tìm hiểu mối liên quan giữa sự có mặt của gen core-precore với một số dấu ấn của hbv trong huyết thanh

Đặc biệt những phụ nữ trong độ tuổi sinh đẻ nếu mang cả hai kháng nguyên bề mặt HBsAg và HBeAg thì khả năng lây truyền HBV cho con của họ tăng lên rõ rệt.. Đây là kỹ thuật phát hiện khán

Tr−êng §¹i häc Y Hμ Néi

1.1.1.1 Dịch tễ học bệnh viêm gan B trên thế giới 3

1.1.1.2 Dịch tễ học bệnh viêm gan B tại Việt nam 5

1.1.2 Lâm sàng và mức độ nguy hiểm của bệnh viêm gan B 8

1.1.2.1 Viêm gan B cấp 8

1.2 Đặc điểm sinh học của vi rút viêm gan B 11

1.2.3.1 Lây truyền HBV từ mẹ sang con 15

1.2.3.2 Lây HBV qua đường tiêm truyền 15

1.2.3.3 Lây HBV qua đường tình dục 15

1.3 Vai trò của các đoạn gen trong bộ gen của HBV 16

1.4.1 Kháng nguyên bề mặt của HBV (HBsAg) và anti-HBs 17

1.4.2 Kháng nguyên lõi của HBV (HBcAg) và anti-HBc 18

1.4.3 Kháng nguyên e của HBV (HBeAg) và anti-HBe 19

1.5.2 Kỹ thuật ELISA 23

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.2 Phương pháp nghiên cứu 24

2.4 Các kỹ thuật sẽ sử dụng trong nghiên cứu 25

2.4.1 ELISA xác định các dấu ấn HBsAg, HBs, HBeAg,

anti-HBe, anti-HBc

25

2.4.1.1 Kỹ thuật ELISA phát hiện HBsAg trong huyết thanh 25

2.4.1.2 Kỹ thuật ELISA phát hiện Anti-HBs trong huyết thanh 25

2.4.1.3 Kỹ thuật ELISA phát hiện HbeAg trong huyết thanh 26

2.4.1.4 Kỹ thuật ELISA phát hiện anti-HBe trong huyết thanh 27

2.4.1.5 Kỹ thuật ELISA phát hiện Anti-HBc trong huyết thanh 28

2.4.2 Kỹ thuật PCR xác định gen Core/Pre-Core 29

3.2 Đánh giá tỷ lệ phát hiện các dấu ấn HBeAg, HBe,

4.1 Tỷ lệ phát hiện gen Core và gen PreCore ở các phụ nữ trong độ

tuổi sinh đẻ có HBsAg(+)

40

4.2 Tỷ lệ phát hiện HBeAg, anti-HBe, anti-HBc, anti-HBs 42

4.3 Mối liên quan giữa sự hiện diện của gen Core, gen PreCore với

bốn dấu ấn trong huyết thanh

Anti- HBs : Antibody against Hepatitis B surface antigen

( Kháng thể kháng kháng nguyên bề mặt vi rút viêm gan B)

Anti- HBc : Antibody against Hepatitis B core antigen

( Kháng thể kháng kháng nguyên lõi vi rút viêm gan B)

Anti- HBe : Antibody against Hepatitis B e antigen

( Kháng thể kháng kháng nguyên e vi rút viêm gan B)

Au : Australia antigen

( Kháng nguyên Australia)

cccDNA : DNA vòng đóng tương đương

( Covalently closed circle DNA)

DNA : Deoxyribonucleic Acid

( Axít deoxyribonucleic)

ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay

( Kỹ thuật miễn dịch hấp phụ gắn men)

HBV : Hepatitis B virus

( Vi rút viêm gan B)

HBsAg : Hepatitis B surface antigen

( Kháng nguyên bề mặt vi rút viêm gan B)

HBcAg : Hepatitis B core antigen

( Kháng nguyên lõi vi rút viêm gan B)

HBeAg : Hepatitis B e antigen

( Kháng nguyên e vi rút viêm gan B)

PCR : Polymerase Chain Reaction

( Phản ứng khuếch đại chuỗi)

500 000 người mang HBV mạn tính chết vì xơ gan và ung thư gan [44]

Người ta thấy rằng 90% những người mang HBV mạn tính ở các nước Đông Nam Á là bị lây nhiễm ở thời kỳ chu sinh, đặc biệt là trong cuộc đẻ [23] Như vậy, nhiễm HBV ở thời kỳ sơ sinh là rất nguy hiểm, bởi đại đa số những trẻ này sẽ là người mang HBV mạn tính với nguy cơ tiến triển thành những bệnh gan mạn tính là rất lớn Lây nhiễm cho trẻ nhỏ ở thời kỳ sơ sinh chủ yếu là từ những mẹ có mang HBV, đặc biệt là ở những

mẹ mang HBV mạn tính

Việt Nam là nước thuộc khu vực có tỷ lệ HBV lưu hành cao Người mang HBsAg(+) trong cộng đồng ở Việt Nam chiếm tỷ lệ 11,1% đến 16,8% [1,4,5,12,15,16,18] Tỷ lệ phụ nữ mang HBV mạn tính cao Đặc biệt những phụ nữ trong độ tuổi sinh đẻ nếu mang cả hai kháng nguyên bề mặt HBsAg và HBeAg thì khả năng lây truyền HBV cho con của họ tăng lên rõ rệt

Phát hiện HBV ở Việt Nam hiện nay phổ biến sử dụng kỹ thuật ELISA (Enzyme Linked Immunosorbernt Assay) Đây là kỹ thuật phát hiện kháng nguyên bề mặt (HBsAg) hay kháng nguyên hoà tan (HBeAg) của HBV và các kháng thể (Anti-HBs, Anti-HBc, Anti-HBe) Những kỹ thuật này chỉ cho phép phát hiện các dấu ấn hòa tan của HBV mà không trực tiếp phát hiện cấu trúc genom của HBV, kỹ thuật này không cho thấy khả năng đang nhân lên của HBV

Kỹ thuật PCR phát hiện các cấu trúc genom của HBV Gen Core/Precore chứa thông tin liên quan đến sự nhân lên của HBV Vì vậy, việc phát hiện gen Core và gen PreCore trong huyết thanh bằng kỹ thuật

PCR cho phép xác định chính xác sự có mặt của HBV cũng như khả năng nhân lên HBV ngay ở giai đoạn sớm của nhiễm HBV Đặc biệt việc phát hiện gen PreCore còn liên quan đến sự xuất hiện hay không của HBeAg, một kháng nguyên được cho là có vai trò quan trọng trong sự lây nhiễm HBV từ mẹ sang con

Thế giới đã có nhiều các công trình nghiên cứu về vấn đề này Nhiều công trình đã tiến hành giải trình tự gen Core, gen PreCore và xác định được các vị trí hay xảy ra đột biến ở vùng gen Core và vùng gen PreCore Tuy nhiên, chưa có công trình nào khảo sát về mối liên quan giữa sự có mặt của hai gen Core/PreCore với sự có mặt của các dấu ấn trong huyết thanh

Ở Việt Nam nhiều công trình nghiên cứu về HBV đã được công bố Các nghiên cứu chủ yếu ở khía cạnh lâm sang, sự hiện diện và sự thay đổi của dấu ấn trong huyết thanh ở các bệnh nhân viêm gan mạn, viêm gan cấp, bệnh nhân xơ gan, và ung thư gan… Về sinh học phân tử, cũng đã có một số công trình nghiên cứu kết hợp với nước ngoài để xác định các thể đột biến của HBV trên các bệnh nhân có bệnh gan mạn tính Có công trình

