Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Nghiên cứu đa dạng di truyền cây tràm trà (Melaleuca alternifolia) tại khu bảo tồn dược liệu Đồng Tháp Mười dựa trên chỉ thị sinh học phân tử ISSR

Do đó,nghiên cứu được tiễn hành nhằm mục tiêu đánh giá sự đa dạng di truyền của 30 mẫutram trà được thu thập tại khu bao tồn dựa trên chỉ thị sinh học phân tử ISSR để phục vụcho công tác

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ;

TRUONG ĐẠI HỌC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

Nganh hoc : CONG NGHE SINH HOC

Sinh viên thực hiện : TRƯƠNG THANH KIM NGUYET

Mã số sinh viên : 18126113

Niên khóa : 2018 - 2022

TP Thú Đức, 08/2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ;

TRUONG ĐẠI HỌC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYEN CÂY TRAM TRA

(Melaleuca alternifolia)TẠI KHU BAO TON DƯỢC LIEU DONG THAP MƯỜI DUA TREN CHỈ THỊ SINH HỌC PHAN TU ISSR

Hướng dẫn khoa hoc Sinh viên thực hiện

TS PHAM ĐỨC TOÀN TRƯƠNG THANH KIM NGUYET

TP Thủ Đức, 08/2023

mọi điều kiện cơ sở vật chất và luôn động viên tinh thần lúc em gặp khó khăn, vì thế mà

em mới hoàn thành khóa luận tốt nghiệp một cách chỉnh chu và tốt nhất

Tiếp đến, em xin gửi lời cảm ơn đến dược sĩ Bùi Đắc Thắng và các anh, chị thuộcTrung tâm Nghiên cứu Bảo tồn và Phát triển Dược liệu Đồng Tháp Mười đã cung cấp

và hỗ trợ em thu thập nguồn mẫu cho nghiên cứu của khóa luận này

Đồng thời, em cũng xin gửi lời cảm ơn đến tập thé anh chị, em, bạn bè của phòngSinh học Phân tử - 205 thuộc Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường đã

giúp đỡ, hướng dẫn và góp ý xuyên suốt quá trình em thực hiện khóa luận

Lời cảm ơn cuối cùng con xin trân trọng gửi đến gia đình con vì đã luôn theo dõi,

hỗ trợ và an ủi con trong suốt quãng đường con học đại học, và sẽ luôn là chỗ dựa vững

chắc giúp con vượt qua những khó khăn, rảo cản trong cuộc sông, là một động lực to

lớn dé con phấn đấu và né lực hết mình trên các chặng đường tiếp theo của cuộc đời

Em xin chân thành cảm ơn!

XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN

Tôi tên: Trương Thanh Kim Nguyệt, MSSV: 18126113, Lớp: DH18SHD thuộc ngànhCông nghệ Sinh học Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, xin cam đoan: Day

là Khóa luận tốt nghiệp đo bản thân tôi trực tiếp thực hiện, các số liệu và thông tin trong

nghiên cứu là hoàn toàn trung thực và khách quan Tôi xin hoản toàn chịu trách nhiệm

trước Hội đồng về những cam kết này

Tp Hô Chí Minh, ngày tháng năm 2023

Người viết cam đoan

(Ký và ghi rõ họ tên)

l

TÓM TẮT

Cay tram trà (Melaleuca alternifolia), một loài cây cho tinh dau từng được xem la

“bí mật quốc gia của Úc” bởi tính chất dược liệu kháng khuẩn tốt mà nó mang lại Sau

đó, cây được du nhập về Việt Nam nhằm khai thác tính chất dược liệu này, đặc biệt là

tại khu bảo tồn dược liệu Đồng Tháp Mười ở huyện Mộc Hóa, tỉnh Long An Do đó,nghiên cứu được tiễn hành nhằm mục tiêu đánh giá sự đa dạng di truyền của 30 mẫutram trà được thu thập tại khu bao tồn dựa trên chỉ thị sinh học phân tử ISSR để phục vụcho công tác di thực và bảo tồn Trong nghiên cứu này, tiễn hành ly trích DNA từ mẫu

lá và thực hiện phản ứng PCR khảo sát 1 mẫu bắt kì với 20 primer ISSR Sau phản ứng,

chọn lọc được 10 primer (UBC810, UBC825, UBC840, UBC841, UBC843, UBC844,

UBC845, UBC848, UBC854, UBC855) cho tỉ lệ đa hình cao và thực hiện tiếp phản ứngPCR — ISSR với tat cả 30 mẫu tram trà Kết quả thu được sẽ dựa vào hệ số tương đồngDICE, kiểu phân nhóm UPGMA trên phần mềm NTSYSpe 2.1 dé dựng cây phân loại

di truyền Tổng cộng có 98 băng được tạo ra trong đó 84 băng đa hình chiếm tỷ lệ 85,7%

Hệ số khoảng cách di truyền của các mẫu tràm trà nằm trong khoảng từ 0,09 — 0,43 (hệ

số tương đồng di truyền từ 0,57 — 0,91) Kết quả nghiên cứu đã chia 30 mẫu tram trà

thành 5 nhóm ở hệ số khoảng cách di truyền trung bình 0,26 Kết quả cho thấy sự đadạng di truyền không quá cao giữa 30 mẫu tràm trà được sử dụng trong nghiên cứu

Từ khóa: Cây tram trà, Melaleuca alternifolia, đa dang di truyền, ISSR primer, khubảo tồn dược liệu Đồng Tháp Mười

ill

Tea tree (Melaleuca alternifolia), an essential oil-producing tree, was once

considered "Australia's national secret" because of its good antibacterial medicinal properties After that, the tree was imported to Vietnam to exploit these medicinal properties, especially in Dong Thap Muoi medicinal reserve in Moc Hoa district, Long

An province Therefore, the study was conducted with the aim of evaluating the genetic

diversity of 30 tea tree samples collected at the reserve based on the ISSR molecular marker for migration and conservation In this study, DNA was extracted from leaf

samples and PCR was performed to examine any sample with 20 ISSR primers After

the reaction, 10 primers (UBC810, UBC825, UBC840, UBC841, UBC843, UBC844, UBC845, UBC848, UBC854, UBC855) were selected for high polymorphism and PCR

- ISSR was run with all 30 samples of tea tree The obtained results will be based on the DICE similarity coefficient, the UPGMA (Unweighted Pair -group Method with Arithmetic Mean) clustering type on NTSYSpe 2.1 software to build a genetic classification tree A total of 98 bands were generated, 84 of which polymorphic bands account for 85.7% The genetic distance coefficient of the tea tree samples ranged from 0.09 to 0.43 (genetic similarity coefficient from 0.57 to 0.91) The results of the study divided 30 tea tree samples into 5 groups, with the number of genetic distance

coefficients of 0.26 on average The results showed that the genetic diversity was not

too high among 30 samples of tea tree used in the study.

Keywords: Tea tree, Melaleuca alternifolia, genetic diversity, ISSR primer, the Dong Thap Muoi medicinal reserve

IV

MỤC LỤC

Trang

(CLS SS) eee iXÁC NHAN VA CAM ĐOAN -52 52221 11211211211211211211211211211211211 212221 1 re ii

QR I cts nda 1

1.2 000i v1 8< 21.3 N61 dung ảinìi i0 2

CHƯƠNG 2 TONG QUAN TAI LIBU 00 ccccsccsscssessessessessesessessessesssstssessessessessnsaeaeees 3

2.1 Giới thiệu về cây tram tra (Melaleuca alternifolia -©5z©22s++s++szzsz+sszs2 32.1.1 Nguồn gốc và phân bồ cây tram trà 2-2-2 S+SE+SE22E22E2E22E22E22122122222222222e, 32.1.2 Đặc điểm thực vật học của Gây WAM ca no giang G1016 411443514316315183485345531365559383ESSE 32.1.3 Giới thiệu về tinh đầu tram trà 2-2 SSS+2E+SE+EE£EE2EE22E22E22E22222122222222222222e, 42.2 Phân tích đa dạng di truyền dựa vào chỉ thị sinh học phân tử - 252 52.2.1 Khái niệm đa dạng di truyền 2-2- 2 2S22E22E22E22121221221221121121121121121222xxe 52.2.2 Một số phương pháp nghiên cứu đa dang di truyễn 2 2¿-552z52scsccsz 62.2.2.1 Phương pháp sử dụng các chỉ thị hình thái 55-55 c+cs2c+czsceereres 6 2.2.2.2 Phương pháp sử dụng các chỉ thị sinh học phân tử - Chỉ thị DNA 6

223 Mot s6 chi thi sinh hoc phan tử được sử dung phổ biến trong nghiên cứu đa dạng

Al tÍUVỂT go6666666650511651195551385501ELS5181GRES0S4SEIS83981855583955ESGGHIASESUSEES1SSSGGESESGAGSIS0RGGNGSSSESG431E3883588 if 2.2.3.1 Chỉ thi AFLP (Amplified Fragment Length PolymorphiIsm) - 7

2.2.3.2 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) - 7

2.2.3.3 Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repea†) - 5 5s cty 8 2.2.3.4 Kỹ thuật ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) - -c+-c+ccsereerrerrrrs 9

2.2.4 Giới thiệu phần mềm xây dựng cây phân loại di truyền NTSYSpe 2.1 112.3 Một số nghiên cứu trong va ngoài nước về đánh giá đa dang cây tram trà 12

CHƯƠNG 3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP - - 2-22+S+E+Ez£E2E+E£EzEzErsrxez 133.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 2 22222+2222E+2E2EE22E222122322212212222222ee2 13

3.2: Vat liệu V4;pHươn6 phap 11 Ch1EH! GỮU::sssssuassisssisssig15560814566053060063:GG388483 5414843858338 lỗ

EU / 08 .11 13

3.2.2 Phuong pháp TbhHhiEn!GỨN:ccsxicrsogyeiistictsistbitrsgliti4GS4GBEI0ISSNSIGG108SSGSIIBSg/IEEGSpHigig- 14 3.2.2.1 Đánh gia các chỉ tiêu hình thái lá 5-25 cee ee cee teceeteceeseeeeeeeteees 143.2.2.2 Quy trình ly trích DNA tổng sỐ -22- 22 22222222EE22EE2EE2EE2EEEEErcrrree 153.2.2.3 Định tính sản phẩm bang kỹ thuật điện di -2- 2 22222222EE2£E2Ez2zEzzxzred l6

3.2.2.4 Phản ứng PCR với chỉ thị ISSR -2-©22222S+2EE+2EE22EE22EE22212221222222222222-e 16

OR | a 18

CHƯƠNG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN 22252+222E22E22E22E22122222222222xe2 19

AV KGt huggäắid.D 194.1.1 Kết quả đánh giá chi tiêu hình thái lá tram trà 2 22-72¿222+22s++2sz+c+z 194.1.2 Kết quả ly trích DNA tổng số từ lá tram trà 2-2 52©5222+c2zz+zxerxrzred 204.1.3 Kết quả phản ứng PCR — ISSR -2- 2-©2222222222212212221221211221 2212221222 zEe 21

4.1.3.1 Khao sát nhiệt độ của các primer sử dụng cho phản ứng ISSR — PCR 21

31-37, Bie rhm.ECIE: với chil Hi TRBEEssueesssesesdodieosihiGdbsng00<SGDDA.0G501400:E0180.<0.06 224.1.4 Phân tích sự đa dang di truyền của 30 mau tram trà 2-22 225525522 26

DANH SANH CHU VIET TAT

Bp Base pair

Ctv Cộng tác viên

DNA Deoxyribonucleic acid

dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate

RAPD Random Amplified Polymorphic DNA

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphisms

AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism

ISSR Inter Simple Sequence Repeat

SSR Simple Sequence Repeat

SDS Sodium dodecyl sulfat

EDTA Ethylene Diamine Tetra acetic Acid

PCI Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol

CI Chloroform/Isoamyl alcohol

TAE Tris — Acetate -EDTA

TE Tris —EDTA

NTSYSpe Numerical Taxonomy System personal computer

UPGMA Unweighted Pair -group Method with Arithmetic Mean

SAHN Sequential agglomerative hierarchical non-overlapping

Vil

DANH SÁCH CÁC BANG

Trang

Bảng 3.1 Danh sách các mẫu tràm trà được thu thập tại Trung tâm bảo tồn được liệu

Đồng Tháp Mười, tỉnh Long An sử dụng cho nghiên cứu -2- 2255222222222 14

Bảng 3.2 Danh sách 20 primer cho phản ứng PCR — ISSR eee eee 17 Bang 3.3 Chu trình nhiệt cho phản wig PCR sec, 002110 k4 D2 an Han 4H 43054848//54 18

Bang 4.1 Chi tiêu chiều dai và chiều rộng của 30 lá tram trà - 2522522522522 20Bang 4.2 Nhiệt độ tối ưu của 10 primer được chọn 2 22©2252z22z+2zz2zz+zzz>sz 23Bang 4.3 Tổng hợp số băng của 10 primer được khảo sát -2-22525522 23Bang 4.4 Hệ số khoảng cách di truyền của 30 mẫu tram trà 2- 2522522522 28Bảng 4.4.(tt) Hệ số khoảng cách di truyền của 30 mẫu tram trà 2- 2-52 29

vill

Sơ đồ minh hoa các loại primer ISSR -2- 2 ©52+S2S22E22E£2E2Ezzzzzzzcez 10

Hình 2 mẫu lá tram trà đại điện 2- 2 2+2+2222+E+E22E2E£E22EzEzzzzrzxzxez 13

Kết quả điện di tổng số của 30 mẫu tram trà 2: 2¿©22+2s25z2c2z+2 21

Kết quả điện di sản phẩm PCR của 1 mẫu DNA với 20 primer ISSR ở nhiệt

ee ee ee 22

Kết quả điện di san pham PCR của 30 mau tram trà với primer UBC855 24Kết quả điện di san phẩm PCR của 30 mẫu tram trà với primer UBC854 25Kết quả điện di sản phẩm PCR của 30 mẫu tram trà với primer UBC844 27Cây phân nhóm di truyền 30 mẫu tram trà 2-2 222222zz+2zz2zzz2 30

1X

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Cay tram tra (Melaleuca alternifolia) hay còn gọi là tram lá hep, là một loài cây

thuộc họ Sim (Myrtaceae), chủ yêu được trồng dé sản xuất tinh dầu Loài cây này đượcxem là thuộc nhóm bí mật quốc gia của Australia từ trước năm 2006 Tràm trà là loàicây thân gỗ nhỏ, cao 2 — 3 m và cao nhất có thể đến 15 m thường được trồng trên đất

cát ven biên hoặc dat phèn ở địa hình cao ráo.

