4.1. Sự hình thành mô sẹo dưới tác động của nồng độ 2,4 - D
Sự tạo mô sẹo có ý nghĩa rat quan trọng trong nuôi cấy in vitro, là nguồn nguyên liệu lý tưởng cho các nghiên cứu về phát sinh chéi gián tiếp qua mô sẹo hoặc sử dụng mô sẹo dé thu hợp chất thứ cấp hay dùng làm nguyên liệu dé nuôi cấy dich treo tế bao.
Thông qua nuôi cấy mô sẹo, nuôi cấy in vitro có thé tái tạo lại cây hoàn chỉnh với số lượng lớn trong thời gian ngắn có đầy đủ rễ, thân và lá (Bùi Trang Việt, 2000).
Mô sẹo hình thành hầu hết ở các bộ phận của cây (rễ, thân, lá), khi nơi đó có vết cắt. Khi đặt trong môi trường các mẫu cấy sẽ phình ra, dày lên do sự hấp thu thu nước, dinh dưỡng vả các chất điều hòa sinh trưởng thực vật. Khả năng tạo mô sẹo và mô cơ quan phụ thuộc rất nhiều vảo trạng thái sinh lý, sinh hóa và kiểu gen. Theo Ochatt và cộng tác viên (1986), mô sẹo có thê được tạo ra từ nhiều loại cơ quan khác nhau của một cơ thể thực vật. Tuy nhiên với mỗi loại mô hay cơ quan thường phải sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng thực vật với loại va nồng độ khác nhau, tùy theo mức độ nhạy cảm của tế bào trong mô hay cơ quan đó.
Chất điều hòa sinh trưởng thực vật có vai trò quan trọng trong quá trình hình thành
mô sẹo, đặc biệc là auxin (Hopkins, 1995). Theo Bùi Trang Việt (2000), trong các loại
auxin được sử dụng trong nuôi cây in vitro, 2,4 - D được xem là một auxin mạnh, có tác động mạnh mẽ lên sự tăng trưởng tế bào, sự acid hóa vách tế bào, cảm ứng sự phân chia tế bào, kích thích sự hình thành mô sẹo. Mặc khác, hiệu ứng của auxin này tùy thuộc vào loại auxin, nồng độ hiện diện trong thực vật và môi trường nuôi cấy (Taiz và ctv, 2002). Vì vậy nồng độ auxin ở mức quá thấp sẽ không có tác dụng hoặc quá cao sẽ ức chế quá trình tạo sẹo. Theo Thomas và cộng tác viên (1996), 2,4 - D mặc dù có hoạt tính rất yếu trong tạo chéi và tạo rễ bat định nhưng là loại auxin kích thích tạo mô sẹo rất hiệu quả. Mặc khác, BA thuộc nhóm chất điều hòa sinh trưởng cytokinin, đóng vai trò thúc đây quá trình tạo mô sẹo.
Thật vay, việc sử dụng kết hợp giữa nồng độ 2.4 - D và BA có tác động đến khả năng hình thành mô sẹo từ mẫu lá và có sự khác biệt giữa các nghiệm thức, điều này được thé hiện trong Bảng 4.1.
23
Quan sát tại thời điểm 2 tuần, mẫu nuôi cây trên môi trường có bé sung 2,4 - D va BA có sự tác động vào quá trình hình thành mô sẹo từ mẫu lá, ở các nghiệm thức môi trường nuôi cay khác nhau cho tỉ lệ mẫu hình thành mô sẹo khác nhau.
Bảng 4.1. Tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo sau 2 tuần nuôi cây
Nghiệm BA 2,4-D Thời gian cảm ứng Tỉ lệ mau tao mô thức (mg/l) (mg/l) mô seo (ngày) sẹo (%)
AI 1,0 0,5 17 14,81 A2 1,0 1,0 10 51,85?
