Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến nhân giống in vitro cây kim phát tài (Zamioculcas zamiifolia)

TÓM TẮTĐề tài “Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến quá trình nhân giống in vitro cây Kim phát tài Zamioculcas zamiifoliay” được tiên hành nhằm xác định nồng độ tối ưu củ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHAO SÁT ANH HUONG CUA CHAT DIEU HOA SINH TRUONG DEN NHAN GIONG IN VITRO CAY KIM PHAT TAI (Zamioculcas zamiifolia)

Nganh hoc : CONG NGHE SINH HOC

Sinh viên thực hiện : LÊ THỊ MỸ HÀ

Mã số sinh viên : 19126037

Niên khóa : 2019 - 2023

TP Thủ Đức, 08/2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TOT NGHIỆP

KHAO SÁT ANH HUONG CUA CHAT DIEU HÒA

SINH TRUONG DEN NHAN GIONG IN VITRO CAY KIM PHAT TAI (Zamioculcas zamiifolia)

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiệnThS TÔ THỊ NHÃ TRÀM LÊ THỊ MỸ HÀ

TP Thủ Đức, 08/2023

LỜI CẢM ƠN

Có được kết quả như ngày hôm nay, em xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám Hiệu

Trường Dai học Nông Lâm thành phó Hồ Chí Minh, thầy Lê Đình Đôn - cố van học tập

lớp DH19SM đã giúp đỡ hỗ trợ và giải đáp thắc mắc cho chúng em trong quá trình 4

năm học tập ở trường Em xin cảm ơn quý thầy cô khoa Khoa Học Sinh Học đã nhiệttình giảng dạy, truyền đạt những kiến thức quý báu cho em trong quá trình học tập

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô Tô Thị Nhã Trầm, người đã nhiệt tình

hướng dẫn, cung cấp kiến thức và tận tình giải đáp thắc mắc đề em hoàn thành tốt khóa

luận.

Tiếp theo em xin cảm ơn chị Lê Thị Phương đã luôn bên cạnh chia sẻ những khó

khăn cùng em, luôn cung cấp những kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong suốt thời

gian em làm đề tài Em xin cảm ơn tat cả anh chị ở Công ty Cổ phần Công nghệ Sinhhọc Cây giống Việt Nam đã tạo điều kiện và giúp đỡ em trong thời gian em thực hiện

đề tài ở Công ty

Sau cùng, con xin gửi lời cảm ơn đặc đặc biệc đến bố mẹ đã luôn bên cạnh quantâm, lo lắng, tin tưởng và động viên con trong suốt thời gian qua

XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN

Tôi tên Lê Thị Mỹ Hà, MSSV: 19126037, Lớp: DH19SM thuộc ngành Công nghệ

Sinh học Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, xin cam đoan: đây là

Khóa luận tốt nghiệp do bản thân tôi trực tiếp thực hiện, các số liệu và thông tin trong

nghiên cứu là hoàn toàn trung thực và khách quan Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước Hội đông về những cam kết này.

Thành phố Hồ Chi Minh, ngày tháng năm 2023

Người viet cam đoan

ii

TÓM TẮT

Đề tài “Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến quá trình nhân giống

in vitro cây Kim phát tài (Zamioculcas zamiifoliay” được tiên hành nhằm xác định nồng

độ tối ưu của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật cho quá trình hình thành mô seo,phát sinh chdi, và nhân nhanh cụm chồi từ mẫu lá cây Kim phát tài phục vụ cho nhânnhanh giống cây này Các mẫu lá cây Kim phát tài sau khi khử trùng và cắt thành nhữngmảnh có kích thước 1 x 2cm, được nuôi cấy trên môi trường MS (Murashige và Skoog,1962) bé sung 2,4 - D ở các nồng độ khác nhau kết hợp với 1,0 mg/l BA để cảm ứnghình thành mô sẹo Sau 4 tuần nuôi cấy, các mẫu đã hình thành mô sẹo được chuyểnsang môi trường MS b6 sung BA ở các nồng độ khác nhau dé theo dõi sự phát sinh chồi.Sau § tuần nuôi cấy, các mẫu đã hình thành chi được tách thành các chéi đơn và nuôicấy trên môi trường MS bồ sung BA kết hợp với 0,1 mg/l IBA dé tiến hành nhân cụmchéi Kết quả ghi nhận được cho thấy, mẫu mảnh lá cho tỉ lệ hình thành mô sẹo tối ưu

(96,30%) trên môi trường MS bồ sung 1,0 mg/1 BA kết hợp với 1,0 mg/1 2,4 - D Chồi

phát sinh từ nuôi cay mô sẹo mau lá trên môi trường MS bổ sung 1,5 mg/l BA cho tỉ lệtai sinh chồi (90,47%) cao hơn các nghiệm thức còn lại Môi trường MS bổ sung 0,1mg/l IBA kết hợp với 1,5 mg/I BA được dùng dé nhân cụm chồi từ chồi đơn cho kết quảtốt nhất với số lượng chéi trung binh dat 5,15 chỗồi/mẫu và chiều cao trung bình 1,52 cmsau 8 tuần nuôi cấy

Từ khóa: Kim phat tài, Zamioculcas zamiifolia, mô sẹo, chéi, điều hòa sinh trưởng

thực vat, in vitro.

111

Thesis “Effect of growth regulators on in vitro propagation of Zamioculcas zamiifolia” was conducted to determine the optimal concentrations of plant growth regulators for callus induction, shoot induction, and shoots multiplication from leaf explants After sterilization, leaf explants were cut into small pieces sized 1 x 2 cm and cultured on MS medium (Murashige and Skoog, 1962) supplemented with 2,4 - D combined with 1.0 mg/l BA to investigate callus induction After 4 weeks of culture, callus were transferred

to shoot induction MS medium supplemented with BA at different concentrations After

8 weeks of culture, shoot samples were transferred to MS medium supplemented with

BA combined with 0.1 mg/l IBA to investigate shoot multiplication.

The results showed that leaf explants gave the optimal callus induction rate (96.30%)

on MS medium supplemented with 1.0 mg/l BA and 1.0 mg/l 2,4 — D Shoots formed from callus culture of leaf explants on MS medium supplemented with 1.5 mg/l BA gave a higher rate of shoot regeneration (90.47%) than other treatments The best effect was obtained on MS medium supplemented with 1.5 mg/l BA and 0.1 mg/l IBA with 5.15 shoots/sample, shoot height 1.52 cm after 8 weeks of culture.

Key words: Zamioculcas zamiifolia, callus induction, shoot induction, shoots multiplication, plant growth regulators, in vitro.

iv

CHƯƠNG 1 MỞ DAU 0ieecseccsesscssssssssssessessssssesssessesseessessesssssusssesssssuessessessessesssecsessuesees |LTLET bú mí ngang ynorrattbtlotiatoisdt r0 AGignnyease 1

1.2 Mục tiêu đề tai sec cccccceccccccccccccessesececssssvcscssesecsesscsecsesseevssesssstssesessesesevarseessseeseeeeens 2

1.3 N61 dung thurc W160 oo 2,

CHƯƠNG 2 TONG QUAN TÀI LIỆU - 2-2-2 ©5222E++2E22EE£2ES22EEz22zzzzzzrez 3

2.1 Tông quan về cây Kim phat tải - -2- 52 SS SS92E2E22152121121121121121121211121 2 c0 3

2.1.1 Vi trí phan loại của cây Kim plata vz ccs s6 6x6 5101616 816525613686 0x16 iu H0 memaaevene 3

2.1.2 Nguồn gốc và phân bố cây Kim phát tài - 2252 s+2szzxszsezsezxezsszse-s-e32.1.3 Đặc điểm hình thái và điều kiện phát triển của cây Kim phát tài 3

2A Ar Cả, TEL CUS: GAY Ki DHẩ LẪI sss-ecsccssssiees635116 10636630 535g 1ö sg8 ientntnnaeestennte sake 288002551844 4

2.2 Phương pháp nuôi cây mô tế bảo thực vật . 2 2+©22+22++22++2z+szzrszxrsrrree 52.2.1 Nhân giống iff Vitro cccccccecceccsssecsessessessesseesessecsessessesseeseesessessesseesessessessessesseesesseees 52.2.2 Các giai đoạn nuôi cấy i ViITO cccccccecccsesssesssesssesssesssessisessesssessesesssseesseseseesteseees 52.2.3 Các yêu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy M6 eeeeeceeeeceeseeeeeeeee 62.2.4 Vai trò của chất điều hòa sinh trưởng trong nuôi cấy mô 2- 2 22 252 82.2.5 Nuôi CAY WG BGO du sen HH Han gu Tá 140131111101530861012101130161318160060 036 112.3 Một số nghiên cứu liên quan đến cây Kim phat tài 2: 22©52222+25z2zz+zz2 12

2:3-1.-ÌNghiÊh CHU HưỚG DEOL sespeesssessssssseiA206118120133355058550556363305614362850043304136933 90191807898 12 2.3.2 Nghién cttu 8À 40 011 14

