bài hướng dẫn thực hành công nghệ lên men

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ HĨA HỌC BÀI HƯỚNG DẪN THỰC HÀNH CƠNG NGHỆ LÊN MEN Biên soạn: TS Đỗ Việt Hà Thành phố Hồ Chí Minh, 10/2019 MỤC ĐÍCH, U CẦU CỦA HỌC PHẦN Mục đích Sau học xong học phần sinh viên có khả năng:  Chuẩn bị giống vsv mơi trường lên men, hoạt hóa, phân lập nuôi cấy giống  Khảo sát, nghiên cứu trình lên men quy mơ phòng thí nghiệm  Nêu yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men kiểm sốt q trình u cầu  Dự lớp 100% (có mặt làm thực hành kết thúc buổi thực hành)  Sinh viên đến trễ phải thông báo cho GV biết, kết thúc buổi thực hành thơng báo khơng chấp nhận bị trừ điểm  Chuẩn bị đầy đủ nguyên liệu cho buổi thực hành  Đọc kỹ phần hướng dẫn thực hành trước lên lớp  Viết báo cáo thực hành theo nội dung giảng viên yêu cầu  Sinh viên vắng mặt khơng có tên báo cáo thí nghiệm khơng có điểm thực hành PHÂN BỐ THỜI GIAN VÀ ĐÁNH GIÁ HỌC PHẦN Phân bố thời gian Một tín thực hành 30 tiết bao gồm (thực hành ngày ngày liên tiếp từ 8h-18h) Bài 1: Chuẩn bị môi trường, phân lập định lượng nấm men Bài 2: Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng lên động học sinh trưởng nấm men q trình ni cấy mẻ Đánh giá thực hành Thang điểm đánh giá thực hành (0-10 điểm) Yêu cầu Chuẩn bị Kỹ năng, thao tác Vệ sinh, an toàn Kết nhận xét Trả lời câu hỏi Tổng điểm Thang điểm 0-1 0-1 0-1 0-6 0-1 0-10 Điểm đánh giá: điểm trung bình cộng tất thực hành Viết báo cáo thực hành Bố cục báo cáo: giới thiệu thực hành, nguyên liệu, dụng cụ, trang thiết bị, nội dung thực hành, kết thực hành trả lời câu hỏi CÁC QUY TẮC AN TOÀN VÀ VỆ SINH TRONG PTN (SV phải tuân thủ) Mặc áo blouse đeo bao tay thời gian thực hành Để ý quan sát làm theo hướng dẫn giáo viên dạy thực hành Trước sau thao tác cần xịt cồn 70 vào tay micropipet lau khăn giấy Khi thực thao tác cần tránh xa lửa đèn cồn tay ướt Sau lau khơng sờ tay vào chỗ dơ Khi lỡ tay làm đổ môi trường vsv, dùng khăn hay giấy tẩm cồn để lau Ghi tên chủng vsv ngày tháng thí nghiệm lên dụng cụ chứa môi trường & vsv Khi sử dụng que cấy để cấy vsv cần phải nhúng đầu que cấy vào cốc chứa cồn 95 để rửa khử trùng cách đốt lửa đèn cồn Tất chất thải môi trường chứa nhiễm vsv cần hấp khử trùng trước đem đổ vào thùng rác Hộp petri sau nuôi cấy cần loại bỏ thạch vsv cách dùng thìa kim loại múc cho vào cốc thủy tinh, sau hộp petri, thìa kim loại cốc thủy tinh bọc giấy nhôm giấy báo đem khử trùng nồi hấp Các dụng cụ nhiễm vsv cần ngâm dung dịch sát khuẩn trước rửa Không đổ thạch vào bồn rửa ống thoát nước Sinh viên vi phạm điều bị ghi tên trừ điểm vào thực hành Bài 1: Chuẩn bị môi trường, phân lập định lượng nấm men Mục đích - Chuẩn bị mơi trường thạch đĩa để phân lập môi trường thạch nghiêng để giữ giống - Phân lập giống vi sinh vật khiết (nấm men) - Định lượng mẫu vi sinh vật khiết - Bảo quản mẫu vi sinh vật khiết Nguyên liệu, trang thiết bị, dụng cụ Nấm men bánh mì Nồi hấp (autoclave) Glucose Tủ (buồng) cấy vơ trùng Peptone Tủ ấm (incubator) NaCl Cân số lẻ KH2PO4 Máy đo pH MgSO4.7H2O Kính hiển vi Cồn 95, 70 Buồng đếm tế bào HCl 0.1N Que trang (que