Kết quả bước đầu nghiên cứu đông lạnh tinh dịch ngựa ở việt nam

kết quả Bớc đầu nghiên cứu đông lạnh tinh dịch ngựa ở việt nam Đào Đức Thà 1 , Trịnh Văn Thân 1 , Đỗ Hữu Hoan 1 , Phan Văn Kiểm 1 , Vũ Ngọc Hiệu 1 Nguyễn Hữu Trà 2 , Vũ Đình Ngoan 2 1 Bộ môn Sinh sản và Thụ tinh Nhân tạo - Viện Chăn Nuôi 2 Trung tâm Nghiên cứu và PTCN miền Núi Summary The aim of the present study was to assess the effects of centrifugation method, diluents and freezing method on stallion sperm motility after freezing-thawing. In this study, semen from 3 horses was used. To assess the effects of centrifugation speed and diluents, ejaculated semen were diluted in two solutions (V1 and V2) and centrifuged with speed of 1500rpm for 15min (R2) and 3000rpm for 5min (R1). After centrifugation, Aliquot semen was diluted and freezed in four extenders: DL1, DL2 and DL3. After thawing, semen was assessed for motility, progressive and viability of spermatozoa using the computer assisted sperm analyzer SpermVision (Minitub, Germany). It is concluded that, using centrifugation speed of R1 in V1 solution and DL3 extender resulted in highest progressive motility (35.83%, P<0.05). 1. Đặt vấn đề Trong nhng nm gn ủõy, nn chn nuụi cụng nghip ca th gii ủó cú nhng bc tin trin nhy vt do ỏp dng nhng k thut tiờn tin v cụng ngh sinh hc, trong ủú cú k thut ủụng lnh tinh dch nga. ụng lnh v bo tn tinh dch nga l mt trong nhng k thut cú ý ngha kinh t trong vic khai thỏc tim nng di truyn ca con ủc, an ton v dch bnh, bo tn cỏc ging quý him cú nguy c b dit chng v ủỏp ng nhu cu th tinh nhõn to trong chn nuụi nga cng nh tớnh cht thng mi sn phm tinh dch nga. Vỡ vy, k thut ủụng lnh, bo tn tinh dch nga v th tinh nhõn to ủó ủc ỏp dng thnh cụng nhiu nc trờn th gii nh: c, Nht, Phỏp, M Vit Nam, nghiờn cu ủụng lnh tinh dch nga l mt vn ủ mi. Do vy chỳng tụi tin hnh ủ ti Kt qu bc ủu nghiờn cu ủụng lnh tinh dch nga Vit Nam Mc tiờu ca ủ ti: Hot lc tinh trựng nga sau ủụng lnh-gii ủụng ủt trờn 30%. 2. Vật liệu, nội dung và phơng pháp nghiên cứu 2.1. Vật liệu S dng tinh dch ca 3 con nga (Kabadin, Cao tỏc v Bch 1). Nga cú khi lng t 400-500kg, tui 3-5, khai thỏc tinh 1 ln/tun v nhng con nga ny ủc chm súc nuụi dng theo tiờu chun nga ủc ging ti Trung tõm Nghiờn cu v phỏt trin chn nuụi min nỳi. Nga cỏi ủ phi ging l nga Kabadin, nga lai 25% Kabadin v nga ni cú chu k sinh lý sinh sn bỡnh thng v khụng mc cỏc bnh v sinh sn. Thi gian nghiờn cu: t thỏng 1 nm 2006 ủn thỏng 12 nm 2006 ti B mụn Sinh sn v TTNT - Vin Chn nuụi v Trung tõm Nghiờn cu v PTCN min nỳi. 2.2. Nội dung nghiên cứu * Khai thỏc tinh nga v ủỏnh giỏ ch t lng tinh nguyờn: - Xỏc ủnh dung dch, tc ủ ly tõm - Xỏc ủnh mụi trng, phng phỏp ủụng lnh thớch hp - ỏnh giỏ cht lng tinh trựng sau gii ủụng - Phi ging th nghim tinh ủụng lnh. 2.3. Phơng pháp nghiên cứu * Khai thỏc tinh v ủỏnh giỏ cht lng tinh nguyờn: Ly tinh nga bng õm ủo gi, ủỏnh giỏ cht lng tinh dch bng phn mn SpermVision ca hóng Minitub v cỏc phng phỏp thng quy trong phũng thớ nghim tinh thụng qua cỏc ch tiờu: lng xut tinh (V), nng ủ tinh trựng (C), hot lc (A), ỏp sut thm thu (ASTT), sc khỏng (R), k hỡnh (K) v pH. Ch nhng tinh dch cú nng ủ trờn 60x10 6 tinh trựng/ml v hot lc trờn 50% ủc ủa vo ủ pha loóng v ủụng lnh. * Dung dch ly tõm: Tinh dch sau khi khai thỏc v ủỏnh giỏ ủc chia ủu thnh 2 phn bng nhau v pha vi 2 dung dch ly tõm V1 v V2 theo t l 1:1, sau ủú ủc lm lnh ti 5C. * Phương pháp ly tâm: Hút tinh pha vào các ống sau ñó ñặt vào máy ly tâm (dùng máy ly tâm UNIVERSAL 3R của hãng Minitub) và ly tâm theo 2 phương pháp: 1500 vòng trong 15 phút ở 25 0 C (R2) và 3000 vòng trong 5 phút ở 5 0 C (R1) * Cân b ng và ñông l nh tinh: Sau khi ly tâm, dùng pipet hút bỏ dung dịch ở trên, phần lắng cặn ở dưới chứa tinh trùng ñược pha với các môi trường ñông lạnh (DL1, DL2 và DL3). Khi pha với môi trường ñông lạnh, sử dụng 2 phương pháp cân bằng: - Cân bằng 1 bước: môi trường ñông lạnh ñem pha một lần với tinh dịch theo tỷ lệ 1:1. Sau khi pha xong dùng pipet hút ñảo nhẹ nhàng cho tinh trùng trộn ñều với môi trường rồi cân bằng ở 5 0 C trong 4 giờ. - Cân bằng 2 bước: Môi trường ñông lạnh ñược chia làm 2 dạng dung dịch: Dung dịch A và Dung dịch B. Tinh dịch ñược pha với dung dịch A theo tỷ lệ 1:0,5, ñể ở 5 0 C trong 2 giờ, sau ñó cho tiếp dung dịch B theo tỷ lệ 1:0,5 ñể ở 5 0 C trong 2 giờ. Sau khi cân bằng 4 giờ tiến hành tạo viên tinh: Nhúng ngập tấm mica (20*30*5 cm, phẳng vào nitơ lỏng trong 10 phút), sau ñó ñưa tấm mica ñặt trên bề mặt nitơ lỏng. Dùng ống nhỏ giọt hút 0,1ml tinh dịch ñã ñược cân bằng nhỏ lên bề mặt tấm mica sao cho giọt tinh có hình cầu. Sau 1 phút gạt bỏ viên tinh xuống nitơ lỏng và kiểm tra hoạt lực tinh trùng sau ñông lạnh. Tinh ñông lạnh sau khi kiểm tra ñạt tiêu chuẩn sẽ ñược chuyển vào bảo quản trong bình nitơ lỏng. * Đánh giá hoạt lực tinh trùng sau gi i ñông: Các viên tinh ñược giải ñông bằng nước sinh lý ở nhiệt ñộ 38-39 0 C, cho thêm cafein, dùng pipet hút 0,23µl nhỏ vào phiến kính chuyên dụng và ñánh giá bằng phần mềm Spermvision. * Ph i giống thử nghiệm: Tinh ñông lạnh dạng viên ñược giải ñông bằng nước sinh lý ở 38-39 0 C và phối giống cho ngựa cái ñể ñánh giá tỷ lệ thụ thai. * Phương pháp xử lý số liệu Số liệu ñược phân tích theo mô hình cân bằng, sự khác nhau giữa các giá trị trung bình thông qua phép kiểm tra ANOVA của phần mềm Minitab 12 và phần mềm SpermVision 3.0 (hãng Minitub, Đức). 