CHƯƠNG 3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP - -22-©2252++czssczcee 16

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên CU oo ccccccecceecseessessessecseessesseceteesesseessessesseesseens 16

Se V at WCU ïï8HIST1/GWDömesannsndsninidiniteBdocEiVESSoES030050G898GGBA1GGGSS S.CRMEHSDSHIGDIS019010900093910048H0/280038 16

3.2.1 Đối tượng nghiên COU ccc ceccecceessesseessecsesssessesseessessesssessesssessessesssessesaseeseeseesees 16

3.2.2 Trang thiết bị và dụng cụ 2¿©2¿52222+22E22E22E1221231221 2211221221212 2E crev 163.2.3 Môi trường và điều kiện nuôi cấy -¿-5222222222222EE22E222222122222xe 17

3.3 Phương: pháp tie biG GỨỮUcsssssctssgssessssxg5)13546480163365956989303.8554690380912500008 163 50g 4.428580530 18

3.3.1 Khử trùng mẫu cấy - 2 ©2222221221122122112112211211211211211211 2121111 ye 183.3.2 Khao sát tác động của 2,4 - D đến khả năng hình thành mô seo từ lá cây Kim

i A P 20

3.3.4 Khao sát tác động của BA đến khả năng nhân cụm chổi của cây Kim phat tải 213.4 Phuong phap 0.017 101 1 -i1 22

CHƯƠNG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN 2 2-©2222E+2E22EE+EE2EE2EEerErrxeer 23

4.1 Sự hình thành mô sẹo dưới tác động của nồng độ 2,4 - D -: - 23

4.2 Sự phát sinh chéi từ mô sẹo dưới tác động của nồng độ BA 29

4.3 Nhân cum chồi dưới tác động của nồng độ BA -. .-34

CHUONG 5 KET LUẬN VÀ DE NGHỊ, 2 2+s2S2+E22E2EE2E22EEE12E12121222 212 ce, 40

Sf a 40

TÀI LIEU THAM KHAO o.oo ccccccccssesseessesssessessesssessessessesssssesstsasessessesstessessesssesseeaseess Al

PHU LLỤC 2: 22222222222E222212221122112111211211211211211211111211111212211211 1 re 44

vi

DANH MUC TU VIET TAT

: 6 - (-y, -rdimethylallylamino) purine : 2,4 - Dichlorophenoxyacetic acid : 2,4,5 - Trichlorophenoxyacetic acid : 6 - benzyladenine

: 6 - benzylaminopurine : Cộng tác viên

: Lethal Concentration 50 (NÑ éng độ gay chét 50%): Hệ số biến động (Correlation of Variance)

: Đối chứng

: Ethylenediaminetetraacetic acid : Indole - 3 - acetic acid

: Indole - 3 - butyric acid : Kinetin

: Murashige va Skoog, 1962 : a - Naphthaleneacetic acid : Ozon

: Thiziazuron

Vil

DANH SÁCH CÁC BANG

Bang 3.1 Thành phần môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) : “17

Bảng 3.2 Khảo sát sự hình thành mô sẹo từ mẫu lá cây Kim phát tải - 19

Bảng 3.3 Khảo sát sự phát sinh chỗồi từ mô sẹo mẫu lá cây Kim phát tài 20

Bảng 3.4 Khảo sát sự nhân ch6i dưới tác động của BA +-c +cccccee 21 Bảng 4.1 Tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo sau 2 D0008) 88 24

Bảng 4.2 Tác động của 2.4 - D đến hình thái mô sẹo sau 2 tuần nuôi cấy 25

Bảng 4.3 Tỉ lệ mẫu tao mô seo sau 4 tuần nuôi cay ee eee 26 Bang 4.4 Tác động của 2,4 - D đến hình thai mô sẹo sau 4 tuần nuôi cấy 27

Bang 4.5 Tí lệ mẫu hình thành chồi từ mô sẹo sau 4 tuần nuôi cấy 30

Bảng 4.6 Tác động của BA đến khả năng hình thành chồi từ mô sẹo sau 4 tuan 31

Bảng 4.7 Tỉ lệ mẫu hình thành chi từ mô sẹo sau 8 tuần nuôi cấy 32

Bang 4.8 Tác động của BA đến khả năng hình thành chổi từ mô sẹo sau 8 tuần 32

Bang 4.9 Tác động của BA đến nhân cụm chồi sau 4 tuần nuôi cấy - 34

Bang 4.10 Tác động của BA đến hình thái cụm chỗi sau 4 tuần nuôi cấy 35

Bang 4.11 Tác động của BA đến nhân cụm chồi sau 8 tuần nuôi cấy 36

Bảng 4.12 Tác động của BA đến hình thái cụm chéi sau 8 tuần nuôi cấy 37

Vill

Hình 2.1.

Hình 2.2.

Hình 2.3.

Hình 3.1.

Hình 4.1.

Hình 4.2.

Hình 4.3.

Hình 4.4.

Hình 4.5.

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang Cây Kim phát tai (Zamioculcas Zam11fỌ14) - 55555 s+ss+ss+ssxsssseesseeỞ

Hình thái thân và hoa cây Kim phát tai (a) Thân cây, (b), (c) Hoa 4

Hình thái lá cây Kim phat tải 5 5-5222 2+ ++ssErsrrerrrrrrrrrrrrrrrrrrrrree 4 Mẫu lá Kim phát tài dùng làm vật liệu nuơi cấy - 2 2 5z2sz25z+: 16 M6 sẹo hình thành từ mẫu lá sau 2 tuần nuơi cấy trên các nghiệm thức 26

Mơ sẹo hình thành từ mẫu lá sau 4 tuần nuơi cấy trên các nghiệm thức 28

Chỗi hình thành từ mơ sẹo sau 8 tuần nuơi cấy trên các nghiệm thite .33

Cụm chổi mới hình thành sau 4 tuần nuơi cấy trên các nghiệm thức 36

Cụm chéi mới hình thành sau 8 tuần nuơi cấy trên các nghiệm thite 38

1X

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Cây Kim phát tài (Zamioculcas zamiifolia), hay có tên gọi khác là cây kim tiềnthuộc họ Ráy (Araceae), là loài duy nhất trong chi Zamioculcas - một trong những loạicây cảnh đang được ưa chuộng hiện nay Với vẻ ngoài độc đáo, có thể tồn tại trong điềukiện môi trường khô hạn, chịu được ánh sáng và lượng nước thấp, cây Kim phát tài đãtrở thành một loài cây cảnh phố biến dùng trang trí nội that trong những năm gan đây

Theo tạp chi Water, Air and Soil Pollution (2013), cây Kim phát tai có khả năng thanh

loc không khí, giúp không khí trong lành gấp 3 lần so với cây lưỡi hồ Cây cũng có kha

năng loại bỏ các khí độc hại như xylene, etylbenzen, benzen, toluene, cacbon dioxide Theo Ecotoxicology and Enviromental Safety (2019), cây còn có kha năng làm giảm 6

nhiễm tang ozon trên trái đất Ngoài ra, cây Kim phat tài con mang ý nghĩa phong thủy,thu hút tài lộc, mang đến may mắn cho gia chủ Chính vì những lí do đó Kim phát tài

được xem là một loại cây cảnh mang giá trị kinh tẾ cao

Từ trước đến nay, Kim phát tài được nhân giống chủ yếu bằng phương pháp tách

bụi hoặc giâm lá Tuy nhiên, với phương pháp nhân giống này phải tách cây từ một cụmcây lớn cần sự khéo léo, dé làm hư hỏng những cây còn lại Hơn nữa, phương pháp nàycho hệ số nhân thấp, không đồng đều, tốn thời gian và công sức, đồng thời cây giống dễ

bị nhiễm bệnh, không đáp ứng được nhu cầu cho thị trường Ngoài ra, Seneviratne va

cộng tác viên (2013) đã thực hiện nghiên cứu phương pháp giâm cảnh cây Kim phát tài

trong môi trường dinh dưỡng lỏng, kết quả là tốc độ tăng trưởng của cây tăng lên đáng

kể so với phương pháp giâm cành thông thường khi được nuôi trồng trong môi trường

chat lỏng có bổ sung phân hữu cơ và cát Tuy nhiên, một khó khăn khác khi thực hiện

phương pháp này đó là phải tim ra một giá thé phù hợp dé đưa cây ra vườn ươm dé câytiếp tục sinh trưởng và phát triển Để khắc phục các yếu điểm trên của phương phápnhân giống trên, phương pháp nuôi cấy mô in vitro là một trong phương pháp hữu hiệunhất hiện nay Đây là một phương pháp tiên tiến đã được ứng dụng thảnh công trên thếgiới và Việt Nam, đem lại hiệu quả kinh tế cao cho hàng loạt cây trồng khác nhau Năm

2007, Vanzie và Leonhardt đã nghiên cứu một quy trình tối ưu để tái sinh cây con

Zamioculcas zamiifolia bang phương pháp nuôi cây mô, ket quả là các cây nuôi cây mô

đều bén rễ và phát triển bình thường sau khi đưa ra nhà kính đưới 70% bóng râm Một

nghiên cứu khác của Papafotiou va Martini (2009), đã tạo ra những cây con Zamioculcas

zamiifolia in vitro hoàn chỉnh và có tỉ lệ sông từ 80% đến 100% sau khi đưa ra ngoài

Vườn ươm.