đã tiến hành xác định HBV-DNA trên những phụ nữ có thai có HBsAg(+)

và một số trẻ nhỏ con của những sản phụ này Nhưng cũng chưa thấy có công trình nào công bố về tỷ lệ phát hiện gen Core và gen PreCore cũng như mối liên quan của hai gen này với một số dấu ấn huyết thanh ở những phụ nữ trong độ tuổi sinh đẻ

Vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu này với hai mục tiêu :

1 Phát hiện gen Core / PreCore ở phụ nữ trong độ tuổi sinh đẻ

mang HBsAg

2 Tìm hiểu mối liên quan giữa sự có mặt của gen

Core/PreCore với một số dấu ấn của HBV trong huyết thanh

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Đại cương về bệnh viêm gan B

1.1.1 Dịch tễ học bệnh viêm gan B

1.1.1.1 Dịch tễ học bệnh viêm gan B trên thế giới

Vi rút viêm gan B (HBV - Hepatitis B Virus) là một tác nhân gây viêm gan rất đa dạng về phương diện dịch tễ Tỷ lệ mang HBV rất khác biệt ở những vùng địa lý khác nhau và liên quan đến độ tuổi khi bị nhiễm HBV [64] Theo ước tính của Tổ chức y tế thế giới đến cuối năm 2000, thế giới có khoảng 400 triệu người mang HBV, hơn 500 000 trong số đó chết

do các bệnh gan hàng năm [44] Ở Mỹ tỷ lệ mang HBV mạn tính là 1,25 triệu người [22,53] Tỷ lệ người mang HBV trên toàn thế giới dao động từ 0,1% đến 20%, khác nhau giữa các châu lục Căn cứ vào tỷ lệ mang HBV trong cộng đồng người ta chia thế giới thành ba khu vực với ba mức độ lưu hành dịch khác nhau Khu vực dịch lưu hành thấp: có tỷ lệ mang HBV từ 0,1% đến 2%, đó là các vùng như Tây Âu, Úc, Niu-di-lân và Mỹ Khu vực dịch lưu hành trung bình đó là các nước Trung Đông, Nhật Bản, Ấn Độ và Singapo, tỷ lệ mang HBV ở đây khoảng 3% đến 5%

Khu vực lưu hành dịch cao đó là Đông Nam Á và khu vực Tiểu Sahara thuộc Châu Phi có tỷ lệ người mang HBV trong cộng đồng từ 10% đến 20% [49]

Ở Mỹ số người nhiễm HBV bao gồm cả mới nhiễm và số cũ là khoảng 5%, đáng lưu ý là gần 100% những người lớn trong số này là người Đông Nam Á và người Phi Nhìn chung sự nhiễm HBV tăng lên theo tuổi

và tỷ lệ nhiễm HBV cao ở những cộng đồng người Mỹ gốc Phi, người Mỹ gốc Tây Ban Nha, Bồ Đào Nha và gốc Á [53]

Một vài nghiên cứu cũng cho thấy một số cộng đồng có tỷ lệ người mang HBV cao hơn các cộng đồng lân cận như người Eskimo ở Alaska, người sống ở các đảo thuộc Châu Á - Thái Bình Dương và những thổ dân ở Australia

Ở hầu hết các nước thuộc khu vực có dịch lưu hành cao như Hồng Kông và Trung Quốc, lây truyền chu sinh ( lây truyền dọc) là phương thức lây truyền chủ yếu Những người nhiễm HBV mạn tính ở đây chủ yếu là do

bị lây nhiễm trong giai đoạn chu sinh Nhưng ở một số vùng khác như Châu Phi và Trung Đông, lây truyền ngang trong hai năm đầu đời là chủ yếu, đây cũng là phương thức lây truyền chính ở của một số các bệnh địa phương khác Hiện tại vẫn chưa có lý giải rõ ràng nào cho việc chiếm ưu thế trong phương thức lây truyền chu sinh ở những người có nguồn gốc Á Đông Nhưng người ta thấy ở những người Á Đông có tỷ lệ cao mang đồng thời cả HBsAg và HBeAg Thêm vào đó 40% đến 50% những người mang

cả hai loại kháng nguyên ( HBsAg và HBeAg) ở trong độ tuổi sinh sản trong khi ở Châu Phi số người cùng trong nhóm này chỉ có 10% đến 20% Những khu vực dịch lưu hành trung bình, sự lan truyền HBV là tương đương ở các nhóm tuổi Nhưng người ta cũng thấy hầu hết những lây nhiễm sớm đều dẫn đến nhiễm HBV mạn tính Ở những khu vực dịch lưu hành thấp hầu hết các trường hợp lây nhiễm là do sinh hoạt tình dục không được bảo vệ hoặc do tiêm truyền khi còn trẻ tuổi

Thực tế cho thấy tuổi bị nhiễm HBV có ý nghĩa rất quan trọng lien quan đến các diễn biến lâm sàng sau này của người bệnh [62] Bởi vì 90% trẻ bị nhiễm ở giai đoạn sơ sinh, đặc biệt là lúc đẻ sẽ chuyển thành nhiễm HBV mạn tính Nếu trẻ bị nhiễm trong giai đoạn từ 1 đến 5 tuổi chỉ 25% đến 50% chuyển mạn tính Và chỉ 5% bị chuyển thành mạn tính khi người

bị nhiễm đã ở tuổi trưởng thành [23]

1.1.1.2 Dịch tễ học bệnh viêm gan B tại Việt Nam

Đã có rất nhiều các công trình nghiên cứu về tỷ lệ nhiễm HBV ở người Việt Nam trên khắp các vùng miền trong cả nước Các kết quả đều cho thấy

tỷ lệ lưu hành HBV trong cộng đồng là rất cao

Tại Hà nội: Lê Vũ Anh, bằng phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên phân tầng của 1.304 người thuộc cộng đồng dân cư ở Hà Nội, cho thấy tỷ lệ người mang HBsAg là 11,35±0,02% [1] Trần Thị Chính nghiên cứu những người lành là cán bộ công chức và sinh viên Y thấy tỷ lệ mang HBsAg là 14,4% [5] Phan Thị Phi Phi khảo sát trên người lành và người ung thư tế bào gan thấy tỷ lệ mang HBV là 13,9% [15] Nguyễn Anh Tuấn bằng phương pháp

miễn dịch phóng xạ phát hiện các dấu ấn của HBV, thấy trong số 3.311 công nhân làm việc tại Hà nội được làm xét nghiệm số người HBsAg(+) là 11.1% [18]

Phạm Văn Lình điều tra ngẫu nhiên trên 1.478 người từ 3 đến 70 tuổi sống

ở Huế, đã rút ra tỷ lệ HBsAg(+) trong cộng đồng ở Huế là 16,8%, trong đó nam chiếm 10,4% và nữ là 6,4% Nếu so sánh giữa các nhóm tuổi thấy rằng HBsAg(+) cao nhất ở nhóm tuổi từ 31 - 40 (chiếm 21,2%) Xét theo nhóm nghề nghiệp kết quả là nhóm nghề lao động chân tay ( thợ nề, thợ uốn tóc, thợ sửa xe…) chiếm tỷ lệ cao nhất 28% [12] Viên Chinh Chiến bằng phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên trên 587 người từ 6 tháng tuổi đến 81 tuổi cho thấy tỷ lệ mang HBsAg trong cộng đồng tại Nha Trang là 10,6% Xét theo nhóm tuổi, tác giả thấy cao nhất ở nhóm từ 20 đến 40 tuổi Xét theo nghề nghiệp nhóm nghề tự do và lao động chân tay chiếm tỷ lệ cao trong số những người mang HBsAg (43,6%) Các yếu tố phơi nhiễm như phẫu thuật, lấy máu, tiêm chích cũng làm cho tỷ lệ HBsAg(+) cao [4]

