Báo cáo thực hành bộ môn công nghệ vi sinh bài 1 nhân sinh khối nấm men saccharomyces cerevisiae

- Thực hành và rèn luyện các kỹ năng: + Chuẩn bị môi trường lên men sản xuất sinh khối nấm men.. Công nghệ sản xuất protein qua nuôi cấy vi sinh vật cónhiều ưu điểm: Có thể được thực hi

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP

BÁO CÁO THỰC HÀNH

Bộ Môn : Công Nghệ Vi Sinh

Giáo Viên Hướng Dẫn: Nguyễn Thị Thu Hằng

Sinh Viên : Nguyễn Hữu Minh Quân

1.1, Mục tiêu và yêu cầu

+ Sinh khối vi sinh vật chứa hàm lượng rất cao protein

+ Công việc sản xuất sinh khối vi sinh vật có thể thực hiện tốt trong diện tích nhỏ, sảnphẩm dễ thu hoạch với hiệu suất thu hồi cao, việc sản xuất không phụ thuộc thời tiết, khíhậu và sử dụng những nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm

- Thực hành và rèn luyện các kỹ năng:

+ Chuẩn bị môi trường lên men sản xuất sinh khối nấm men

+ Chuẩn bị giống nấm men, hoạt hóa giống, cấy giống vào môi trường lên men, thựchiện quá trình lên men nhân giống nấm men ở qui mô phòng thí nghiệm

+ Thu nhận sinh khối nấm men

+ Xác định hiệu suất của quá trình lên men

1.2 Kiến thức lý thuyết

Công nghệ sản xuất protein đơn bào (Sing - Cell Protein - SCP) hay công nghệ nhân sinhkhối vi sinh vật nhằm tạo chế phẩm có hàm lượng cao protein từ vi sinh vật (tế bào visinh vật chứa nhiều protein) Công nghệ sản xuất protein qua nuôi cấy vi sinh vật cónhiều ưu điểm: Có thể được thực hiện chỉ trong diện tích nhỏ; sản phẩm dễ thu hoạch vớihiệu suất thu hồi cao; trong thời gian ngắn có thể tạo lượng lớn sinh khối vi sinh vật chứanồng độ protein cao; việc nuôi cấy vi sinh vật không phụ thuộc vào khí hậu, thời tiết củatừng địa phương do điều kiện của môi trường nuôi cấy có thể điều chỉnh được khá dễdàng; có thể phân lập và lựa chọn các chủng vi sinh vật thích hợp cho từng quy trìnhcông 6 nghệ, cho từng loại nguyên liệu; nồng độ protein và thành phần dinh dưỡng chứatrong sinh khối vi sinh vật có thể được điều chỉnh bằng thay đổi thành phần môi trường

và điều kiện nuôi cấy, hoặc bằng thay đổi di truyền của chủng giống vi sinh vật; môitrường lên men sản xuất sinh khối có thể tận dụng nguồn nguyên liệu phi protein, rẻ tiền(phế liệu, phụ phẩm của một số ngành công nghiệp và nông nghiệp như rỉ đường, dịchđường khi thủy phân gỗ tạp, rơm rạ, bã mía…) góp phần làm giảm giá thành sản phẩm vàgiải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường do chất thải và nước thải.

Trong số các vi sinh vật hữu ích cho sản xuất protein đơn bào, nấm men thường được ứngdụng Nấm men thuộc nhóm vi sinh vật có cấu tạo đơn bào, sinh sản theo lối nảy chồi và

có khả năng sinh sản nhanh Tế bào nấm men chứa hàm lượng cao chất dinh dưỡng: Hàmlượng protein có thể lên đến 40 - 60%, trong đó có nhiều loại axit amin không thay thế;hàm lượng vitamin khá cao với hoạt tính hơn gấp 2 - 3 lần vitamin tổng hợp Hiện nay,

có khá nhiều loài nấm men được sử dụng làm giống cho sản xuất thu nhận protein như:Endomyces fibuligera, Torulopsis utilis, Candida tropicalis, Saccharomyces cerevisiae,Hansenula capsulata, Monilia candida, Mycotorula japonica…, trong đó các chủng nấmmen thuộc giống Torulopsis, Candida, Saccharomyces được sử dụng phổ biến