Xuất phát từ những vấn đề mang tính thực tiễn trên, đề tài “Khảo sát ảnh hưởngcủa chất điều hòa sinh trưởng đến nhân giống in vitro cây Kim phát tài ” được thực hiệnnhằm đây mạnh nghiên cứu dé xây dựng quy trình tốt nhất trong nhân giống in vitro

phục vụ cho nhu cầu phát triển sản xuất loài cây cảnh có giá trị này

1.2 Mục tiêu đề tài

Xây dựng được quy trình nhân giống in vitro cây Kim phát tài

1.3 Nội dung thực hiện

Khảo sát tác động của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật 2.4 - D kết hợpvới 1,0 mg/l BA đến khả năng hình thành mô sẹo

Khảo sát tác động của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật BA đến khả năng

phát sinh chỗồi từ mô sẹo

Khảo sát tác động của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật BA kết hợp với

0,1 mg/l IBA dén kha năng nhân nhanh cụm chéi

CHƯƠNG 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Tống quan về cây Kim phát tài

2.1.1 Vị trí phần loại của cây Kim phát tài

Giới Plantae

Bộ Alismatales

Họ Araceae

Chi Zamioculcas

ima ZA „Hai Hình 2.1 Cây Kim phát tài

Danh pháp 2 phân: Zamioculcas zamiifolia (Zamioculcas zamiifolia)

2.1.2 Nguồn gốc và phân bố cây Kim phát tài

Zamioculcas zamiifolia được phát hiện vào năm 1905, là loài cây nhiệt đới lâu năm

có nguồn gốc từ Đông Phi (Lopezet và ctv, 2009) Florida là nơi đầu tiên sản xuất quy

mô lớn Zamioculcas zamiifolia làm cây cảnh vào năm 1999 (Harrison, 2009) và kế từ

đó nổi lên như một loài cây quan trọng cho cảnh quan nội that cũng như cây trang trí lễ

hội Zamioculcas zamiifolia được tim thay ở cả các đồng cỏ khô hoặc đất rừng thấp, trênđịa hình nhiều đá, ít bóng ram (Mayoet và ctv, 1998)

Ở Việt Nam, Kim phát tài đã được nhập và trồng nhiều ở khắp nơi phục vụ cho

nhu cau cây cảnh của thị trường trong nước và xuất khẩu

2.1.3 Đặc điểm hình thái và điều kiện phát triển của cây Kim phát tài

Cây Kim phát tài mọc ra từ gốc và khi lớn sẽ tạo thành cụm, là thực vật thân thảo,

rễ chùm, thuộc ho Ray, có tuổi thọ cao Thân cây ngắn, chắc khỏe và mong nước, gốccây phình to, nhờ vào đặc điểm này cây có khả năng sống tốt trong môi trường thiếunước Cuống lá dài, mọc thăng, nhiêu thịt, phình to ở gốc, có màu xanh xám nhạt hoặcmàu xanh đậm Lá cây thuộc loại lá kép, vươn thắng và xòe đều, cân đối về cả 2 bên,mọc trực tiếp từ thân Lá khá dày và có màu xanh mướt hoặc mau xanh có sọc vàng

hoặc đỏ, đen, lá nhẫn bóng, có hình elip hoặc mũi mác Cây Kim phát tài có hoa nhưng

rất hiếm, hoa chỉ nở khi đáp ứng đủ các điều kiện ánh sáng, dinh dưỡng, nhiệt độ, khi rahoa hoa có mảu trắng hình trụ, mọc từ gốc lên, nếp hoa uốn lượn, thời gian nở hoa kéodai từ 3 đến 4 ngày sau đó chuyền dan sang mau ngả vàng và tan

Hình 2.2 Hình thai thân và hoa cây Kim phát tài (a) Thân cây, (b), (c) Hoa.

(hitps://www.houseplantsexpert.com/zz-plant.html)

Hình 2.3 Hình thai lá cây Kim phát tai.

Cây Kim phát tài chứa hàm lượng nước cao trong lá (91%) và cuống lá (95%), cótuổi thọ của từng lá ít nhất là sáu tháng, đó có thé là lý do nó có thé tồn tại cực kỳ tốttrong điều kiện ánh sáng yếu trong bốn tháng không có nước (Chen và Henny, 2003).Theo Chenet và cộng tác viên (2004), cây Kim phát tài có thé sống trong điều kiện môitrường khô can và không cần tưới quá nhiều nước, sinh trưởng ở nhiệt độ trên 15°C,tăng trưởng tốt nhất từ 18°C đến 26°C và với độ 4m tương đối từ 50% đến 95%

2.1.4 Giá trị của cay Kim phát tài

Cây Kim phát tài được xem là loài cây mang lại nhiều tác dụng đối với sức khỏengoài tác dụng làm trang trí cho không gian, nội thất Theo Sriprapat và cộng tác viên

(2014), cây Kim phat tài có kha năng thanh lọc không khí, loại bỏ các khí độc hại trong

không khí gây hại đến sức khỏe con người như khả năng loại bỏ khí xylene cao nhất

trong 15 loài nghiên cứu và các khí khác như etylbenzen, benzen, toluene, cacbon đioxide Theo Pheomphun và cộng tác viên (2019), cây còn có khả năng làm giảm ô

nhiễm tầng ozon trên trái đất Hơn nữa, Le Moullec và cộng tác viên (2015) đã thu đượccác chất chuyên hóa thứ cấp từ dịch chiết lá của Kim phát tài bao gồm axit phenolic,

phenylpropanoids và flavonoid Trong lĩnh vực y tế, các hoạt chất sinh học thu được có

ứng dụng day hứa hen trong được ly ung thư đã được ghi nhận, đó là các chất chiết xuấtđược từ rễ của cây Kim phát tài do tác dụng chống oxy hóa bao gồm steroid, triterpenoid,

flavonoid va polyphenolic (Muharini và ctv, 2018).

Ngoài ra, ở Việt Nam cây Kim phát tài con mang ý nghĩa phong thủy tốt đẹp Day

là loài cây biểu tượng cho sự giàu sang, mang lại tiền tài và phú quý

2.2 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.2.1 Nhân giống in vitro

Nhân giống in vitro hay nuôi cấy mô là hình thức nuôi cấy vô trùng của tế bào, mô,

bộ phận và các thành phần khác của thực vật dưới điều kiện lý hóa xác định, là một công

cụ quan trọng không chỉ dựa trên nghiên cứu cơ bản ma còn ứng dụng cả thực tiễn vào

thương mại Ưu điểm của phương pháp này là tiết kiệm thời gian và diện tích, giảm chi

phí sản xuất, hệ số nhân giống cao, đồng nhất, tạo cây giống sạch bệnh, có thể nhângiống các loài mà phương pháp tự nhiên không thực hiện được Nhờ áp dụng kĩ thuật

nuôi cay mô, con người đã thúc đây thực vật sinh sản nhanh hon gap nhiều lần tốc độ

vốn có trong tự nhiên Do đó, tạo ra hàng loạt cá thé mới giữ nguyên tính trạng di truyềncủa cơ thể mẹ, làm rút ngắn thời gian đưa giống mới vào sản xuất Hơn nữa, dựa vào kĩthuật nuôi cấy mô có thể duy trì và bảo quản cây trồng quý hiếm (Nguyễn Đức Lượng

và Lê Thị Thủy Tiên, 2016).

Nuôi cấy mô và tế bào thực vật cho đến nay được chứng minh là phương phápnghiên cứu quá trình hình thành cơ quan hiệu quả nhất Năm 1939, nghiên cứu quá tìnhhình thành cơ quan trên sự hình thành chồi và rễ (White và Nobercourt, 1939) va cáckết quả nghiên cứu về sự tác động của các nhân tố bên trong và bên ngoài ảnh hưởngđến quá trình hình thành cơ quan (Brown và Thorpe, 1986)

2.2.2 Các giai đoạn nuôi cấy in vitro

Theo Tran Thi Dung (2003), sự thành công của nhân giống in vitro chỉ đạt được

khi trải qua 5 giai đoạn.

Giai đoạn 1 là chuẩn bị vật liệu nuôi cấy Việc chọn vật liệu nuôi cấy là bước đầutiên quyết định sự thành công của cả quá trình Tất cả các cơ quan và mô đều có khảnăng sử dụng làm vật liệu nuối cấy và các loại tế bào, mô khác nhau thì có mức độ thànhcông trong nuôi cay khác nhau Những mau đốt thân non có nhiều nhu mô phân sinhnên khả năng tạo chỗồi cao, mẫu quá già có khả năng tái sinh chậm hon mẫu non, nhưng

5

mẫu non lại dễ bị chết sau quá trình khử trùng Do đó, việc lựa chọn vật liệu ban đầu rấtquan trọng, không nên chọn mẫu quá non hoặc quá già, cây trồng được chọn làm vậtliệu gốc cần được cách ly 2 - 3 ngày dé hạn chế tối đa các tác nhân gây nhiễm.