Tinh dau của loài cây này chứa các thành phần chính gồm Terpinen-4-ol, Terpinene, a-Terpinene, 1,8-Cineole từ lâu đã được nghiên cứu và sử dụng ở nhiều nơi

y-trên thế giới cho mục đích trị liệu và làm đẹp nhưng không hại da như: mỹ phẩm bôi da,

kem đánh răng hoặc dùng trực tiếp dé trị mụn cóc hoặc nam da Do tram trà là loài câytrồng cho hiệu quả kinh tế cao và ôn định nên được du nhập vào Việt Nam từ Nam raBắc để khai thác trọn vẹn giá trị của cây Và khu bảo tồn Đồng Tháp Mười tại huyệnMộc Hóa, tỉnh Long An với địa hình đất phèn phù hợp cho việc nuôi trồng và công tyMộc Hoa Trà thuộc khu bảo tồn chuyên sản xuất các sản phẩm từ tinh dau sẽ khai tháctrọn vẹn các giá trị từ cây Tuy vậy, những hiểu biết về nguồn gen cây tràm trà ở nước

ta vẫn còn nhiều hạn chế thế nên việc nghiên cứu, tìm hiểu về các đặc điểm của cây làmột cần thiết phải làm Thế nhưng, việc chỉ đánh giá các giống tràm trà qua những tiêuchí kiểu hình thường rất khó khăn dé nhận ra mối quan hệ giữa các giống tram trà Do

đó cần áp dụng chỉ thị phân tử nhằm xác định chính xác các giống là cách tiếp cận tốt

hơn nhằm nâng cao hiệu quả quản lý và sử dụng nguồn gen cây tràm trà Từ đó, có thêmnhững thông tin về quan hệ di truyền giữa các giống tràm trà, phục vụ cho công tác chọntạo giống theo những đặc tính mong muốn và bảo tồn nguồn tài nguyên của cây tại khu

bảo tôn.

Hiện nay, có rất nhiều phương pháp dé nghiên cứu sự đa dang di truyền của cácnguồn gen cây trồng như: AFLP, SSR, ISSR, RAPD, Trong giới hạn của nghiên cứunày phương pháp ISSR được sử dụng dé phân tích đa dạng di truyền một số mẫu tramtrà tại khu bảo tồn Đồng Tháp Mười tại huyện Mộc Hóa, tỉnh Long An

Đề tài được thực hiện nhằm cung cấp những thông tin về da dạng di truyền dé cócái nhìn khái quát, góp phan cho nghiên cứu bảo tồn và di thực các giống tram trà tạikhu bảo tồn cũng như trên cả nước.

1.2 Mục tiêu của đề tài

Nghiên cứu di truyền và phân nhóm di truyền cây tram trà dựa vào chỉ thị ISSR déphục vụ cho công tác di thực và bảo tồn cây tràm trà đùng cho mục đích dược liệu tạikhu bảo tồn dược liệu Đồng Tháp Mười, huyện Mộc Hóa, tỉnh Long An

1.3 Nội dung thực hiện

Nội dung 1: Đánh giá các chỉ tiêu về đặc điểm hình thái lá của 30 mẫu tràm tràđược trồng tại khu bảo tồn được liệu Đồng Tháp Mười Các đặc điểm hình thái bao gồm:hình dạng, mau sắc, kích thước lá,

Nội dung 2:

Ly trích DNA tổng số các mẫu tram trà được thu thập

Thực hiện phản ứng PCR — ISSR trên các mẫu tram trà sau khi ly trích DNA.

Xây dựng cây phân nhóm di truyền dựa trên kết quả của phản ứng PCR — ISSRbằng phần mềm thống kê di truyền NTSYSpc 2.1

Đánh giá sự đa dạng di truyền của các mẫu tràm trà được thu thập tại khu bảo tồndược liệu Đồng Tháp Mười dựa trên kết quả cây phân nhóm di truyền đã xây dựng

CHUONG 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Giới thiệu về cây tram tra (Melaleuca alternifolia)

2.1.1 Nguồn gốc và phân bố cây tràm trà

Ñ Giới: Thực vat (Plantae)

¡ Ngành: Thực vật hạt kín (Angiospermae)

Lớp: Thực vật hai lá mầm thật sự

(Eudicots)

Bộ: Dao kim nương (Myrtales)

Họ: Đào kim nuong/Sim (Myrtaceae)

Chi: Tram (Melaleuca)

"loài = Tram tra (Melaleuca alternifolia)

Cay tram tra (Melaleuca alternifolia (Maiden and Betche) Cheel.), thuộc họ Sim

(Myrtaceae), có nguồn gốc từ Australia (Cheel, 1924) Loại cây này có xuất xứ từ Úc,

cụ thé là đông nam Queensland và bờ biển phía bắc với dãy liền kề của New South

Wales, nơi nó mọc đọc theo suối và trên đầm lay, đây là một loại cây phổ biến ở Uc

Theo Rossetto và ctv (2003), cây tràm trà là nguồn thực vật chính cho ngành công nghiệptỉnh dầu tràm của Úc Cây tràm trà có khả năng thích ứng cao với nhiều điều kiện, sinhtrưởng được trên trên đât sét, đât mặn ven biên, đât ngập nước và cả đât đôi núi cao.

2.1.2 Đặc điểm thực vật học của cây tràm trà

Cây tram trà là một loài cây bụi với tan ram rap, có thể cao tới khoảng 7 m, vỏ cónhiều lớp như giấy, màu trắng Đặc điểm nỗi bật của tram trà là sau khi trồng 1 — 2 năm

có thé khai thác lần đầu, sau đó khai thác cây chéi hàng năm trong hơn 20 năm, nên làloài cây trồng có hiệu quả kinh tế cao và ôn định

Do tính đa dạng về hình thái và khả năng thích ứng với điều kiện môi trường nên

việc mô tả cũng rất khó khăn Hầu hết các tài liệu chỉ tập trung vảo một số đặc điểm

hình thái chính được mô tả dưới đây.

Về hình thái lá, các lá sắp xếp xen kẽ, đôi khi mọc rải rác hoặc mọc thành chùm.Các lá nhẫn, mềm, phiến lá thắng nhọn, có chiều đài lá là 10 — 35 mm và chiều rộng làkhoảng 1 mm Các lá giàu tinh dầu, các tuyến dầu nổi rõ trên lá cây có thé nhìn thaybằng thấu kính Về hình thái hoa, những cây trên 3 năm tuổi thường ra hoa vào tháng

10 và tháng 11 và hoa mọc thành từng chùm hoặc rời rạc mảu trắng đến màu kem ở nách

lá hoặc đầu cành, có thê khiến cây có vẻ ngoài “mềm mại” (Carson và Riley, 1993).Cụm hoa nhiều hoa, mọc thành chùm dày đặc, ở nách lá hoặc đầu cành; hoa đơn độctrong mỗi nách lá với đài hoa hình ống dai tới 3 mm va tràng hoa màu trang dai 2 — 3

mm, nhụy hoa dài 3 — 4 mm Quả của cây tràm trà là quả nang chứa nhiều hạt nhỏ bêntrong, có hình cầu như quả măng cụt, hóa gỗ, có đường kính 2 — 3 mm nằm rải rác đọc

theo cảnh.