1.3 Nội dung thực hành

*Chuẩn bị nguyên vật liệu

- Giống vi sinh vật: Các ống giống nấm men Saccharomyces cerevisiae

- Hóa chất: Các hóa chất sử dụng trong nuôi cấy vi sinh vật như: peptone, glucose,K2HPO4, MgSO4.7H2O, các vitamin như Thiamine HCl…

- Dụng cụ: ống nghiệm, bình tam giác, pipet, que cấy vi sinh vật đầu tròn, cuvet, lamkính, lamen…

- Thiết bị: box cấy vô trùng, nồi hấp khử trùng, tủ định ôn nuôi cấy vi sinh vật, máy somàu quang phổ, kính hiển vi quang học, máy li tâm, cân phân tích…

*Thực hiện thí nghiệm.

-Pha chế môi trường nhân sinh khối nấm men

- Thực hiện pha chế 1 lít môi trường dinh dưỡng lỏng nhân sinh khối nấm men theo côngthức như sau

- Môi trường sau khi pha chế được phân phối vào các bình tam giác 250 ml (50 ml/bình)

và 500 ml (100 ml/bình) Dán nhãn ghi tên môi trường, ngày pha chế môi trường, ngườipha môi trường lên từng bình môi trường Làm nút bông và nút giấy cho các bình môitrường

- Khử trùng môi trường ở 118ºC trong 30 phút

- Sau khi khử trùng, môi trường được bảo quản và làm nguội trong tủ đựng môi trường ởnhiệt độ phòng

*Kiểm tra chất lượng nấm men bằng phương pháp quan sát dưới kính hiển vi quang học

Làm tiêu bản nhuộm đơn nấm men cấy trong môi trường dịch thể với Xanh methylenLoeffler Quan sát trên kính hiển vi ở vật kính x40 và x100

Cách thực hiện:

+ Nhỏ 1 giọt thuốc nhuộm xanh methylen Loeffler lên phiến kính;

+ Nhỏ 1 giọt canh trường nấm men lên thuốc nhuộm;

+ Đặt lá kính lên giọt dịch thật nhẹ nhàng tránh không tạo thành bọt khí (để một mép lákính tiếp xúc với phiến kính rồi từ từ hạ lá kính xuống) Nếu giọt dịch nhiều quá tràn rangoài phần tiếp xúc của lá kính và phiến kính thì dùng giấy thấm bớt nước đi

+ Đưa tiêu bản lên quan sát dưới kính hiển vi

- Chỉ tiêu quan sát, thống kê: Thống kê các chỉ số: tỷ lệ tế bào nấm men sống; tỷ lệ tế bàonấm men nảy chồi; tỷ lệ tế bào nấm men chết

*Lưu ý: Tế bào nấm men chết là tế bào bắt màu xanh của thuốc nhuộm; tế bào sốngkhông cho thuốc nhuộm thấm qua thành và màng tế bào nên không bắt màu xanh của

thuốc nhuộm; tế bào nảy chồi là các tế bào đang phát triển và có nhiều chồi mọc chồngchất lên nhau.

tb chết

* Cấy và hoạt hóa giống nấm men :

- Dùng que cấy đầu tròn lấy giống nấm men Saccharomyces cerevisiae trong ống giống

- Cấy giống vào bình môi trường dung tích 250 ml đã chuẩn bị Lắc đều Ghi ký hiệu giống, thời điểm cấy giống và người cấy giống lên thành bình 8

- Nuôi hoạt hóa nấm men trên máy lắc ở 28ºC, chế độ lắc 200 vòng/phút trong 12h

* Nhân sinh khối và thu nhận sinh khối nấm men:

- Cấy giống nấm men đã hoạt hóa sang bình tam giác dung tích 500 ml chứa môi trường nhân sinh khối nấm men đã chuẩn bị.