Giai đoạn 2 là khử trùng mô mẫu cay Đây là giai đoạn quan trọng quyết định toàn

bộ quá trình nhân giống in vitro Mục dich của giai đoạn này là phải tao ra được nguyênliệu ban đầu vô trùng để đưa vào môi trường nuôi cấy Nếu điều kiện này không được

đảm bao mẫu cấy sẽ bị nhiễm nam, nhiễm khuan dẫn đến mô nuôi cấy bị chết hoặc phátsinh mầm bệnh dẫn đến mọi giai đoạn của thí nghiệm sau sẽ bị ngừng trệ ảnh hưởng đến

quá trình nghiên cứu và sản xuất

Giai đoạn 3 là nhân nhanh chdi Giai đoạn này được xem là giai đoạn then chốt củaquá trình Để tăng hệ số nhân người ta thường đưa thêm vào môi trường dinh dưỡngnhân tạo các chất điều hòa sinh trưởng (auxin, cytokinin, gibberellin), các chất bổ sung

khác như nước dừa, dịch chiết nắm men kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích

hợp Tùy thuộc vào từng đối tượng nuôi cấy, người ta có thể nhân nhanh bằng cách kích

thích sự hình thành qua các cụm chồi (nhân cụm chồi) hay kích thích sự phát triển của

các chồi nách (vi giâm cành) hoặc thông qua việc tạo cây từ phôi vô tính

Giai đoạn 4 là tạo cây hoàn chỉnh Khi đạt được kích thước nhất định, các chéi

được chuyền từ môi trường ở giai đoạn 3 sang môi trường tạo rễ Thường 2 đến 3 tuầncác chéi riêng lẻ này sẽ xuất hiện rễ vào tạo thành cây con hoàn chỉnh Ở giai đoạn nàythường bé sung vào môi trường cấy các chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin lànhóm chất hormone thực vật quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy

Giai đoạn 5 là đưa cây con ra đất Day là bước cuối cùng của nhân giống in vitro

và là bước quyết định khả năng ứng dụng của quá trình nảy trong thực tiễn sản xuất.Đây cũng là giai đoạn khó khăn nhất trong nhân giống in vitro Khi đưa ra vườn ươm,cây con in vitro sẽ chuyên từ trạng thái sống di dưỡng sang sống hoàn toàn tự dưỡng với

điều kiện tự nhiên khác biệt Do đó, cây con sẽ rất đễ bị héo vì sự mất nước Đề tránh

tình trạng này vườn ươm phải có cường độ chiếu sáng, nhiệt độ không khí thấp, độ âmcao và được duy trì thường xuyên Cây con thường được xử lí với chất kích thích ra rễbằng cách ngâm hoặc phun lên lá dé rút ngắn thời gian ra rễ

2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô

Mô muôi cay, theo lý thuyết tất cả các mô chưa hóa gỗ đang sinh trưởng mạnh như

mô phân sinh ngọn, tượng tầng, dầu rễ, phôi đang phát triển, thịt quả non khi đặt vào

6

môi trường có chứa một lượng hormone thích hợp đều có khả năng tạo mô sẹo Tuynhiên, mỗi tế bào ở mỗi mô khác nhau có khả năng tạo mô sẹo, phân hóa thành rễ, thân,cành, lá rất khác nhau Do đó kết quả thu được cũng rất khác nhau ở những mẫu khi đưavào nuôi cấy Việc chọn mẫu thực vật dé sử dụng trong quá trình nuôi cấy có vai trò

quyết định, nếu chọn sai mẫu chúng ta sẽ không thu nhận được kết quả, hoặc thu được

những cây sẽ không phát triển mạnh, thậm chí cây có thể ngưng phát triển ở một giai

đoạn nhất định (Nguyễn Đức Lượng, 2002)

Vô trùng trong nuôi cấy, môi trường nuôi cấy mô thực vật có chứa đường, muối

khoáng và vitamine thích hợp cho các loài nam, vi khuẩn phát triển Dé dam bảo điềukiện vô trùng trong quá trình nuôi cấy đòi hỏi chúng ta phải thực hiện các yêu cầu như

vô trùng mô cấy, vô trùng dụng cụ thủy tinh, môi trường và nút đậy, vô trùng trong thaotác nuôi cấy cần phải tránh làm rơi nam, khuẩn lên bề mặt môi trường nuôi cấy Phươngpháp vô trùng mẫu cấy phô biến hiện nay là dùng các chất hóa học có hoạt tính diét nam,khuẩn Hiệu lực diệt nắm, khuẩn của các chất này phụ thuộc vào thời gian xử lý, nồng

độ và khả năng xâm nhập của chúng trên bề mặt mô cấy Các chất kháng sinh ít được

sử dung vì tác dụng không triệt dé và ảnh hưởng xấu lên sự sinh trưởng của mô cấy.Ngoài ra, người ta còn sử dụng các chất làm giảm sức căng bề mặt như tween 80, dungdịch điệt nắm, khuẩn (Ngô Xuân Bình, 2009)

Điều kiện nuôi cấy như ánh sáng, sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy chịu ảnh

hưởng từ các yếu tố thời gian chiếu sáng, cường độ chiếu sáng và chất lượng ánh sáng.Thời gian chiếu sáng tác động đến quá trình phát triển của mô nuôi cấy, thời gian thíchhợp với đa số các loài cây là 12 đến 18 giờ/ngày Cường độ chiếu sang tác động đến sựphát sinh hình thái của mô nuôi cấy, cường độ chiếu sáng cao kích thích sự tạo chồi.Ngoài ra, chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng tới sự phát sinh hình thái của mô thực

vật in vitro: anh sáng đỏ làm tăng chiều cao của thân chéi hơn so với ánh sáng trang

Nếu mô nuôi cấy trong ánh sáng xanh thì sẽ ức chế vươn cao nhưng lại có ảnh hưởngtốt tới sự sinh trưởng của mô sẹo Ngoài ra, nhiệt độ và không khí cũng ảnh hưởng sâusắc đến sự sinh trưởng và phát triển của cây in vitro qua các tiến trình sinh lý như hôhấp, hình thành các tế bào và cơ quan Nhiệt độ thích hợp cho quá trình nuôi cấy tế bào

là 20°C đến 27°C Tuy nhiên, nhiều đề nghị cho rằng nên tránh nhiệt độ cao bởi vì nhiệt

độ cao có thé làm cho kha năng kích thích tạo chồi của của cytokinin giảm (Trần Van

Minh, 2004) Các chất khí có tác động lên sự phát triển chéi trong nuôi cấy in vitro bao

gồm oxy, carbon dioxide va ethylene

Môi trường nuôi cấy phải có day đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phân chia,phân hóa tế bào cũng như sự sinh trưởng bình thường của cây Trong tất cả các môi

trường nuôi cấy đều bao gồm năm thành phần chính sau đây: các muối khoáng đa lượng,

muối khoáng vi lượng, đường, các chất điều hòa sinh trưởng Ngoài ra, người ta còn bổsung thêm một số chất hữu cơ có thành phần xác định như acid amin, EDTA, hoặc khôngxác định như nước dừa, dịch chiết nắm men vào trong môi trường tùy theo nhu cầu riêngcủa từng đối tượng nuôi cấy

2.2.4 Vai trò của chất điều hòa sinh trưởng trong nuôi cấy mô

Chat điều hoà sinh trưởng là những chất với liều lượng thấp hiệu ứng sinh học cao,

được tổng hợp tại một cơ quan và gây ảnh hưởng điều tiết đến các quá trình sinh lý, traođổi chat nào đó trong những cơ quan khác Chất điều hoà sinh trưởng đóng vai trò chủ

đạo trong quá trình sinh trưởng, phát triển và những quá trình sinh lý, hoá sinh kháccũng như trong phản ứng thích nghỉ của thực vật đối với điều kiện của môi trường (BùiTrang Việt, 2000) Chất điều hòa sinh trưởng thực vật bao gồm 5 nhóm (auxin, cytokinin,gibberellin, ethylen, abscisic acid) Hai nhóm điều hòa sinh trưởng thường được sử dụngtrong nuôi cay mô thực vật:

e Nhóm chất điều hòa sinh trưởng auxin

Là hormone sinh trưởng do Went và Thimann (1937) phát hiện Auxin là yếu tố

quan trong trong sự phat sinh hình thái thực vật Auxin có ảnh hưởng khác nhau trong các giai đoạn khác nhau của quá trình phát sinh phôi cũng như sự phát sinh cơ quan.

