Thực hành công nghệ lên men pps

Nâng nhiệt độ lên 52 o C giữ 30 min: quá trình enzyme protease thủy phân protein thành amino acid và peptide tạo nguồn dinh dưỡng cho nấm men.. Nâng nhiệt độ lên 65 o C giữ nhiệt độ tro

BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP.HCM

KHOA MÔI TRƯỜNG & CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÀI GIẢNG

THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ LÊN MEN

Biên soạn: TS Nguyễn Hoài Hương

- 2009 -

-

NỘI DUNG THỰC HÀNH

Bài 1 : Lên men bia (25 tiết)

Bài 2 : Sản xuất nước tương bằng phương pháp lên men/ kết hợp hóa giải (20 tiết)

Bài 3: Sản xuất yoghurt (15 tiết)

Bài 1: Lên men bia

A Lý thuyết

I Giới thiệu

Bia là loại đồ uống có cồn và có gas đã có từ cổ xưa, thơm ngon và bổ dưỡng Công nghệ sản xuất bia đã xuất hiện trên thế giới hàng ngàn năm vào được du nhập vào Việt Nam hơn một trăm năm nay

Bia là đồ uống bắt nguồn từ Ai Cập cổ đại

Độ cồn trong bia thấp (3-8%) và nhờ có CO2, khi rót bia tạo nên nhiều bọt gây sảng khoái khi uống Giá trị dinh dưỡng của bia khá cao, trong bia có nhiều vitamin nhóm

B và các nguyên tố vi lượng Vì vậy công nghệ sản xuất bia không ngừng phát triển

và hoàn thiện trên thế giới

II Nguyên liệu và thiết bị

1 Nguyên liệu:

a) Có thể sản xuất bia thuần túy từ malt (đại mạch nảy mầm) hoặc có bổ sung thế

liệu (gạo, đại mạch…) để giảm giá thành Khi nấu malt ở nhiệt độ thích hợp, tinh bột malt sẽ được hệ enzyme amylase (alpha và beta amylase) gọi chung là diastase thủy phân thành đường maltose

Đại mạch (Hordeum distichum) Hạt đại mạch

b) Hoa bia (hoa houblon): là nguyên liệu cơ bản thứ hai đứng sau malt trong công nghệ sản xuất bia Hoa bia làm cho bia có vị đắng dịu, hương thơm đặc trưng và làm tăng khả năng tạo và giữ bọt Thành phần chính của hoa bia mà ta quan tâm là các chất đắng gồm acid đắng và nhựa đắng; tannin; tinh dầu Trong công nghệ sản xuất bia người ta sử dụng trực tiếp hoa bia hoặc chế phNm từ hoa bia bột hoa hay cao hoa bia

c) Nấm men Saccharomyces cerevisiae và Saccharomyces carlsbergensis là hai loại

nấm men thường được sử dụng để lên men bia Các loài nấm men lên men bia thuộc loại yếm khí tùy tiện Khi có oxy chúng tăng sinh khối nhờ hô hấp tế bào, khi không

có oxy chung lên men tạo thành ethanol và CO2 theo phương trình:

Đường + Nitơ amine tự do + Nấm men + Oxy →→→ Ethanol + CO 2 + Nấm men

(glucose, fructose), đường đôi (saccharose, maltose), khó lên men đường tam (raffinose)

Lên men tốt glucose, mannose, galactose, fructose, saccharose, maltose và cả raffinose

Làm giảm độ cứng của nước: Al2(SO4)3, CaSO4;

Điều chỉnh pH = H2SO4, acid lactic, CaCl2

Chất chống oxy hóa: acid ascorbic

Chất tạo màu: caramen

III Yêu cầu chất lượng (TCVN7042:2002)

Bảng 1 – Yêu cầu cảm quan của bia hơi

Tên chỉ tiêu Yêu cầu

1 Màu sắc Đặc trưng của từng loại sản phNm

2 Mùi Đặc trưng của bia sản xuất từ hoa houblon và malt đại mạch,

không có mùi lạ

3 Vị Đặc trưng của bia sản xuất từ hoa houblon và malt đại mạch,

không có vị lạ

5 Trạng thái Đặc trưng của từng loại sản phNm

Bảng 2 – Yêu cầu đối với các chỉ tiêu hoá lý

1 Độ axit, số mililit NaOH 1 N trung hòa hết 100 ml bia hơi

đã đuổi

1,8

hết CO2, không lớn hơn

công bố của nhà sản

xuất

4 Hàm lượng chất hoà tan ban đầu

Chỉ tiêu về kim loại nặng, vi sinh (xem TCVN7042:2002)