- Nuôi cấy nấm men trong máy lắc ổn nhiệt ở 28ºC, chế độ lắc 200 vòng/phút và thu hồi sinh khối nấm men tạo thành ở các thời điểm: Sau 0h, 3h, 6h, 12h, 24h, 30h, 36h, 48h và 72h lên men

Lưu ý: Ở mỗi thời điểm thu nhận sinh khối nấm men, các bình lên men chứa sinh khối nấm men được mang vào box cấy vô trùng Dùng pipet vô trùng hút 3 - 5 ml dịch nấm men từ bình lên men sang một ống nghiệm vô trùng để kiểm tra lượng sinh khối nấm mentạo thành Tiếp theo đậy nắp bình nhân giống nấm men và tiếp tục nuôi cấy trong tủ định

ôn cho thu hồi sinh khối ở các thời điểm tiếp theo

* Vẽ đường cong sinh trưởng của nấm men

-các bước thực hiện:

+ trước khi đo phải lắc đều

+đo vi sinh vật từ thấp đến cao thì ta không cần phải thay đầu côn

+hút 1,5ml dịch lên men chứa sinh khối nấm men, cho vào cuvet , đặt vào vị trí của mẫu cần đo độ đục của máy so màu quan phổ

Thu nhận sinh khối nấm men ở các thời

gian sau lên men Lượng sinh khối nấm men tạo thành

- Đường cong sinh trưởng

(%)

Số tbchết Tỷ lệ tbchết (%)

quan sátđược

Khôngquan sátđược

97

Bài 2 : ỨNG DỤNG NẤM MEN ĐỂ LÀM TRƯƠNG NỞ BỘT MÌ

2.1 Mục tiêu và yêu cầu

·*Mục tiêu

Giúp sinh viên nắm vững cơ sở khoa học, nguyên tắc và yêu cầu cơ bản

trong quá trình sử dụng nấm men để làm trương nở bột mì

·*Yêu cầu

- Nắm được, trình bày được vai trò và cơ chế hoạt động của nấm men trong

quá trình làm trương nở bột bánh mì

- Củng cố và hình thành kỹ năng:

+ Bố trí nguồn nguyên liệu bột mì;

+ Phối trộn bột mì, một số chất phụ gia, nấm men;

+ Tạo điều kiện thích hợp để nấm men hoạt động làm trương nở bột mì

hiệu quả nhất

2.2 Kiến thức lý thuyết

Hiện nay, giống để sản xuất trong công nghệ làm bánh thường sử dụng các chủng

Saccharomyces cerevisiae Trong khối bột mì, nấm men Saccharomyces cerevisiae trước

hết sử dụng nguồn carbon là glucose, tiếp theo sử dụng các đường khác như maltose, sucrose và fructose có sẵn trong bột để lên men Để hoạt động của nấm men tốt hơn, loại enzyme phân giải tinh bột thành đường làm nguồn cơ chất cho lên men như α-amylase bền nhiệt thường được bổ sung vào vật liệu lên men Quá trình lên men làm trương nở bột mì dưới hoạt động của nấm men sẽ sản sinh CO2 tạo các lỗ hổng trong bột Bên cạnh

đó, quá trình lên men diễn ra sẽ tạo khoảng 0,5% - 1,4% ethanol trong khối bột mì Phương trình tổng quát của quá trình lên men:

C6H12O6 → 2CH3CH2OH + 2CO2 + 2ATP

Các chủng nấm men sử dụng cho sản xuất bánh mì phải là các chủng bền nhiệt, có khả năng sinh sản nhanh và có hoạt tính enzyme α-amylase bền nhiệt Hoạt lực làm trương nởbột mì của nấm men là chỉ số chất lượng quan trọng của nấm men ứng dụng trong công nghệ làm bánh mì Bên cạnh đó, thời gian nấm men làm cho khối bột trương nở càng ngắn thì chất lượng nấm men càng tốt (nấm men chất lượng tốt thường làm nở bột sau 60

