TỔNG QUAN VỀ ĐÔNG LẠNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỦY TINH HÓA (Vitrification) pot

Trong thời điểm hiện tại, ở nhiều trung tâm thụ tinh trong ống nghiệm, phương pháp hạ nhiệt độ chậm với chất bảo vệ đông lạnh cryoprotectant là Propanediol PrOH đang được ứng dụng khá ph

TỔNG QUAN VỀ ĐÔNG LẠNH BẰNG

PHƯƠNG PHÁP THỦY TINH HÓA

(Vitrification)

GIỚI THIỆU

Trứng và phôi có thể sống, tiếp tục phát triển sau khi được đông lạnh - rã đông hay không; chúng ta có thể khống chế được những rủi ro xảy ra cho trứng và phôi trong suốt quá trình thực hiện hay không là điều không dễ dàng Ngoài việc thành thạo về thao tác của người thực hiện, chọn lựa được chất lượng trứng và phôi tốt

để lưu trữ, việc chọn lựa một chương trình hạ nhiệt độ thích hợp có ảnh hưởng rất lớn đến thành công của một quy trình đông lạnh trứng và phôi Hiện nay, kỹ thuật đông lạnh có thể được chia thành 2 nhóm chính: hạ nhiệt độ chậm (slow freezing)

và thủy tinh hóa (vitrification) Sự lựa chọn phác đồ đông lạnh ở từng trung tâm phụ thuộc vào một số yêu cầu như (1) tính hiệu quả, (2) tính an toàn, (3) tính tiện lợi và (4) khả năng ứng dụng trong thực tế để phù hợp với điều kiện hiện có của từng trung tâm

Trong thời điểm hiện tại, ở nhiều trung tâm thụ tinh trong ống nghiệm, phương pháp hạ nhiệt độ chậm với chất bảo vệ đông lạnh (cryoprotectant) là Propanediol (PrOH) đang được ứng dụng khá phổ biến Với phác đồ đông lạnh và rã đông hiện đang được sử dụng như trên, nhiều báo cáo trên thế giới cho thấy tỷ lệ phôi sống sau rã đông vào khoảng 70 – 80% và tỷ lệ thai lâm sàng trên một chu kỳ chuyển phôi trữ lạnh thay đổi tùy trung tâm, chỉ trong khoảng 16 – 30% Phương pháp hạ nhiệt độ chậm có thể dẫn đến hình thành tinh thể nước đá bên trong tế bào khi nhiệt độ hạ từ -50oC đến -150oC Đây là nguyên nhân chính gây vỡ màng trong suốt hoặc vỡ tế bào và dẫn đến thất bại

Trong vài năm gần đây, phương pháp thủy tinh hóa với các cải tiến mới được nhiều trung tâm áp dụng thành công trong trữ lạnh trứng và phôi người Phương pháp thủy tinh hóa rất được các nhà phôi học lâm sàng quan tâm và áp dụng ngày càng phổ biến (chủ yếu trên trứng và phôi phát triển ngày 3 hoặc ở giai đoạn phôi nang) nhờ tính chất đơn giản, nhanh chóng và hiệu quả cao Thành công của việc ứng dụng này góp phần không nhỏ trong việc tiết kiệm được thời gian và nhân sự trong một đơn vị thụ tinh trong ống nghiệm ở người, đồng thời giảm chi phí điều trị và nâng cao tỉ lệ thành công cho người bệnh

KỸ THUẬT THỦY TINH HÓA (Vitrification)

Trữ lạnh phôi và trứng người được thực hiện thành công đầu tiên bởi Trouson vào năm 1986 Sau sự ra đời của em bé đầu tiên từ phôi trữ lạnh (năm 1983), trữ lạnh

phôi trở thành một hướng mở không thể thiếu trong lĩnh vực hỗ trợ sinh sản ở người

Phương pháp đông lạnh bằng kỹ thuật thủy tinh hóa được Rall và Fahy thực hiện thành công đầu tiên trên phôi bò vào năm 1985 Kỹ thuật này được thực hiện rộng rãi trên gia súc vào nhiều năm sau đó Tuy nhiên, quy trình này chỉ được Kuleshova và Lopata ứng dụng đầu tiên trên trứng người vào năm 1999 và sau đó vài tháng, được thực hiện đầu tiên trên phôi người đang phát triển ở giai đoạn phôi nang bởi Lane Vào ngày 20/6/1999, em bé đầu tiên trên thế giới từ phôi trữ lạnh bằng kỹ thuật thủy tinh hóa ra đời

