực vật. Cầu nối chính là sự tiếp hợp giữa hai tế bào do cảm ứng sản phẩm gen virB mà thành. Khi T-DNA đã được chuyển giao vào tế bào thực vật, chúng nhanh chóng hợp nhất trong gen tế bào thực vật được ổn định và di truyền như các gen bình thường khác [4]. Ðể khai thác và sử dụng A. tumefaciens như là một vector chuyển gen các nhà khoa học đã loại bỏ các gen gây khối u và gen mã hoá opine của T - DNA và thay thế vào đó là các marker chọn lọc, trong khi vẫn duy trì các vùng bờ phải và bờ trái của T-DNA và các gen vir. Gen chuyển được xen vào giữa các vùng bờ của T-DNA. Nó sẽ được chuyển vào tế bào và trở nên hợp nhất với nhiễm sắc thể tế bào thực vật. Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium đã được kiểm tra đối với sự xâm nhập bền vững, sự biểu hiện và sự di truyền của các gen chuyển đặc biệt. Một vài yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp là loại mô được biến nạp, giai đoạn phát triển của mô, mức độ khởi đầu của vi khuẩn A. tumefaciens sử dụng, môi trường để nuôi cấy mô sau khi biến nạp, marker được sử dụng để chọn lọc thể biến nạp, loại vector sử dụng và kiểu gen của thực vật [21]. 10 [...]... sánh phương pháp chuyển gen, phương pháp truyền thống và các phương pháp nông nghiệp khác để làm sáng tỏ những mối rủi ro tương đối cũng như những lợi ích của vi c áp dụng cây trồng chuyển gen Một điểm đặc trưng của kỹ thuật chuyển gen là nó đưa vào một hay nhiều gen đã 23 được xác định rõ Điều này giúp cho vi c thử nghiệm độc tính của các cây trồng chuyển gen dễ thực hiện hơn so với các cây trồng. .. mà cây lúa này sẽ sống được ở cả vùng miền núi khô cạn [14] 4.Kết luận Hiện nay, phương pháp chuyển gen vào cây trồng bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (At) được xem là một phương pháp rất có hiệu quả và là phương pháp mà qua đó kết quả chuyển gen (ở phân tích Southern blot) thường biểu hiện kiểu tích hợp gen (DNA integration) tương đối đơn giản - phù hợp với mục tiêu của các nhà công nghệ gen. .. Bulgaria, Pháp, Đức, Mexico, Rumani, Nam Phi, Tây Ban Nha và Uruguay Ngoài vi c chuyển được vào cây trồng gen kháng sâu hại, gen kháng thuốc diệt cỏ người ta còn chuyển được cả gen đề kháng với một số bệnh do virut, vi khuẩn và nấm gây ra ở cây trồng Bên cạnh đó là vi c chuyển gen chịu lạnh cho các cây lương thực, thực phẩm trồng ở các nước ôn đới, đặc biệt là cho thuốc lá và khoai tây, vốn là những cây. .. E-8) chứa gen mã hoá cho kháng nguyên RVS-F được chuyển vào cà chua thông qua phương pháp chuyển gen bằng Agrobacterium Sử dụng promoter đặc hiệu quả cho phép biểu hiện protein chỉ ở trong quả của tất cả các cây chuyển gen Protein này tạo đáp ứng miễn dịch khi được thử nghiệm ở chuột [25] Các vaccine sản xuất trong thực vật đã nâng cao giá trị cây trồng, nhất là cây chuyển gen do chúng được trồng và...2.1.4 Quy trình chuyển gen bằng Agrobacterium chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium 11 2.1.5 Ưu và nhược điểm của phương pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium 2.1.5.1 Ưu điểm Hiệu suất cao vì Khi xem xét vị trí biểu hiện màu xanh chàm của phản ứng GUS (của cơ chất với enzym B-Gluconidase), người ta nhận thấy Agrobacterium có xu hướng chuyển gene vào những vùng mô đang phân sinh... được chuyển vào vi khuẩn gây nhiễm thực vật Vi khuẩn được nhiễm vào các mẫu lá khoai tây mầm tạo đựơc từ các mẫu lá mang gen bệnh người Khi ăn khoai tây gây ra phản ứng miễn dịch mầm bệnh Chuyển gen vào khoai tây nhờ vi khuẩn Agrobacterium Tạo ra dược phẩm: ngô có lợi cho những người mắc bệnh xơ nang; Hạt ngô cũng là đối tượng quan tâm để sản xuất kháng nguyên vaccine vi m gan B.; ngô với tỷ lệ vitamin... sản phẩm cây chuyển gien Qua các kết quả trên, nhóm nghiên cứu của Phòng Công nghệ Gen - Vi n Sinh học nhiệt đới nhận thấy, protein kháng nguyên HBsAg sử dụng qua đường tiêu hóa có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch tốt Điều này mở ra một triển vọng nghiên cứu chuyển nạp gien này vào các cây trồng có bộ phận ăn tươi như quả, lá, thân, củ Với phương pháp chuyển gien bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, ... thực vật trên thế giới đã đạt được tập trung vào một số vấn đề 14 Hầu hết các báo cáo hiện nay về sản xuất vaccine ăn được đều liên quan đến phương pháp chuyển gen bằng Agrobacterium và promoter phổ biến nhất Nguyên tắc của phương pháp này là lợi dụng sự lây nhiễm của Agrobacterium để vận chuyển và phát tán vector virus vào thực vật, sau đó vector mang gen quan tâm này sẽ tiến hành sao chép, nhân lên... năng tự bảo vệ trước bọ khoai tây Colorado Giống khoai tây được chuyển gen nhằm kháng virus xoăn lá khoai tây (PLRV) và virus khoai tây Y (PVY) Loại khoai tây này được chuyển gen của virus để tự kháng lại virus [10] Thực hiện vi c chuyển nạp hiệu quả ở lúa trong các kiểu gen độc lập, và hiện nay hơn 40 giống đã được chuyển gen thành công Mẫu vật sử dụng là phôi non và các callus... phenol như cây hai lá mầm Tuy nhiên, cho đến thời điểm này, người ta đã tìm được nhiều chủng Agrobacterium có khả năng chuyển gene cho một số cây một lá mầm như bắp, lúa, cỏ, mía, lan…ứng dụng tạo ra gạo vàng, phong lan phát sáng [6] Phương pháp này có một số bất lợi: plasmid Ti gắn gen ngẫu nhiên vào hệ gen thực vật, làm tăng tính không đồng đều về mức độ biểu hiện kháng nguyên trong cây chuyển gen Ngoài . (liposome), vector virus, tế bào gốc phôi, chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium, chuyển gen bằng súng bắn gen. Phương pháp để đưa gen mới vào tế bào thực vật bằng vi c sử dụng Agrobaterium kiểu gen của thực vật [21]. 10 2.1.4. Quy trình chuyển gen bằng Agrobacterium 11 chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium 2.1.5. Ưu và nhược điểm của phương pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium 2.1.5.1 phosphoryl hóa gen virG. Sản phẩm của gen virG liên tiếp làm hoạt hóa toàn bộ các gen vir còn lại, mà hai gen cuối cùng được hoạt hóa là gen virB và virE. Trước đó, khi gen virD được hoạt hóa,