IV Sơ đồ công nghệ lên men bia malt thuần túy

Các quá trình chính trong công nghệ lên men bia:

1 Nấu bia: tinh bột dưới tác dụng của enzyme amylase trong malt (hoạt lực diastase

…) Khi nấu bia có thể liệu cần bổ sung enzyme để tăng vận tốc đường hóa Enzyme thường sử dụng: Termamyl nguồn gốc vi khuNn, chịu nhiệt

Giản đồ nấu là đồ thị hướng dẫn quá trình nấu: sự thay đổi nhiệt độ theo thời gian

Các giai đoạn trong quá trình nấu bia:

Malt: nước trộn theo tỉ lệ 1:4 rồi đưa nhiệt độ lên 38 – 40 o C trong 30 min Điều chỉnh

pH về 5,5 bằng H2SO4 Khi này các enzyme hemicellulase, glucanase, protease được hoạt hóa thủy phân glucan hoặc protein phức tạp bao quanh hạt tinh bột tạo điều kiện cho enzyme amylase thủy phân tinh bột

Nâng nhiệt độ lên 52 o C giữ 30 min: quá trình enzyme protease thủy phân protein

thành amino acid và peptide tạo nguồn dinh dưỡng cho nấm men Thành phần này c hiếm 5-7% chất hòa tan của dịch đường Ngoài ra thành phần này còn giúp bia có hương vị đậm đà, có khả năng giữ bọt

Nâng nhiệt độ lên 65 o C giữ nhiệt độ trong 30 min để enzyme amylase hoạt động

thủy phân tinh bột thành các đường có khả năng lên men

Nâng nhiệt độ lên 72 o C giữ ở 20 min để enzyme amylase hoạt động

Nâng nhiệt độ lên 78 o C giữ 30 min rồi lọc

Điều kiện hoạt động của các enzyme trong malt:

Đường hóa kết thúc khi p hản ứng giữa iod và tinh bột cho thấy màu iod không bị thay đổi

2 Lọc rửa bã

Rửa bã bằng nước nóng 76oC 3 lần

Bảo đảm lượng nước trong dịch đường

Rửa đến khi nồng độ chất hòa tan trong nước rửa bã còn 0,3-0,5% thì ngưng

Nâng nhiệt lên 76 – 78oC giữ 10 min để đường hóa nốt phần tinh bột còn lại

Đun sôi dịch đường 10 min thì cho ½ hoa bia vào tạo vị đắng

Trước khi kết thúc 10 min cho ½ hoa bia vào tạo hương

3 Làm lạnh nhanh: đưa nhanh chóng dịch đường sau khi nấu hoa về nhiệt độ lên

men

4 Nhân giống nấm men:

Cần bổ sung Zn và N Môi trường giống khởi động càng giống môi trường lên men chính càng tốt Sục khí hoặc lắc đóng vai trò quan trọng

Ống thạch nghiêng (rửa bằng môi trường vô trùng)

Tỉ lệ cấy giống tối ưu là 6-10.106 tế bào/ml men nổi; 10-14.106 tế bào/ml men

chìm Dịch đường càng đậm đặc tỉ lệ cấy giống phải càng cao

6 Lên men chính

Hiện nay lên men theo mẻ vẫn là phương pháp thịnh hành

Sau đây là đồ thị tăng trưởng của nấm men trong lên men bia

Thời gian (giờ)

I) Pha lag: Nấm men hấp thụ toàn bộ oxy có trong dịch đường, tổng hợp enzyme cần

thiết, tổng hợp sterol Pha lag xảy ra trong vòng một vài giờ sau khi cấy giống Nếu

môi trường giai đoạn nhân giống trước giống giai đoạn hiện tại pha lag sẽ ngắn

II) Pha tăng tốc: tế bào tăng trưởng và phân chia ChuNn bị lên men Tổng hợp

glycogen

III) Pha lũy thừa: tế bào sinh sản và trao đổi chất cực đại Chu kỳ phân chia 90-180

phút Bắt đầu lên men Số lượng nấm men có thể tăng 1000 lần trong vòng 24 giờ Tỉ

lệ cấy giống ảnh hưởng đến mức độ phân chia của tế bào Nếu cấy giống ở tỉ lệ thích hợp 5-15 106 tế bào/ml và phân chia 3 lần (số lượng tế bào tăng 8 lần) thì thu được 80-100.106 tế bào 100.106 tế bào/ml là nồng độ nấm men cao nhất trong dịch đường lên men Lên men cũng xảy ra rất mạnh và có hiện tượng trào bọt