2.1.3 Giới thiệu về tỉnh dầu tràm trà

Theo Carson va ctv (2006), tinh dau từ cây tram trà đã được sử dụng gần 100 năm

ở Úc nhưng hiện đã có mặt trên toàn thế giới dưới dang tinh dầu nguyên chat và là một

thành phan phụ trong một loạt các sản phẩm với công dụng kháng khuẩn Úc cũng lànước có lich sử sản xuất tinh dau tram tra hơn 60 năm, có nhiều công trình nghiên cứu

về cải thiện giống cho loài cây này Hiện nay 97% tinh dau thương phẩm của nước này

được sản xuất từ các khu trồng tram trà ở vùng ven biển phía bắc New South Wales và

Atherton của Queensland Ngoài ra, Indonesia, Trung Quốc, An Độ là những quốc gia

có sản lượng lớn tinh dau tram tra

Vào năm 1989, Wiliams và Home đã chia tinh dầu tram tra (tea tree oil) thành 3nhóm là: Nhóm 1 có 1,8-cineole thấp (3%) và terpinen-4-ol cao (45,4%), nhóm 2 có 1,8-

cineole trung bình (30,3%) và terpinen-4-ol trung bình (18%), nhóm 3 có 1,8-cineolecao (64,1%) và terpinen-4-ol thấp (1,7%) Nhóm tỉnh dầu giàu terpinen-4-ol được sản

xuất nhiều nhất tại Australia và là nhóm có giá trị nhất (Khả và ctv, 2018) Bên cạnh đó,thành phan của tinh dau tram tra rất biến động theo các điều kiện địa lý, môi trường,sinh thái ven biển khác nhau

Tram trà giàu terpinen-4-ol là loại đa tác dụng, không hại da, được sử dụng trong

nhiều lĩnh vực đời sống như nước súc miệng, mỹ phẩm bôi da, nước hoa, dầu gội đầu,

xà phòng thơm, kem đánh răng (Brophy và ctv, 2013) Tĩnh dầu tràm trà cũng đượcdùng chữa một số bệnh ngoài da thông thường như mụn trứng cá, mụn cóc, mụn nhọt,

mụn rộp, bỏng, côn trùng căn, bệnh nam móng tay, bệnh nam da bàn chân, m6 hôi chan (Trịnh Thị Điệp và ctv, 2012).

Cây tràm trà được đưa về khảo nghiệm ở Việt Nam từ năm 1993, tràm trà trồng ởViệt Nam và trồng ở Australia (Tiêu chuẩn Australia-A.S.2782) có các chỉ số vật lýtương đương nhau) Các mô hình thí điểm tràm trà được trồng ở miền Bắc nước ta cótạo ra tinh đầu có hàm lượng terpinen-4-ol đạt 33 — 43% Hiện tại đang được mở rộngquy mô sản xuất, ứng dụng Mặc dù chưa ghi nhận về trường hợp tử vong nào được báocáo trong tai liệu y khoa, nhưng tinh dau tram không được uống với lượng tương đối

cao do độc tính của nó Hiện tại, tiêu chuẩn của Uc (AS 2782-1985) đang quy định hàmlượng của hai thành phan: terpinen-4-ol, hợp chất kháng khuẩn giả định, phải có ít nhất

30% trong tinh dầu tram, trong khi 1,8 -cineole, được cho là chat gây kích ứng da, không

được vượt quá 15% trong các sản phẩm từ cây tram tra (Carson và ctv, 2006).

Tại Long An, tram tra được trồng trên khu vực đất phèn thuộc huyện Mộc Hóa

và Thạnh Hóa Cây sinh trưởng khá tốt nếu áp dụng đúng quy trình kỹ thuật, đặc biệtcây chịu được phèn nặng nhưng phát trién tốt ở vùng đất cao ráo Diện tích cây tram tratrên địa bàn huyện Thạnh Hóa khoảng 10 ha Và tại khu bảo tồn Đồng Tháp Mười(huyện Mộc Hóa) đã phát triển cây tràm trà với diện tích khoảng 15 ha với dây chuyền

sản xuất tinh dau tram tra (Nhà máy Mộc Hoa Tràm) đạt tiêu chuan GPP, bảo đảm nguồn

dược liệu sạch Cây tràm trà là 1 trong 2 đề tài khoa học cấp quốc gia mà Khu bảo tồn

đang thực hiện.

2.2 Phân tích đa dạng di truyền dựa vào chỉ thị sinh học phân tử

2.2.1 Khái niệm đa dạng di truyền

Da dang di truyền là tất ca các gen di truyền khác nhau của tat cả các cá thé thựcvật, động vật, nam, và vi sinh vật Da dang di truyền ton tại trong một loài và giữa các

loài khác nhau.

Đa dang di truyền là sự đa dang về thành phan gen giữa các cá thé trong cùng mộtloài và giữa các cá thể khác loài, sự đa dạng di truyền còn là sự đa dạng về thành phầngen có thé di truyền trong một quan thé và giữa các quan thé khác nhau của cùng mộtloài.

Quá trình sinh trưởng và phát triển qua nhiều thế hệ tạo ra các biến dị làm đa dạngnguồn gen trong quan thé Da dạng di truyền có ý nghĩa quan trọng đối với quan thé déthích nghi với những biến đổi của môi trường Nghiên cứu đa dạng di truyền giúp đánhgiá nguồn tài nguyên di truyền của một một tập đoàn giống hay vật nuôi từ đó giúp choviệc sử dụng tải nguyên di truyền một cách hiệu quả hơn, giúp xác định sự khác nhau

về mặt di truyền từ đó ứng dụng trong chọn giống tạo ưu thế lai

Sự khác biệt về di truyền ở các cá thể trong cùng một giống hay giữa các giốngtrong cùng một loài có thể biểu hiện hay không biểu hiện ra bên ngoài thành tính trạng.Nhờ có sự phát triển của khoa học kĩ thuật trong sinh học, con người đã tìm ra nhữngphương pháp khác nhau dé nhận biết sự khác nhau giữa cá thé và quan thé trong cùng

một loài, được gọi là các chỉ thị (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999)

2.2.2 Một số phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền

2.2.2.1 Phương pháp sử dụng các chỉ thị hình thái

Sự đa dạng di truyền có thê phát hiện thông qua các tính trạng hình thái Gen mãhóa cho một sản phâm xác định, khi sản phẩm của gen là protein biểu hiện tinh trang rabên ngoài thì gen này có liên kết đến tính trạng hình thái Sự khác nhau của cùng mộttính trạng ở các cá thé khác nhau có thé được sử dụng làm chỉ thị hình thái dé phan biét

Tuy nhiên, do gen di truyền trong cá thé có thé biểu hiện hoặc không biểu hiện rathành kiểu hình cho nên việc sử dụng chỉ thị hình thái có nhiều bat lợi trong đánh giá sự

đa dạng di truyền Ngoài ra, các dấu hiệu hình thái có thé bi ảnh hưởng nhiều bởi tác

động của môi trường mà DNA thì không Đặc biệt, các loài phức hợp như chi, có đơn

vị phân loại là trạng thái vô định hình do sự xuất hiện thường xuyên của sự lai chéo,apomixes, đa bội và chồi đột biến (Kumar và ctv, 2011) Do đó, chi thị hình thái chỉthường được sử dụng dé bồ trợ cho các chỉ thi mang tính chính xác hơn khác

2.2.2.2 Phương pháp sử dụng các chỉ thị sinh học phân tử - Chỉ thị DNA

Khoa học kỹ thuật trong lĩnh vực sinh học phát triển giúp cong người có thé tác

động ở cấp độ phân tử đã mở đường cho sự ra đời các chỉ thị phân tử DNA Chỉ thị phân

tử có thé là bất cứ chuỗi DNA nao có thé phân biệt được hai cá thé hoặc hai giống khác

nhau Làm cho việc đánh giá đa dạng đi truyền ở thực vật ngày nay trở nên đơn giảnhơn, chỉ phí thấp, đáng tin cậy và thực hiện được trong thời gian ngắn hơn so với cách

truyền thống Những kỹ thuật này có thể được chia ra làm 2 nhóm chính dưới đây.

