3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 03/2023 đến tháng 07/2023 tại Công ty Cổ phần Công Nghệ Sinh Học Cây Giống Việt Nam.
3.2. Vật liệu nghiên cứu
3.2.1. Đối tượng nghiên cứu
Cây Kim phát tài được mua từ vườn ươm về chăm sóc đề cây thích nghi với điều kiện môi trường. Đề tiến hành các thí nghiệm, chọn các mẫu lá khỏe, không quá giả và không quá non, lá phải nguyên vẹn, không sâu bệnh, sau đó cắt gọn cuống lá. Các mẫu lá sau khi được cắt gọn phải tiến hành khử trùng mẫu cấy ngay.
Hình 3.1. Mẫu lá Kim phát tài ding làm vật liệu nuôi cấy 3.2.2. Trang thiết bị và dụng cụ
Phòng chuẩn bị môi trường, dụng cụ thí nghiệm gồm: máy khuấy từ, máy đo pH, cân điện tử, nồi hấp vô trùng Autoclave, tủ lạnh, cốc dong, pipet. Phòng này dé chuẩn bị và khử trùng môi trường cũng như dụng cụ nuôi cấy, bảo vệ các môi trường dự trữ.
Phòng cấy: tủ cấy vô trùng, đèn cồn, dụng cụ cay (dao, kéo, pence, dia), cén 90°, cồn 70°, bình đựng cồn, giấy cấy, bông. Day là phòng tiến hành các thao tác nuôi cấy,
16
phòng này cần phải hạn chế tối thiểu sự gây bụi, phòng phải kín gió. Phòng có hệ thống
đèn UV khử trùng.
Phòng tăng trưởng: kệ để mẫu sau cấy (có hệ thống đèn chiếu sáng), máy điều hòa
nhiệt độ. Phong có buông sáng và buông tôi. Buông tôi dùng dé nuôi cây mô sẹo và các
mẫu đặc biệc khác. Buông tối cần tất cả thiết bị như buồng sáng nhưng không cần hệ thống đèn chiếu sáng.
3.2.3. Môi trường và điều kiện nuôi cấy
Bảng 3.1. Thành phần môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962)
Hóa chất Nồng độ (mg/l)
KNO3 1900 NH4NOs3 1650 Da luong MgsS0O4.7H20 370
CaCl2.2H20 440 KH¿PO¿ 170 CoCh.6H20 0,025 CuSO4.5H20 0,025 H3PO3 6,2 Vi luong KI 0,83
MnS0O4.4H20 22,3 Na2Mo0O4.2H2O0 0,25 ZnSO4.H20 8,6 Na2EDTA.2H20 37,3 Fe - EDTA
FeSO4.7H20 27,8 Glycine 2,00 Myo-Inositol 100 Vitamine Nicotonic acid 0,50
Pyridoxine HC] 0,50 Thiamine - HCl 0,10
17
Hóa chất khử trùng mẫu: cồn 70°, javel, tween 80, dung dịch HgC]›, khang sinh,
xà phòng Sunlight.
Môi trường được sử dụng dé nuôi cấy trong các thí nghiệm này là môi trường khoáng cơ ban MS (Murashige va Skoog, 1962) có bổ sung đường đường 30,0 g/l và agar 0,6 g/l. Ngoài ra các chất điều hòa sinh trưởng thực vật được bổ sung vào môi trường với nồng độ tùy theo từng thí nghiệm, chất điều hòa sinh trưởng 2.4 - D được sử dụng để nuôi cay tạo mô seo, chất điều hòa sinh trưởng BA được sử dụng dé nuôi cấy tạo chéi và nhân chồi. Ngoài ra, sử dụng chất điều hòa sinh trưởng IBA làm chất nền trong thí nghiệm nhân chồi. Môi trường sau khi pha được điều chỉnh pH ở 5,8, sau đó cho vào hũ nhựa đậy kín nắp, được hấp khử trùng bằng néi hấp Autoclave ở nhiệt độ
121°C, áp suất 1 atm trong 20 phút.