IV) Pha giảm tốc: xảy ra 12-24 giờ sau khi cấy giống Khi đó oxy đã hết, chỉ còn

quá trình lên men sinh CO2 Bọt trào mạnh Lên men cực đại xảy ra trong vòng 12-48 giờ, sinh nhiệt và CO2

V) Pha cân bằng động: các chất dinh dưỡng lên men cạn kiệt Nấm men không còn

tăng trưởng mà bắt đầu kết bông Sterol và glycogen được tổng hợp và dự trữ trong các pha trước đó bắt đầu được sử dụng Kéo dài pha này dẫn đến tự phân nấm men

Thời gian Biến đổi sinh học Biến đổi sinh hóa Biến đổi vật lý

Giai đoạn hiếu

khí: 3 h sau khi

cấy

Nấm men tăng trưởng nảy chồi nhờ oxy còn lại trong thiết bị, hô hấp tỏa nhiệt đạt cực đại, xuất hiện nhiều bóng khí to Nồng độ đường giảm nhanh

Thủy phân đường đôi thành đường đơn Đường phân Tổng hợp glucogen Tổng hợp acid béo và sterol

Sử dụng nguồn N hữu cơ vô cơ để tăng trưởng

Nhiệt độ tăng

Giai đoạn kị khí : Lên men Sinh C2H5OH và CO2

và các sản phNm phụ trong đó ester đóng vai trò tạo hương

Nồng độ ethanol 2% nấm men phát triển bình thường

Nồng độ ethanol 2% - 5%: nấm men giảm tăng trưởng

Nồng độ ethanol > 5 % nấm men chấm dứt tăng trưởng nhưng vẫn lên men

Nồng độ ethanol =12% nấm men chấm dứt lên men

Thời gian lên men: 7 – 10 ngày phụ thuộc vào độ cồn và pH

Kết thúc quá trình lên men chính ta thu được bia non, mùi vị còn nồng, cảm quan chưa đạt

7 Quá trình lên men phụ:

Quá trình lên men phụ là quá trình

- các phản ứng enzyme và phi enzyme diễn ra dẫn đến ổn định chất lượng bia,

- các hợp chất tạo hương quan trọng hình thành

- diacetyl bị phân hủy xuống tới dưới mức quy định 0,2 mg/l là chỉ tiêu quyết định thời gian lên men phụ

- Bão hòa bia bằng CO2 để tăng vị và khả năng tạo bọt, ức chế sự phát triển của

vi sinh vật có hại

Tiến hành:

Sau khi tách men, hạ nhiệt đô dịch xuống 0-1oC, duy trì áp suất 0.9 – 1.2 mg/cm2, ngưng thu hồi CO2 khi quá trình lên men phụ diễn ra 15 ngày Kết thúc quá trình lên men phụ nồng độ đường còn lại cỡ 1,9 oBr, tách nốt phần nấm men còn lại Bia sau

khi lên men được bơm qua thiết bị lọc

a) Phòng thí nghiệm vi sinh đại cương:

đĩa Petri, ống nghiệm, bình tam giác, máy lắc, buồng đếm hồng cầu, kính hiển vi…

Bộ chưng cất cồn

Nồi nấu malt ổn nhiệt Bình lên men bia có khóa khí

III Nội dung thực hành

1 Chun bị men giống

Men chìm lấy từ bồn lên men chính của nhà máy bia Vinaken, cấy trên môi trường Hansen Môi trường nhân giống YEPG hoặc dịch malt đường hóa

Ống thạch nghiêng → ống nghiệm 10 ml YEPG → bình tam giác 100 ml dịch malt đường hóa

Giống phải đạt số lượng tế bào 15-20.107 tế bào/ml

2 Chun bị nguyên liệu:

Xay malt bằng máy xay phòng thí nghiệm

3 Quy trình nấu:

Malt : nước = 1: 4 nấu theo quy trình mô tả ở phần lý thuyết theo giản đồ sau:

Đường hóa đến khi thử với iod không đổi màu

4 Lọc qua vải lọc (lọc nóng)

5 Nấu hoa bia:

Lượng cao hoa sử dụng: 0,02%

6 Làm lạnh nhanh về nhiệt độ lên men 8 oC

7 Cấy giống

Bảo đảm cấy giống vô trùng

Đếm tế bào cấy giống dùng buồng đếm hồng cầu <221> sao cho đạt 14.107 tế bào/ml

Xác định tỉ lệ sống của tế bào nấm men nếu sử dụng nấm men từ lần lên men trước bằng phương pháp nhuộm xanh methylen rồi đếm trong buồng đếm hồng cầu <223>

Tế bào sống không bắt màu, tế bào chết bắt màu

Nếu sử dụng nấm men từ đợt lên men trước phải sục khí dịch đường

Tỉ lệ cấy giống 1: 10

8 Lên men chính

Trong phòng thí nghiệm lên men trong bình tam giác 1 L miệng bình bao bằng quả bóng cao su Để đạt nhiệt độ lên men 8oC, để bình lên men trong tủ lạnh (kiểm soát nhiệt độ)

Kiểm tra dịch đường trong thời gian lên men

Hàm lượng đường (độ Brix), pH

9 Thu hoạch bia non

Sau lên men chính hạ nhiệt độ xuống 2oC để lên men phụ và kết lắng nấm men Nấm men kết lắng được thu hồi và bảo quản 8oC

Trước khi sử dụng phải kiểm tra tỉ lệ sống của nấm men

Xác định độ hòa tan của malt (%): (mục 2.4 <20>)

Độ hòa tan của malt là lượng chất khô trong malt có thể hòa tan vào dung dịch trong điều kiện phòng thí nghiệm và biểu thị theo tỉ lệ phần trăm so với trọng lượng của

malt Đó là hàm lượng chất hòa tan của dịch đường sau khi đường hóa và lọc bã malt

Độ hòa tan của malt:

E1(%)= e(W+800)/(100-e)

W = độ Nm malt, %

e = hàm lượng chất hòa tan của dịch đường, % (theo khối lượng)

800 = lượng nước cất dùng để đường hóa 100 g malt, ml

Độ hòa tan của malt tính theo chất khô tuyệt đối:

E2(%)= E1x 100/(100-W)

Xác định hàm lượng chất hòa tan của dịch đường (e) ở 20 o C (% chất khô)

Hàm lượng chất hòa tan của dịch đường được tính từ tỉ trọng của dịch đường đo ở

20oC dựa trên bảng Phụ lục 1 (<265>)

b) Phân tích dịch đường trước,

Xác định tỉ trọng của dịch đường (d 20 20 ) = Tỉ trọng của dịch đường so với nước ở

20 o C

Đo bằng tỉ trọng kế rồi tra Phụ lục 4 (<301>) hiệu chỉnh về 20oC, hoặc

Đo bằng Brix kế (Hình) rồi tra Phụ lục 2 (<299>) hiệu chỉnh về 20oC, tra Phụ lục 8 (<306>) hiệu chỉnh về tỉ trọng

Xác định năng lực đường hóa của malt (hoạt tính diastase của malt): đo hoạt

động tổng hợp của enzyme alpha và beta amylase (<27>)

Các enzyme trong malt được chiết với nước ở 40oC và dùng để thủy phân dung dịch tinh bột chuNn Lượng đường khử tạo thành nhờ hoạt động của enzyme amylase được tính theo phương pháp iod Kết quả được tính bằng số g maltose tạo thành từ 100 g malt ở điều kiện chuNn

Hoạt tính diastase được tính theo đơn vị WK (Windish-Kolbach)

Hoạt tính diastase của mẫu:

DP1 = F(V -V )

VT = thể tích Na2S2O3 dùng để chuNn độ iod dư trong mẫu thực (thí nghiệm)

F = hệ số chuyển đổi để tính kết quả theo 100 g malt dùng chiết enzyme

Xác định độ lên men biểu kiến của dịch đường

Độ lên men biểu kiến là độ lên men khi đo hàm lượng chất hòa tan trong dịch lên men khi chưa đưổi rượu và CO2

Độ lên men biểu kiến = (E1-E2)/E1x100, trong đó: E1: lượng chất hòa tan (g) trong