- 65 phút)

=> kết quả làm trương nở khối bột mì nhờ hoạt động của nấm men

2.3 Nội dung thực hành

2.3.1 Chuẩn bị nguyên vật liệu

- Giống vi sinh vật: Sinh khối nấm men Saccharomyces cerevisiae đã thu nhận sau khi thực hành bài 1 (Nhân sinh khối nấm men Saccharomyces cerevisiae) được thu hồi bằng

phương pháp li tâm và sấy khô ở nhiệt độ 40ºC

- Dụng cụ: cốc thủy tinh, thước kẻ chia vạch

- Thiết bị: tủ ấm, cân phân tích, cân kỹ thuật

2.3.2 Thực hiện thí nghiệm

2.3.2.1 Kiểm tra sức sống của nấm men

- Cân 10 g bột mì bằng cân phân tích vào cốc thủy tinh

- Cân 5 g sinh khối nấm men khô bổ sung vào cốc bột mì

- Hút 7,5 ml nước vào cốc để thấm ướt bột mì và nấm men, trộn đều tạo khối nấm mentrộn bột mì

- Nhanh tay nặn khối nấm men trộn bột mì thành các viên tròn có cùng đường kính 1 cm, sau đó thả đồng loạt các viên vào cốc nước đã được làm ấm đến 35ºC

- Quan sát sẽ thấy ban đầu các viên nấm men trộn bột mì (viên bột men) nặng hơn nước lên nhanh chóng lắng xuống đáy cốc Sau một khoảng thời gian, viên bột men sẽ di

chuyển từ đáy cốc lên bề mặt nước Xác định khoảng thời gian cần thiết để các viên bột men nổi lên trên bề mặt cốc nước ấm

Lưu ý: Trong các viên nấm men trộn bột mì, dưới hoạt động lên men của nấm men, các

bọt khí CO2 tạo thành và thoát khỏi viên bột men đi lên mặt nước, qua đó tạo lực đẩy cácviên bột men nổi lên bề mặt nước Thời gian cần thiết để các viên bột men nổi lên càng ngắn thì nấm men càng có sức sống tốt và có khả năng làm trương nở bột mì mạnh và ngược lại Mặt khác, nấm men không hoạt động sẽ không tạo ra bọt khí CO2 trong khối bột men và không tạo lực đẩy khối bột men nổi lên mà vẫn nằm dưới đáy cốc và dần tan

ra hòa vào cốc nước

=>Thời gian xác định viên bột men nổi lên trên bề mặt cốc nước ấm : 1p 30s

2.3.2.2 Sử dụng nấm men để làm trương nở bột mì

- Cân 850 g bột mì, 15 g NaCl cho vào cốc thủy tinh dung tích lớn

- Bổ sung dịch nấm men đã hoạt hóa vào cốc bột mì, thêm 450 ml nước đã được làm ấm đến 35ºC

- Nhào trộn đều khối nấm men + bột mì + NaCl + nước bằng tay cho đến khi bột được hòa tan thật đều với nước và men sữa (bột không còn dính vào tay là được)

- Nặn bột thành hình 1 chiếc bánh lớn và cho vào khuôn đã đặt sẵn thước có thang chia vạch Xác định chiều cao của khối bột lúc ban đầu và tính thể tích của khối bột khi chưa

ủ

- Đặt khuôn chứa bột nhào trộn nấm men vào tủ ấm ở 35ºC trong 3h

- Sau thời gian ủ, lấy khối bột ra khỏi tủ ấm, đo chiều cao của khối bột men sau ủ và xác định thể tích của khối bột men sau lên men

2.4 Kiểm tra, đánh giá.

*trước lên men: -ĐC : +ngang :15,6 cm

* chuẩn bị nguyên vật liệu:

- hóa chất : glucose, MgSO4 , KH2PO4 , ( NH4)2SO4

- dụng cụ: 4 ống phancol , pipet , cân phân tích, phân tử

- nguyên liệu: nước cam ( rửa sạch quả cam tươi dưới vòi nước, để khô tự nhiên, vắt lấy

nước, loại bỏ hạt và đem lọc lấy dịch nước cam)

3.2 , Pha chế môi trường lên men.