Những kỹ thuật dựa trên kỹ thuật PCR: AFLP, RAPD, SSR, ISSR.

Kỹ thuật dựa trên kỹ thuật lai DNA — DNA: tiêu biéu là RFLP

2.2.3 Một số chỉ thị sinh học phân tử được sử dụng phố biến trong nghiên cứu da

dạng di truyền

2.2.3.1 Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

Kỹ thuật AFLP được định nghĩa là sự da hình chiều dai các đoạn DNA đượckhuếch đại chọn lọc Phân tích AFLP được kết hợp cả RFLP và PCR, gồm 2 bước là cắtDNA bằng enzyme cắt giới hạn và dùng kĩ thuật PCR nhân đoạn DNA được chọn lọc

có gắn thêm adaptor có trình tự tương ứng với trình tự ở đầu đoạn DNA được phân cắt

Doan adaptor này gồm 2 phan: Phan trình tự thiết kế primer và phần trình tự đặc hiệu

cho vị trí cắt enzyme Các cặp primer thường tạo được từ 50 — 100 băng trong một phantích Sự khác nhau trong chiều dài các đoạn khuếch đại có thé do những thay đổi củacác base trong vùng trình tự primer, hoặc thêm, mat đoạn ở giữa hai vị trí cắt Thôngthường, enzyme cắt sử dụng trong AFLP là một cặp enzyme một enzyme hạn chế cắtkhông thường xuyên (EcoRI) và một enzyme cắt thường xuyên (Msel) (Nguyễn Đức

2.2.3.2 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

RAPD được định nghĩa là kỹ thuật đa hình DNA nhân bản ngẫu nhiên Cơ sở của

kỹ thuật RAPD là sự nhân bản DNA genome bằng phản ứng PCR với các primer ngẫunhiên dé tạo ra sự đa hình DNA do sự tái sắp xếp hoặc mắt nucleotide ở vị trí bat primer

(Welsh và ctv, 1990) Primer sử dụng cho kỹ thuật RAPD là các primer ngẫu nhiên (có

điều kiện), thường là 10 nucleotide, có trình tự biết trước và có nhiệt độ kéo dai primerthấp (34 - 37°C)

Kỹ thuật RAPD được thực hiện theo 4 bước cơ bản: Tách chiết DNA tổng SỐ,

Khuếch đại DNA bằng máy PCR, Điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamide,

Xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần mềm thông dụng (NTSYS) các số liệu

thu được cho thấy sự gần gũi hoặc cách biệt di truyền của các mẫu nghiên cứu

Kỹ thuật RAPD giúp nhận diện những chỉ thị phân tử trội nhưng có hạn chế làkhông nhận biết được cá thé di hợp RAPD là một phương pháp đánh giá đa hình nhanh

và hữu hiệu, chi phí thực hiện thấp Mặc dù vậy, kỹ thuật cũng gặp một số hạn chế Độchính xác không cao, kết quả không ổn định do độ dài primer ngắn dẫn đến nhiệt độ bắtcặp thấp

2.2.3.3 Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeat)

Ky thuật SSR là kỹ thuật chi thi dựa trên các tiểu vệ tinh (Microsatellite) hay chuỗilặp lại đơn giản Microsatellite là chuỗi mã di truyền lặp lại đơn giản tồn tại ngẫu nhiêntrong bộ gen sinh vật nhân thực Kích thước của đoạn sản phẩm là chuỗi lặp lại của 2 —

6 nucleotide.

SSR là chỉ thị đồng trội có thể xác định được cá thể dị hợp tử Vị trí củamicrosatellite trên nhiễm sắc thé có thé được xác định bang PCR từ một lượng DNA ratnhỏ Xác định microsatellite PCR trên một loài nào đó thì có thé áp dụng trên những

loài khác có quan hệ họ hàng SSR là kỹ thuật chỉ thị phân tử quan trọng trong cả động

vật và thực vật Việc phát triển chỉ thị SSR được tiến hành theo một số bước như: Xâydựng thư viện SSR, xác định locus SSR, xác định vùng phù hợp dé thiết kế primer, PCRvới các primer được thiết kế , đánh giá và phân tích mẫu băng , đánh giá đa hình của sảnphẩm PCR Bên cạnh những những điểm mạnh, chỉ thị SSR cũng còn một số hạn chế.Cần phải biết được trình tự genome của đối tượng dé thiết kế các cặp primer đặc thù vàtối ưu hóa điều kiện các primer cho từng loài trước khi sử dụng

Hiện nay, SSR là chỉ thị được chọn cho các nghiên cứu hồ sơ pháp lý, di truyềnquan thé và nghiên cứu động vật hoang da Ở thực vật SSR được sử dụng trong nghiêncứu đa dang di truyền, trong chon cặp lai, trong xác định con lai và trong lập ban đồ liênkết phân tử (Nguyễn Đức Thành, 2014)

2.2.3.4 Kỹ thuật ISSR (Inter Simple Sequence Repeat)

Nghiên cứu dau tiên về kỹ thuật chi thi phân tir ISSR được xuất ban năm 1994.ISSR là sự cải tiến của RAPD là kỹ thuật phân tích sự đa hình các phân đoạn DNA được

nhân bản ngẫu nhiên (Zietkiewicz và ctv, 1994) ISSR là kỹ thuật chuỗi lặp lại đơn giản

giữa (sử dụng PCR) và là kỹ thuật nhân bản đoạn DNA nằm giữa hai vùng lặp lại giốngnhau và ngược chiêu nhau.

Theo Zietkiewicz và ctv (1994), primer của PCR — ISSR là một primer don SSR

điển hình được gan thêm 1 — 4 bp chon lọc ngẫu nhiên được dùng dé tổng hợp nhiềuđoạn băng trên gel Nhằm tránh việc các primer có xu hướng trượt trên các đơn vị lặp

lại trong suốt quá trình lặp lại dan đến hình thành các vết mờ thay vì các băng rõ Kéodài thêm 1 hay vai nucleotide ở đầu 3’ và 5’ sẽ đảm bảo các primer bắt cặp chính xácvào các đoạn vệ tinh trên DNA mẫu Từ đó sẽ hạn chế được sự tự bắt cap của primerhay tao ra các vết mờ (Reddy va ctv, 2002)

Hai kỹ thuật SSR va ISSR đều liên quan đến các tiểu vệ tinh nhưng khác nhau ởtrình tự primer và đoạn DNA mục tiêu thu được ở hai kỹ thuật này Kỹ thuật SSR muốn

sử dụng phải biết được trình tự của gen từ đó mới tạo ra primer dé khuếch đại đoạn trình

tự lặp lại đơn giản Kỹ thuật ISSR thì trái ngược lại, bằng cách sử dụng các primer làcác trình tự lặp lại bồ sung với hai tiểu vệ tinh nên đoạn DNA mục tiêu thu được là đoạnnằm giữa hai tiêu vệ tỉnh đó

Các trình tự lặp lại hay các motif như (AG), (GA), (CT), (TC), (AC), (CA) cho

mức đa hình cao hơn các motif lặp lại như (AT) do các primer nay thường có xu hướng

tự bắt cap Cac motif được sử dụng như primer trong kỹ thuật ISSR có thể có 2 — 5nucleotide gắn bố sung ở đầu 3’ hoặc 5’ với 1 đến 4 nucleotide thoái hóa kéo đến các

chuỗi bên cạnh (Nguyễn Đức Thành, 2014).