3. KÕt qu¶ vµ th¶o luËn . ChÊt l−îng tinh nguyªn Tinh d ch ngựa sau khi khai thác ñược ñánh giá thông qua một số các chỉ tiêu sinh học: lượng xuất tinh (Vml), hoạt lực (A%), nồng ñộ tinh trùng (C), tổng số tinh trùng tiến thẳng (VAC), tỷ lệ kỳ hình (K), sức kháng (R), kết quả ñược thể hiện ở bảng 3: Bảng 1 . M t s chỉ tiêu của tinh dịch ngựa Ngựa Ka Quốc Ngựa Cao Tác Ngựa Bạch 1 Chỉ tiêu n X ± SE n X ± SE n X ± SE V (ml) 24 66,17±2,5 a 24 48,0 ±3,25 b 24 40,5 ±2,65 c A (%) 24 76,67±1,28 a 24 75,47 ±1,25 a 24 75,85 ±1,09 a C (Triệu/ml) 24 189,51±3,56 a 24 190,25 ±3,68 a 24 190,30 ±3,48 a VAC (tỷ/lần) 24 9,61±0,41 a 24 6,8 9±0,72 b 24 2,81 ±0,69 c K (%) 24 7,84±0,17 a 24 7,91 ±0,19 24 7,78 ±0,20 R 24 3620±380 a 24 3679 ±368 a 24 3701 ±389 a pH 24 7,43±0,14 a 24 7,33 ±0,20 a 24 7,49 ±0,18 a ASTT 24 294,36±5,17 a 24 290,70 ±4,86 a 24 296,30 ±5,24 a Màu sắc tinh Trắng ngà Tr ắng ngà Tr ắng ngà Các chữ cái a,b,c trong cùng m t hàng có sự sai khác về ý nghĩa thống kê. .P<0.05 Kết quả bảng 1 cho thấy, lượng xuất tinh của ngựa Ka Quốc là cao nhất: 66,17 ml, tiếp theo là của ngựa Cao tác (48ml) và thấp nhất là của ngựa Bạch 1 (40,5ml). Kết quả của chúng tôi tương tự như kết quả của một số tác giả ñã báo cáo. Theo Nguyễn Hữu Trà (2005), lượng xuất tinh của ngựa Ka Quốc là 70,82 ml, ngựa Nội là 40,50 ml. Còn theo Brinsko SP (2000), lượng xuất tinh ngựa giao ñộng từ 40-100ml và nồng ñộ tinh trùng là 191 triệu/ml. Chỉ tiêu VAC của ngựa Ka Quốc cao nhất (9,61 tỷ), ngựa Cao tác là 6,89 tỷ và ngựa Bạch 1 thấp nhất (2,81 tỷ). Hoạt lực, nồng ñộ, kỳ hình, sức kháng, pH và ASTT của 3 giống ngựa không có sự sai khác (P>0,05): Hoạt lực tinh trùng của 3 giống ngựa trên lần lượt là 76,67%; 75,47% và 75,85%, kết quả này thấp hơn kết quả của H. Sienme (2003), hoạt lực của tinh trùng sau khi khai thác tinh ñạt 76,9%. Tuy nhiên, kết quả của chúng tôi cao hơn của S. Blottner (2000), hoạt lực tinh trùng của tinh nguyên là 67,3% vào tháng 12 và ñạt 59,4% ở tháng 5. . Ho¹t lùc tinh trïng sau khi pha víi dung dÞch ly t©m Tinh dịch sau khi khai thác và ñánh giá một số chỉ tiêu, chỉ những tinh dịch có nồng ñộ trên 60x10 6 tinh trùng/ml và hoạt lực trên 50% ñược ñưa vào ñể pha loãng với 2 dung dịch ly tâm V1 và V2 theo tỷ lệ 1:1, sau ñó ñược làm lạnh tới 5°C. Kết quả ñược thể hiện ở bảng 2: Bảng 2 . ạt lực tinh trùng sau khi pha với dung dịch ly tâm (n 24) Ngựa Ka Quốc Ngựa Cao Tác Ngựa