Cả hai nghiên cứu tại Huế và Nha Trang còn cho thấy không thấy có trường hợp nào HBsAg(+) ở nhóm tuổi trên 60 và không thấy có sự khác biệt về tỷ lệ mang HBsAg trong cộng đồng ở các vùng sinh thái khác nhau

và giữa các dân tộc

Tại Thành phố Hồ Chí Minh, Phạm Hoàng Phiệt đã tổng kết trên 9.087 người đến xét nghiệm HBsAg trước khi tiêm chủng vắc xin và kết quả có HBsAg(+) là 14,8% [16]

Từ các nghiên cứu trên cho thấy tỷ lệ nhiễm HBV ở Việt Nam là từ 11,1% đến 16,8% Việt Nam là nước có tỷ lệ lưu hành HBV cao theo xếp loại của tổ chức y tế thế giới Bên cạnh các đường lây truyền phổ biến như: lây qua tiêm truyền, lây qua đường tình dục thì phương thức lây truyền dọc (từ mẹ sang con) và những lây truyền sớm do tiếp xúc khi trẻ còn nhỏ (trước tuổi đi học) là một nguyên nhân quan trọng dẫn đến tỷ lệ cao HBsAg(+) cao trong cộng đồng

Người ta thấy trẻ ở tuổi tiền học đường (4 - 6 tuổi) có tỷ lệ mang HBsAg là 18,4%, trẻ bị nhiễm chủ yếu là do tiếp xúc trong gia đình như với bố mẹ, anh chị em, ông bà [32]

Nghiên cứu của Nguyễn Anh Tuấn cho thấy trong số 1.564 phụ nữ

có thai được làm xét nghiệm có 10,6% người HBsAg(+) và dẫn đến 23,6% con của các bà mẹ này có HBsAg(+) [18]

Ngoài HBsAg Việt Nam còn là nơi có tỷ lệ người mang HBeAg thuộc loại cao trên thế giới, đặc biệt là ở phụ nữ trong lứa tuổi sinh đẻ Tỷ

lệ phụ nữ có thai có HBeAg(+) là 5,1% [10] Các nghiên cứu của Việt Nam cũng như thế giới đều đã cho thấy HBeAg có vai trò rất quan trọng trong lây truyền HBV, đặc biệt trong lây truyền từ mẹ sang con

Chu Thị Thu Hà nghiên cứu trên 1.300 sản phụ tới sinh con tại bệnh viện Phụ sản trung ương Hà nội, số sản phụ có HBsAg(+) chiếm 12,5%, số sản phụ có cả HBsAg(+) và HBeAg(+) là 40,5% Máu cuống rốn con của các mẹ có HBsAg(+) có kháng nguyên bề mặt của HBV tới 49,08% [10]

Theo Đinh Thị Bình tỷ lệ mang HBsAg ở 1.564 sản phụ ở Hà nội là 10,6% Trong 141 sản phụ có 25,5% mang cả hai kháng nguyên HBsAg(+)

và HBeAg(+) Nếu mẹ có cả HBsAg(+) và HBeAg(+), tỷ lệ HBsAg(+) trong máu cuống rốn con của họ là 66,7%, còn con các mẹ chỉ có HBsAg(+) nhưng HBeAg(-) tỷ lệ này là 23,6% [3]

Theo Đỗ Trung Phấn các mẹ mang cả hai kháng nguyên HBsAg và HBeAg sẽ truyền HBsAg cho 67,1% con của họ và nếu mẹ chỉ mang HBsAg thì chỉ truyền cho 14,6% con của họ [14]

Nghiên cứu của Đỗ Tuấn Đạt cũng cho thấy tỷ lệ mang HBsAg ở phụ nữ có thai là 10,5% Số sản phụ mang cả hai kháng nguyên HBsAg và HBeAg là 3,6%, và nguy cơ truyền HBsAg cho con ở các sản phụ này tăng 16,5 lần [7]

Như vậy nếu mẹ có cả hai dấu ấn bề mặt của HBV sẽ có nguy cơ truyền HBsAg cho con họ gấp 2,8 lần theo Đinh Thị Bình [3] và gấp 4,6 lần theo Đỗ Trung Phấn [14] Điều này cũng cho thấy vai trò quan trọng của HBeAg trong lây nhiễm HBV theo chiều dọc ở Việt Nam nói riêng cũng như ở những người gốc Á nói chung trên thế giới

Các nghiên cứu còn chỉ ra lây truyền HBV ở Việt Nam là lây truyền

cả theo chiều ngang và dọc Lây truyền ngang chủ yếu ở lứa tuổi thanh thiếu niên (14-16 tuổi) chiếm 20,5% [32], do tiêm truyền, phẫu thuật…

lây truyền dọc từ mẹ sang con cũng rất đáng kể Tỷ lệ trẻ có HBsAg giai đoạn chu sinh ở nông thôn Việt Nam là 12,5% Tỷ lệ nhiễm HBV hiện tại

và nhiễm HBV cũ ở tuổi chu sinh là 19,6% [32] Như vậy Việt Nam cũng như các nước có lưu hành HBV cao nói chung đều có tỷ lệ lây nhiễm dọc rất lớn Đường lây này có vai trò quan trọng đến diễn tiến của HBV bởi 85% đến 90% trẻ được sinh ra từ những bà mẹ có HBsAg(+) và HBeAg(+)

sẽ chuyển thành nhiễm HBV mạn tính [18]

Qua các nghiên cứu thấy rằng lây nhiễm dọc ở nước ta cao, do nhóm mang HBsAg trong cộng đồng cao nhất nằm trong độ tuổi sinh đẻ [4,12] Những người này hầu như không có triệu chứng, không được trang bị đầy

đủ kiến thức để có thái độ đúng trong phòng chống lây nhiễm HBV cho cộng đồng Điều này góp phần làm tăng tỷ lệ nhiễm HBV, tăng tỷ lệ người nhiễm HBV mạn và viêm gan

1.1.2 Lâm sàng và mức độ nguy hiểm của bệnh viêm gan B

Nhiễm HBV tiên phát trên lâm sàng có thể biểu hiện từ mức độ nhẹ đến nặng nhất là thể viêm gan tối cấp

Nhiễm HBV trường diễn thường có hình ảnh mô học bình thường hoặc gần như bình thường, lâm sàng có thể có biểu hiện hội chứng viêm gan mạn tồn tại hoặc viêm gan mạn hoạt động Hội chứng viêm gan mạn tồn tại ít khi tiến triển nặng, còn viêm gan mạn hoạt động có thể nặng và tiến triển tới xơ gan hoặc ung thư gan nguyên phát Do vậy trên lâm sàng

có thể gặp nhiều biểu hiện khác nhau của nhiễm HBV

1.1.2.1 Viêm gan B cấp:

Thời gian ủ bệnh khoảng 60-110 ngày [39]

Thời kỳ khởi phát (thời kỳ tiền hoàng đảm) dao động từ 2-16 ngày [8] Các triệu chứng hay gặp là sốt nhẹ, mệt mỏi, tiểu vàng, chán ăn [9]