Hiện nay, đông lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa đang là một kỹ thuật được các trung tâm thụ tinh trong ống nghiệm lớn trong khu vực và thế giới đưa vào ứng dụng trong thực tiễn điều trị và đang dần thay thế phương pháp hạ nhiệt độ chậm trước đây Bên cạnh đó, các nhà khoa học cũng không ngừng thực hiện những kiểm chứng lâm sàng nhằm chứng minh kỹ thuật này thật sự an toàn đối với con người

Khái niệm về phương pháp thủy tinh hóa

Thủy tinh hóa là quá trình làm lạnh mẫu trứng hoặc phôi với thời gian rất nhanh Trong suốt quá trình hạ nhiệt độ, toàn bộ khối vật chất bên trong và bên ngoài tế bào chuyển thành dạng khối đặc, trong suốt giống như thủy tinh (glass-like), đặc

biệt không có sự hình thành tinh thể đá bên trong mẫu tế bào, cũng như môi trường bên ngoài trong quá trình làm lạnh

Sau khi được cân bằng với môi trường có nồng độ chất bảo quản đông lạnh rất cao (4 – 8M), mẫu trứng hoặc phôi được cho vào các dụng cụ chứa và nhúng trực tiếp vào nitơ lỏng, không qua quá trình hạ nhiệt độ theo từng bước như trong đông lạnh chậm Tốc độ làm lạnh của phương pháp này rất lớn, khoảng 2000 – 2500oC / phút

Ưu điểm của kỹ thuật thủy tinh hóa

Trong hạ nhiệt độ chậm, quá trình mất nước cần được diễn ra từ từ để hạn chế sự thành lập tinh thể nước đá Do đó, thời gian cần thiết để hoàn tất một quy trình đông lạnh bằng phương pháp hạ nhiệt độ chậm có thể kéo dài gấp 10 lần so với hạ nhiệt độ cực nhanh Để có thể đảm bảo được tốc độ hạ nhiệt trong phương pháp đông lạnh chậm, người ta cần trang bị hệ thống hạ nhiệt độ bằng hơi nitơ lỏng Chi phí đầu tư cho một hệ thống này rất cao, chưa kể đến chi phí bảo trì và sửa chữa hằng năm Trong khi đó, với phương pháp thủy tinh hóa, cơ sở thực hiện không cần phải trang bị bất kỳ thiết bị nào

Nồng độ chất bảo vệ đông lạnh được sử dụng trong phương pháp thủy tinh hóa cao gấp 4 – 5 lần so với nồng độ chất bảo vệ đông lạnh được sử dụng trong phương pháp đông lạnh chậm trước đây Ưu thế này giúp cho quá trình khử nước bên trong tế bào xảy ra nhanh và hoàn toàn hơn Kết quả là không có sự hình

thành thể đá bên trong tế bào, nhờ đó tế bào có thể tránh được những tổn thương màng và các bào quan do tinh thể đá gây ra Qua kết quả đánh giá thực nghiệm, phương pháp thủy tinh hóa cho tỉ lệ sống sau rã đông của phôi và trứng cao hơn rất nhiều so với phương pháp đông lạnh chậm trước đây

Hiệu quả cao của đông lạnh bằng phương pháp hạ nhiệt độ cực nhanh so với hạ nhiệt độ chậm cũng được nhiều tác giả báo cáo Các nghiên cứu thực nghiệm trên phôi chuột cũng như phôi người ở các giai đoạn phát triển đều cho thấy tỷ lệ phôi bào còn sống sau rã đông, tỷ lệ phôi tiếp tục phát triển sau rã đông cũng như số tế bào trong khối tế bào bên trong (ICM – inner cell mass) của phôi nang ở nhóm phôi đông lạnh bằng hạ nhiệt độ cực nhanh cao hơn so với nhóm phôi sử dụng phương pháp hạ nhiệt độ chậm Tuy chưa có một nghiên cứu nào đủ lớn được thực hiện nhằm đánh giá hiệu quả của phương pháp này ở tất cả các giai đoạn phát triển của phôi, nhưng kết quả bước đầu rất khả quan, đặc biệt ở những trường hợp trữ lạnh trứng Nghiên cứu cho thấy tỷ lệ phôi phân chia và tỷ lệ phôi phát triển đến giai đoạn phôi nang từ những chu kỳ sử dụng trứng trữ lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa cao hơn so với nhóm trữ lạnh bằng phương pháp hạ nhiệt độ chậm…