A3 1,0 1,5 14 40,74 A4 1,0 2,0 15 29,632bc AS 1,0 2,5 20 22,22"
%CV 11,74
Trong cùng một cột và cùng 1 yếu tô ảnh hưởng, các giá trị trung bình có kí tự theo sau khác
nhau có sự khác biệt về mặt thông kê (P < 0,01). Các số liệu ti lệ được chuyên sang dang
arcsin(x)1⁄2 để xử li thong kê.
Cụ thể, nghiệm thức A2 có bổ sung 1,0 mg/1 2,4 - D cho tỉ lệ mẫu hình thành mô sẹo cao nhất đạt 51,85% và nghiệm thức Al bổ sung 2,4 - D ở nồng độ 0,5 mg/1 cho tỉ lệ mẫu hình thành mô sẹo thấp nhất (14,81%). Nguyên nhân của hiện tượng này là do nồng độ auxin cung cấp quá thấp không đủ cho cảm ứng tạo mô sẹo. Đối với nghiệm thức A3 ở môi trường có bổ sung 1,5 mg/1 cũng cho tỉ lệ mẫu hình thành mô seo cao đạt 40,74%, không khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức A4, A5.
Ngoài ra, kết quả từ Bang 4.1 còn cho thấy, thời gian cảm ứng mô sẹo giảm từ 17 ngày ở nghiệm thức A1 (0,5 mg/l 2,4-D) xuống còn 10 ngày ở nghiệm thức A2 (1,0 mg/1 2,4 - D) sau đó tăng lên 20 ngày khi tăng dần nồng độ 2,4 - D từ 1,0 mg/l lên 2,5 mg/I (nghiệm thức A3, A4, A5). Điều này chứng tỏ sử dụng quá mức auxin dẫn đến việc ức chế ngược, làm cho thời gian cảm ứng lâu và tỉ lệ tạo mô sẹo thấp. Thời gian cảm ứng tạo mô sẹo ngắn nhất ở nghiệm thức A2 ở nồng độ 1,0 mg/l 2,4 - D kết hợp 1,0 mg/l BA chỉ với 10 ngày nuôi cấy, chứng tỏ tỉ lệ auxin/cytokinin phù hợp cho quá trình cảm ứng
mô seo của cây Kim phat tai.
Điều này kha tương đồng với giải thích của Thomas (1989), sự có mặt của 2,4 - D trong môi trường làm tăng quá trình sinh tổng hợp protein, dẫn đến sự gia tăng sinh khối
24
của mau cấy, nhưng khi nồng độ 2,4 - D quá cao sẽ làm gia tăng RNA và dang tích lũy là rRNA do đó mẫu cấy sinh trưởng chậm han đi và thời gian cảm ứng mô sẹo kéo dai.
Trong khi kết quả ghi nhận được ở thí nghiệm 1 số ngày hình thành mô sẹo thấp nhất là 10 ngày nuôi cấy trên môi trường MS bồ sung 1,0 mg/1 2,4 - D kết hợp 1,0 mg/1 BA, thì với nghiên cứu về sự hình thành mô sẹo từ mẫu lá Kim phát tài được Hernandez và cộng tác viên (2005) thực hiện và kết quả hình thành mô sẹo tốt nhất trên môi trường MS 1/2 đa lượng bổ sung 1,5 mg/I BA và 0,2 mg/l 2,4 - D hoặc 0,8 mg/1 2,4 - D với số ngày thấp nhất hình thành mô sẹo là 15 ngày, như vậy nhận thấy được môi trường ở thí nghiệm 1 có sự tối ưu hơn về thời gian nuôi cấy so với nghiên cứu của Hernandez và
cộng tác viên (2005).
Bang 4.2. Tác động của 2,4 - D đến hình thái mô sẹo sau 2 tuần nuôi cấy
Nghiệm 2,4-D thức (mg/l)
Mau sac Hinh thai
Vang, Các mau cong lên cảm ứng tao mô seo, hình thanh
AI 0,5 . : xanh mô sẹo tinh thê màu vàng nhạt theo các mép cắt.
Mô sẹo bắt đầu hình thành từ gân lá, phát triển dọc
A2 1,0 Xanh : : : theo các mép cat, seo mau vàng nhạt, dang not, chac.