Thời kỳ toàn phát (thời kỳ hoàng đảm) Trường hợp điển hình thường có tiền triệu: đau đầu, mệt mỏi, chán ăn, buồn nôn và nôn, sốt nhẹ (37,5-390C) khoảng 2-7 ngày trước khi có vàng da Sau đó có đầy bụng hoặc đau khu trú ở hạ sườn phải (hay gặp), nước tiểu sẫm màu và phân nhạt màu, một số có ngứa nhẹ, có đau khớp [66] Khi bắt đầu thấy ăn ngon, tiểu nhiều, vàng da vàng mắt giảm dần là bệnh lui Trẻ nhỏ thường hồi phục sau

2 tuần, người lớn sau 4-6 tuần Tuy nhiên dấu hiệu mệt mỏi, chán ăn có thể còn kéo dài sau nhiều tháng [11]

Nói chung viêm gan B cấp với các biểu hiện lâm sàng không đặc hiệu muốn xác định chắc chắn cần dựa vào các xét nghiệm huyết thanh và chẩn đoán vi rút học

- Xét nghiệm công thức máu: thấy bạch cầu tăng, chủ yếu do tăng lymphocyte

- Có hội chứng huỷ hoại tế bào gan: Transaminase tăng cao dần, tăng ALT (alanine aminotransferase) và AST (aspartate aminotransferase) [41]

- Hội chứng ứ mật: Bilirubin trực tiếp trong máu tăng sớm nhất ngay

cả khi bilirubin toàn phần còn bình thường Trong 10-14 ngày đầu bilirubin toàn phần tăng dần nhưng không quá 17µmol/l sau đó giảm dần Sau 3 tuần nếu nồng độ bilirubin toàn phần giảm còn dưới 51µmol/l là tiên lượng tốt, nếu không giảm là dấu hiệu bệnh diễn biến nặng và kéo dài [8] Phosphataza kiềm bình thường hoặc tăng nhẹ

- Hội chứng suy tế bào gan: Tỷ lệ prothrombin giảm, nếu giảm dưới 40% thường là diễn biến kéo dài và tiên lượng không tốt Albumin, globulin huyết thanh bình thường hoặc hơi tăng trong các thể nhẹ Thể nặng có albumin giảm và globulin tăng [11]

Các thể lâm sàng của viêm gan B cấp

- Thể không triệu chứng: 80-90% các trường hợp nhiễm HBV

- Thể vàng da thông thường: thời gian ủ bệnh dài (50-100 ngày), có các biểu hiện của thời kỳ khởi phát rồi toàn phát như đã mô tả ở trên Bệnh khỏi không để lại di chứng

- Các thể đặc biệt (được đặt tên theo những biểu hiện lâm sàng nổi trội nhất bên cạnh những biểu hiện chung):

o Thể không vàng da (lâm sàng không có vàng da)

o Thể ứ mật

o Thể kéo dài ( biểu hiện lâm sàng kéo dài sau 3-4 tháng)

o Thể tái phát

o Thể viêm gan tối cấp: là bệnh do sự kết hợp một bệnh não gan

và sự suy tế bào gan Viêm gan tối cấp là thể nặng nhất, nếu không ghép gan tử vong chiếm 90%

o Thể viêm gan ở phụ nữ có thai: Biểu hiện lâm sàng không có

gì đặc biệt nhưng có nguy cơ gây xẩy thai và truyền HBV cho con

o Thể viêm gan ở trẻ em: Các biểu hiện toàn trạng thường rõ ràng

o Thể viêm gan ở người có suy giảm miễn dịch (AIDS, bệnh máu ác tính, hoá trị liệu chống ung thư): Biểu hiện thường không điển hình nhưng nguy cơ chuyển thành viêm gan mạn rất cao [11]

1.1.2.2 Viêm gan B mạn:

Viêm gan mạn tồn tại: Thường không có triệu chứng, đôi khi có mệt mỏi, chán ăn, tức nhẹ hạ sườn phải Lâm sàng bình thường hoặc gan to nhẹ Transaminase tăng Bilirubin, phosphataza kiềm và γ globulin bình thường Tiên lượng tốt với những tổn thương tồn tại không tiến triển Tuy nhiên có thể tiến triển thành viêm gan mạn hoạt động đặt biệt khi có sự duy trì nhân lên của vi rút [11]

Viêm gan mạn hoạt động: Biểu hiện lâm sàng có mệt mỏi, đau hạ sườn phải, vàng da, ngứa, gan to vừa, có thể có lách to Đặc biệt có tăng áp lực tĩnh mạch cửa ngay cả khi không có xơ gan Xét nghiệm transaminase tăng, ALT tăng, phosphataza kiềm và γ globulin bình thường hoặc tăng nhẹ (trừ trường hợp có ứ mật sẽ tăng cao), bilirubin bình thường hoặc tăng nhẹ Prothrombin giảm Tiến triển theo hướng nặng lên, hoặc từng đợt dẫn tới

xơ gan sau nhiều năm [11]

Xơ gan: Biểu hiện lâm sàng không phân biệt căn nguyên Xơ gan là kết quả của kích thích gây viêm liên tục kéo dài hoặc do rối loạn trong cơ chế điều hoà gây nên thể kinh diễn (hình thành u hạt) Nguy cơ dẫn đến ung thư gan nguyên phát rất cao ở nhóm bệnh nhân này Bệnh nhân cần được kiểm tra bằng cộng hưởng từ, chụp động mạch có cản quang [11]

1.2 Đặc điểm sinh học của vi rút viêm gan B

1.2.1 Cấu trúc của vi rút viêm gan B

Vi rút viêm gan B là một vi rút có cấu trúc DNA sợi kép, có vỏ thuộc

họ Hepadnaviridae Vi rút lưu hành trong máu dưới 3 dạng hình thể:

Hình 1.1: Ba dạng hình thể của HBV trong máu

+ Bao ngoài (envelop)

+ Vỏ trong của hạt vi rút (capsid)

+ Bộ gen của HBV (genome)

Hình 1.2: Cấu trúc hạt vi rút viêm gan B hoàn chỉnh

+ Bao ngoài (envelop): được cấu tạo bởi 3 loại protein:

ƒ Protein bề mặt nhỏ: Trọng lượng phân tử (TLPT) 25 kilo Dalton Đây là protein chiếm số lượng nhiều nhất trong thành phần bao ngoài Đây chính là thành phần chính của HBsAg (kháng nguyên bề mặt) với 5 quyết định kháng nguyên khác nhau: a, d, y, w, r (trong

đó a đặc hiệu chung cho nhóm)

ƒ Protein bề mặt trung bình: TLPT 29 kilo Dalton, có cấu trúc gồm protein bề mặt nhỏ (HBsAg) và thêm một đoạn có 55 acid amin ( là sản phẩm của Pre-S2)

ƒ Protein bề mặt lớn: TLPT 33 kilo Dalton, có cấu trúc gồm toàn bộ chuỗi trung bình và thêm một đoạn có 108 acid amin ( là sản phẩm của Pre-S1) Đây là thành phần quan trọng của hạt vi rút hoàn chỉnh

và có tính sinh miễn dịch cao ( hình 1.2)

+ Vỏ trong của hạt vi rút (capsid): là một khối hình hộp có đường kính

27-28 nm, khoảng cách giữa lớp bao ngoài và lớp này là 7 nm Vỏ được cấu tạo bởi 2 loại polypeptid được gọi là polypeptid lõi và tiền lõi Polypeptid lõi có TLPT 22 kilo Dalton, chính là kháng nguyên lõi của vi rút được kí

hiệu là HBcAg Polypeptid tiền lõi có TLPT 25 kilo Dalton, có cấu trúc gồm polipeptid lõi và thêm một peptid đơn có 29 acid amin (hình 1.2) Kháng nguyên e (HBeAg) chính là một sản phẩm chuyển hoá của lớp vỏ trong (của polypeptid tiền lõi) [58]