Do đó, tại hầu hết các báo cáo về đông lạnh trứng người, phương pháp thủy tinh hóa là kỹ thuật được ưu tiên lựa chọn đầu tiên

Tính an toàn của phương pháp này cũng được chứng minh qua một số nghiên cứu trong một nghiên cứu vào năm 2005 tại Nhật trên 147 trẻ sinh ra từ phôi trữ lạnh bằng phương pháp hạ nhiệt độ cực nhanh, các tác giả đã không tìm thấy sự khác

biệt nào về các yếu tố sản khoa cũng như tỷ lệ dị tật so với nhĩm trẻ sinh ra từ chuyển phơi tươi

Qua bảng so sánh (bảng 1), chúng ta cĩ thể nhận thấy rằng phương pháp thủy tinh hĩa tỏ ra cĩ nhiều ưu thế hơn so với phương pháp đơng lạnh chậm: ngồi ưu điểm tiết kiệm về thời gian, giảm bớt chi phí cho một trường hợp đơng lạnh trứng hoặc phơi, khả năng sống sau rã đơng của trứng / phơi khi được đơng lạnh bằng kỹ thuật thủy tinh hĩa cao hơn rất nhiều so với kỹ thuật đơng lạnh chậm

Bảng 1: So sánh giữa hai phác đồ đơng lạnh

Hạ nhiệt

độ chậm

Thủy tinh hĩa

Thời gian hoàn tất

khoảng

2 giờ

15-20 phút

Hệ thống hạ nhiệt độ bằng hơi nitơ lỏng cần

không cần

Lượng nitơ lỏng sử dụng cho 1 lần thực hiện # 10 lít

# 0,5

lít

Môi trường

Cần nhiều loại môi trường cho các giai đoạn phát triển khác nhau của phôi

Một loại môi trường cho tất

cả các giai đoạn phát triển của phôi

Tỷ lệ phôi sống sau rã đông

# 70%-80%

# 95-100%

Chất bảo vệ đơng lạnh (cryoprotectant)

Nhìn chung, các chất bảo vệ đơng lạnh được sử dụng trong kỹ thuật thủy tinh hĩa gần giống như trong kỹ thuật đơng lạnh chậm trước đây, nhưng nồng độ sử dụng cao hơn Trong một dung dịch dùng để thủy tinh hĩa luơn bao gồm 1 hoặc 2 chất bảo vệ đơng lạnh cĩ khả năng thấm qua màng tế bào (permeable cryoprotectant)

để khử nước bên trong tế bào và 1 chất bảo vệ đơng lạnh khơng cĩ khả năng thấm qua màng tế bào (non-permeable cryoprotectant) làm đối trọng, giúp quá trình khử nước bên trong tế bào xảy ra nhanh hơn

- Chất bảo vệ đơng lạnh cĩ khả năng thẩm thấu qua màng tế bào: ethylene glycol (được sử dụng phổ biến nhất), propylene glycol, acetamid, glycerol, raffinose, dimethylsulphoxide (DMSO) và 1,2-propanediol (PrOH)

- Chất bảo vệ đơng lạnh khơng cĩ khả năng thấm qua màng tế bào: sucrose, trehalose, glucose và galactose

Trong thành phần mơi trường thủy tinh hĩa hiện nay, người ta thường sử dụng ethylene glycol và 1 chất bảo vệ đơng lạnh khác cũng cĩ khả năng thấm qua màng

tế bào (thường là DMSO hoặc PrOH) kết hợp với sucrose Sự kết hợp này vừa bảo

đảm được khả năng thẩm thấu qua màng tế bào cao hơn so với khi chỉ sử dụng từng chất riêng lẻ, vừa giảm được độc tính của từng thành phần riêng lẻ tác động lên tế bào khi sử dụng chúng ở nồng độ cao