Nồng độ auxin trong tế bao mô được điều khiến bởi tốc độ sinh tổng hợp, trạng thái hoạt

động và sự vận chuyền, trong khi khả năng đáp ứng với auxin của tế bào hay mô đượcxác định bởi hàm lượng và hoạt động của con đường truyền tín hiệu (Hobbie, 2007).Môi trường nuôi cấy thường được bé sung các loại auxin khác nhau như: indole -

3 - acetic acid (IAA), a - Naphthyl acetic acid (NAA), 2,4 — Dichlorophenoxyacetic acid (2,4 - D), indole - 3 - butyric acid (IBA) Trong đó, IAA là auxin tự nhiên có trong mô thực vật, con lại là các auxin nhân tao Cac auxin nhân tạo thường có hoạt tính mạnh

hơn, do cấu trúc phân tử khá bền vững nên auxin nhân tạo ít bị oxi hóa bởi các enzyme.Auxm có tác dụng tích cực đến quá trình sinh trưởng của tế bào, hoạt động củatầng phát sinh, sự hình thành rễ, hiện tượng ưu thế ngọn, tính hướng của thực vật, sự

8

sinh trưởng của quả và tạo ra quả không hạt, kích thích sự sinh trưởng giãn của tế bảo,

đặc biệc theo chiều ngang làm tế bào phình ra Hiệu quả đặc trưng của auxin là tác động

lên sự giãn của thành tế bào Bên cạnh đó, auxin còn ảnh hưởng đến sự phân chia tế bào.Tuy nhiên sự ảnh hưởng của auxin lên sự giãn và phân chia tế bào trong các mối tácđộng hỗ trợ với các phytohormone khác (gibberellin, cytokinin) (Ngô Xuân Bình, 2009)

Tác động cua auxin trong nuôi cấy mô tế bào thay đổi tùy theo loài va tùy thuộc

vào nồng độ hiện diện các chất điều hòa sinh trưởng thực vật Auxin thường được bésung vào môi trường nuôi cấy để cảm ứng tạo mô sẹo từ mẫu cấy, loại chất điều hòa

sinh trưởng auxin được sử dụng cho mục đích này là 2,4 - D, nhưng nếu tiếp tục duy trì

mô seo trọng môi trường chứa 2,4 - D thì tế bao dé bị đột biến Auxin ảnh hưởng đến sựphát sinh hình thái (trên sự tao chỗi và rễ) Sự tạo chỗồi và rễ từ mô sẹo đòi hỏi cần phải

có sự điều chỉnh lại nồng độ auxin và cytokinin cảm ứng ban đầu Khi nồng độ nhómchất điều hòa sinh trưởng cytokinin cao hơn nhóm chất điều hòa sinh trưởng auxin thì

sẽ có sự tạo chồi từ mẫu cấy Ngược lại, khi nồng độ chất điều hòa sinh trưởng auxincao hơn nhóm chất điều hòa sinh trưởng cytokinin thì rễ được hình thành (Nguyễn Đức

Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2011).

e Nhóm chất điều hòa sinh trưởng cytokinin

Cytokinin được Skoog và Miller khám phá năm 1950 trên sự phân chia tế bảo môlõi thuốc lá Phan lớn là dan xuất của purine La hormone liên quan chủ yếu đến sự phânchia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi Các cytokinin thường được sửdụng nhất là BAP hoặc BA, kinetin, zeatin, 2 - iP Trong đó zeatin va 2 - iP là cáccytokinin tự nhiên, BA và kinetin là các cytokinin nhân tạo Ở nồng độ cao cytokininkích thích rõ rệt sự hình thành chồi bat định, đồng thời ức chế mạnh mẽ sự tạo rễ

Nhóm chất điều hòa sinh trưởng cytokinin ngăn cản sự lão hóa, kích thích sự trưởngthành của diệp lạp và là nhân tố chính điều khiển quá trình tái sinh mạch giúp cho sựtạo chồi (Taiz và Zeiger, 2002) Khi kết hợp với các chất trong nhóm chat điều hòa sinh

trưởng auxin thì cytokinin có tác dụng kích thích sự phân chia tế bào, điều khiến sự phát

sinh hình thái Khi được bổ sung vào môi trường nuôi cấy chéi thì những hợp chất này

pha vỡ trạng thái ngủ của chỗồi ngọn và kích thích sự hoạt động của các chéi bên

Hiệu quả sinh lý đặc trưng nhất của cytokinin đối với thực vật là kích thích sự phânchia tế bào mạnh mẽ Có được hiệu quả nay là do cytokinin hoạt hóa mạnh mẽ sự tông

hợp axit nucleic va protein Cytokinin có khả năng kim hãm sự gia hóa của co quan và

9

của cây nguyên ven Chang han, một lá bị ngắt khỏi cây thì chúng biểu hiện đặc trưng

bằng sự giảm hàm lượng clorophin và sẽ hóa vàng, làm giảm hàm lượng của protein vàaxit nucleic Nếu như lá tách rời được xử lí cytokinin thì duy trì được hàm lượng protein

và clorophm trong thời gian lâu hon và duy trì được màu xanh lâu hơn Cytokinin trong

một số trường hợp anh hưởng lên sự nay mam của hạt và củ Vì vậy nếu xử lí cytokinin

cũng có thé phá bỏ trạng thái ngủ của hạt, củ, chồi (Ngô Xuân Binh, 2009)

Tác động của cytokinin trong nuôi cấy mô tế bào thay đối tùy theo loài và nồng độhiện diện các chất điều hòa sinh trưởng thực vật Đối với cam ứng tạo mô sẹo, cytokiningiúp quá trình tạo sẹo hình thành nhanh hơn, sử dụng auxin kết hợp với cytokinin giúptạo chồi, dùng cytokinin ở nồng độ thấp (0,01 mg/l) kết hợp với auxin từ 1,0 đến 5,0mg/l có thé kích thích tạo rễ (Rogosie và ctv, 2006) Ở nồng độ cytokinin cao sẽ đưa

đến kết quả là tạo thành các cụm chồi Số lượng chỗi hình thành tùy thuộc vào nồng độ

cytokinin Tuy nhiên cũng có những bắt lợi nhất định trong việc điều chỉnh nồng độ đềcảm ứng tạo nhiều chéi, chéi được tạo ra trở nên nhỏ, không thé kéo dài đến một kíchthước nhất định dé có thé tách ra được cho hình thành rễ, và tạo ra những lá bất thường.Cytokinin ở nồng độ thấp kích thích sự phát triển chồi nách Nồng độ cao hơn sẽ cảm

ứng hình thành chéi bất định nhưng chi rất khó ra rễ (Edwin, 1996)

Cytokinin cần cho giai đoạn cảm ứng tạo chồi nhưng kim hãm sự kéo dài của chồi.Những vấn đề này có thể khắc phục bằng cách giảm nồng độ chất điều hòa sau một hoặcvai lần cây chuyền để chồi được phát triển tốt nhất (Edwin, 1996) Cytokinin riêng lẻcũng đã được dùng như nhân tố cảm ứng cho sự hình thành phôi ở một số loài thực vật

e Sự kết hợp giữa auxin va cytokinin trong nuôi cấy in vitro

Sự kết hợp giữa auxin và cytokinin trong môi trường nuôi cấy với tỉ lệ nhất định

có vai trò trong sự biệt hóa tạo mô sẹo, hình thành cơ quan chồi, rễ cho từng loại thựcvật nhất định Auxin có thể ảnh hưởng lên hoạt động cua cytokinin trong tế bào bằngcách điều hòa xuôi trong quá trình tổng hợp hoặc phát huy sự thoái hóa cytokinin (Kiss

và ctv, 1992).

Skoog và Miller (1965) chứng minh khúc cắt lõi hay mô sẹo thuốc lá tạo rễ hay

chi tùy theo tỉ lệ auxin/cytokinin (A/C) trong môi trường nuôi cấy (Bùi Trang Việt,

2000), tỉ lệ A/C cao giúp sự tạo rễ, tỉ lệ A/C thấp giúp tạo chồi Ở cỏ Creeping, sự kếthợp 2.4 - D với cytokinin kích thích sự tăng sinh mô sẹo tạo phôi nhiều hơn khi sử dụng2,4 - D riêng lẻ (Zhong và ctv, 1991) Ở tiêu, phôi thể hệ được tạo ra trong môi trường

10

có 2,4 - D và TDZ nhưng phôi thể hệ không được tạo ra trên môi trường chỉ có 2,4 - D

(Binzel và ctv, 1996) Tương tự, sự tạo phôi thé hệ ở Cayratia japonica được cảm ứng

trên môi trường có 2,4 - D kết hợp với TDZ hoặc kinetin (Zhou và ctv, 1994)

Như vậy, cytokinin hỗ trợ auxin trong sự tăng trưởng, đồng thời cũng có sự đốikháng giữa auxin và cytokinin, sự cân bằng giữa hai kiểu hormone này là một trongnhững yếu tố kiểm soát sự phát triển (Bùi Trang Việt, 2000)