+ Chứa trong vỏ của hạt vi rút là bộ gen của HBV (genome) Bộ gen của HBV là một DNA phụ thuộc DNA polymeraza, có 3200 đôi bazơ

(hình 1.2).[6*]

Ba dạng hình thể lưu hành trong huyết thanh của người nhiễm HBV

có thể đứng riêng lẻ hoặc dính lại với nhau, điều này tạo ra những bao ngoài rỗng của vi rút do sự sản xuất dư thừa các protein bề mặt trong quá trình nhân lên của vi rút Các hạt này có rất nhiều trong huyết thanh ( 106-

109 hạt / ml) và với tỷ lệ số hạt Dane / HBsAg là khoảng 1/10.000 [51]

1.2.2 Sự nhân lên của HBV

Sự nhân lên của HBV, cũng giống như nhiều vi rút khác, phải trải qua nhiều bước: (1) Vi rút gắn vào tế bào chủ; (2) Vi rút xâm nhập vào tế bào chủ; (3) Vi rút di chuyển vào nhân; (4) Vi rút phóng thích bộ gen; (5) Thực hiện sao mã và dịch mã; (6) Sao chép bộ gen vi rút; (7) Sự lắp ráp để tạo bộ gen của hạt vi rút; (8) Giải phóng hạt vi rút [4]

Sau khi vào cơ thể HBV sẽ gắn và xâm nhập vào tế bào gan 24 giờ sau đó DNA của HBV xuất hiện trong nhân của tế bào gan Khi đó DNA vòng mở được chuyển thành DNA vòng đóng (covalently closed circle DNA (cccDNA) CccDNA tiếp tục làm khuôn mẫu tổng hợp các mRNA của vi rút [59] Trước khi quá trình sao mã tạo các mRNA kết thúc, các tiền mRNA phải qua một quá trình biến đổi ở ngay trong nhân để tạo các mRNA hoạt động Trong quá trình nhân lên bình thường, DNA của vi rút không liên kết với cấu trúc gen của vật chủ Kết quả là tạo ra một loạt các mRNA với kích thước khác nhau Các mRNA hoạt động này có khả năng tham gia dịch mã để tạo các protein là các vật liệu để lắp ráp tạo các hạt vi rút hoàn chỉnh Sau khi dịch mã một lượng đủ HBc protein và ít nhất với một phân tử polymerase để tạo thành hạt lõi Lõi vi rút trưởng thành được bao bọc trong các protein HBsAg tại hệ thống lưới nội bào sau đó được giải phóng ra khỏi tế bào (hình 1.3)

Hình 1.3: Quá trình nhân lên của vi rút viêm gan B

Trong các mRNA được tạo ra chỉ có mRNA tiền genome 3,5 kb là khuôn mẫu cho quá trình dịch mã để tổng hợp phân tử DNA vòng mở Các DNA vừa được tổng hợp này có thể vào nhân và tạo các cccDNA mới trong nhân, như vậy vi rút liên tục được nhân lên HBsAg có tác dụng ức chế quá trình tạo cccDNA nên HBsAg là tác nhân điều hoà ngược âm tính quá trình nhân lên của vi rút

Như vậy khác đa số các vi rút, HBV cho phép DNA của vi rút mới được tổng hợp từ dịch bào tương có thể tiếp tục quay lại nhân để làm khuôn mẫu cho sự tổng hợp tiếp theo [6]

1.2.3 Các phương thức lây truyền của HBV

HBV được lây truyền khi bề mặt da và niêm mạc có các thương tổn tiếp xúc với máu có nhiễm vi rút, hay với các dịch tiết của cơ thể Thông thường máu là nơi có nồng độ vi rút cao nhất, nồng độ vi rút trong các dịch tiết của cơ thể thường thấp

Vi rút viêm gan B không lây truyền trong không khí, qua thức ăn, nước uống Mà theo 3 phương thức lây truyền chính :

• Từ mẹ sang con

• Do tiêm truyền

• Qua đường tình dục

1.2.3.1 Lây truyền từ mẹ sang con:

Lây truyền vi rút từ mẹ sang con là một đường lây quan trọng Có 3 thời điểm đó là: lây truyền trong tử cung; lây truyền khi chuyển dạ và đẻ;

và lây truyền do tiếp xúc trong thời gian ngắn sau đẻ Các phụ nữ mang thai, mang vi rút viêm gan B hầu hết ở giai đoạn không triệu chứng nên họ không biết tình trạng nhiễm vi rút của bản thân (trừ khi họ được xét nghiệm tìm HBsAg) vì vậy nguy cơ lây truyền cho con lớn Trẻ nhỏ là lứa tuổi mà

sự đáp ứng miễn dịch chưa hoàn chỉnh, nếu bị nhiễm vi rút ở lứa tuổi này

sẽ làm tăng khả năng nhiễm vi rút kéo dài và làm tăng tỷ lệ mang vi rút mạn tính trong cộng đồng Các bà mẹ có đồng thời cả HBsAg(+) và HBeAg(+) hoặc mẹ nhiễm HBV cấp tính ở giai đoạn cuối của thai kỳ có tải lượng vi rút cao trong máu, có khả năng truyền vi rút cho các con của họ tới 85%-90% [28] Trẻ sinh ra từ các bà mẹ này dễ trở thành người mang HBV mạn tính

1.2.3.2 Lây qua đường tiêm truyền:

Truyền máu và sử dụng các chế phẩm từ máu không qua sàng lọc HBsAg chính là nguồn lây nhiễm vi rút viêm gan B [50] Dùng chung bơm kim tiêm khi tiêm chích ma tuý đường tĩnh mạch cũng là một phương thức lây truyền vi rút thường gặp Các loại dụng cụ không tiệt trùng: Dụng cụ phẫu thuật, nha khoa, bơm kim tiêm, kim chích, kim châm cứu, dụng cụ xăm mình, xỏ lỗ tai, dao cạo râu… đều là những yếu tố gây lây truyền vi rút viêm gan B [40]

1.2.3.3 Lây qua đường tình dục:

Lây truyền qua đường tình dục là người bị nhiễm HBV từ bạn tình mang HBV cấp tính hay mạn tính [29] Nguyên nhân do trong nước bọt, tinh dịch, dịch tiết âm đạo,… của những người mang vi rút viêm gan B có

HBsAg Ở Bắc Âu và Tây Âu lây truyền qua đường tình dục chiếm 80-85% trong các lây nhiễm HBV ở trẻ vị thành niên và người lớn [36,65]

1.3 Vai trò của các đoạn gen trong bộ gen của HBV

HBV là vi rút có DNA nhỏ nhất được biết đến, cấu trúc genom chỉ

có 3200 đôi bazơ và tổ chức dưới dạng vòng đặc biệt Phân tử DNA này không xoắn hai vòng mà chỉ xoắn ở đoạn cuối và xếp thành hình vòng tròn gồm hai sợi: một sợi ngắn (gọi là sợi dương của vi rút) và một sợi dài (là sợi âm)

o Sợi dương của vi rút ngắn hơn, chiếm khoảng 50-80% chiều dài của sợi

âm Sợi dương có chiều dài thay đổi

o Sợi âm DNA là một vòng hoàn chỉnh có bốn khung đọc mở ( ORF: Open Reading Flame) chứa các gen mã hóa đan xen nhau là: ORF S - gen tiền S1, gen tiền S2 và S, ORF C - gen tiền lõi (pre-core) hoặc lõi (core), ORF X - gen X và ORF P – gen polymeraza (hình 1.4)