Bạch 1 Dung dịch (% ± SE) (% ± SE) (% ± SE) V1 75,47 ± 1,15 a 75,09 ± 1,26 a 74,80 ± 1,27 a V2 48,61 ± 1.12 a 56,74 ± 1,39 b 59,07 ± 1,55 b Các chữ cái a,b trong cùng m t hàng có sự sai khác về ý ngh a thống kê. .P<0.05 Kết quả ở bảng 2 cho thấy khi sử dụng dung dịch ly tâm V1, không có sự khác biệt về hoạt lực tinh trùng giữa 3 giống ngựa Ka Quốc, ngựa Cao Tác và ngựa Bạch 1 (75,47; 75,09 và 74,8%, tương ứng). Tuy nhiên, khi sử dụng dung dịch ly tâm V2, hoạt lực tinh trùng của giống ngựa Bạch 1 là cao nhất: 59,07%, tiếp ñến là giống ngựa Cao Tác (56,74) và nhất là giống ngựa Ka Quốc ở V1 cao hơn ở V2 (75,47% so với 59,07%). Kết quả sử dụng V1 không có sự sai khác so với một số tác giả ñã báo cáo. Theo M. Vidamentla (2000) hoạt lực tinh trùng sau ly tâm ñạt 77,05%, còn theo Ijaz A, Ducharme R, (1995) tỷ lệ này là 78%. Như vậy, khi sử dụng dung dịch ly tâm V1 cho kết quả hoạt lực tinh trùng tốt hơn dung dịch ly tâm V2. 3.3. ChÊt l−îng tinh trïng sau khi ly t©m Đưa tinh pha vào các ống của máy ly tâm và ly tâm theo 2 phương pháp R1 và R2. Chất lượng tinh trùng sau khi ly tâm thể hiện ở bảng 3: Bảng 3 . M t số chỉ tiêu của tinh trùng sau ly tâm =24) ChØ tiªu Phương pháp R2 R2 V (ml) 5,75 ± 0,24 a 5,43 ± 0,22 a A % 75,29 ± 1,35 a 75,39 ± 1,32 a C (triệu/ml) 2704 ± 7,1 b 3356 ± 5,9 a K (%) 8,62 ± 0,61 a 8,61 ± 0,56 b R 3490 ± 7,5 a 3560 ± 6,8 b Các chữ cái a b trong cùng m t hàng có sự sai khác về ý nghĩa thống kê.P<0.05 Kết quả ở bảng 3 cho thấy lượng tinh trùng cô ñặc trong phương pháp R1 chỉ còn 5,43 ml trong khi ñó trong phương pháp ly tâm R2 còn là 5,75 ml tức lượng tinh thanh còn trong phần cặn ly tâm nhiều hơn. Hoạt lực (A), tỷ lệ kỳ hình (K) của tinh trùng sau khi ly tâm của 2 phương pháp ly tâm R2 và R1 là như nhau (75,29% so với 75,39%), (8,62 so với 8,61%). Nồng ñộ và sức kháng của tinh trùng ở hai phương pháp ly tâm R1, R2 lần lượt là (3356 và 2704), (3560 và 3490). Như vậy, việc loại bỏ triệt ñể tinh thanh ra khỏi mẫu khi ñưa vào ñông lạnh không chỉ ñảm bảo việc loại bỏ hiện tượng thể tinh hoá tốt hơn mà còn tập trung một lượng tinh trùng lớn trong một thể tích nhỏ là ñIều cần thiết trong bảo quản và phối giống. Trong cả hai phương pháp ly tâm, hoạt lực có thay ñổi và giảm xuống, ñiều này có thể giải thích khả năng chống lại lực ly tâm của tinh trùng nhờ vào dung dịch ly tâm chưa cao ñồng thời phản ánh qua tỷ lệ kỳ hình của tinh trùng trong cả hai phương pháp ñều cao hơn so với trước khi ly tâm. . ChÊt l−îng tinh trïng sau ®«ng l¹nh-gi¶i ®«ng Việc tiến hành kiểm tra hoạt lực sau cân bằng ñồng thời tiến hành ñông lạnh tinh