Dụng cụ

- OPS (open-pulled straw): đây là một loại straw có đường kính trong nhỏ hơn rất nhiều so với đường kính nguyên thủy của các loại straw 0,25ml thường dùng trong đông lạnh chậm Người ta tạo ra OPS bằng cách làm nóng chảy straw 0,25ml và kéo dãn bằng tay, sau đó cắt bằng 1 lưỡi dao rất mỏng, sao cho đường kính và bề dày của thành straw bằng khoảng ½ so với ban đầu, bảo đảm lượng môi trường

có chứa trứng/phôi khi được hút vào trong OPS chỉ khoảng 1µl, đầu OPS chứa môi trường và trứng/phôi được bảo vệ bằng 1 straw 0,5ml; đầu còn lại được gắn một nút nhựa nhằm tránh trường hợp OPS bị nổi lên bề mặt khi thả vào nitơ lỏng OPS là loại dụng cụ được sử dụng phổ biến nhất trong kỹ thuật đông lạnh cực nhanh hiện nay

- Cryoloop: dụng cụ này bao gồm một vòng tròn rỗng bằng nhựa mềm, gắn với một cán nhựa hoặc kim loại Dung dịch thủy tinh hóa tạo thành mộp lớp màng mỏng trong phần rỗng của vòng tròn và phôi/trứng được đặt ngay trên lớp màng mỏng này, sau đó toàn bộ dụng cụ có chứa trứng và phôi được làm lạnh trong hơi nitơ lỏng

- Nilon mesh: một dạng kết hợp giữa lưới đồng và cryoloop, được làm bằng nhựa dẻo Và chỉ được sử dụng chủ yếu trong đông lạnh trứng/phôi của động vật nuôi bằng kỹ thuật thủy tinh hóa

- Cryotop: đây là loại dụng cụ chỉ mới được phát minh trong một vài năm gần đây (2000) nhưng được xem là dễ sử dụng và có hiệu quả sau rã đông cao nhất Dụng

cụ bao gồm một bản phim trong mỏng được bảo vệ bởi một nắp nhựa, gắn với 1 cán cầm bằng nhựa Trứng/phôi được đặt trên bề mặt bản phim với một lượng môi trường rất nhỏ và toàn bộ mẫu được nhúng trực tiếp vào nitơ lỏng Ngoài ưu điểm

dễ thao tác, tốc độ làm lạnh và rã đông khi sử dụng cryotop nhanh hơn rất nhiều

so với OPS, điều này giúp tăng tỉ lệ sống của trứng/phôi sau khi rã đông Một dụng cụ khác có hình thức tương tự cũng được nhóm chuyên gia ở Trường Đại học McGill Canada phát triển được gọi tên là Cryo Leaf

Thao tác

Thao tác đơn gian nhất trong kỹ thuật thủy tinh hóa là đầu tiên mẫu trứng/phôi được cân bằng với môi trường có chứa chất bảo vệ đông lạnh có nồng độ rất cao (4 – 8M) để khử toàn bộ nước bên trong tế bào Sau đó, trứng/phôi được cho vào những dụng cụ chứa, toàn bộ mẫu được nhúng trực tiếp trong nitơ lỏng và chuyển vào bình lưu trữ Thời gian cho toàn bộ quy trình đông lạnh chỉ tốn 15 – 20 phút

Hiện nay, ở một số trung tâm, người ta sử dụng nitơ ở dạng sệt (nitrogen slush) thay thế cho nitơ lỏng trong kỹ thuật thủy tinh hóa Ưu điểm của dạng nitơ này là

tránh sự bay hơi và thay đổi nhiệt độ ở vùng bề mặt khi nhúng trực tiếp dụng cụ chứa mẫu vào trong nitơ lỏng

Rủi ro thường gặp nhất trong kỹ thuật thủy tinh hóa

Trong kỹ thuật thủy tinh hóa, đòi hỏi người thực hiện phải thuần thục và chính xác trong kỹ thuật cao Sự thay đổi nhiệt độ do ngẫu nhiên hay “tai nạn” trong quá trình lưu trữ và di chuyển mẫu đã đông lạnh là rủi ro thường gặp nhất Do thể tích môi trường xung quanh trứng/phôi rất nhỏ, chỉ một vài thay đổi nhiệt độ nhỏ cũng làm ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng trứng/phôi sau rã đông