Primer

3 AGAGAGAGAGAGAGAGNN ——> 5?

CTCTCTCTCTCTCTCTTCTCTCT

ISSR được nhân bản

Hình 2.2 Nhân bản chuỗi lặp lại nằm giữa hai chuỗi (CT)n ngược chiều nhau bằng

primer đơn (GA)n (A) Primer đơn (GA)n không neo có thé bắt cặp bat kỳ ở vị trí nào trong vùng (CT)u của DNA, (B) Primer đơn (GA)n có hai nucleotide (NN) neo ở dau 3’ bat cặp vào vùng đặc thà trên DNA khuôn và tạo băng rõ ràng (Nguyễn Đức Thanh, 2014)

Các sản phẩm khuếch dai của phản ứng PCR — ISSR thường dai 200 — 2000 bp và

có thé phát hiện được bang cả điện di trên gel agarose và polyacrylamide Kết quả saukhi điện di sản phẩm PCR — ISSR sẽ nhận được sự khác nhau trong phổ các phân đoạn

DNA được nhân ban Sự khác biệt đó được gọi là sự đa hình Vi vậy, tính đa hình được

nhận ra do sự có mặt hay không có mặt của một sản phẩm nhân bản (Valdemar và ctv,

2004).

Ưu điểm: Chỉ thị ISSR sử dụng các đoạn primer dài với nhiệt độ bắt cặp primer

cao nên phản ứng khuếch đại thường có độ 6n định hơn Sản phẩm khuếch đại có độ dàikhoảng nên có thể phân tách trên gel agarose

Kỹ thuật ISSR có một số lợi thé hơn so với các chỉ thị khác là có thé phân biệt

được các kiểu gen mà không cần thông tin về trình tự của cây nghiên cứu So với RAPD,

phương pháp này đơn giản, nhanh, và có độ chính xác cao hơn.

10

Nhược điểm chủ yếu của kỹ thuật ISSR là tạo ra chỉ thị trội nên không phân biệt

cứu đặc điểm di truyền trong quan thé, lấy dấu di truyền, đánh dấu gen, xác định cây

trồng, phân tích nguồn gốc, xác định sự thay đôi genome và đánh dấu con lai

2.2.4 Giới thiệu phần mềm xây dựng cây phân loại di truyền NTSYSpc 2.1

NTSYSpe là phần mềm thống kê chủ yếu dùng cho việc thống kê sinh học từ cáckết quả của chỉ thị sinh học phân tử như RAPD, ISSR, SSR Phần mềm NTSYSpc cóthé chuyên đổi dit liệu, ước tính sự tương đồng hoặc khác biệt giữa các đối tượng và

tóm lược các mối quan hệ bằng cách sử dụng phân tích cluster, xếp loại và phân tích

nhiều yếu tố Kết quả có thé được hiển thị cả dạng số và đồ thị

Ưu điểm: Phần mềm có nhiều chức năng điều chỉnh trong phần kết quả hiển thị

dang đồ thị (kiểu chữ, mau sắc, đường nét, dạng đồ thị) Nhược điểm: Hạn chế kiểu đữliệu đầu vào, dữ liệu từ file Excel phải qua bước chuyên đổi dữ liệu trung gian thành file

Notepad.

Đa dạng di truyền giữa các cá thể đánh giá dựa vào số băng đa hình hoặc tỷ lệ các

băng đa hình của các cá thể Số băng DNA đa hình hoặc tỷ lệ băng đa hình có thể daođộng từ 0 đến 100%, tỉ lệ băng đa hình càng lớn thì mức đa dạng cảng cao

Tỷ lệ băng đa hình được tinh bằng tổng số băng đa hình chia cho tổng số các băngghi nhận được theo công thức: P = npj/ nt Trong đó: P là tỷ lệ băng đa hình, npj là số

băng đa hình, n là tổng số băng ghi nhận được (Ng va Tan, 2015)

Quan hệ di truyền giữa các cá thể trong quần thể được đánh giá dựa vào hệ số

tương đồng di truyền (Genetic similarity coefficient) và hệ số không tương đồng di

truyền (Genetic dissimilarity coefficient) theo hệ số Dice qua công thức (Pham Thi

Trong đó: xy là số băng chung giữa 2 mẫu

x là số băng của mẫu x

y la số băng của mẫu y

Sxy là hệ số tương đồng của 2 mẫu, từ Sxy tính được khoảng cách ditruyền giữa x và y theo công thức: Dxy = 1 — Sxy

2.3 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về đánh giá đa dạng cây tràm trà

Ở Việt Nam, chưa tìm thấy nghiên cứu về đa dạng di truyền cây tràm trà sử dụng

chỉ thị ISSR Mặc dù vậy, Trần Thị Ngọc Trâm và ctv (2021), đã dùng phương phápRAPD để đánh giá đa dạng di truyền của 49 mẫu Tràm (Melaleuca spp.) thu ở một số

địa phương của Thừa Thiên Huế Cho thấy mức độ tương đồng di truyền giữa các quan

thể khá cao, đao động từ 0,891 đến 0,963

Ở nước ngoài, hiện tại vẫn chưa tìm ra các nghiên cứu liên quan đến việc đánh đa

dạng di truyền cây tràm trả sử dụng chỉ thị ISSR Tuy nhiên, với nghiên cứu của Butcher

và ctv (1992), cho thấy mức độ khác biệt giữa các quần thể tràm trà tại Úc thấp nhưng

có một tỷ lệ đáng ké (42%) là do sự khác biệt giữa các vùng địa lý New South Wales vaQueensland Sự tách biệt về mặt địa lý giữa 2 quan thé trên tương ứng với các thước đokhoảng cách di truyền Còn Rossetto và ctv (2003) đã phân tích đa dạng di truyền bằng

5 primer SSR trong 500 cá thé Melaleuca alternifolia đã tạo ra 98 băng, với mức đa hìnhkhoảng 90% Nghiên cứu này cho thấy mức độ giao phối cận huyết thấp ở một số quầnthé nhất định, cũng như mô hình trồng có khoảng cách đáng ké Chỉ có hai nhóm quan

thé Queensland và New South Wales tạo thành các nguồn gốc di truyền khác nhau do

sự cách ly về địa lý

12

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 8/2022 đến tháng 7/2023:

Địa điểm lay mẫu: Trung tâm bảo tồn dược liệu Đồng Tháp Mười tinh Long An

Địa điểm thực hiện: Phòng Sinh học Phân tử - 205, Viện nghiên cứu Công nghệSinh học và Môi trường — Trường Dai học Nông Lâm Thành phó Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Vật liệu

Sử dụng 30 mẫu lá tràm trà được thu thập tại Trung tâm Nghiên cứu Bảo tồn vàPhát triển Dược liệu Đồng Tháp Mười, tỉnh Long An làm vật liệu nghiên cứu