Hình 1.4: Bộ gen của vi rút viêm gan B

o Có bốn RNA thông tin có chức năng được biết đến trong quá trình sao

mã và dịch mã của HBV Đoạn dài nhất (3,5 kb) làm khuôn cho quá trình nhân lên của genome và tổng hợp ra các protein HBc/HBe và

polymeraza Đoạn 2,4 kb mã hoá protein tiền S1, tiền S2 và HBsAg (LHBs) Đoạn 2,1 kb mã hoá protein tiền S2 và HBsAg ( MHBs/SHBs) Đoạn ngắn nhất (0,8 kb) mã hoá protein X [57]

o HBcAg và HBeAg được phiên mã từ một gen chung (đoạn dài nhất 3,5 kb) Trong quá trình sao chép, HBcAg khi đến lưới nội bào liền bị cắt rời và HBeAg được tạo ra từ đoạn tiền lõi và lõi HBcAg có chức năng chủ yếu trong việc tạo nên thành phần liên kết của nucleocapsit tạo ra lớp vỏ trong của vi rút

o Polypeptid polymeraza phiên mã từ RNA tiền genome có vai trò quan trọng trong quá trình nhân lên của vi rút, đặc biệt là chuỗi âm của phân

tử DNA

o Protein X, được mã hoá từ RNA nhỏ nhất (0,7kb), được cho là có vai trò trong quá trình nhiễm trùng tự nhiên của vi rút, nhưng cho đến nay còn chưa rõ ràng

o Các gen S và tiền S mã hoá lớp vỏ vi rút Các protein tạo nên các hạt HBsAg Các gen tiền S2 và S (mã hoá cho protein bề mặt trung bình MHBs), gen tiền S1 tiền S2 và S ( mã hoá cho protein bề mặt lớn LHBs), protein tiền S1 đóng vai trò quan trọng trong quá trình kết hợp của HBV vào tế bào gan [54]

1.4 Các dấu ấn huyết thanh của HBV

1.4.1 Kháng nguyên bề mặt của HBV (HBsAg) và anti-HBs

Kháng nguyên bề mặt của HBV (HBsAg) được sản xuất trong bào tương của tế bào gan và xuất hiện chủ yếu trong huyết thanh cũng như trên màng tế bào gan với nồng độ đôi khi rất lớn [4,19], nhưng không có trong nhân tế bào gan [10,20] HBsAg là dấu ấn huyết thanh cho thấy tình trạng nhiễm HBV của cơ thể HBsAg có thể được xác định nhờ hai kỹ thuật: Kỹ thuật miễn dịch phóng xạ (RIAs) và kỹ thuật miễn dịch enzym (EIAs) HBsAg xuất hiện sớm nhất trong huyết thanh bệnh nhân, chỉ một đến mười tuần sau khi có phơi nhiễm với HBV, và còn có thể thấy ở giai đoạn cuối của thời kỳ ủ bệnh, trước khi men transaminaza trong máu tăng cao và trước khi vàng da từ một tuần đến một tháng [23b] Khi bắt đầu có dấu hiệu lâm sàng là lúc nồng độ HBsAg đạt đỉnh cao nhất, 4-8 tuần sau đó nồng độ

này bắt đầu giảm dần và biến mất sau 2-3 tháng, cũng có trường hợp còn tồn tại đến 6 tháng hoặc suốt đời Những người có HBsAg(+) trên 6 tháng được coi là người mang vi rút mạn tính [13]

Người ta còn tìm thấy HBsAg trong các dịch tiết khác nhau của cơ thể người như nước tiểu, nước mắt, sữa, nước bọt của những người có HBsAg(+) [26] Phân của những người có HBsAg(+) trong máu không có HBsAg vì vậy không có khả năng lây truyền HBV [43]

Anti-HBs là kháng thể đặc hiệu kháng HBsAg, xuất hiện sau 1-3 tháng kể từ khi HBV xâm nhập vào cơ thể hay do tiêm vắc xin Khi có anti-HBs thường đã hết HBsAg trong huyết tương Anti-HBs giảm dần theo thời gian, có vai trò bảo vệ cơ thể, chống tái nhiễm HBV [27]

1.4.2 Kháng nguyên lõi của HBV (HBcAg) và anti-HBc

HBcAg hiếm khi xuất hiện trong huyết tương mà chủ yếu xuất hiện trong nhân của tế bào gan, vì vậy chỉ phát hiện được khi sinh thiết tế bào gan Sự có mặt của HBcAg với hàm lượng cao chứng tỏ đang có hoạt động sao chép của HBV (trong viêm gan cấp) HBcAg kích thích cơ thể tạo ra

KT kháng lõi của HBV (anti-HBc)

Anti-HBc không được tạo ra do tiêm chủng vắc xin

Anti-HBc được sản sinh trong thời gian đầu của nhiễm trùng cấp tính

và tiếp tục tồn tại trong nhiều năm và có thể suốt đời Giai đoạn đầu HBc gồm cả hai loại IgG và IgM IgM anti-HBc thường phát hiện được ở giai đoạn đầu của biểu hiện lâm sàng ( trước cả anti-HBs), sau đó giảm xuống dưới mức có thể xác định được trong vòng 6 tháng IgG anti-HBc tồn tại dai dẳng như một dấu ấn của nhiễm trùng trước đây[2,24]

anti-Khi HBsAg đã hết, nếu anti-HBc có hàm lượng cao chứng tỏ HBV đang phát triển, đang hoạt động và đang là một viêm gan B cấp Người ta thấy rằng anti-HBc không có tác dụng bảo vệ cơ thể chống tái nhiễm HBV, không có vai trò điều hoà miễn dịch cũng như trong bệnh sinh của VGB

Nó chỉ có tác dụng chỉ điểm chứng tỏ sự có mặt của HBcAg[46,60]

Vai trò bảo vệ của anti-HBc chống lại sự xâm nhập của vi rút đến nay vẫn chưa rõ ràng [19] Tuy nhiên anti-HBc là một dấu ấn khá quan

trọng trong chuẩn đoán hồi cứu và điều tra dịch tễ học về tình trạng nhiễm HBV

Xét nghiệm xác định IgM anti-HBc được dùng trong chuẩn đoán bệnh cấp tính Sự hiện diện của IgM anti-HBc trong huyết thanh pha loãng 1/5000 có thể giúp chuẩn đoán VGB cấp Nếu IgM anti-HBc âm tính trong huyết thanh pha loãng 1/5000 có thể loại trừ VGB cấp khá chắc chắn [48]

Cửa sổ của giai đoạn cấp (là khoảng thời gian mất HBsAg và xuất hiện anti-HBs), IgM anti-HBc có giá trị chuẩn đoán khi bệnh nhân đã thải trừ HBsAg trước khi xét nghiệm Có khoảng 10% trường hợp VGB cấp không phát hiện được nếu chỉ dùng duy nhất dấu ấn HBsAg IgM anti-HBc cũng tồn tại ở mức độ thấp trong viêm gan mạn và người ta theo dõi IgM anti-HBc để đánh giá hiệu quả của đáp ứng với interferon [47]

1.4.3 Kháng nguyên e của HBV (HBeAg) và anti-HBe

Năm 1972 Maginus và Espmark đã phát hiện ra một kháng nguyên không thuộc hệ HBsAg, KN này có mối liên quan với tình trạng nhiễm HBV mạn tính, đó là kháng nguyên e