Hình thành một số mô seo dạng nốt nhỏ mau vàng
A3 L5 Xanh ; , đọc theo vi trí mép cat.
Hình thành một số mô sẹo dạng nốt nhỏ màu vàng
A4 2,0 Xanh ; , đọc theo vi trí mép cat.
R Xanh, Các vị trí mép cắt chuyển sang màu nâu, sẹo dạng
5 2,5
vàng tinh thé hình thành từ gân lá.
Sau 2 tuần nuôi cấy, trên tất cả các nghiệm thức đều có mẫu cảm ứng mô sẹo thông qua việc mẫu cong lên và hơi phồng ở 2 đầu gân lá do sự hấp thu nước, chất dinh dưỡng và chất kích thích sinh trưởng. Trong đó, thấy rõ nhất sự hình thành mô sẹo ở nghiệm thức A2 (1,0 mg/1 2,4 - D). Mô sẹo được hình thành từ gân lá và phát triển dọc theo vị trí mép cắt, có màu vàng nhạt dạng nốt, chắc. Ngược lại, ở nghiệm thức Al bé sung 0,5 meg/1 2,4 - D chưa nhìn thấy rõ sự hình thành mô sẹo, dọc theo mép cắt đặc biệc là vị trí 2 đầu gân lá trương phông lên và có dang tinh thé màu vàng nhạt. Ở các nghiệm thức
25
còn lại mô sẹo khá giống nhau về hình thái, có dạng nốt nhỏ hình thành quanh vị trí mép cắt (Hình 4.1).
1,5 mg/l 2,4 - D
Hình 4.1. Mô sẹo hình thành từ mẫu lá sau 2 tuần nuôi cấy trên các nghiệm thức.
Sau 4 tuần quan sát, nhận thấy có sự khác biệt rất rõ trong quá trình hình thành mô sẹo từ mẫu lá ở các nghiệm thức môi trường nuôi cấy khác nhau. Cụ thể, nghiệm thức A2 có bổ sung 1,0 mg/12,4- D cho tỉ lệ mẫu hình thành mô sẹo cao nhất đạt 96,28%, có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với tất cả nghiệm thức còn lại. Điều này chứng tỏ 2,4 - D có ảnh hưởng lớn đến quá trình hình thành mô sẹo. Tuy nhiên, khi tăng dần nồng độ 2.4 - D từ 1,0 lên 2,5 mg/l thi ti lệ mẫu hình thành mô sẹo giảm dan và còn 55,56% (nghiệm thức A3, A4, A5). Kết quả này phù hợp với kết quả của Vũ Văn Vụ (2009), tỉ lệ tạo sẹo giảm là do sử dụng chất điều hòa sinh trưởng ở nồng độ cao sẽ gây ức chế và nếu cao quá sẽ phá hủy cấu trúc tế bào, dẫn đến chết mẫu. Tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo thấp nhất (22,22%) ở nghiệm thức Al với 2,4 - D Ở nồng độ 0,5 mg/1 (Bảng 4.3).
Bảng 4.3. Tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo sau 4 tuần nuôi cay
26
Nghiệm thức BA (mg/l) 2,4 - D (mg/l) Ti lệ mẫu tạo mô seo (%)
AI 1,0 0,5 9S, SÁU
A2 1,0 1,0 96,28?
A3 1,0 1,5 74,08°
A4 1,0 2,0 62,96%
A5 1,0 2S is
%CV 12,03
Trong cùng một cột và cùng 1 yếu tô ảnh hưởng, các giá trị trung bình có kí tự theo sau khác
nhau có sự khác biệt về mặt thông kê (P < 0,01). Các số liệu tỉ lệ được chuyên sang dang
arcsin(x)1⁄2 để xử lí thong kê.