100 ml dịch đường trước khi lên men; E2: lượng chất hòa tan biểu kiến (g) trong 100

ml dịch đường đã lên men

Độ lên men thực

Độ lên men thực là độ lên men khi đo hàm lượng chất hòa tan trong dịch lên men khi

đã đuổi hết rượu và CO2

Có thể tính độ lên men thực theo công thức sau:

Độ lên men thực= độ lên men biểu kiến x 0,81

Malt: độ Nm, ví dụ 6%, hệ số hòa tan, ví dụ 70%

Tính lượng nước sử dụng để đường hóa nhằm đạt dịch đường 12 o Br:

Lượng chất khô của malt

5 kg x 0,94 = 4,7 kg

Lượng chất chiết từ malt là:

5 kg x 0,94 x 0,70 = 3,29 kg

Tính lượng chất hòa tan còn lại trong dịch đường sau giai đoạn nấu, đường hóa, lọc là nếu tổn thất chung là 1,5% (1-2%)

3,29 x 0,985 = 3,24 kg

Lượng dịch đường 12oBr sau khi đun hoa là

3,24/ 0,12 = 27 kg

Dịch đường 12oBr có khối lượng riêng d= 1,0462 kg/l

Do đó thể tích dịch đường sau khi đun hoa là: V = M/d

Tính toán độ cồn của bia sau khi lên men

Lượng chất chiết sau khi nấu hoa là 3,24 kg sau khi để lắng và làm lạnh nhanh tổn thất chung là 2 % Như vậy lượng chất chiết trong dịch lên men là

3,24 kg x 0,98 = 3,175 kg

Hiệu suất lên men thực là ví dụ là 60% và coi toàn bộ đường lên men là maltose

(tức là chỉ 60% đường maltose đường sử dụng để lên men) Cứ 1 kg đường maltose lên men sẽ tạo ra 0,682 l cồn, đo đó độ cồn của bia sau khi lên men là:

Phụ lục 1: Chất lượng malt của nhà máy bia Sài gòn

Phụ lục 2: Thành phần hóa học của hoa bia

Phụ lục 3: Phân loại hoa bia

Phụ lục 4: Giản đồ nấu của nhà máy bia Sài Gòn (nấu bia có thế liệu, sử dụng amylase Termamyl để thủy phân)

Bài 2: Sản xuất nước tương lên men

A Lý thuyết

I Giới thiệu

Nước chấm nguồn gốc thực vật là dịch thủy phân nguồn đạm có trong nguyên liệu Tác nhân thủy phân có thể là enzyme do vi sinh vật tiết ra, có thể là acid như HCl (nước chấm hóa giải)

Nước chấm lên men thuần túy là nước chấm cổ truyền ở các nước Á châu Tuy nhiên thời gian thủy phân kéo dài hàng tháng, giá thành cao Vì vậy trong một thời gian dài hầu hết nước tương được sản xuất ở Việt Nam là nước chấm hóa giải

Gần đây người ta phát hiện trong nước chấm (nước tương) hóa giải bằng HCl có chứa nhiều 3-MCPD (3-monochloropropane-1,2diol) có khả năng gây ung thư Vì vậy có

xu hương quay trở về công nghệ truyền thống Một số quy trình sản xuất nước chấm

an toàn (về 3-MCPD) giá thành chấp nhân được bằng cách kết hợp lên men và hóa giải đã được triển khai

II Nguyên liệu:

1 Khô dầu nành hoặc đậu phộng (hàm lượng béo càng thấp càng tốt < 5%)

2 Nấm sợi Aspergillus oryzae

Asp.oryzae sinh trưởng dạng hệ sợi, bao gồm các sợi rất mảnh chiều ngang 5-7

µm, phân nhánh nhiều, có vách ngăn chia sợi thành nhiều tế bào

Asp oryzae có khuNn lạc, màu sắc bào tử và hình thái rất giống Asp flavus, một

loài nấm tổng hợp aflatoxin

KhuNn lạc Asp.flavus và Asp oryzae

Asp flavus

Aflatoxin

Asp oryzae

So sánh hình thái khuNn lạc, cấu trúc

III Yêu cầu chất lượng

Dịu ngọt, sau khi nếm không có cảm gáic khé

cổ, không đắng, chua hay

có các vị không thích hợp khác