Hình 3.1 Hình 2 mẫu lá tram trà đại diện (4) la mẫu TT48, (B) là mẫu TT100, (C) là ảnh

chi tiết của mau TT48, (D) là ảnh chi tiết của mau TT100.

là

Bảng 3.1 Danh sách các mẫu tram trà được thu thập tại Trung tâm bảo tồn được liệu

Đồng Tháp Mười, tỉnh Long An sử dụng cho nghiên cứu

STT Tên mẫu Mã số mẫu

3.2.2 Phuong phap nghién ciru

3.2.2.1 Đánh gia các chỉ tiêu hình thái lá

Cách lay mẫu: Tiến hành lay mẫu ở những cây được chọn đã đánh số tại vườn

Mỗi cây thu từ 2 đến 3 nhánh, cho mẫu vào túi zip riêng, ghi nhãn dán day đủ bao gồmtên mẫu và thời gian thu mẫu Sau khi mang về cho vào tủ mát bảo quan dé tiến hànhđánh giá các chỉ tiêu hình thái lá và cho cả việc ly trích.

14

Đánh giá chỉ tiêu hình thái lá cơ bản bao gồm: Hình dạng lá, màu sắc lá non, màu

sắc lá già, chiều dài lá, Quan sát để đánh giá các chỉ tiêu như hình dang, màu sắc lá

và dùng thước đề đo đạc các chỉ tiêu như chiều dài lá, chiều rộng lá và ghi nhận kết quả

3.2.2.2 Quy trình ly trích DNA tong số

Phương pháp ly trích DNA từ mẫu lá non được tiến hành theo quy trình được pháttriển tại Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học NôngLâm Thành phố Hồ Chí Minh

Cách lay mau: dùng mau lá non Các mẫu đã được thu thập va cho vao túi zip baoquản trong tủ mát sẽ lay ra dé ly trích và khi ly trích xong thì bảo quản ở tủ đông (-20°C)

đề lưu trữ mẫu

Bước 1: Cho lá non vào eppendorf 1,5 ml (Pháp), thêm 300 ul dich ly trích gồm:

Tris 200 mM (pH = 8), EDTA 25 mM, NaCl 250 mM, SDS (Sodium dodecyl sulfat)

0,5%, tiến hành nghiền hỗn hợp trên bang chày nhựa cho đến khi mẫu min hoàn toàn

Sau đó, dùng pipet (Nichiryo — Nhật) và dau tip 100 ul — 1000 yl (Đức) cho thêm vào

eppendorf 300 ul dich ly trích và trộn đều

Bước 2: U hỗn hợp trên bằng bồn ủ nhiệt với nhiệt độ 65°C trong 40 phút

Bước 3: Sau khi ủ xong, mang hỗn hợp tiến hành ly tâm bằng máy ly tâm (Hettich

— Đức) với chu kỳ 10.000 vòng/phút trong 5 phút.

Bước 4: Dùng pipet và dau tip 100 pl - 1000 pl chuyển 400 ul dich nỗi sang

eppendorf mới Thêm 1V (V là thể tích dịch nổi hút vào) dung dich PCI

(Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol với tỉ lệ 25:24:1) và trộn đều

Bước 5: Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút Dùng pipet hút 300 pl dịch nổichuyền sang eppendorf mới

Bước 6: Thêm 1V dung dich CI (Chloroform/Isoamyl alcohol với tỉ lệ 24:1) vatrộn đều Sau đó ly tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút

Bước 7: Dùng pipet hút 200 ul địch nổi chuyển sang eppendorf mới Thêm 0,6V

dung địch Isopropanol và lắc nhẹ

Bước §: Mang hỗn hợp đi ủ lạnh - 20°C (tủ lạnh Sanyo - Nhật) trong 30 phút

15

Bước 9: Hết thời gian ủ lạnh mang hỗn hợp ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút

và loại bỏ dịch nôi.

Bước 10: Rửa DNA bang cách thêm 500 ul Ethanol 70%, sau đó ly tâm 12.000vòng/phút trong 3 phút và loại bỏ dich nồi

Bước 11: Lặp lại bước 10 một lần nữa

Bước 11: Phơi eppendoorf cho đến khi không còn dung dich

Bước 12: Thêm vào eppendorf có kết tủa DNA 50 pl dung dich TE 1X và bảo quan

15 phút.

Đồ gel vào khay đã gắn lược 13 giếng sẵn Chờ khoảng 30 phút thì gel đông đặc

hoàn toàn Kiểm tra gel đã đủ độ cứng, sau đó gỡ lược khỏi gel và đặt gel vào bề điện

di (máy điện di — Biorad) theo đúng chiều (đầu có giếng đặt ở cực âm nguồn điện) và

cho dung dịch đệm TAE 0,5 X vào ngập miếng gel

Các mau được bơm vào giếng với tỉ lệ 10 pl loading dye 5X và 5 ul DNA mau.Day nắp bồn điện di sau đó cắm điện Điện di DNA tổng số ở hiệu điện thé 100 V, trong

15 phút Sau đó kết quả được quan sát ở buồng chiếu tia UV

Kết quả điện di thé hiện sự hiện điện DNA có trong mẫu ly trích Các mẫu có chứaDNA sẽ xuất hiện một băng trên miếng gel sau khi được chiếu đèn UV và chụp ảnh.Những mẫu cho băng sáng rõ sẽ được tiếp tục thực hiện các quá trình tiếp theo

3.2.2.4 Phan ứng PCR với chỉ thị ISSR

Tiến hành sàng lọc 20 primer ISSR ở bảng 3.2 bằng cách chọn ngẫu nhiên mộtmẫu DNA dé chạy PCR với các primer trên để khao sát sự đa hình và tìm ra nhiệt độ bắtcặp (Ta) tối ưu của các primer ở 6 nhiệt độ từ 50°C - 55°C Chọn nhiệt độ mà tai đó kết

16

quả khảo sát cho sản pham rõ nhất Những primer cho sản phẩm có tỉ lệ đa hình cao,

băng sáng, rõ đạt tiêu chuẩn sẽ được giữ lại dé tiếp tục thực hiện phản ứng ISSR — PCR

với tất cả các mẫu.

Bảng 3.2 Danh sách 20 primer cho phản ứng PCR - ISSR

STT Tén primer Trinh tự primer (5’-3’)

R=(I1G); Y= (C, 1) (Behera va ctv, 2008; Anil và ctv, 2015)

Mẫu DNA sau khi được ly trích và bảo quản ở -20°C sẽ được pha loãng nồng độ

10 lần dé tiếp tục tiến hành phản ứng PCR

Phản ứng PCR với primer ISSR được thực hiện với phan ứng khuếch dai ở thé tích12,5 ul bao gồm: Master mix (Meridian Bioscience) với nồng độ đầu 2X và nồng độ

cuối 1X: 6,25 ul; primer (Sigma): 0,5 ul; DNA mau: 1 wl; nước khử ion: 4,75 wl Quá

trình mix mẫu DNA được thực hiện trong tủ an toàn sinh học cấp 2 Phan ứng PCR được

thực hiện trên máy PCR (Applied Biosystems 2720) với chu trình nhiệt ở bang 3.3.

