Nghiên cứu đông lạnh tế bào trứng trâu đầm lầy bằng phương pháp thủy tinh hóa

NGHIÊN CỨU ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO TRỨNG TRÂU ĐẦM LẦY BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỦY TINH HÓA Nguyễn Khánh Vân, Vũ Thị Thu Hương, Quản Xuân Hữu, Đỗ Văn Hương, Nguyễn Thị Hương Phòng thí nghiệm trọng ñiểm công nghệ tế bào ñộng vật ABTRACT The study aimed to determine survival of buffalo oocytes immature and matured in vitro after cryopreservated by vitrification method. Survival of buffalo oocytes was evaluated base on their normal morphology and chromosome to oocytes matured or the maturation rate to immature oocytes. The vitrification solution (VS) consisted of TCM 199 supplemented with 0.5M sucrose, 0.5M bovine serum albumin (BSA) and 6M ethylene glycol (EG). The buffalo oocytes were pre-equilibrated in 50% of the VS for 3-5min, then kept in VS for 1min in temperature room and loaded in 0.25ml straws. The straws were then plunged in LN2 for storage. After 2 week of storage buffalo oocytes matured were (38oC for 5s) and evaluated for morphological, the maturation rate and chromosome damage. The percentage of post thawing morphologicalnormal vitrified mature oocytes significantly higher were (76,67% vs 70.31%). It was observed that 75.33% (113/150) of the mature buffalo oocytes were not chromosome damage after vitrification-warming. However, the maturation rate of the buffalo oocytes immature after vitrification-warming significantly much lower than that for control groups (31.1% vs 65.45%). It was concluded that can cryopreservation success the mature or immature buffalo oocytes by vitrification method. Keywords : oocytes; buffalo; mature, immature, vitrification 1. Đặt vấn ñề Quá trình bảo quản lạnh là một lựa chọn hàng ñầu cho việc giữ gìn trứng chưa thụ tinh cho cả hai mục ñích nghiên cứu và thương mại. Đã có một số phương pháp bảo quản lạnh ñược sử dụng ñể bảo quản phôi, trứng ñộng vật và tạo ra ñược con non từ trứng, phôi sau ñông lạnh-giải ñông. Một trong những phương pháp ñông lạnh nhanh ñược nghiên cứu rộng rãi hiện nay là phương pháp thủy tinh hóa (Vitrification). Trong sinh học lạnh thì thuật ngữ Vitrification liên quan tới nhóm các phương pháp ñông lạnh khác nhau, mà mục ñích chính của phương pháp này là ñảm bảo tới mức tối ña sự ñông ñặc không tạo ñá của toàn bộ dung dịch chứa mẫu khi nhiệt ñộ ñược hạ thấp. Lợi ích chính của quá trình thủy tinh hóa là không gây tổn thương cho tế bào trứng trong quá trình ñông lạnh. Đông lạnh tế bào trứng theo phương pháp thủy tinh hóa hiện nay là một phương pháp rất phổ biến vì có thể loại trừ ñược việc hình thành tinh thể ñá bên trong tế bào bằng cách sử dụng các chất bảo quản lạnh có nồng ñộ cao do tính nhầy của chúng làm cho nước bị ñông ñặc nhưng không có sự giãn nở. Đã có nhiều báo cáo về sự thành công của việc bảo quản lạnh tế bào trứng của một số loài ñộng vật bằng phương pháp thủy tinh hóa như là chuột (Edashige và cs., 2003); người (Katayama và cs., 2003); bò (Luna và cs., 2001); lợn (Huang và Holtz, 2002); ngựa (Hurtl và cs., 2000); trâu (Dhali và cs., 2000; Hufana và cs., 2004). Tại Việt Nam, ñông lạnh tế bào trứng vẫn còn là một lĩnh vực cần có nhiều nghiên cứu, ñặc biệt là trứng của ñộng vật lớn trong ñó có tế bào trứng trâu. Việc ñông lạnh thành công tế bào trứng trâu có một ý nghĩa rất lớn ñối với việc bảo tồn nguồn gen và tạo nguồn nguyên liệu cho các nghiên cứu quá trình phát triển và lai tạo giống. Mục ñích chính của nghiên cứu này là ñánh giá ñược khả năng sống của tế bào trứng trâu thành thục và chưa thành thục sau ñông lạnh-giải ñông. 