Nghiệm thức A3 trên môi trường bồ sung 2,4 - D ở nồng độ 1,5 mg/l cũng cho tỉ lệ mẫu hình thành mô seo khá cao, đạt 74,08% và có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê so với các nghiệm thức khác. Nghiệm thức A4 và A5 có tỉ mẫu mẫu hình thành mô sẹo lần lượt là 62,96% và 55,56% và không có sự khác biệc có ý nghĩa về thống kê.
Sự tác động của các yếu tố điều hòa sinh trưởng cũng tạo ra sự thay đổi về hình thái mô sẹo sau 4 tuần nuôi cấy và có sự khác nhau giữa các nghiệm thức.
Bảng 4.4. Tác động của 2,4 - D đến hình thái mô sẹo sau 4 tuần nuôi cay
Nghiệm 2,4-D thức (mg/l)
Màu sắc Hình thái
Mô sẹo xốp, dạng nốt, màu vàng, phát triển chậm.
Al 0,5 Vang, nau ơđ
Một sô mâu hóa nâu.
Mô seo rat chắc, dang not, mau vàng hoặc xanh A2 1,0 Xanh a : _
phát triên trên toản bộ bê mặt mâu.
Mô sẹo có dạng nốt, chắc, phát triển dọc theo vị
A3 1,5 Vang, xanh „ trí mép cat.
Mô sẹo có dạng nốt, xốp, mau vàng hoặc xanh,
A4 2,0 Vang, xanh - „ phát triên dọc theo mép cắt.
Mô sẹo có dạng hạt, nhỏ, xốp, màu vàng, phát A5 25 Vang trién cham.
VỊ tri các mép cắt chuyên dan sang mau nâu.
21
Quan sát mẫu có thé thấy sự tăng sinh của mô sẹo qua thời gian từ 2 tuần đến 4 tuần nuôi cay. Ở nghiệm thức Al (0,5 mg/l 2,4 - D), vì nồng độ 2,4 - D thấp nên mô sẹo hình thành nhỏ, phát triển chậm, mức độ tăng sinh kém. Ở nghiệm thức A2 (1,0 mg/l 2,4 - D) và A3 (1,5 mg/l 2,4 - D) sự hình thành mô sẹo diễn ra nhanh hơn và nhiều hơn mô sẹo tạo thành chắc, dạng nốt, phát triển toàn bộ bề mặt vết cắt và có khả năng phát sinh phôi hoặc tạo chéi trực tiếp từ mô seo cao. Mặc khác, mô sẹo ở nghiệm thức A4 (2,0 mg/l 2,4 - D) và A5 (2,5 mg/l 2,4 - D) có hiện tượng bị xốp do bổ sung 2,4 - D ở nồng độ cao làm cho các tế bào tăng sinh mat kiểm soát, phá vỡ liên kết giữa tế bào với
tê bao làm các tê bao năm rời rac.
~
Hình 4.2. Mô seo hình thành từ mẫu lá sau 4 tuần nuôi cấy trên các nghiệm thức.
Cytokinin kích thích sự phân chia tế bào, thúc đây sự phiên mã tạo mRNA, kích thích sự tổng hợp protein và enzyme đặc hiệu trong các mô xác định dé tạo sẹo với điều kiện có auxin (Taiz va Zeiger, 2002). Do đó các nghiệm thức MS bé sung 2,4 - D phối hợp với BA cho hiệu quả tạo sẹo cao, thể hiện qua quá trình cảm ứng tạo sẹo diễn ra sớm, sẹo phát triển mạnh và tỉ lệ auxin/cytokinin cao kích thích tạo rễ, trong khi tỉ lệ này thấp kích thích tạo chéi, ở mức trung gian sẽ kích thích tạo mô seo (Zakizadeh và ctv, 2008). Vì thế, ở nghiệm thức 2 trong môi trường MS bồ sung 1,0 mg/l 2,4 - D kết hợp với 1,0 mg/l BA cho hiệu quả phát triển seo cao và tốt nhất trong các nghiệm thức.