Vi

Bảng 3.3 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR

Giai đoạn Nhiệt độ Chu kì Thời gian

Tiền biến tính 94°C | 2 phút

Biến tính 94°C 30 giây

Bắt cặp Te 40 45 giây

Kéo dai IPC 2 phút

Hau kéo dai TC | 10 phút

T°C: nhiệt độ tùy thuộc vào từng primer

Sản phẩm của phản ứng PCR-ISSR được điện di trên gel agarose 1,5 % trong môi

trường TAE 1X với điện thế 100V và thời gian điện di là 45 phút Thang chuẩn 1 kb

DNA được dùng làm thước đo kích cỡ của các đoạn DNA khuếch đại Sau đó, đọc kếtquả bằng tủ chiếu đèn UV và chụp hình, tiếp theo mã hóa dữ liệu và dùng cho các phântích số liệu

3.3 Xử lý số liệu

Từ kết qua phản ứng PCR với chỉ thị ISSR trên gel, dir liệu sẽ được chuyền thànhdạng ma trận nhị phân trên Excel Dữ liệu được mã hóa theo quy ước: Số “1” là có hiện

diện băng DNA, số “0” là không hiện diện băng DNA và thực hiện lần lượt với các

primer trong bài Ở hàng trên cùng ghi tên file với dau “ đầu câu Hàng thứ 2 cột đầutiên ghi số 1 (dữ liệu tổng hợp trên một file); cột số 2 ghi số hàng chứa dit liệu, cột thứ

3 ghi số cột chứa dữ liệu và thêm ky tự “L” phía sau, cột thứ 4 ghi số 0 (không có 6trồng di liệu)

Sau khi hoàn thành thống kê dữ liệu, sao chép tat cả dữ liệu sang Notepad (.txt)

dé đưa vào phần mềm NTSYSpc 2.1 dé xây dựng cây phân loại di truyền biéu diễn mối

quan hệ xa gần của giữa các cá thé thông qua xác định hệ số tương đồng di truyền hay

hệ số khoảng cách di truyền theo công thức của Nei (1972)

Dữ liệu được phân nhóm dựa vào hệ số tương quan Dice, kiểu phân nhóm sử dung

phương pháp nhóm đôi các giá trị trung bình số học UPGMA (Unweighted Pair group

Method with Arithmetic Mean) và biéu đồ cây phân loại đi truyền được vẽ theo phươngpháp SAHN (Sequential agglomerative hierarchical non-overlapping) trên phần mềm

NTSYSpe 2.1.

18

CHƯƠNG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả

4.1.1 Kết quả đánh giá chỉ tiêu hình thái lá tràm trà

Đánh giá các chỉ tiêu hình thái lá trên 30 mẫu tràm trà gồm: hình dạng lá, màu sắc

lá non, màu sắc lá già, chiều dài lá, chiều rộng lá Kết quả qua quan sát cho thấy các látram trà đều có kích thước nhỏ, lá có hình mũi mác, thon nhọn va lá mọc chi chit, xen

kẽ trên suốt chiều đài nhánh Lá non có màu xanh nhạt (xanh chuối), non mềm và lá già

có màu xanh đậm, dai cứng Chiều dài và chiều rộng lá được ghi nhận tại bang 4.1.Bảng 4.1 Chỉ tiêu chiều dài và chiều rộng của 30 lá tràm trà

Chiêu dài lá Chiều rộng lá

STT Nhận xét

(cm) (mm)

i 15-235 05-15 Lá có chiêu đài trung bình, hơi bầu

2 1,3 —1,7 0,8 — 1,2 La nho thon hep

3 1,3 —1,8 0,8 — 1,2 La nho thon hep

4 13-3 1-13 Lá có chiều dai, rộng lớn nhất

5 1,5 —2,5 0,7-1 Lá có chiều dài trung bình, thon hẹp

6 15—2 0,8 —1 Lá có chiều dai trung bình, thon hẹp

7 2-25 L=12 La dai thon hep

8 9.23 i132 Lá dai, chiều rộng hoi bau

9 1,8 —2,2 1—1,2 Lá dai thon hẹp

10 1,2 —1,5 0,8 —1 La nho thon hep

11 1,3 —1,7 0,7-1 La nho thon hep

i2 15-2 ie Lá có chiều dai trung bình, hơi bầu

13 l3 — 1¿7 0/1 Lá nhỏ thon hẹp

14 12 0,8 —1 Lá có chiều dai trung bình, thon hẹp

15 1,3 —1,7 0,7 -1 La nho thon hep

16 1,5 -235 1-—1,2 Lá có chiều đài trung bình, thon vừa

17 14-2 L=15 Lá có chiều đải trung bình, thon vừa

18 1,2-2 0,8 —1 La nho thon hep

19 2 25 1,1-—1,2 La dài thon vừa

20 1-2,5 1-1,1 La dai thon hep

21 1,2—-2 0,7 -1 La nho thon hep

52 L_# 05-1 Lá có chiều dai, rộng nhỏ nhất

23 18-34 Ì~14 Lá dài, chiều rộng hơi bầu

24 17-25 1-13 Lá dai, chiều rộng hơi bầu

25 1,3 — 1,7 0,8 —1 La nho thon hep

26 2-2,5 1-1,2 La dai thon hep

27 13-33% 12-13 Lá có chiều đài trung bình, hoi bầu

28 12-25 0,7—1 Lá có chiều dai trung bình, thon hẹp

29 1,3—2 0,8 —1 La nhỏ thon hep

30 1,5 —2,7 1-—1,3 La dài thon vừa

19

Theo ghi nhận các chỉ tiêu chiều dai và chiều rộng lá của 30 mẫu tram trà ở bang4.1, các mẫu tram trà có chiều dai từ 1 — 3 cm, và chiều rộng từ 0,5 — 1,5 mm Các lá cókích thước nhỏ có chiều dài là 1 — 1,5 em, chiều rộng là 0,5 — 0,9 mm Các lá có kích

thước trung bình có chiều dài là 1,6 — 2 cm, chiều rộng là 1 — 1,2 mm Các lá có kích

thước lớn có chiều dài là 2 — 3 em, chiều rộng là 1,2 — 1,5 mm Theo quan sát, mẫu số 4

(TT48) có lá cho kích thước lớn nhất và mẫu số 22 (TT100) có lá cho kích thước nhỏ

nhất so với các mẫu còn lại như hình 3.1 Từ các số liệu ghi nhận về kích thước của 30mẫu tram trà cho thấy sự chêch lệch không đáng kể giữa các mẫu nghiên cứu Nếu chỉdựa vào quan sát đặc điểm hình thái lá để phân biệt và nhận thấy sự khác biệt của các

đặc điểm di truyền là rất khó Thế nên, cần sử dụng phương pháp PCR với chỉ thị ISSR

dé đánh giá rõ hơn về sự đa dang di truyền của 30 mẫu tram trà

4.1.2 Kết quả ly trích DNA tổng số từ lá tràm trà

Kết quả điện di DNA tổng số của 30 mẫu lá tràm trà sau khi ly trích được trình bày

ở hình sau.

12 13 14 15

Hình 4.1 Kết quả điện di DNA tổng số của 30 mẫu tram trà Kỹ hiệu từ 1 — 30 dai điện

cho 30 mẫu tràm trà biểu thị ở bảng

Qua kết quả điện di cho thấy DNA tổng số của các mẫu tram trà đều cho băng sáng

rõ, biểu hiện DNA được ly trích đạt hiệu quả tốt và không có hiện tượng DNA bị đứt,

20