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1. Khai thác và thu tế bào trứng trâu Buồng trứng trâu thu ở lò mổ ñược bảo quản trong dung dịch PBS có bổ sung 0.1% antibiotic, nhiệt ñộ 32-37 o C, ñưa ngay về phòng thí nghiệm trong vòng 2-3h. Thu tế bào trứng trâu từ những nang trứng 3-8mm của buồng trứng bằng phương pháp chọc hút. Lựa chọn những tế bào trứng loại A, B với khối tế bào chất ñồng nhất và 3 lớp màng cumulus trở nên . Các tế bào trứng này sẽ ñược chia làm 3 nhóm: nhóm 1 ñược thủy tinh hóa ngay sau khi thu; nhóm 2 ñược thủy tinh hóa sau 24h nuôi thành thục; nhóm 3 ñược nuôi thành thục 24h ñể làm ñối chứng. 2.2. Nuôi thành thục trứng trâu in vitro Môi trường nuôi tế bào trứng trâu thành thục in vitro gồm có: Hams F-10 + 10% FCS + 5µg/ml FSH + 0.1% dung dịch antibiotic (100 000 iu Penicilin + 0.1g Streptomycin/ml) .Những tế bào trứng trâu loại A, B sau khi lựa chọn sẽ ñược rửa trong môi trường nuôi thành thục in vitro 3 lần, rồi chuyển vào ñĩa có chứa giọt nuôi, nuôi 24h trong ñiều kiện 5% CO 2 và 38.5 o C. Tỷ lệ thành thục ñược kiểm tra bằng phương pháp nhuộm nhân tế bào với sự xuất hiện thể cực thứ nhất. 2.3. Đông lạnh tế bào trứng trâu bằng phương pháp thủy tinh hóa Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp thuỷ tinh hoá của Yadav và cs., 2008 có cải biến) 2.3.1. Môi trường thủy tinh hóa - Môi trường thuỷ tinh hoá VS (TCM 199 + 6M EG + 0.5M sucrose + 0.4% BSA), môi trường trước cân bằng (TCM 199 + 50% VS). 2.3.2. Đông lạnh tế bào trứng trâu - Các tế bào trứng ñược cho vào môi trường trước cân bằng ở nhiệt ñộ phòng trong vòng 3-5 phút, sau ñó chuyển vào môi trường thủy tinh hóa và ñược hút ngay vào cọng rạ ñể ở nhiệt ñộ phòng trong vòng 1 phút. Sau ñó cọng rạ ñược nhúng ngập trực tiếp vào trong dung dịch ni tơ lỏng. 2.4. Gi i ông tế bào trứng trâu - Sau 2 tuần bảo quản trong ni tơ lỏng các tế bào trứng trâu thành thục in vitro sẽ ñược giải ñông,và ñánh giá khả năng sống sau ñông lạnh-giải ñông bằng phương pháp nhuộm nhân tế bào và quan sát hình thái. Kiểm tra hình thái của chúng bằng kính hiển vi soi nổi và kính hiển vi huỳnh quang. Những tế bào trứng trâu khi quan sát dưới kính hiển vi soi nổi có hình thái bình thường, các lớp tế bào hạt (cumulus) sáng, giãn nở trở lại, khối tế bào chất ñồng nhất chặt chẽ sẽ ñược tiếp tục kiểm tra bằng nuôi thành thục in vitro 24h (ñối với trứng chưa thành thục) và nhuộm nhân tế bào sau ñó (ñối với trứng thành thục in vitro). Những tế bào trứng trâu thành thục in vitro có khả năng sống sau ñông lạnh-giải ñông là những tế bào trứng sau giải ñông không xuất hiện những tổn thương về mặt hình thái: lớp tế bào hạt sáng và giãn nở trở lại, có màng sáng (zona pellucida) và nhiễm sắc thể không bị ñứt gãy, màng tế bào chất và tế bào chất còn nguyên vẹn, ñồng ñều. - Số liệu ñược phân tích thống kê theo chuẩn χ 2 . 3. Kết quả và thảo luận 3.1. Đánh giá chất lượng hình thái của tế bào trứng trâu sau ñông lạnh-giải ñông Tỷ lệ tế bào trứng thu ñược sau ñông lạnh-giải ñông (ĐL-GĐ) ñối với trứng thành thục và chưa thành thục trong nghiên cứu này tương ứng là 96.15% và 82.05%. Tỷ lệ thu ñược tế bào trứng sau ñông lạnh-giải ñông ñược báo cáo là 80- 100% ở các loài khác nhau (Nowshari và cs., 1994; Men và cs., 2002; Atabay và cs., 2004), ñiều ñó cũng phù hợp với kết quả của nghiên cứu này. Việc mất một số tế bào trứng trong quá trình ñông lạnh - giải ñông cũng có một vài báo cáo ñưa ra (Dhali và cs., 2000; Luna và cs., 2001; Isachenko và