2.2.5 Nuôi cấy mô sẹo

Mô seo là một khối tế bào không có tổ chức, hình thành từ các mô hoặc cơ quan

đã phân hóa dưới điều kiện đặc biệc (vết thương, xử lý với các chất điều hòa sinh trưởngthực vật) Mô sẹo phát triển không tuân theo một quy luật nào nhưng có khả năng biệc

hóa thành rễ, chỗồi và phôi dé phát triển thành cây hoan chỉnh Mô sẹo là nguyên liệu

khởi đầu cho các nghiên cứu quan trọng khác như phân hóa mô và tế bào, chọn dòng tế

bảo, nuôi cay tế bào trần, nuôi cấy tế bào đơn, nuôi cay phôi soma, sản xuất các chất thứcấp có hoạt tính sinh học Nuôi cay mô sẹo được thực hiện với các loai thực vat không

có khả năng nhân giống đỉnh sinh trưởng hoặc các loài mẫu nuôi cay không thé trực tiếp

hình thành chồi Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống cây mẹ và từ một cụm tế bảo

mô sẹo có thể tái sinh cùng một lúc cho nhiều chồi hơn nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tuynhiên mức biến dị soma cao trong quá trình nuôi cấy tạo mô sẹo (Ngô Xuân Bình, 2009)

Mô sẹo hình thành từ các mô của thực vật một và hai lá mầm Các mô thường dùng

dé tạo mô seo là tượng tầng libe mộc, cơ quan dự trữ, trụ bì ré, phôi nhũ, tử tiệp, tế bảođiệp lục và các mô tiền tượng tầng (N guyén Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên, 2006) Môsẹo là một khối tế bào phát triển không có định hướng, thường có màu trắng, vàng, hơixanh (Vũ Văn Vụ và ctv, 2009) Các cơ quan khác của thực vật như rễ, thân, lá, củ, chéihoa, túi phan đều được sử dung làm nguyên liệu nuôi cay phát sinh mô seo

Dé tạo được mô sẹo môi trường nuôi cấy phải bố sung thêm các chất điều hòa sinh

trưởng và đôi khi chi là dich chiết Phụ thuộc vào từng loại mô và cơ quan khác nhau

của thực vật người ta sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng và nồng độ thích hợp với

độ nhạy cảm của tế bào trong mô va cơ quan dé phát sinh mô seo tốt nhất Lê Văn Hòa

và cộng tác viên (2012) nhận định rằng nồng độ auxin cao kích thích sự tạo mô seo dangrời rạc nhưng khi giảm auxin thì mô sẹo có dạng nốt và cứng chắc Tuy nhiên, trong môitrường có bồ sung auxin kết hợp với cytokinin cho tỉ lệ mẫu tạo mô seo và khối lượngtươi cao hơn so với môi trường chỉ bổ sung auxin (Đỗ Quốc Trường, 2012)

lãi

Sự hình thành mô seo có thé chia làm 3 thời kì đó là thời kỳ cảm ứng tế bào chuyểnhóa của mẫu cấy chuyên ngược trạng thái phát triển, biên đổi hình thái và chức năngtheo hướng tế bào phân sinh; thời kỳ phân chia tế bào các tế bào phân hóa của mô sẹo

có tần suất phân chia tương đối nhanh; thời kỳ phân hóa tế bào tốc độ phân chia và sinh

trưởng giảm đi cho tới khi dừng han, trong mô sẹo xuất hiện mô dẫn

Nuôi cấy mô sẹo được ứng dụng trong nhân giống in vitro các loài thực vat maphương pháp nhân giống đỉnh sinh trưởng ít hiệu quả hay khó thực hiện, nghiên cứu quátrình hình thành cơ quan, làm nguồn nguyên liệu đề nuôi cấy tế bào đơn cho chọn lọcdòng tế bào, thu nhận các sản phẩm hoạt chất thứ cấp có hoạt tính sinh học cao, nuôicấy huyền phù tế bảo

2.3 Một số nghiên cứu liên quan đến cây Kim phát tài

2.3.1 Nghiên cứu nước ngoài

Hernandez và cộng tác viên (2005) đã nghiên cứu sự phát sinh cơ quan trực tiếp invitro cua Zamioculcas zamiifolia bao gồm thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của 2.4 - D

(với các nồng độ lần lượt 0,0; 0,2; 0,4; 0,8 mg/l) và BAP (với các nồng độ lần lượt 0,0;1,5; 3,0; 6,0 mg/l) trong môi trường MS với 1/2 đa lượng đối với sự hình thành mô seo

và mô rễ từ lá Zamioculcas zamiifolia trong điều kiện in vitro Kết qua cho thấy, sau 8tuần đánh giá, tất cả các môi trường có bồ sung 2,4 - D va BAP ở tat cả các nồng độ đều

hình thành mô sẹo và mô rễ từ mẫu lá của Zamioculcas zamiifolia Trong đó, môi trường

có bổ sung 1,5 mg/l BAP kết hợp với 0,2 mg/l 2,4 - D và môi trường bé sung 1,5 mg/lBAP kết hợp với 0,8 mg/l 2,4 - D có tỉ lệ tái sinh mô sẹo cao nhất đạt 77% Điều nàycho thấy vai trò của auxin cụ thể là 2,4 - D là rất quan trọng đối với việc hình thành môsẹo Đối với sự hình thành mô rễ, ở các nghiệm thức bồ sung 6,0 mg/l BAP kết hợp với

0,2 và 0,4 mg/l 2,4 -D mới có sự hình thành mô rễ từ mô sẹo với tỉ lệ 15%.

Rohollahi và cộng tác viên (2021) đã nghiên cứu sự ảnh hưởng của nồng độ nito

và 2,4 - D khác nhau đối với quá trình hình thành mô sẹo và cây con của Zamioculcaszamiifolia trong điều kiện in vitro Kết quả cho thay khả năng tạo mô sẹo và tăng trưởngtốt nhất trong điều kiện nuôi cay MS 1/2 đa lượng bồ sung 9,5 uM 2,4 - D Thứ hai, môi

trường nuôi cay bổ sung 2,69 uM NAA kết hợp với 2,22 uM BAP và môi trường MS

biến tính với nồng độ nitơ là 30 uM và tỉ lệ nitrat trên amoni (1:3) là môi trường tốt nhấtcho phôi giống như sự phát triển cấu trúc trong những tuần đầu tái sinh và sản xuất cây

con, tăng số lượng lá trong những tuần cuối cùng so với các phương pháp nhân giống

12

khác Theo phương pháp này, một số lượng nhỏ lá có thé được nhân giống trong khoảngthời gian khoảng 16 tuần thành một số lượng lớn Zamioculcas zamiifolia, có thé so sánh

với các phương pháp sinh sản khác của loài thực vật này và các nghiên cứu tương tự cho

thấy việc thực hiện điều này trong khoảng 30 tuần là hợp lý về mặt kinh tế

Diaz và cộng tác viên (2007) đã nghiên cứu sự tái sinh trong điều kiện in vitro từ

lá của Zamioculcas zamiifolia dựa vào sự tương tac của auxin 2,4 - D với cytokinin BAP

và kinetin Mười hai nghiệm thức bao gồm ba nồng độ 2,4 - D auxin (0,2 và 4 uM) và

hai nồng độ (15 và 20 uM) của BAP và hai nồng độ (15 và 20 uM) của kinetin đã đượcđánh giá Kết quả cho thấy sau 6 tuần nuôi cấy, khả năng hình thành mô sẹo tốt nhất thuđược ở môi trường bổ sung 2 uM 2,4 - D kết hợp với bat kì loại và nồng độ cytokinin

nao trong các nghiệm thức Phân tích tác dụng của cytokinin độc lập với ảnh hưởng của

2,4 - D, người ta nhận thấy rằng sử dụng 15 hoặc 20 uM Kinetin và 20 uM BAP sẽ thu

được sự hình thành mô sẹo tốt nhất

Năm 2007, Vanzie và Leonhardt đã nghiên cứu một quy trình tối ưu dé tái sinh cây

con Zamioculcas zamiifolia bằng phương pháp nuôi cay mô Mẫu được nuôi cấy tao sẹotrên môi trường MS 1/2 đa lượng bồ sung 0,2 mg/1 BA và 4,0 mg/l 2,4 - D Sau 5 tuần

nuôi cay và đã tao đủ lượng mô sẹo các mẫu cây được chuyền sang môi trường cảm ứngtạo chồi MS 1/2 đa lượng bồ sung 1,0 mg/l BA Nuôi cấy trên môi trường tạo chéi đượcgiữ dưới ánh sáng, và sự phát triển chồi ngẫu nhiên được quan sát thấy sau 11 tuần trênmôi trường Khi các chéi bất định đã dài ra và be lá dài khoảng 2,5 cm, các mẫu cấyđược chuyên sang môi trường kéo dài chéi không có chất điều hòa sinh trưởng thực vật

dé phát triển thêm Cây con đã bén rễ, cao khoảng 5 cm, sau đó được chuyên sang chậu

trồng trong nhà kính dưới 70% bóng ram Tat cả các cây con được chuyền ra nhà kínhđều phát triển bình thường

Hơn nữa, Seneviratne va cộng tác viên (2013) đã thực hiện nghiên cứu phương pháp giâm cành Zamioculcas zamiifolia trong môi trường dinh dưỡng long Ba thí

nghiệm đã được tiến hành để tìm ra phương pháp giâm cành tốt nhất, ảnh hưởng củaánh sáng đến sự phát triển của cây trong môi trường lỏng và phát triển một môi trườngrắn mới với các chất dinh dưỡng dé tăng tốc độ tăng trưởng Kết quả cho thấy, các láchét ở gốc là kiểu cắt tốt nhất dé nhân giống nhanh Môi trường rắn tốt hơn môi trườnglỏng để ra rễ nhanh Phân hữu cơ + cát + 0,75 g/l phân bón có thé được khuyến nghị dé

13

nhân giống nhanh chóng cây trồng Sự phát triển của cây cao hơn trong môi trường chấtlỏng tiếp xúc với ánh sáng so với xử lý trong bóng tối.