dịch. Hoạt lực sau giải ñông phụ thuộc rất nhiều nguyên nhân: thao tác làm tinh viên ñông lạnh, nhiệt ñộ giải ñông và môi trường ñông lạnh. Kết quả thể hiện ở bảng 4: Bảng 4 . Hoạt lực tinh trùng sau ñông lạnh-giải ñông =18) Cân bằng 2 bước Cân bằng 1 bước Phương pháp ly tâm Môi trường ñông lạnh (% ± SE) (% ± SE) R2 DL1 27,50 ± 2,5 a 11,80 ± 2,46 b DL2 26,25 ± 1,97 a 14,75 ± 1,60 b DL3 33,67 ± 0,88 a 21,42 ± 2,36 b DL1 23,33 ± 4,41 a 11,10 ± 2,91 b DL2 32,00 ± 1,22 a 17,16 ± 2,52 b R1 DL3 35,83 ± 1,14 a 28,08 ± 1,85 b Các chữ cái a b trong cùng m t hàng có sự sai khác về ý nghĩa thống kê.P<0.05 Theo kết quả ở bảng 4 cho thấy, khi sử dụng phương pháp ly tâm R2 và cân bằng 2 bước, hoạt lực tinh trùng sau ñông lạnh-giải ñông của môi trường DL3 cho kết quả cao nhất (33,67%), tiếp ñó ñến DL1 (27,5%) và DL2 (26,25%); còn khi cân bằng 1 bước của môi trường DL1, DL2 và DL3 lần lượt là 11,8%; 14,75% và 21,42%. Tuy nhiên khi so sánh giữa 2 kỹ thuật cân bằng 2 bước và 1 bước của phương pháp ly tâm R2 thì kết quả cho thấy hoạt lực tinh trùng ở kỹ thuật cân bằng 2 bước tốt hơn 1 bước, cụ thể ở các môi trường DL1, DL2 và DL3 lần lượt là (27,5 so với 11,8%); (26,25% so với 14,75%) và (33,67% so với 21,42%). Mặt khác, khi sử dụng phương pháp ly tâm R1 và cân bằng 2 bước, A của tinh trùng ở DL3 cho kết quả cao nhất (35,83%), tiếp ñó ñến DL2 (32%) và DL1 (23,33%); khi cân bằng 1 bước A của tinh trùng ở môi trường DL1, DL2 và DL3 lần lượt là 11,10; 17,16 và 28,08%. Hơn nữa, khi so sánh A của tinh trùng giữa 2 kỹ thuật cân bằng 2 bước và 1 bước của phương pháp ly tâm R1 kết quả cũng cho thấy kỹ thuật cân bằng 2 bước tốt hơn 1 bước, cụ thể ở các môi trường DL3, DL2 và DL1 lần lượt là (35,83% so với 28,08%); (32% so với 17,16%) và (23,33% so với 11,10%). Như vây, hoạt lực tinh trùng sau ñông lạnh-giải ñông của môi trường DL3 ở cả 2 phương pháp ly tâm R2 và R1 ñều cho kết quả cao nhất và phương pháp ly tâm R1 tốt hơn R2 cụ thể (35,83% so với 33,67%). Kết quả về hoạt lực tinh trùng sau ñông lạnh-giải ñông của chúng tôi thấp hơn của một số tác giả ñã công bố. Theo H. Sieme (2003), hoạt lực của tinh trùng sau giải ñông là 49,6%; Theo M. Vidamentla (2000) là 47% và theo S. Blottner (2000), ñạt 37,5% ở tháng 12 và ñạt 20,8% ở tháng 5. . KÕt qu¶ phèi gièng thö nghiÖm tinh viªn ®«ng l¹nh Bảng 5. ết quả phối giống th nghiệm Ngựa Chỉ tiêu Kabadin Lai 25% Nội Số lần dẫn tinh/chu kỳ 1 1 1 VAC/lần dẫn tinh (triệu) 250 250 250 Số ngựa có thai/ngựa ñược phối giống 1/2 4/6 1/2 Tỷ lệ thụ thai (%) 50 66 50 Kết quả ở bảng 5 cho thấy, tỷ lệ thụ thai của ngựa lai 25% cao nhất (66%), tiếp ñó là ngựa Kabadin 50% và ngựa Nội 50%. Tỷ lệ thụ thai bằng tinh viên ñông lạnh bình quân ñạt 60%. Kết quả này của chúng tôi cao hơn của M. Vidamentla và cs (2000) các tác giả này ñã thực hiện trên 243 chu kỳ và tỷ lệ thụ thai là 56% 4. KÕt luËn vµ ®Ò nghÞ . KÕt luËn 1. Lượng xuất tinh của ngựa Ka Quốc cao nhất: 66,17 ml, tiếp theo là ngựa cao tác (48ml) và thấp nhất là ngựa Bạch 1 (40,5ml). 2. Sử dụng dung dịch ly tâm V1 cho kết quả tốt hơn V2 và không có sự khác biệt về hoạt lực tinh trùng giữa 3 giống ngựa. 3. Khi sử dụng phương pháp ly tâm R1, kỹ thuật cân bằng 2 bước và môi trường ñông lạnh DL3 hoạt lực tinh trùng sau khi ñông lạnh-giải ñông cao nhất 35,83%. 4. Phối giống nhân tạo thử nghiệm cho ñàn ngựa cái bằng tinh ñông lạnh dạng viên tỷ lệ thụ thai ñạt 60%. 4.2. §Ò nghÞ Tiếp tục nghiên cứu ñông lạnh tinh dịch ngựa dạng viên tạo tiền ñề cho ñông lạnh tinh ngựa dạng cọng rạ. Tµi liÖu tham kh¶o 1. rinsko P Crockett EC, Squires E 2000): Effect of centrifugation and partial removal of seminal plasma on equine spermatozoal motility after cooling and storage. Theriogenology 54, 129–136. 2. H Sieme, G Martinsson, H Rauterberg, Walter, C Aurich, R Petzoldt and E lug 2003). Application of Techniques for Sperm Selection in Fresh and Frozen-Thawed Stallion Semen. Reprod Dom Anim 38, 134-140. 3. jaz A, Ducharme R 1995): Effect of various extenders and Taurine on survival of stallion sperm cooled to 5 o C. Theriogenology 44, 1039–1050. 4. M. Vidamentla, P. EcotZ, P. Noue, C. Bourgeoisl, M. Magistrinil and E. Palmer 2000). Centrifugation and addition of glycerol at 22 °C instead of 4°C improve post-thaw motility and fertility of stallion spermatozoa. Theriogenology 54:907-919. 5. S. Blottner, C. Warnke, A. Tuchscherer, V. Heinen, H. Torner 2000). Morphological and functional changes of stallion spermatozoa after cryopreservation during breeding and non- breeding season. Animal Reproduction Science 65 (2001) 75–88. Nguy n Hữu Trà 2005). Nghiên cứu một số ñặc ñiểm sinh sản của ngựa. Luận án tiến sĩ nông nghiệp. Viện Chăn nuôi. . kết quả Bớc đầu nghiên cứu đông lạnh tinh dịch ngựa ở việt nam Đào Đức Thà 1 , Trịnh Văn Thân 1 , Đỗ Hữu Hoan 1 , Phan Văn Kiểm 1 ,. nghiệm cho ñàn ngựa cái bằng tinh ñông lạnh dạng viên tỷ lệ thụ thai ñạt 60%. 4.2. §Ò nghÞ Tiếp tục nghiên cứu ñông lạnh tinh dịch ngựa dạng viên tạo tiền ñề cho ñông lạnh tinh ngựa dạng cọng. thẳng (VAC), tỷ lệ kỳ hình (K), sức kháng (R), kết quả ñược thể hiện ở bảng 3: Bảng 1 . M t s chỉ tiêu của tinh dịch ngựa Ngựa Ka Quốc Ngựa Cao Tác Ngựa Bạch 1 Chỉ tiêu n X ± SE n X ± SE n