cs., 2005). Nguyên nhân có thể là do tế bào trứng bị dính vào cọng rạ do bề mặt rạn hoặc ghồ ghề (ñiều này thường xảy ra trong quá trình giải ñông) hoặc trứng bị tan rã khi bị ñông lạnh không ñúng cách. B ng 1. Chất lượng tế bào trứng trâu dựa vào hình thái ngay sau ĐL-GĐ Số lư ợng trứng Giai ño ạn Trứng ñư ợc thủy tinh hóa Số tbt thu ñược sau ĐL-GĐ (%) Số tbt có hình thái không thay ñổi sau ĐL-GĐ (%) Số tbt bị tổn thương sau ĐL- GĐ (%) Chưa thành th ục 156 128 (82.05±5.88) b 90 (70.31±7.8) d 38 (29.69) Thành th ục 156 150 (96.15±2.77) a 115 (76.67±6.7) c 35 (23.33) a;b : Các giá trị trong cùng một cột khác nhau có ý nghĩa (p<0.05) c;d : Các giá trị trong cùng một cột khác nhau có ý nghĩa (p< 0.05) Trong nghiên cứu của chúng tôi, tỷ lệ trứng trâu có hình thái không bị biến ñổi sau ñông lạnh-giải ñông ( số trứng có hình thái bình thường/số trứng thu ñược) trong lô trứng thành thục có tỷ lệ cao hơn so với lô trứng chưa thành thục (tương ứng là 76.67% và 70.31%). Hong và cs., (1999) ñã báo cáo rằng tỷ lệ trứng người chưa thành thục có hình thái bình thường sau ñông lạnh-giải ñông là rất cao (84%). Theo báo cáo của Lim và cs., (1999); Arav và cs., 2000; Hochi và cs., 2000 thì tỷ lệ trứng bò thành thục có hình thái không thay ñổi sau ñông lạnh-giải ñông (70-90%) là cao hơn so với trứng chưa thành thục (23–33%) (Fuku và cs., 1995). Tuy nhiên Martino và cs., (1996); cũng như Albarracin và cs., (2005) lại báo cáo rằng tỷ lệ này ở trứng bò thành thục là thấp hơn so với chưa thành thục. Trong khi ñó theo Yadav và cs., (2008) tỷ lệ trứng trâu nước chưa thành thục có hình thái không bị biến ñổi sau ñông lạnh-giải ñông là rất cao (90.56%). Điều ñó cho thấy số lượng trứng thành thục và chưa thành thục ñược bảo quản lạnh theo phương pháp thủy tinh hóa có hình thái không thay ñổi sau ñông lạnh-giải ñông là khác nhau ñối với mỗi loài. Hình 1. Trứng có hình thái thay ñổi sau Hình 2.Trứng có hình thái không thay ĐL-GĐ ñổi sau 3.2. Đánh giá kh năng sống sau ñông lạnh-giải ñông của tế bào trứng trâu thành thục in vitro Quá trình ñông lạnh sẽ làm tổn thương ñến cấu trúc vi ống của tế bào trứng. Sự bất thường trong sợi thoi vô sắc dẫn ñến sự phân tán nhiễm sắc thể, do ñó tế bào trứng thành thục sau ñông lạnh-giải ñông sẽ không thực hiện ñược sự thụ tinh một cách bình thường và không hoàn thiện ñược sự phát triển. Kết hợp với việc ñánh giá chất lượng trứng dựa trên hình thái chúng tôi còn kiểm tra sự ổn ñịnh của bộ nhiễm sắc thể và thoi phân bào vì ñây là nhân tố tiên quyết ñảm bảo trứng thành thục có khả năng sống sau ñông lạnh-giải ñông hay không. B ng 2. Chất lượng nhiễm sắc thể của các tế bào trứng trâu thành thục in vitro có hình thái không thay ñổi sau ñông lạnh-giải ñông Số tbt có hình thái bình thường Số tbt thu ñược sau ĐL-GĐ Nhiễm sắc thể không bị tổn thương Nhiễm sắc thể bị ñứt gãy phân tán n n % n % 150 113 75.33±6.7 2 1.33 Hình 3.Trứng trâu thành thục có nhiễm sắc thể bị tổn thương sau ñông lạnh-giải ñông Những trứng có thể phát triển ñược sau ñông lạnh-giải ñông phải có bộ nhiễm sắc thể tập trung với các nhiễm sắc thể rõ nét thường nằm lệch về một phía của trứng hoặc gần với màng sinh chất. Những trứng không còn khả năng phát triển khi có các nhiễm sắc thể phân tán hoặc quá co cụm, nhiễm sắc thể bị phân rã hoặc không còn giữ ñược hình dạng ñặc trưng. Tỷ lệ trứng thành thục có khả năng sống sau ñông lạnh- giải ñông trong nghiên cứu của chúng tôi là 75.33%. Hình 4.Trứng trâu thành thục có nhiễm s c th không b tổn thương sau ĐL-GĐ 3.3. Đánh giá kh năng sống sau ñông