Điều kiện nuôi cấy: tùy theo từng giai đoạn thí nghiệm, các mẫu cấy được nuôi cấy trong điều kiện tối hoàn toàn hoặc dưới ánh sáng trắng với cường độ chiếu sáng 16 giờ/ngày, nhiệt độ đao động từ 23 °C đến 27°C, độ am từ 60 đến 65%.
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Khử trùng mẫu cấy
Các mẫu lá Kim phát tài nguyên vẹn, khỏe, không sâu bệnh được cắt gọn cuống lá được xử lí sơ bộ bằng cách ngâm mẫu trong xà phòng Sunlight pha loãng trong 1 phút và dùng bông lau sạch mẫu dưới vòi nước máy, sau đó dùng bông lau khô và đưa mẫu vào bình vô trùng để chuyên vào tủ cấy tiếp tục khử trùng. Trong tủ cấy, ngâm và lắc mẫu trong dung dịch javel 5% thêm vào 0,5 ml Tween 80 trong 10 phút, sau đó rửa lại với nước vô trùng 3 lần. Tiếp theo, ngâm va lắc mẫu trong dung dịch HgCh 0,1% thêm 0,5 ml Tween 80 2 lần, mỗi lần 5 phút và rửa lại bằng nước vô trùng 3 lần. Chuyển mẫu sang bình vô trùng khác và tiễn hành ngâm lắc mẫu trong kháng sinh nồng độ 200 mg/l thêm 0,5 ml Tween 80 2 lần, lần đầu 20 phút và rửa lại bằng nước vô trùng 3 lần; lần 2 15 phút và rửa lại bằng nước vô trùng 3 lần. Mẫu lá sau khi khử trùng được sử dụng dé bố trí vào các nghiệm thức ở các thí nghiệm 1, 2, 3.
3.3.2. Khảo sát tác động của 2,4 - D đến khả năng hình thành mô seo từ lá cây Kim
Phát Tài
Năm 2021, Rohollahi và cộng tác viên đã nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nito và chất điều hòa sinh trưởng 2,4 - D lên quá trình hình thành mô sẹo từ lá Kim phát tài, kết qua cho thấy khả năng tạo mô seo và tăng trưởng tốt nhất trên môi trường 1/2 MS
18
bé sung 9,5 uM 2,4 - D. Lê Văn Tường Huân và Lê Thị Trang (2015) đã có nghiên cứu tạo mô sẹo từ mẫu lá và cuống lá Kim phát tài trên môi trường MS bồ sung chất điều hòa sinh rưởng 2,4 - D và BA, kết quả sau 2 tháng cho thay mau trên tat cả môi trường bồ sung 2,4 - D và BA có có sự hình thành mô seo. Từ đó cho thấy việc nghiên cứu về sự hình thành mô sẹo đã chịu tác động của nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật auxin đặc biệc là 2,4 - D được sử dụng riêng lẻ hoặc kết hợp với nhóm chất cytokinin (BA). Chính vì vậy, mục tiêu của thí nghiệm này là xác định được nồng độ tối ưu của chất điều hòa sinh trưởng 2.4 - D kết hợp với 1,0 mg/1 BA cho sự hình thành mô sẹo từ
lá cây Kim phat tài.
Cách tiến hành: lá cây Kim phat tài sau khi khử trùng, được cắt thành các mảnh có kích thước khoảng lcm x 2em. Các mẫu mảnh lá được cấy trên môi trường cơ bản MS bồ sung 2,4 - D ở các nồng độ khác nhau kết hợp với 1,0 mg/l BA được bồ trí theo từng
nghiệm thức sau (Bang 3.1).