28
Nghiên cứu về sự hình thành mô sẹo từ mẫu lá Kim phát tài cũng đã được Hernandez và cộng tác viên (2005) thực hiện và kết quả hình thành mô sẹo tốt nhất đạt 77.0% trên môi trường MS 1/2 đa lượng bổ sung 1,5 mg/l BAP và 0,2 mg/l 2,4 - D hoặc
0,8 mg/l 2,4 - D. Hay Rohollahi và cộng tác viên (2021) đã nghiên cứu sự ảnh hưởng
của các nồng độ nitơ và 2.4 - D khác nhau đối với quá trình hình thành mô sẹo và cây con của Zamioculcas zamiifolia trong điều kiện in vitro. Kết quả cho thay khả năng tạo mô sẹo và tăng trưởng tốt nhất trong điều kiện nuôi cấy MS 1/2 đa lượng bồ sung 9,5 uM 2,4 - D. Một nghiên cứu khác của Lê Văn Tường Huân và Nguyễn Thị Thao Ngọc (2015) cho thấy tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo từ lá Kim phát tài đạt 100% khi nuôi cấy trên môi trường MS bồ sung 1,0 mg/l 2,4 - D kết hợp 0,5 mg/1 BA.
Ngoài ra, ở nhiều loài hoa, cây cảnh trong họ Araceae đã được nghiên cứu nhân giống in vitro bằng mảnh lá thông qua giai đoạn tạo mô sẹo và sau đó tái sinh cây hay phat sinh phôi, sử dụng các môi trường có bồ sung 2,4 - D hay 2,4,5 - T và BA hay kinetin, như ở Hồng môn Anthurium andraeanum (Kuehnle và Sugii, 1991; Kuehnle va ctv, 1992), Hồng môn Anthurium scherzerianum (Geier, 1986; Hamidah va ctv, 1997), Bán hạ Bắc (Pinellia ternata) (Xu va ctv, 2005).
4.2. Sự phát sinh chéi từ mô seo dưới tác động của nồng độ BA
Mô sẹo được xem là giai đoạn trung gian của quá trình nhân nhanh mẫu cấy, chính vì vậy việc tìm ra môi trường thích hợp cho quá trình biệt hóa, phát sinh chéi hoặc phôi vô tính từ mô sẹo là bước tiếp theo trong nhân giống in vitro.
Cytokinin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng thường được sử dụng dé cảm ứng bật chỗồi và nhân cụm chdi, trong đó BA được dùng rộng rãi nhất và có cảm ứng tốt trên nhiều đối tượng khác nhau. Tuy nhiên, các chất thuộc nhóm auxin tích lũy trong khối mô seo (hàm lượng auxin nội sinh trong mô sẹo) có thể sẽ có ảnh hưởng nhất định đến hiệu quả bật chồi của các chất thuộc nhóm cytokinin trong giai đoạn nuôi cấy tiếp theo.
Thật vậy, thí nghiệm này cho thấy sự ảnh hưởng khác nhau từ các nồng độ chất điều hòa sinh trưởng BA khác nhau lên quá trình hình thành chồi từ mô sẹo và kết quả này được thê hiện trong Bảng 4.5.
Quan sát mẫu tại thời điểm 4 tuần nuôi cấy, có sự tác động lên quá trình phát sinh chéi. Cụ thé, tại thời điểm 4 tuần nuôi cấy, nghiệm thức B3 bổ sung 1,5 mg/1 BA có ti lệ mẫu phát sinh chéi từ mô sẹo cao nhất đạt 71,43%, có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức BI (0,5 mg/1 BA) va BS (2,5 mg/1 BA). Tỉ lệ mẫu hình thành mô
29
seo đạt thấp nhất ở nghiệm thức B5 bồ sung 2,5 mg/1 BA và xét về mặt thống kê, không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức B1 (0,5 mg/1 BA).