trải) Agar, nước cất Đĩa petri Methylen blue Micropipette (100-1000l) + tip Bút marker Micropipette (20-200l) + tip Ống nghiệm Máy lắc ống nghiệm (vortex mixer) Cốc thủy tinh 100 ml Bình tam giác 250 ml Bình định mức 100 ml Đèn cồn, giấy vệ sinh, giấy nhôm, bao tay, bút marker Nội dung thực hành  Mỗi buổi thực hành chia làm nhóm, nhóm khoảng 12-13 SV  Dụng cụ nhóm: cốc thủy tinh 250 ml, bình tam giác 250 ml, ống nghiệm nút bơng, ống nghiệm pha lỗng, đĩa petri, cá từ, nút cho ống nghiệm  Chuẩn bị giống vsv môi trường Mỗi nhóm cân mẫu nấm men bánh mì, mẫu 0.02 g, mẫu pha loãng phân lập nấm men, mẫu pha lỗng đếm trực tiếp kính hiển vi Nhóm pha 100 ml dung dịch HCl 0.1N dùng chung cho vào chai đựng thủy tinh 600 ml cồn 70 cho vào bình phun sương bình vòi Nhóm pha 100 ml nước muối peptone dùng chung (SPW, saline peptone water)(8.5 g/l NaCl, 1.0 g/l peptone, 100 ml nước cất cho vào cốc thủy tinh 250 ml khuấy cá từ 15 phút, sau cho vào ống nghiệm đem hấp khử trùng đánh số 1, 2, theo thứ tự 4.98 ml (ứng với độ pha loãng 10-2), 4.95 ml (ứng với độ pha loãng 10-4), 4.5 ml (ứng với độ pha lỗng 10-5 ống nghiệm khơng đem hấp khử trùng để pha loãng đếm nấm men đánh dấu 1b, 2b, 3b theo thứ tự 4.98 ml (ứng với độ pha loãng 10-2), 4.95 ml (ứng với độ pha loãng 10-4), 4.5 ml (ứng với độ pha lỗng 10-5) Phần nước muối peptone lại cho vào chai nhựa đựng nước muối rửa Bọc đầu ống nghiệm đem hấp lớp giấy nhôm bọc đầu ống nghiệm không đem hấp lớp giấy nhôm Cho 12 ml nước cất vào ống nghiệm đổ thạch nghiêng, dùng bút marker đánh dấu mực nước ống nghiệm để đổ môi trường thạch nghiêng xong đổ nước đi, gắn nút bơng vào, bọc đầu ống nghiệm có nút hai lớp giấy nhôm Pha 150 ml môi trường thạch Hansen (nhóm nhóm 2): 50 g/l glucose, 10 g/l peptone, 3.0 g/l KH2PO4, 2.0 g/l MgSO4.7H2O, 24 g/l agar 140 ml nước cất cho vào bình tam giác 250 ml Khuấy cá từ 15 phút, điều chỉnh pH nhiệt độ phòng HCl 0.1N Cho nước cất vừa đủ 150 ml, bọc đầu bình tam giác chứa mơi trường hai lớp giấy nhôm  Tiệt trùng môi trường Cho vào nồi hấp tiệt trùng bình tam giác chứa môi trường thạch Hansen bọc đầu giấy nhôm, ống nghiệm chứa SPW bọc đầu giấy nhôm, ống nghiệm có nút bơng bọc đầu giấy nhôm, đĩa petri bọc giấy nhôm, hộp chứa pipet tip màu xanh (100-1000 l) bọc giấy nhôm, hộp chứa pipet tip màu vàng (20-200 l) bọc giấy nhôm 121C 15 phút  Chuẩn bị tủ cấy trước đổ môi trường cấy vsv Xịt cồn 70 vào buồng cấy lau buồng cấy, sau thắp hai đèn cồn (chứa cồn 96) để khử trùng buồng cấy 30 phút  Chuẩn bị môi trường thạch nghiêng thạch hộp petri Ghi tên nhóm ngày làm TN lên ống nghiệm có nút bơng hộp petri, ghi đĩa đối chứng đĩa tỉ lệ pha loãng 10-4, 10-5 lên hộp petri Lắc nhẹ đổ môi trường ấm bình tam giác vào ống nghiệm có nút bơng tiệt trùng bên lửa đèn cồn, đậy nút lại để đầu ống nghiệm nằm mép khay melanin để nguội tạo môi trường thạch nghiêng Đổ môi trường thạch hộp petri: nắp hộp petri, đổ nhanh mơi trường thạch ấm vào với độ dày môi trường khoảng mm, đậy nắp hộp lại để yên đến môi trường nguội đơng đặc lại  Pha lỗng phân lập nấm men Cho 0.02 g nấm men vào ống nghiệm chứa 4.98 ml SPW (tỉ lệ pha