Mô tả thí nghiệm: thí nghiệm gồm 5 nghiệm thức được bồ trí theo kiểu đơn yếu tố hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi nghiệm thức lặp lai 3 lần, mỗi lần lặp lại 9 mẫu. Tổng số mẫu thí nghiệm là 5x3x9 = 135 mẫu.
Bảng 3.2. Khảo sát sự hình thành mô sẹo từ mẫu lá cây Kim phát tai
Nghiệm thúc Môi trường BA (mg/l) 2,4 - D (mg/l) Tổng số mẫu
Al MS 1,0 0,5 27 A2 MS 1,0 1,0 27 A3 MS 1,0 La ZT A4 MS 1,0 2,0 27
A5 MS 1,0 VIỆC 27
Ghi nhận chỉ tiêu theo đối sau 2 tuần và 4 tuần:
Ð Số mẫu hình thành sẹo 3 Số mẫu đã cấy
Tỉ lệ mẫu hình thành mô sẹo (%) = x 100
Thời gian xuất hiện mô sẹo (ngày), ghi nhận từ thời điểm mẫu có hiện tượng cong
lên, mô sưng phù.
Hình thái và màu sắc mô sẹo, quan sát mẫu hình thành mô sẹo dạng nốt, chắc hoặc dạng xốp, màu trắng hoặc màu vàng. Tình trạng mẫu có biểu hiện hóa nâu hoặc chết đều
được ghi nhận.
19
3.3.3. Khảo sát tác động của BA đến khả năng phát sinh chdi từ mô seo lá cây Kim
Phát Tài
Lê Văn Tường Huân và Lê Thị Trang (2017) đã có kết quả về nghiên cứu tái sinh cây từ mẫu cuống lá Kim phát tài trên môi trường MS bổ sung chất điều hòa sinh trưởng BA kết hợp 0,1 mg/l NAA, sau 3 tháng, tat cả môi trường có bé sung BA và NAA đều có mẫu có xu hướng tái sinh chỗi trực tiếp từ cuống lá, ở môi trường không có bổ sung BA không có chi hình thành. Năm 2022, Lê Thi Thúy và cộng tác viên đã có nghiên cứu về nhân giống in vitro cây trầu bà cung đàn (Philodendron ‘Jungle boogie’) một loài thuộc ho Araceae, trong nghiên cứu tái sinh chéi, chồi đỉnh được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung chất điều hòa sinh trưởng BA, kết quả cho thay trên môi trường khổng bổ BA không có sự hình thành chéi, môi trường bồ sung BA nông độ từ 0,5 mg/l đến 1,5 mg/l đều cho 100% tỉ lệ mẫu hình thành chéi. Từ đó có thể thấy vai trò của nhóm chat cytokinin đặc biệc là BA là rất quan trọng đối với quá trình hình thành chồi của cây. Chính vì vậy mục tiêu của thí nghiệm này là xác định được nồng độ tối ưu của chất điều hòa sinh trưởng BA cho sự phát sinh chéi từ mô sẹo lá cây Kim phát tai.
Cách tiến hành: chọn các mẫu mô sẹo khỏe, đồng đều phat sinh từ lá Kim phát tài ở thí nghiệm 1 cấy trên môi trường cảm ứng tạo chồi gồm môi trường cơ bản MS có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật BA ở các nồng độ khác nhau được bé trí theo
từng nghiệm thức sau (Bảng 3.2).
Mô tả thí nghiệm: thí nghiệm gồm 5 nghiệm thức được bố trí theo kiểu 1 yêu tố hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần 7 mẫu. Tổng số mẫu thí nghiệm là 5x3x7 = 105 mẫu.