lạnh-giải ñông của tế bào trứng trâu chưa thành thục Các t bào trứng chưa thành thục có hình thái bình thường sau ñông lạnh-giải ñông trong nghiên cứu này có tỷ lệ thành thục thấp hơn so với ñối chứng (31.1% so với 65.45%) nhưng có phần cao hơn so với kết quả nghiên cứu của Hammam và cs., (2005) (30.0%), Yadav và cs., (2008) (21.17%). Nguyên nhân có thể là do quá trình thủy tinh hóa tác ñộng lên sợi thoi vô sắc và các tế bào hạt cumulus. Khi sợi thoi vô sắc bị phá hủy nó sẽ làm giảm sự hoàn thiện quá trình thành thục, sự hình thành thể cực thứ nhất, sự di chuyển của tiền nhân (Carroll và cs., 1993). Thêm vào ñó, việc bảo quản lạnh thành công trứng chưa thành thục phụ thuộc nhiều vào khả năng lưu giữ tính nguyên vẹn về mặt cấu trúc và chức năng của toàn bộ tế bào trứng và lớp cumulus bao xung quanh tế bào trứng. Cầu nối giữa trứng và tế bào cumulus có một vai trò quan trọng trong quá trình thành thục bởi vì nó cung cấp cơ chất dinh dưỡng có tầm quan trọng trong suốt quá trình thành thục của tế bào trứng. Điều ñó cho thấy rằng trứng chưa thành thục nếu không có tế bào cumulus sẽ không ñủ khả năng thành thục nhân và tế bào chất. Hình 5. Trứng trâu chưa thành thục phát triển in vitro sau ñông lạnh-giải ñông B ng 3. ả năng thành thục in vitro của trứng trâu chưa thành thục sau ĐL-GĐ Trứng Số trứng ñược nuôi in vitro (n) Số trứng thành thục (%) Chưa thành thục 90 28 (31.1±9.5) b Đối chứng 110 72 (65.45±8.8) a a;b : Các giá trị trong cùng một cột khác nhau có ý nghĩa (p<0.05) 4. Kết luận Với những kết quả ñạt ñược của nghiên cứu này cho thấy khả năng bảo quản lạnh tế bào trứng trâu thành thục in vitro và chưa thành thục bằng phương pháp thủy tinh hóa tại Việt Nam bước ñầu ñã thành công. Từ ñó có thể mở rộng hướng nghiên cứu sâu hơn về lĩnh vực ñông lạnh tế bào trứng ñộng vật nói chung và tế bào trứng trâu nói riêng. Tài liệu tham khảo Albarraci J.L Morat R zquierdo D. and Mogas, T., 2005a.Vitrification of calf oocytes: effects of maturation stage and prematuration treatment on the nuclear and cytoskeletal components of oocytes and their subsequent development. Molecular Reproduction and Development, 72(2), 239–249 1. Albarracin, J.L., Morato, R., Rojas, C. and Mogas, T., 2005b. Effects of vitrification in open pulled straws on the cytology of in vitro matured prepubertal and adult bovine oocytes. Theriogenology, 63(3), 890–901 2. Atabay, E.C., Takahashi,Y., Katagiri, S., Nagano, M.,Koga, A. and Kanai,Y., 2004. Vitrification of bovine oocytes and its application to intergeneric somatic cell nucleus transfer. Theriogenology, 61(1), 15–23 3. Arav, A., Zeron, Y. and Ocheretny, A., 2000. A new device and method for vitrification increases the cooling rates and allows successful cryopreservation of bovine oocytes. Theriogenology, 53, 248 (Abstract) 4. Carroll, J., Wood, M.J. and Whittingham, D.G., 1993. Normal fertilization and development of frozenthawed mouse oocytes: protective action of certain macro- molecules. Biology of Reproduction, 48, 606–612 5. Dhali, A., Manik, R.S., Das, S.K., Singla, S.K. and Palta, P., 2000. Vitrification of buffalo (Bubalus bubalis) oocytes. Theriogenology, 53, 1295–1303 6. Edashige, K., Yamaji, Y., Kleinhans, F.W. and Kasai, M., 2003. Artificial expression of Aquaporin-3 improves the survival of mouse oocytes after cryopreservation. Biology of Reproduction, 68, 87–94 7. Fuku, E., Xia, L. andDowney, B.R., 1995. Ultrastructural changes in bovines oocytes cryopreserved by vitrification. Cryobiology, 32, 139–156 8. Hochi, S., Akiyama, M., Kimura, K. and