3.2.1 , Công thức lên men 1 (40ml)

-ống thí nghiệm: 50% nước cam , 20% glucose , nấm men 1%

-ống đối chứng : 50% nước cam , 20% glucose

3.2.2 , Công thức lên men 2 (40ml)

-ống thí nghiệm: 20% glucose , 1g/l MgSO4 , 0.5g/l KH2PO4 , 0.5g/l (NH4)2SO4 , 1% nấmmen.

-ống đối chứng: 20% glucose, 1g/l MgSO4 , 0.5g/l KH2PO4 , 0.5g/l (NH4)2SO4

3.3 Kiểm tra, đánh giá.

Lượng sinh khối nấm men(mg)

* Trước lên men:

*Lượng đường lên men:

-CTTN1: ZĐC = = 3,5196 g ; ZTN = = 4,5030 g-CTTN2: ZĐC = = 0,7011 g ; ZTN = = 1,6654 g

* Cường độ lên men:

Lượng ethanol tạo thành (g)

Hiệu suất lên men theo lý thuyết

Trước lên men (mg) Sau lên men(mg) Lượng đường lên

men (g)

Cường độ lên men(g)

Tn:56331,3

Đc:54304,0Tn:54129,8

Đc: 1,7207Tn: 2,2015

Đc:1,799Tn:2,301

Đc:3,5196Tn:4,5030

Đc:35,196Tn:45,03

Tn:54665,9

Đc:49473,3Tn:53851,7

Đc: 0,3428Tn:0,8142

ĐC:0,358TN:0,851

Đc: 0,7011Tn:1,6654

Đc:7,011Tn:16,654

Bài 4 : QUÁ TRÌNH LÊN MEN LACTIC 4.1 Mục tiêu và yêu cầu

4.2 Kiến thức lý thuyết

4.3 Nội dung thực hành

4.3.1 Chuẩn bị nguyên vật liệu.

-Vật liệu để pha chế môi trường dinh dưỡng cho lên men lactic:sữa(sữa đặc có đường/sữatươi), rau/củ/quả (ví dụ rau cải/củ xu hào/quả đu đủ…)

-Giống vi sinh vật: Nhóm vi khuẩn lactic trong sản phẩm sữa chua thương phẩm và nhóm

vi khuẩn lactic có sẵn trong rau/củ/quả

- Hóa chất: Phenolphthalein 0,5%, NaCl tinh thể, NaOH 0,1N

- Môi trường xác định số lượng vi khuẩn lactic:

- Nguyên liệu: sữa chua, sữa ông thọ, nước cất vô trùng, cốc đong, 2 bình thí nghiệm 500ml.

- Tiến hành:

+Đổ sữa ông thọ vào cốc đong

+Dẫn nước cất vô trùng lên 1000ml , khuấy đều

+Chia ra 2 bình, mỗi bình 500ml.( bình đối chứng:ko cho sữa chua ; bình thí ngiệm: cho nửa hộp sữa chua rồi lắc đều)

- Hình ảnh:

4.3.2.2 Xác định các đặc trưng của quá trình lên men lactic

a) Đánh giá kết quả bằng cảm quan

Sữa

chua Tn:lỏng

Đc:lỏng

Tn:đặchơn banđầu

Đc:phântách lớp

Tn:màutrắngĐc:màutrắng

Tn:trắng

có ánhvàngĐc:vàng

Tn:mùichuanhẹĐc:mùisữa nhẹ

Tn:chuaĐc:chua

tn:chuanhẹđc: ngọtnhẹ

-Hình ảnh thí nghiệm:

+trước lên men

+sau lên men:

b Xác định sự biến đổi về thành phần sinh hóa trong sản phẩm trước và sau lên men