Nghiên cứu của Sriprapat và cộng tác viên (2014) đã chỉ ra rằng Zamioculcaszamiifolia có hiệu quả loại bỏ khí xylene cao nhất trong 15 loài được nghiên cứu, nồng

độ xylene độc hại đối với Zamioculcas zamiifolia với LCso ở 3,464 ppm Nong độ xylenecao hơn biểu hiện các triệu chứng gây hại như đầu lá chuyên sang mau vàng và hoại tử

Năm 2019, Pheomphun và cộng tác viên đã nghiên cứu khả năng loại bỏ O3 của

18 loài thực vật khác nhau và kết qua cho thay Zamioculcas zamiifolia là loài có tiềmnăng loại bỏ Os cao nhất thông qua 3 con đường thân cây, sáp biểu bì và khí không

Muharini và cộng tác viên (2018) đã có báo cáo về nghiên cứu chiết xuất các hợpchất từ rễ của Zamioculcas zamiifolia cho thay trong rễ có chứa steroid, triterpenoid,flavonoid và polyphenolic Dựa trên kết quả chống oxy hóa và gây độc tế bảo, chiết xuất

rễ của Zamioculcas zamiifolia có tiềm năng như một nguồn chống oxy hóa, chống ungthư gan và không gây độc cho tế bào bình thường của con người

2.3.2 Nghiên cứu ở Việt Nam

Lê Văn Tường Huân và Nguyễn Thị Thảo Ngọc (2015) đã có nghiên cứu tạo môsẹo ở cây Kim Phát Tài nhằm ứng dụng trong nhân giống vô tinh in vitro cũng như trongchọn tạo giống ở cây Kim phát tài bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào Thí nghiệm 1nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4 - D kết hợp với BA lên khả năng tạo mô sẹo của mẫumảnh lá Kết quả ghi nhận được cho thấy sau 2 tháng nuôi cấy, mẫu ở tat ca các môitrường có bồ sung 2,4 - D và BA đều có mô sẹo tạo thành ngoại trừ môi trường không

có chất điều hòa sinh trưởng Trong đó ở môi trường có bé sung 1,0 mg/l 2,4 - D kếthợp với 0,5 mg/1 BA có tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo đạt 100% khả năng sinh trưởng mô sẹo tốt.Thí nghiệm 2 nghiên cứu ảnh hưởng của 2.4 - D kết hợp với BA lên khả năng tạo môsẹo của mẫu cuống lá Kết quả sau 2 tháng nuôi cấy cho thấy ở các môi trường khácnhau thì khả năng tạo mô sẹo khác nhau, trên môi trường không có chất điều hòa sinhtrưởng không có mô sẹo tạo thành Trong đó, môi trường có bổ sung 1,0 mg/l 2,4 - Dkết hợp với 0,5 mg/L BA, tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo đạt 100% Khả năng sinh trưởng của

mô sẹo tốt, mô sẹo tạo thành có dạng chặt, màu xanh Một vài mau có sự mọc ré Tỉ lệ

mẫu tạo rễ từ mô sẹo đạt 10% Thí nghiệm 3 nghiên cứu khả năng nhân của mô sẹo Các

mẫu mô sẹo có kích thước khoảng 3 x 3 mm, tách từ mô seo tạo thành từ in vitro, được

cấy lên các môi trường có bồ sung các chất điều hòa sinh trưởng với các nồng độ và tổ

14

hợp khác nhau dé thăm dò khả năng sinh trưởng của mô sẹo Kết quả sau 4 tuần nuôicay cho thay mô sẹo sinh trưởng tốt nhất trên môi trường có bé sung 2,0 mg/1 2,4 - Dkết hợp với 1,0 mg/l BA, mô seo sau quá trình nuôi cấy có dang hạt, màu vàng nhạt,một số mẫu mô sẹo có phần nhỏ ngả xanh Kích thước trung bình của mô sẹo sau 4 tuầnnuôi cay đạt 10,9 mm Trọng lượng tươi trung bình của mô sẹo là 456,8 mg.

Năm 2017, Lê Văn Tường Huân và Lê Thị Trang cũng đã có kết quả về “Nghiên

cứu tái sinh cây từ mẫu cuống lá trong điều kiện in vitro ở Kim phát tài” Các mẫu cuống

lá chét có kích thước khoảng 0,7 cm được cấy lên môi trường cơ bản MS có 3% đường,

0,8% agar và b6 sung BA với các nồng độ từ 1,0 - 7,0 mg/1 kết hợp với 0,1 mg/l NAA

dé thăm dò khả năng tái sinh cây từ mẫu cuống lá chét cây Kim phát tài trong điều kiện

in vitro Sau 3 thang, tat cả các môi trường có bồ sung BA kết hợp với NAA đều có xuhướng làm tái sinh chồi trực tiếp từ mẫu cuống lá của cây Kim phát tài Riêng môitrường MS không bồ sung chất điều hòa sinh trưởng không có sự tạo chdi Trong đó,môi trường bồ sung 4,0 mg/l BA kết hợp với 0,1 mg/l NAA là môi trường tốt nhất cho

tái sinh cây từ mẫu cuống lá chét của cây Kim phat tài với tỉ lệ mẫu hình thành chồi là100% đạt 4.85 chồi/mẫu

Ngoài ra, các nghiên cứu trong nước khác liên quan đến nhân giống in vitro các

loài thuộc họ Araceae từ mẫu lá cũng được thực hiện Năm 2022, Phan Xuân Huyên và

cộng tác viên đã thực hiện nghiên cứu kha năng tái sinh in vitro của cây Hồng môn thiênnga (Anthurium scherzerianum Schott) từ mau lá Kết qua cho thấy, môi trường MS bổsung 0,3 mg/1 đến 0,5 mg/1 BA kết hợp 0,1 mg/1 2,4 - D đều phù hợp đến sự hình thành

mô sẹo từ lá non (khối lượng tươi của mô seo đạt 0,19 g/mau đến 0,20 g/mau, tỉ lệ mẫutạo mô seo 80%) Môi trường MS bổ sung 1,5 mg/1 BA là phù hợp đến sự biệt hóa chồi

từ mô sẹo (chiều cao chồi 2,98 em, số chỗồi 25,10 chồi/mẫu, số mẫu biệt hóa chéi 100%).Môi trường MS bồ sung 0,0 mg/1 đến 1,0 mg/1 IBA đều thích hợp tạo rễ in vitro (tỉ lệ

mẫu tạo rễ 100%).

15

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 03/2023 đến tháng 07/2023 tại Công ty Cổ phần

Công Nghệ Sinh Học Cây Giống Việt Nam

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Cây Kim phát tài được mua từ vườn ươm về chăm sóc đề cây thích nghi với điềukiện môi trường Đề tiến hành các thí nghiệm, chọn các mẫu lá khỏe, không quá giả vàkhông quá non, lá phải nguyên vẹn, không sâu bệnh, sau đó cắt gọn cuống lá Các mẫu

lá sau khi được cắt gọn phải tiến hành khử trùng mẫu cấy ngay

Hình 3.1 Mẫu lá Kim phát tài ding làm vật liệu nuôi cấy

3.2.2 Trang thiết bị và dụng cụ

Phòng chuẩn bị môi trường, dụng cụ thí nghiệm gồm: máy khuấy từ, máy đo pH,

cân điện tử, nồi hấp vô trùng Autoclave, tủ lạnh, cốc dong, pipet Phòng này dé chuẩn

bị và khử trùng môi trường cũng như dụng cụ nuôi cấy, bảo vệ các môi trường dự trữ.Phòng cấy: tủ cấy vô trùng, đèn cồn, dụng cụ cay (dao, kéo, pence, dia), cén 90°,cồn 70°, bình đựng cồn, giấy cấy, bông Day là phòng tiến hành các thao tác nuôi cấy,

16

phòng này cần phải hạn chế tối thiểu sự gây bụi, phòng phải kín gió Phòng có hệ thống

đèn UV khử trùng.