Hanada, A., 2000. Vitrification of in vitro matured bovine oocytes in open-pulled glass capillaries of different diameters. Theriogenology, 53, 255 (Abstract) 9. Hong, S.W., Chung, H.M., Lim, J.M., Ko, J.J., Yoon, T.K., Yee, B. and Cha, K.Y., 1999. Improved human oocytes development after vitrification: a comparision of thawing methods. Fertility and Sterility, 72, 142–146 10. Huang, W.T. and Holtz, W., 2002. Effects of meiotic stages, cryoprotectants, cooling and vitrification on cryopreservation of porcine oocytes. Asian Australasian Journal of Animal Science, 15, 485–493 11. Hufana-Duran, D., Pedro, P.B., Venturina, H.V., Hufana, R.D., Salazar, A.L., Duran, P.G. and Cruz, L.C., 2004. Post-warming hatching and birth of live calves following transfer of in vitro-derived vitrified water buffalo. Theriogenology, 61(7–8), 1429–1439 12. Hurtt, A.E., Landim-Alvarenga, F., Seidel, G.E. and Squires, E.L., 2000. Vitrification of immature and mature equine and bovine oocytes in ethylene glycol, Ficoll and sucrose solution using open-pulled straws. Theriogenology, 54, 119–128 13. Isachenko,V., Montag, M., Isachenko, E., Zaeva,V., Krivokhachenko, I., Shafei, R. andVanderven, H., 2005. Aseptic technology of vitrification of human pronuclear oocytes using open-pulled starws. Human Reproduction, 20(2), 492–496 14. Katayama, K.P., Stehlik, J., Kuwayana, M., Kato, O. and Stehlik, E., 2003. High survival rate of vitrified human oocytes results in clinical pregnancy. Fertility and Sterility, 80, 223–224 15. Lim, J.M., Ko, J.J., Hwang, W.S., Chung, H.M. and Niwa, K., 1999. Development of in vitro matured bovine oocytes after cryopreservation with different cryoprotectants. Theriogenology, 51, 1303–1310 16. Luna, H.S., Ferrari, I. and Rompf, R., 2001. Influence of maturation of bovine oocytes at time of vitrification on the incidence of diploid metaphase II at completion of maturation. Animal Reproduction Science, 68, 23–28 17. Martino, A., Songsasen, N. and Leibo, S.P., 1996. Development into blastocysts of bovine oocytes cyropreserved by ultra rapid cooling. Biology of Reproduction, 54, 1059–1069 18. Men, H., Monson, R.L. and Rutledge, J.J., 2002. Effect of meiotic stages and maturation protocols on bovine oocyte’s resistance to cryopreservation. Theriogenology, 57(3), 1095–1103 19. M. Hammam, A. M; El- Shahat K.H., 2005. Vitrification of immature and mature buffalo oocytes in glycerol solution by a simple method. ISAH , Vol 1 (252-255) 20. Nowshari, M.A., Nayudu, P.L. and Hodges, J.K., 1994. Effect of cryoprotectant concentration, equilibration time and thawing procedure on survival and development of rapid frozen-thawed mouse oocytes. Theriogenology, 42, 1193– 1204 21. Yadav.R.C, Sharma. A, Grarg. N, Purohit G.N., 2008. Survival of vitrified water buffalo cumulus oocytes complexes and their subsequent development invitro. Bulgarian Juornal of Veterinary Medicine. 11, No1, 55-64. . tra bằng phương pháp nhuộm nhân tế bào với sự xuất hiện thể cực thứ nhất. 2.3. Đông lạnh tế bào trứng trâu bằng phương pháp thủy tinh hóa Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp. chính của quá trình thủy tinh hóa là không gây tổn thương cho tế bào trứng trong quá trình ñông lạnh. Đông lạnh tế bào trứng theo phương pháp thủy tinh hóa hiện nay là một phương pháp rất phổ biến. NGHIÊN CỨU ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO TRỨNG TRÂU ĐẦM LẦY BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỦY TINH HÓA Nguyễn Khánh Vân, Vũ Thị Thu Hương, Quản Xuân Hữu, Đỗ