HBeAg là một kháng nguyên hoà tan, có mặt trong huyết tương HBeAg xuất hiện sớm ngay từ thời kỳ ủ bệnh gần như cùng lúc với HBsAg, trước khi có dấu hiệu lâm sàng cũng như tổn thương gan HBeAg được xem như là dấu ấn biểu thị sự nhân lên của HBV liên quan đến tình trạng nhiễm và mức độ nặng của bệnh HBeAg còn đóng vai trò quan trọng trong khả năng lây bệnh của các mẫu máu có HBsAg(+) Người ta thấy HBeAg (+) ở 50% các trường hợp viêm gan mạn tính có HBsAg Ngược lại

ở những người lành mang HBsAg thì HBeAg ít dương tính hơn[46]

Trong nhiễm vi rút cấp tính, HBeAg tồn tại trong huyết thanh từ vài ngày đến vài tuần rồi biến mất và có sự xuất hiện của kháng thể kháng HBeAg HBeAg tồn tại lâu hơn trong các thể mạn tính, đặc biệt là viêm gan mạn hoạt động [19]

Anti-HBe là kháng thể xuất hiện sớm, kháng thể này thường được tìm thấy ở cuối giai đoạn cấp tính Khi anti-HBe xuất hiện thì đó là dấu hiệu của sự lui bệnh và hàm lượng HBsAg sẽ giảm dần xuống [19] Những

người có HBsAg(+) mà có anti-HBe(+) thì ít có khả năng truyền bệnh hơn những người có đồng thời HBsAg(+) và HBeAg(+) (hình 1.5)[24,25]

Hình 1.5: Biểu đồ động học của một số dấu ấn huyết thanh và kháng thể

1.5 Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu

1.5.1 Kỹ thuật PCR

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction), do Karry Mullis và CS phát minh năm 1983, là một phương pháp tổng hợp DNA in vitro, không cần sự hiện diện của tế bào Ngày nay, PCR đã trở thành một trong những

kỹ thuật đầu tiên và được sử dụng nhiều nhất trong lĩnh vực sinh học phân

tử

PCR là một kỹ thuật sinh học phân tử dựa trên đặc điểm hóa học của axít nucleic có thành phần bazơ bổ sung được với nhau: A và T luôn bổ xung với nhau nhờ 2 liên kết hydro, G và C luôn bổ xung với nhau nhờ 3 liên kết hydro Với đặc điểm hóa học này, phân tử DNA tồn tại trong tế bào dưới hình thái DNA kép gồm có 2 chuỗi DNA đơn bổ xung nhau

Liên kết hydo là một liên kết yếu Ta có thể phá liên kết hydro bằng nhiệt độ cao hoặc bằng hóa chất Càng có nhiều liên kết hydro việc biến tính DNA càng đòi hỏi phải được sử lý ở nhiệt độ cao Các DNA có tỷ lệ G/C cao được biến tính ở nhiệt độ cao hơn các DNA có tỷ lệ A/T cao

Khi các điều kiện trong dung dịch quay trở về bình thường, 2 chuỗi DNA đơn lại dần lai ghép lại với nhau, và DNA kép lại được khôi phục lại như trước

DNA polymeraza: Quá trình sao chép DNA là một quá trình tự

nhiên xẩy ra khi tế bào nhân lên Nó bắt đầu bằng sự tách ra của 2 chuỗi DNA với sự phá vỡ các liên kết hydro Đương nhiên, trong trường hợp tự nhiên này, biến tính DNA không phải bằng nhiệt độ cao mà là do enzyme đặc biệt xúc tác Ở những nơi hai chuỗi DNA tách rời nhau, có oligonucleotit vào lai ghép với DNA đơn và DNA polymeraza có vai trò kéo dài các oligonuleotiti này bằng cách nối các nucleotit ở dạng hoạt hóa với nhau theo một trình tự bổ sung với chuỗi DNA vừa tách rời Như vậy mỗi chuỗi DNA ban đầu được dùng làm khuôn mẫu cho sự tổng hợp một chuỗi DNA mới để tạo ra một phân tử DNA kép lai gồm có một chuỗi cũ

và một chuỗi mới

Kỹ thuật PCR thực hiện dựa trên nguyên lý sao chép DNA trong tế bào đó là: DNA được nhân lên theo cơ chế bán bảo tồn Từ một phân tử DNA chuỗi kép ban đầu được tách thành hai chuỗi đơn, mỗi chuỗi này làm khuôn mẫu cho việc tổng hợp DNA Các đoạn mồi được chọn nằm ở hai đầu đoạn DNA cần nhân lên sao cho các sợi DNA tổng hợp mới được bắt đầu tại mỗi đoạn mồi và kéo dài về phía đoạn mồi nằm trên sợi kia và cho sản phẩm có độ dài nằm giữa hai đoạn mồi này Độ dài của sản phẩm PCR

có thể từ vài trăm đến hàng nghìn, thậm chí hàng chục nghìn cặp nucleotid Như vậy, cứ sau một chu kỳ các bản sao của DNA đích sẽ gấp đôi Kết quả

cuối cùng của phản ứng PCR sau n chu kỳ, tính theo lý thuyết, sẽ có 2 n bản sao các phân tử DNA mạch kép nằm giữa 2 đoạn mồi

Để thực hiện được quá trình nhân lên này, mỗi chu kỳ của phản ứng PCR bao gồm 3 giai đoạn:

- Tách DNA thành sợi đơn: Được thực hiện ở nhiệt độ 90-980C trong vài giây đến vài phút, khi đó các phân tử DNA xoắn kép sẽ bị tách ra tạo nên các sợi đơn, làm khuôn cho các đoạn mồi bám vào và enzym DNA-polymerase xúc tác tổng hợp

- Gắn mồi: Nhiệt độ được hạ xuống 37-680C để các đoạn mồi bám vào các vị trí đặc hiệu với các trình tự bổ sung tương ứng trên sợi DNA làm

khuôn

- Tổng hợp: Nhiệt độ được nâng lên 68-720C trong vài chục giây đến vài phút, để các sợi DNA được tổng hợp kéo dài trên cơ sở từ vị trí mồi bám vào

Sau chu kỳ cuối cùng, có một chu kỳ bổ sung được duy trì ở nhiệt độ

720C trong 5-10 phút để cho tất cả các sợi đơn DNA mới xoắn lại, tạo nên sản phẩm PCR là hỗn hợp các chuỗi xoắn kép DNA Kết thúc phản ứng, nhiệt độ hạ xuống 40C để bảo quản sản phẩm (hình 1.6)

đầu để làm nguyên liệu

và hoạt hoá enzym Enzym hoạt hoá sẽ biến cơ chất không mầu thành có mầu Phản ứng lên mầu này được xác định bằng mắt thường và được đọc chính xác bằng quang kế (hình 1.8)

Kỹ thuật ELISA phát hiện HBsAg trong huyết thanh, phát hiện Anti-HBs trong huyết thanh, phát hiện HBeAg trong huyết thanh, phát hiện anti-HBe trong huyết thanh, và phát hiện Anti-HBc trong huyết thanh Nguyên lý kỹ thuật ELISA được tóm tắt như sau:

Hình 1.8 : Nguyên lý kỹ thuật ELISA

KT gắn enzym

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Phụ nữ trong độ tuổi sinh đẻ có HBsAg(+), không có các biểu hiện bệnh gan kèm theo

Do chưa có nghiên cứu nào tương đương trước đây nên chọn cỡ mẫu cho nghiên cứu là n = 50

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp: Nghiên cứu mô tả cắt ngang

2.3 Các bước tiến hành nghiên cứu

Bước 1: Chọn các mẫu máu đã có kết quả HBsAg (+)