Bảng 4.5. Tỉ lệ mẫu hình thành chéi từ mô sẹo sau 4 tuần nuôi cấy
Nghiệm thức BA (mg/D Thời gian tạo chéi Tilé mals hinh thanh
(ngay) chéi (%)
Bl 0,5 29 38,10°
B2 1,0 27 61,90 B3 1,5 24 71,43*
B4 2,0 22 42,86”
B5 2.5 26 33,33
%CV 14,59
Trong cùng một cột và cùng I yến to ảnh hưởng, các giá trị trung bình có kí tự theo sau khác nhau có sự khác biệt về mặt thống kê (P < 0,01). Các số liệu tỉ lệ được chuyển sang dạng arcsin(x)1⁄2 dé xử li thong kê.
Ngoài ra, từ nghiệm thức B1 đến B4 thời gian hình thành chỗi từ mô seo tỉ lệ nghịch với nồng độ BA, cụ thé là thời gian hình thành chéi giảm từ 27 ngày xuống còn 22 ngày tương ứng với nồng độ BA tăng từ 0,5 mg/1 lên 2,0 mg/l. Thời gian ngắn nhất cho sự hình thành chồi từ mô sẹo lá Kim phát tài là ở nghiệm thức A4 với 2,0 mg/l BA là 22 ngày. Tuy nhiên khi tăng nồng độ BA từ 1,5 mg/l lên 2,0 mg/l thì thời gian hình thành chi tang từ 22 ngày lên 26 ngày. Điều này chứng tỏ, sử dung cytokinin ở nồng độ quá cao không những gây ức chế mà còn kéo đài thời gian tái sinh chồi.
Sau 4 tuần nuôi cấy mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung BA ở các nồng độ khác nhau từ 0,5 - 2,5 mg/I đều có sự hình thành chỗi nhưng tỉ lệ hình thành chồi không cao, chéi chỉ xuất hiện ở một số mẫu trên các nghiệm thức. Hầu như các chéi hình thành không có sự khác biệt về hình thái, chồi nhỏ, dạng búp, có màu vàng hoặc xanh. Tuy nhiên ở nghiệm thức B5 (2,5 mg/1 BA) tỉ lệ mẫu hình thành chi rất thấp, mẫu có hiện
tượng chuyền sang màu nâu ở vị trí mép cắt.
30
Bang 4.6. Tac động của BA đến khả năng hình thành chồi từ mô sẹo sau 4 tuần
Nghiệm BA
Hình thái Hình ảnh thức (mg/l)
Chéi có dạng búp, nhỏ, màu BI 0,5 vàng, số lượng chéi hình thành
trên mẫu thấp
Chéi có màu vàng hoặc xanh,
B2 1,0 F nho, cham phat trién
Chéi có màu vàng hoặc xanh,
B3 15
nho, dang bup
Khả năng hình thành chồi từ mô B4 2,0 sẹo thấp, một số chồi hình thành
có mảu vàng, nhỏ
Rat ít mẫu hình thành chdi từ mô BS 25 seo, tai vi tri vét cat chuyén sang
mau nau.
Sau 8 tuần nuôi cấy, nhận thấy ở tat cả nghiệm thức đều có tỉ lệ mẫu phát sinh chồi từ mô sẹo tăng lên so với thời điểm 4 tuần nuôi cấy. Trong đó, nghiệm thức B3 bổ sung 1,5 mg/1 BA có tỉ lệ mẫu phát sinh chồi cao nhất đạt 90,47%. Kế đến là nghiệm thức A2 với nồng độ BA 1,0 mg/l cũng có tỉ lệ hình thành chồi khá cao đạt 80,95% nhưng không có khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức B1 và B4. Tỉ lệ mô sẹo hình thành chéi thấp nhất ở nghiệm thức B5 với nồng độ 2,5 mg/l BA (42,86%). Ngoài ra, nghiệm thức BI đến B3 cho thấy tỉ lệ hình thành chồi tăng tỉ lệ thuận với nồng độ BA từ 0,5 - 2,0 mg/l tương ứng với tỉ lệ 61,90 - 90,47%. Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng nồng độ BA từ 1,5 mg/1 lên 2,5 mg/l thì tỉ lệ mẫu phát sinh chồi từ mô sẹo giảm từ 90,47% xuống còn
42,86% (nghiệm thức B4, B5) (Bang 4.7).
31