Nồng độ chất bảo vệ đông lạnh sử dụng trong kỹ thuật thủy tinh hóa cao hơn rất nhiều so với kỹ thuật đông lạnh chậm trước đây Điều này có thể gây ảnh hưởng không nhỏ đến sức sống của trứng/phôi Đặc biệt là ảnh hưởng lớn đến hệ thoi vô sắc của trứng sau khi được rã đông Nhiều ý kiến cho rằng, với nồng độ chất bảo

vệ đông lạnh cao, những tế bào nhạy cảm như trứng/phôi có thể bị tổn thương chất liệu di truyền, nhưng cho đến nay, chưa có một bằng chứng nào cho thấy những em bé được sinh ra từ kỹ thuật đông lạnh trứng/phôi bằng phương pháp thủy tinh hóa có tỉ lệ dị tật bẩm sinh cao hơn phương pháp đông lạnh chậm trước đây

Trứng/phôi sau khi được cho vào những dụng cụ chứa, thường tiếp xúc trực tiếp với nitơ lỏng mà không được bảo vệ Do đó, dễ dẫn đến nguy cơ lây truyền các vi sinh vật gây bệnh giữa các mẫu trứng / phôi với nhau qua trung gian nitơ lỏng

Tuy nhiên, đây chỉ là một trong những nguy cơ có thể xảy ra đối với kỹ thuật này Cho đến thời điểm hiện tại, chưa có một báo cáo về trường hợp lây nhiễm liên quan đến việc chuyển phôi trữ lạnh được công bố Ngoài ra, phương pháp chứa phôi trong cọng rạ (straw) cũng không loại trừ hoàn toàn việc tiếp xúc với nitơ lỏng

Hiện nay, kỹ thuật thủy tinh hóa đang phát triển nhanh chóng khắp nơi trên thế giới và sẽ đóng vai trò quyết định tương lai của kỹ thuật đông lạnh nhờ tính đơn giản, chi phí thấp và hiệu quả vượt trội Ngày càng nhiều trung tâm sử dụng thủy tinh hóa như một kỹ thuật đông lạnh thường quy cho phôi và trứng, thay thế hoàn toàn phương pháp hạ nhiệt độ chậm Ngoài ra, một số báo cáo đông lạnh tinh trùng bằng kỹ thuật thủy tinh hóa thành công được công bố, mở ra một hướng nghiên cứu mới trong lĩnh vực duy trì và bảo tồn khả năng sinh sản

Tình hình ứng dụng kỹ thuật thủy tinh hóa tại Việt Nam

Hiện có 2 trung tâm IVF ở Việt Nam đã sử dụng thường quy kỹ thuật thủy tinh hóa

để thay thế kỹ thuật đông lạnh chậm trước đây là bệnh viện Từ Dũ và bệnh viện Phụ sản Quốc tế Một số trung tâm khác cũng đang từng bước nghiên cứu triển khai kỹ thuật này

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Đặng Quang Vinh, Vương Thị Ngọc Lan, Đỗ Quang Minh, Phùng Huy Tuân,

Hồ Mạnh Tường Trường hợp thai lâm sàng đầu tiên từ phôi người đông lạnh Vô sinh các vấn đề mới 137 – 142

2 Đỗ Quang Minh (2003) Nguyên tắc và kỹ thuật trong trữ lạnh phôi người Vô sinh các vấn đề mới.131 – 136

3 Bras G., Lens J W., Piederiet M H., Rijnders P M., Verveld M., Zeilmaker G

H (1999) Cryopreservation embryo IVF Laboratory aspects of invitro fertilization, 13, 247 – 270

4 Dale B and Elder K (2000) Cryopreservation In vitro fertilization 132 - 149

5 J Konc, Cseh S., Varga E., Kriston R., Kanyo K (2005) Cryopreservation of Oocytes and Embryos in Human Assisted Reproduction J Reproduktionsmed Endokrinol, vol 2, no 4, 251 - 258

6 J Tan (2004) Vitrification of human oocytes and bovine oocytes and embryos Presented to the ISEF Judging Committee

7 Kasai M (2004) Cryopreservation of animal and human embryos by vitrification Repro BioMed Online, vol 9, no 2, 164 - 170