loãng 10-2) lắc máy lắc ống nghiệm Cho 50 l dung dịch ống nghiệm vào ống nghiệm chứa 4.95 ml SPW lắc (tỉ lệ pha loãng 10-4) Cho 500 l dung dịch ống nghiệm vào ống nghiệm chứa 4.5 ml SPW lắc (tỉ lệ pha loãng 10 -5) Nhúng đầu que trải vào cốc 100 ml chứa cồn 95, hơ qua lửa để khử trùng, để đầu que trải nguội không gian vô trùng lửa đèn cồn Cho 25 l dung dịch sau pha lỗng (10-4 10-5) vào hộp mơi trường thạch, dùng que trải xoay sang phải kết hợp xoay đĩa sang trái để trải dung dịch lên bề mặt thạch Mỗi nhóm trải đĩa petri 10-4, đĩa petri 10-5, đĩa không trải để đối chứng Bao đĩa petri màng bọc thực phẩm Úp ngược hộp petri để nhiệt độ phòng 18-48 h Sau quan sát thấy khuẩn lạc mọc thạch hộp petri, chọn khuẩn lạc đơn có hình thái giống nấm men để cấy chuyền sang ống thạch nghiêng, ủ nhiệt độ phòng (28-30C) 18-48 h cho lên khuẩn lạc giữ giống tủ mát 4C  Định lượng nấm men + Đếm trực tiếp (tế bào/g tế bào/ml): mật độ vsv đơn bào có kích thước lớn nấm men xác định trực tiếp buồng đếm kính hiển vi Đếm vùng buồng đếm có 25 lớn x 16 nhỏ Nguyên tắc đếm trực tiếp buồng đếm neubauer thủy tinh tráng bạc:  Pha loãng huyền phù tế bào vsv (10-4, 10-5 10-6) cho ô lớn 16 ô nhỏ từ 10 - 50 tế bào Nhỏ giọt xanh methylen vào dung dịch pha lỗng  Một buồng đếm hình vng diện tích mm2 có 25 vng lớn, vuông lớn chia thành 16 ô vuông nhỏ, buồng đếm có tổng cộng có 400 vng nhỏ Độ sâu buồng đếm 0,1 mm Diện tích ô lớn 0,04 mm2, thể tích ô lớn 0,004 mm3  Rửa buồng đếm kính cồn 70 nước cất thấm khô khăn giấy giấy vệ sinh Lắc mạnh dịch huyền phù pha loãng, dùng micropipet để hút 20 l dịch huyền phù pha loãng nhỏ vào buồng đếm, đậy kính Di chuyển nhẹ nhàng kính để dịch huyền phù tràn đầy khoang đếm, sau đưa lên kính hiển vi để đếm (dùng vật kính 4 để tìm buồng đếm sau chuyển sang vật kính 40 để đếm)  Đếm số lượng tế bào ô theo đường chéo theo góc trung tâm Với tế bào ranh giới ô lớn quy ước đếm tế bào cạnh bên trái Đếm 3~5 lớn lấy số lượng trung bình Chụp ảnh nấm men có buồng đếm camera Đếm số lượng tế bào chết tế bào thấm màu xanh đậm thuốc nhuộm Đếm số tế bào ô khoanh tròn nằm ô này: a + b + c + d + e  Số tế bào: N = A  25 : V : n (tế bào/ml), N: số tế bào ml dịch huyền phù A: số tế bào trung bình lớn V: thể tích buồng đếm (0,1  10-6 ml) 25: số ô lớn buồng đếm n: độ pha lỗng mẫu Từ tính tổng số tế bào tỉ lệ tế bào sống/chết có g mẫu men bánh mì (tế bào/g mẫu) ban đầu + Đếm khuẩn lạc (Colony Forming Unit-CFU): đếm tất số khuẩn lạc xuất đĩa sau ủ Chọn đĩa có số đếm từ 25 đến 250 để tính kết Tính số lượng tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) g hay ml chất ban đầu tạo dịch huyền phù: N = A : V : Df (CFU/ml) A: số CFU trung bình đĩa petri độ pha lỗng định V: thể tích mẫu cấy đĩa petri Df: độ pha loãng mẫu Từ tính số tế bào có g mẫu men bánh mì (tế bào/g mẫu) ban đầu Ví dụ: Phân lập 0,05 ml dịch huyền phù đất độ pha lỗng 10 -6, ta đếm trung bình có 45 CFU/đĩa petri N = (45/0,05)/10-6 =  108 (CFU/ml) Nếu độ pha loãng cao nhất, số khuẩn lạc đếm đĩa >250, ví dụ nồng độ 10 -5 số đếm lớn 250, kết ghi >2,5 × 107 CFU/g Nếu độ pha loãng thấp nhất, số khuẩn lạc đếm đĩa