Bảng 3.3. Khảo sát sự phát sinh chi từ mô sẹo mẫu lá cây Kim phát tai
Nghiệm thức Môi trường BA (mg/L) Tổng sô mẫu
BI MS 0,5 21 B2 MS 1,0 21 B3 MS 15 21 B4 MS 2,0 PA BS MS 255 21
20
Ghi nhận chỉ tiêu theo đõi sau 4 tuần và 8 tuần:
3 Số mẫu hình thành choi Ð Số mẫu đã cấy
Tỉ lệ mẫu hình thành chồi (%) = x 100 Thời gian hình thành chi (ngày)
Hình thái và màu sắc chồi hình thành, tình trạng mẫu có biểu hiện hóa nâu hoặc chết đều được ghi nhận.
3.3.4. Khảo sát tác động của BA đến khả năng nhân cụm chồi của cây Kim phát tài Ahawaah và cộng tác viên (2020) viên đã nghiên cứu về hiệu quả nhân chồi trên Trầu bà thanh xuân (Philodendron bipinnatifidum Schott ex Endl.), kết quả cho thay hiệu quả nhân chỉ chồi đạt cao nhất 6,3 chồi/mẫu khi môi trường bổ sung BA riêng lẻ, trong khi kết hợp giữa BA và IBA hoặc BA và NAA cho kết quả nhân chồi đạt lần lượt 10,9 chồi/mẫu và 9,4 chéi/ mẫu; hoặc ở Vạn lộc (4g/aonema ‘Valentine’) ghi nhận được cao nhất 2,5 chồi/mẫu khi bổ sung riêng lẻ BA va con số này cao hơn khi kết hợp BA và NAA đạt 4,0 chồi/mẫu (El-Mahrouk và ctv, 2016). Từ đó nhận thấy hiệu quả của việc kết hợp và sử dung 2 nhóm chất điều hòa sinh trưởng cytokinin và auxin ở một ti lệ phù hợp có tác động đến quá trình nhân chồi. Chính vì vậy mục tiêu của thí nghiệm này là xác định được nồng độ tối ưu của chất điều hòa sinh trưởng BA kết hợp 0,1 mg/1 IBA dé nhân nhanh cụm chi.
Cách tiến hành: các mẫu đã hình thành chồi chắc, khỏe và đồng đều ở thí nghiệm 2 được cấy trên môi trường nhân nhanh chồi gồm môi trường cơ bản MS bồ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật BA ở các nồng độ khác nhau kết hợp với 0,1 mg/l IBA được bồ trí theo từng nghiệm thức sau (Bảng 3.3).
Mô tả thí nghiệm: thí nghiệm gồm 5 nghiệm thức được bồ trí theo kiểu 1 yếu tố hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần 7 mẫu. Tổng số mẫu thí nghiệm là 5x3x7 = 105 mẫu.
Bảng 3.4. Khảo sát sự nhân chi dưới tác động của BA
Nghiệm thức Môi trường IBA (mg/l) BA (mg/L) Tổng số mau
Cl MS 0,1 0,0 21
€2 MS 0,1 0,5 21 C3 MS 0,1 1,0 21 C4 MS 0,1 1,5 21 C5 MS 0,1 2,0 21
21
Ghi nhận chỉ tiêu theo déi sau 4 tuần và 8 tuần nuôi cấy:
Số chồi trung bình của các lần lặp lại
Số chổi trung bình = =ẽ 3 Số mau đã cấy
Chiều cao trưng bình của các lần lặp lại
Chiều cao trung bình của chéi (em) = Tsien đt
Hình thái va mau sắc chồi hình thành, tinh trạng mẫu có biểu hiện hóa nâu hoặc chết đều được ghi nhận.
3.4. Phương pháp xử lí số liệu
Số liệu được tính toán bằng phần mềm Microsoft Excel và xử lí thông kê bởi phân tích ANOVA bằng phần mềm Minitab 16. Các nghiệm thức được phân hạng theo Tukey’s HSD với mức P-value < 0,01. Đối với số liệu phần trăm, số liệu được chuyên đối theo công thức y = arcsin(x)/? trước khi xử lí thông kê, với x là số phần trăm trước khi xử lí thống kê.
22