Bước 2: Xét nghiệm xác định các dấu ấn: anti-HBs, HBeAg, anti- HBe, anti-HBc của HBV

Bước 3: Tách DNA từ huyết thanh của các mẫu máu được chọn

Bước 4: Thực hiện kỹ thuật PCR để phát hiện gen Core/Pre-Core

2.4 Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu

2.4.1 ELISA xác định các dấu ấn HBsAg, anti-HBs, HBeAg, anti-HBe,

- Cơ chất TMB: dung dịch cơ chất TMB (R9) pha với dung dịch đệm

cơ chất R8 theo tỷ lệ 1:1 rồi lắc đều Dung dịch này chỉ nên pha trước khi dùng 5-10 phút, cần tránh ánh sáng trực tiếp khi pha và bảo quản nơi tối

- Dùng dung dịch rửa, rửa sạch các giếng nhiều lần

- Hút sạch bằng máy hút chân không

- Thêm 100 µl TMB cho mỗi giếng, ủ ở 180C - 200C trong tối 30 phút

- Cơ chất TMB: dung dịch cơ chất TMB (R9) pha với dung dịch đệm

cơ chất R8 theo tỷ lệ 1:50 rồi lắc đều Dung dịch này chỉ nên pha trước khi dùng 5 - 10 phút, cần tránh ánh sáng trực tiếp khi pha và bảo quản nơi tối

• Các bước tiến hành:

- Cho 100 µl cho mỗi mẫu chứng dương, chứng âm, mẫu huyết thanh cần thử vào các giếng Đậy kín các giếng ủ 370C trong 60 phút

- Rửa 4 lần bằng dung dịch rửa rồi hút khô

- Nhỏ 100 µl dung dịch cộng hợp cho mỗi giếng, đậy kín các giếng rồi

ủ ở nhiệt độ 370C trong 60 phút

- Dùng dung dịch rửa, rửa sạch các giếng nhiều lần

- Hút sạch bằng máy hút chân không

- Thêm 200 µl cơ chất TMB cho mỗi giếng, ủ ở 180C - 200C trong tối

• Các bước tiến hành:

- Cho 100 µl cho mỗi mẫu chứng dương, chứng âm, mẫu huyết thanh cần thử vào các giếng Đậy kín các giếng ủ ở nhiệt độ phòng qua đêm

- Rửa 4 lần bằng dung dịch rửa rồi hút khô

- Nhỏ 100 µl dung dịch cộng hợp cho mỗi giếng, đậy kín các giếng rồi

ủ ở nhiệt độ 400C trong 30 phút

- Dùng dung dịch rửa, rửa sạch các giếng nhiều lần

- Hút sạch bằng máy hút chân không

- Thêm 100 µl cơ chất OPD cho mỗi giếng, ủ ở 180C - 200C trong tối

- Lấy số giếng cần dùng, ghi sơ đồ nhỏ mẫu

- Nhỏ 1 giọt các chứng, nhỏ 50 µl huyết thanh cần thử vào mỗi

giếng

- Nhỏ vào mỗi giếng 1 giọt dung dịch enzyme cộng hợp, rồi 1 giọt dung dịch trung hoà phản ứng vào mỗi giếng

- Lắc nhẹ, đậy kín các giếng Ủ 370C trong 60 phút

- Hút rửa các giếng 10 lần bằng dung dịch rửa

- Đập trên giấy thấm để làm sạch nước còn đọng

- Nhỏ 1 giọt chất nền A và 1 giọt chất nền B vào mỗi giếng, ủ ở nhiệt

- Cơ chất TMB: dung dịch cơ chất TMB (R9) pha với dung dịch đệm

cơ chất R8 theo tỷ lệ 1:11 rồi lắc đều Dung dịch này chỉ nên pha trước khi dùng 5-10 phút, cần tránh ánh sáng trực tiếp khi pha và bảo quản nơi tối

• Các bước tiến hành:

- Cho 200 µl dung dịch pha loãng mẫu vào mỗi giếng

- Cho 20 µl cho mỗi mẫu chứng dương, chứng âm, mẫu huyết thanh cần thử vào các giếng Đậy kín các giếng ủ ở 370C trong 30 phút

- Rửa 4 lần bằng dung dịch rửa rồi hút khô

- Nhỏ 200 µl dung dịch cộng hợp cho mỗi giếng, đậy kín các giếng rồi

ủ ở 370C trong 60 phút

- Dùng dung dịch rửa, rửa sạch các giếng nhiều lần

- Hút sạch bằng máy hút chân không

- Thêm 100 µl dung dịch cơ chất TMB cho mỗi giếng, ủ ở 180C - 200C trong tối 30 phút

- Nhỏ 100 µl dung dịch dừng phản ứng ( H2SO4 1M)

- Đọc kết quả sau 5 phút bằng mắt thường hoặc máy đo quang phổ ở bước sóng 450-620nm

2.4.2 Kỹ thuật PCR xác định gen Core/Pre-Core

Khuếch đại DNA-HBV trong ống nghiệm bằng PCR

DNA-HBV được phát hiện bằng PCR với hai cặp mồi Một cặp mồi khuếch đại vùng gen Core, và một cặp khuếch đại vùng gen PreCore

Qui trình bao gồm hai giai đoạn chính: giai đoạn 1 tách chiết DNA-HBV từ huyết thanh người, và giai đoạn 2 thực hiện kỹ thuật PCR

Các mẫu huyết thanh được tách DNA bằng bộ sinh phẩm QIAamp DNA của hãng QIAGEN-Đức Toàn bộ kỹ thuật được tiến hành trong buồng vô trùng và có mẫu kiểm chứng

Qui trình kỹ thuật tách DNA từ huyết thanh:

- Cho 20 µl dung dịch proteinaza K vào ống 1,5ml vô trùng

- Thêm 150 µl dung dịch PBS và 50 µl huyết thanh cần tách DNA vào ống, trộn đều

- Thêm 200 µl dung dịch đệm ly giải (AL), trộn kỹ (15 giây), ly tâm nhanh ( 5 giây), ủ ở nhiệt độ phòng 10 phút

- Ly tâm nhanh rồi cho thêm 200 µl ethanol và trộn đều

- Chuyển toàn bộ hỗn dịch trên vào cột ly tâm QIAamp rồi ly tâm tốc độ

Đánh giá độ tinh khiết của DNA sau tách bằng đo mật độ quang (OD) bước

sóng 260/280 nm trên máy quang phổ tử ngoại

Khuếch đại DNA HBV bằng PCR

Tiến hành kỹ thuật PCR với cặp mồi xác định vùng gen Core

- Dung dịch phản ứng gồm có:

• Master Mix: 12,5 µl/1mẫu thử

• DNA đích: 1 µl/1mẫu thử

• Mồi xuôi (mồi CG1F): 1 µl/1mẫu thử

• Mồi ngược (mồi CG1R): 1 µl/1mẫu thử

• Nước cất vừa đủ 25 µl/1mẫu thử

- Cặp mồi trong phản ứng:

Core-gene:

F: 5’-TGT GGA GTT ACT CTC TTT TTT GCC- 3’ Vị trí từ 1938-1961 R: 5’-CGG AGG TGT TGA TAA GAT AGG GG- 3’ Vị trí từ 2313-2334 Sản phẩm khuếch đại có độ dài 396 cặp bazơ

Tiến hành kỹ thuật PCR với cặp mồi xác định vùng gen PreCore

- Dung dịch phản ứng gồm có:

• Master Mix: 12,5 µl/1mẫu thử

• DNA đích: 1 µl/1mẫu thử