-Dụng cụ và hóa chất:

+bình tam giác

+ống đong

+ống phancol

Hình ảnh sau lên men

*Định lượng axit lactic bằng phương pháp chuẩn độ Therner

- Lấy 10 ml dịch lên men, bổ sung 20 ml nước cất và thêm 1 - 2 giọt phenol phthalein0,5%

- Chuẩn độ bằng NaOH 0,1N đến khi xuất hiện màu hồng nhạt thì dừng lại

=> Trước lên men: +bình TN: 4,2 ml

+bình ĐC: 2,8 ml

=> Sau lên men: +bình TN: 7,4 ml

+bình ĐC: 2,9 ml

Hình ảnh thí nghiệm sau lên men:

-Độ axit trước lên men:

men Sau lên men Trước lên men Sau lên men

trình lên menSữa chua TN:6

ĐC:7

TN:5ĐC:7

TN:0,378ĐC:0,252

TN:0,666ĐC:0,261

TN:0,288ĐC:0,009

Phương pháp pha loãng vi sinh vật:

- Xếp 1 dãy ống nghiệm, mỗi ống nghiệm chứa 9 ml nước cất vô trùng;

- Hút 1 ml cơ chất hoặc cân 1 gam cơ chất (tùy theo cơ chất cần xác định số lượng vi sinhvật là láng hay đặc) cho vào ống nghiệm thứ nhất, lắc đều, có dung dịch cơ chất được phaloãng đến 10-1 lần;

- Dùng pipet vô trùng hút 1 ml dịch ở nồng độ 10-1 cho vào 9 ml nước cất vô trùng ở ống nghiệm thứ hai, lắc đều có nồng độ pha loãng 10-2 ;

- Tiếp tục làm như vậy với các ống nghiệm thứ 3, 4, 5, 6, 7, 8… đến khi có được dãy pha loãng cần thiết để nuôi cấy và xác định số loại vi sinh vật có trong cơ chất và số lượng của chúng

* Tiến hành cấy trải vsv vào môi trường dinh dưỡng cho lên men lactic:

-dụng cụ và thiết bị:

+đĩa petri

+ đũa thủy tinh

+đun môi trường cho đến khi tan,rồi đổ vào đĩa petri, để nguội.

+trước khi cấy thì khử trùng tay và dụng cụ tiến hành cấy như đũa thủy tinh , đĩa petri.+bắt đầu tiến hành dải vi sinh vật lên trên bề mặt môi trường, dùng đũa thủy tinh dàn đều đến khi khô hoàn toàn,sau khi cấy xog thì mọc màng thực phẩm và nuôi trong tủ ấm ở t0

30-350C

- Lưu ý: khi nuôi để đĩa ngược lại ( nắp đĩa ở dưới) để ngăn chặn sự thấm nước,phòng tránh oxy hóa (không khí ko thể dễ dàng tiếp xúc với mt nuôi cấy ,ngăn chặn sự oxy hóa),ngăn chặn hiện tượng ngưng tụ (ngăn chặn sự ngưng tụ của hơi nước từ môi trường nuôi cấy lên lắp đĩa ,sự ngưng tụ này có thể gây ra sự oxy hóa và phá vỡ điều kiện nuôi cấy)

Phương pháp xác định số lƣợng vi sinh vật bằng đếm khuẩn lạc:

-Xác định các đặc trưng về thành phần vi sinh vật thuộc nhóm vi khuẩn lactic trong sản phẩm sữa chua (số loại vi khuẩn lactic và số lượng tế bào vi khuẩn tương ứng với từng loại) Kết quả xử lý và thống kê vào bảng dưới đây:

Ký hiệu vi

sinh vật Hình thái khuẩn lạc Số lượng khuẩn lạc

đếm được

ở nồng độ pha loãng

Số lượng

tế bào(CFU/ml)

Số lượng

tb vi sinhvật tổngsố

Đường kính (mm) Màu sắc Hình dạng 10

-5