Phòng tăng trưởng: kệ để mẫu sau cấy (có hệ thống đèn chiếu sáng), máy điều hòa

nhiệt độ Phong có buông sáng và buông tôi Buông tôi dùng dé nuôi cây mô sẹo và các

mẫu đặc biệc khác Buông tối cần tất cả thiết bị như buồng sáng nhưng không cần hệ

thống đèn chiếu sáng

3.2.3 Môi trường và điều kiện nuôi cấy

Bảng 3.1 Thành phần môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962)

Myo-Inositol 100

Vitamine Nicotonic acid 0,50

Pyridoxine HC] 0,50 Thiamine - HCl 0,10

17

Hóa chất khử trùng mẫu: cồn 70°, javel, tween 80, dung dịch HgC]›, khang sinh,

xà phòng Sunlight.

Môi trường được sử dụng dé nuôi cấy trong các thí nghiệm này là môi trườngkhoáng cơ ban MS (Murashige va Skoog, 1962) có bổ sung đường đường 30,0 g/l vàagar 0,6 g/l Ngoài ra các chất điều hòa sinh trưởng thực vật được bổ sung vào môi

trường với nồng độ tùy theo từng thí nghiệm, chất điều hòa sinh trưởng 2.4 - D được sử

dụng để nuôi cay tạo mô seo, chất điều hòa sinh trưởng BA được sử dụng dé nuôi cấy

tạo chéi và nhân chồi Ngoài ra, sử dụng chất điều hòa sinh trưởng IBA làm chất nền

trong thí nghiệm nhân chồi Môi trường sau khi pha được điều chỉnh pH ở 5,8, sau đócho vào hũ nhựa đậy kín nắp, được hấp khử trùng bằng néi hấp Autoclave ở nhiệt độ121°C, áp suất 1 atm trong 20 phút

Điều kiện nuôi cấy: tùy theo từng giai đoạn thí nghiệm, các mẫu cấy được nuôi cấy

trong điều kiện tối hoàn toàn hoặc dưới ánh sáng trắng với cường độ chiếu sáng 16

giờ/ngày, nhiệt độ đao động từ 23 °C đến 27°C, độ am từ 60 đến 65%

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Khử trùng mẫu cấy

Các mẫu lá Kim phát tài nguyên vẹn, khỏe, không sâu bệnh được cắt gọn cuống láđược xử lí sơ bộ bằng cách ngâm mẫu trong xà phòng Sunlight pha loãng trong 1 phút

và dùng bông lau sạch mẫu dưới vòi nước máy, sau đó dùng bông lau khô và đưa mẫu

vào bình vô trùng để chuyên vào tủ cấy tiếp tục khử trùng Trong tủ cấy, ngâm và lắc

mẫu trong dung dịch javel 5% thêm vào 0,5 ml Tween 80 trong 10 phút, sau đó rửa lại

với nước vô trùng 3 lần Tiếp theo, ngâm va lắc mẫu trong dung dịch HgCh 0,1% thêm0,5 ml Tween 80 2 lần, mỗi lần 5 phút và rửa lại bằng nước vô trùng 3 lần Chuyển mẫusang bình vô trùng khác và tiễn hành ngâm lắc mẫu trong kháng sinh nồng độ 200 mg/lthêm 0,5 ml Tween 80 2 lần, lần đầu 20 phút và rửa lại bằng nước vô trùng 3 lần; lần 2

15 phút và rửa lại bằng nước vô trùng 3 lần Mẫu lá sau khi khử trùng được sử dụng dé

bố trí vào các nghiệm thức ở các thí nghiệm 1, 2, 3

3.3.2 Khảo sát tác động của 2,4 - D đến khả năng hình thành mô seo từ lá cây Kim

Phát Tài

Năm 2021, Rohollahi và cộng tác viên đã nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nito

và chất điều hòa sinh trưởng 2,4 - D lên quá trình hình thành mô sẹo từ lá Kim phát tài,

kết qua cho thấy khả năng tạo mô seo và tăng trưởng tốt nhất trên môi trường 1/2 MS

18

bé sung 9,5 uM 2,4 - D Lê Văn Tường Huân và Lê Thị Trang (2015) đã có nghiên cứutạo mô sẹo từ mẫu lá và cuống lá Kim phát tài trên môi trường MS bồ sung chất điềuhòa sinh rưởng 2,4 - D và BA, kết quả sau 2 tháng cho thay mau trên tat cả môi trường

bồ sung 2,4 - D và BA có có sự hình thành mô seo Từ đó cho thấy việc nghiên cứu về

sự hình thành mô sẹo đã chịu tác động của nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật

auxin đặc biệc là 2,4 - D được sử dụng riêng lẻ hoặc kết hợp với nhóm chất cytokinin

(BA) Chính vì vậy, mục tiêu của thí nghiệm này là xác định được nồng độ tối ưu của

chất điều hòa sinh trưởng 2.4 - D kết hợp với 1,0 mg/1 BA cho sự hình thành mô sẹo từ

lá cây Kim phat tài.

Cách tiến hành: lá cây Kim phat tài sau khi khử trùng, được cắt thành các mảnh có

kích thước khoảng lcm x 2em Các mẫu mảnh lá được cấy trên môi trường cơ bản MS

bồ sung 2,4 - D ở các nồng độ khác nhau kết hợp với 1,0 mg/l BA được bồ trí theo từng

nghiệm thức sau (Bang 3.1).

Mô tả thí nghiệm: thí nghiệm gồm 5 nghiệm thức được bồ trí theo kiểu đơn yếu tố

hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi nghiệm thức lặp lai 3 lần, mỗi lần lặp lại 9 mẫu Tổng số mẫu

thí nghiệm là 5x3x9 = 135 mẫu.

Bảng 3.2 Khảo sát sự hình thành mô sẹo từ mẫu lá cây Kim phát tai

Nghiệm thúc Môi trường BA (mg/l) 2,4 - D (mg/l) Tổng số mẫu

Tỉ lệ mẫu hình thành mô sẹo (%) = x 100

Thời gian xuất hiện mô sẹo (ngày), ghi nhận từ thời điểm mẫu có hiện tượng cong

lên, mô sưng phù.

Hình thái và màu sắc mô sẹo, quan sát mẫu hình thành mô sẹo dạng nốt, chắc hoặcdạng xốp, màu trắng hoặc màu vàng Tình trạng mẫu có biểu hiện hóa nâu hoặc chết đều

được ghi nhận.

19

3.3.3 Khảo sát tác động của BA đến khả năng phát sinh chdi từ mô seo lá cây Kim

Phát Tài

Lê Văn Tường Huân và Lê Thị Trang (2017) đã có kết quả về nghiên cứu tái sinh

cây từ mẫu cuống lá Kim phát tài trên môi trường MS bổ sung chất điều hòa sinh trưởng

BA kết hợp 0,1 mg/l NAA, sau 3 tháng, tat cả môi trường có bé sung BA và NAA đều

có mẫu có xu hướng tái sinh chỗi trực tiếp từ cuống lá, ở môi trường không có bổ sung

BA không có chi hình thành Năm 2022, Lê Thi Thúy và cộng tác viên đã có nghiên

cứu về nhân giống in vitro cây trầu bà cung đàn (Philodendron ‘Jungle boogie’) một

loài thuộc ho Araceae, trong nghiên cứu tái sinh chéi, chồi đỉnh được nuôi cấy trên môitrường MS bổ sung chất điều hòa sinh trưởng BA, kết quả cho thay trên môi trườngkhổng bổ BA không có sự hình thành chéi, môi trường bồ sung BA nông độ từ 0,5 mg/lđến 1,5 mg/l đều cho 100% tỉ lệ mẫu hình thành chéi Từ đó có thể thấy vai trò củanhóm chat cytokinin đặc biệc là BA là rất quan trọng đối với quá trình hình thành chồicủa cây Chính vì vậy mục tiêu của thí nghiệm này là xác định được nồng độ tối ưu của

chất điều hòa sinh trưởng BA cho sự phát sinh chéi từ mô sẹo lá cây Kim phát tai

Cách tiến hành: chọn các mẫu mô sẹo khỏe, đồng đều phat sinh từ lá Kim phát tài

ở thí nghiệm 1 cấy trên môi trường cảm ứng tạo chồi gồm môi trường cơ bản MS có bổ

sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật BA ở các nồng độ khác nhau được bé trí theo

từng nghiệm thức sau (Bảng 3.2).

Mô tả thí nghiệm: thí nghiệm gồm 5 nghiệm thức được bố trí theo kiểu 1 yêu tốhoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần 7 mẫu Tổng số mẫu thí

nghiệm là 5x3x7 = 105 mẫu

Bảng 3.3 Khảo sát sự phát sinh chi từ mô sẹo mẫu lá cây Kim phát tai

Nghiệm thức Môi trường BA (mg/L) Tổng sô mẫu