3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 8/2022 đến tháng 7/2023:
Địa điểm lay mẫu: Trung tâm bảo tồn dược liệu Đồng Tháp Mười. tinh Long An.
Địa điểm thực hiện: Phòng Sinh học Phân tử - 205, Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường — Trường Dai học Nông Lâm Thành phó Hồ Chí Minh.
3.2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 3.2.1. Vật liệu
Sử dụng 30 mẫu lá tràm trà được thu thập tại Trung tâm Nghiên cứu Bảo tồn và Phát triển Dược liệu Đồng Tháp Mười, tỉnh Long An làm vật liệu nghiên cứu.
22cm 20cm
Hình 3.1. Hình 2 mẫu lá tram trà đại diện. (4) la mẫu TT48, (B) là mẫu TT100, (C) là ảnh chi tiết của mau TT48, (D) là ảnh chi tiết của mau TT100.
là
Bảng 3.1. Danh sách các mẫu tram trà được thu thập tại Trung tâm bảo tồn được liệu Đồng Tháp Mười, tỉnh Long An sử dụng cho nghiên cứu
STT Tên mẫu Mã số mẫu 1 Tram trà số 31 TT31 2 Tram trà số 44 TT44 3 Tram trà số 45 TT45 4 Tràm trà số 48 TT48 5 Tràm trà số 73 TT73 6 Tràm trà số 74 TT74 7 Tram trà số 78 T758 8 Tram tra s6 79 TT79 9 Tram trà số 80 TT80 10 Tram tra s6 81 TTS81 11 Tram tra s6 82 TT82 12 Tram trà số 83 TT83 13 Tram tra s6 84 TT84 14 Tram tra s6 85 TT85 15 Tram tra s6 86 TT86 16 Tràm tra số 87 TT87 17 Tram trà số 95 TT95 18 Tram trà số 96 TT96 19 Tram trà số 97 TT97 20 Tram trà số 98 TT98 21 Tram trà số 99 TT99
= Tram trà số 100 TT100 23 Tram tra số 101 TT101 24 Tram tra s6 102 TT102 25 Tràm tra số 103 TT103 26 Tràm trà số 104 TT104 27 Tràm trà số 105 TT105 28 Tràm trà số 107 TT107 29 Tram trà số 108 TT108 30 Tram tra số 110 TT110
3.2.2. Phuong phap nghién ciru
3.2.2.1. Đánh gia các chỉ tiêu hình thái lá
Cách lay mẫu: Tiến hành lay mẫu ở những cây được chọn đã đánh số tại vườn.
Mỗi cây thu từ 2 đến 3 nhánh, cho mẫu vào túi zip riêng, ghi nhãn dán day đủ bao gồm tên mẫu và thời gian thu mẫu. Sau khi mang về cho vào tủ mát bảo quan dé tiến hành
đánh giá các chỉ tiêu hình thái lá và cho cả việc ly trích.
14
Đánh giá chỉ tiêu hình thái lá cơ bản bao gồm: Hình dạng lá, màu sắc lá non, màu sắc lá già, chiều dài lá,... Quan sát để đánh giá các chỉ tiêu như hình dang, màu sắc lá và dùng thước đề đo đạc các chỉ tiêu như chiều dài lá, chiều rộng lá và ghi nhận kết quả.
3.2.2.2. Quy trình ly trích DNA tong số
Phương pháp ly trích DNA từ mẫu lá non được tiến hành theo quy trình được phát triển tại Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh.
Cách lay mau: dùng mau lá non. Các mẫu đã được thu thập va cho vao túi zip bao quản trong tủ mát sẽ lay ra dé ly trích và khi ly trích xong thì bảo quản ở tủ đông (-20°C) đề lưu trữ mẫu.
Bước 1: Cho lá non vào eppendorf 1,5 ml (Pháp), thêm 300 ul dich ly trích gồm:
Tris 200 mM (pH = 8), EDTA 25 mM, NaCl 250 mM, SDS (Sodium dodecyl sulfat)
0,5%, tiến hành nghiền hỗn hợp trên bang chày nhựa cho đến khi mẫu min hoàn toàn.
Sau đó, dùng pipet (Nichiryo — Nhật) và dau tip 100 ul — 1000 yl (Đức) cho thêm vào eppendorf 300 ul dich ly trích và trộn đều.
Bước 2: U hỗn hợp trên bằng bồn ủ nhiệt với nhiệt độ 65°C trong 40 phút.
Bước 3: Sau khi ủ xong, mang hỗn hợp tiến hành ly tâm bằng máy ly tâm (Hettich
— Đức) với chu kỳ 10.000 vòng/phút trong 5 phút.
Bước 4: Dùng pipet và dau tip 100 pl - 1000 pl chuyển 400 ul dich nỗi sang eppendorf mới. Thêm 1V (V là thể tích dịch nổi hút vào) dung dich PCI (Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol với tỉ lệ 25:24:1) và trộn đều.
Bước 5: Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút. Dùng pipet hút 300 pl dịch nổi chuyền sang eppendorf mới.
Bước 6: Thêm 1V dung dich CI (Chloroform/Isoamyl alcohol với tỉ lệ 24:1) va
trộn đều. Sau đó ly tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút.
Bước 7: Dùng pipet hút 200 ul địch nổi chuyển sang eppendorf mới. Thêm 0,6V dung địch Isopropanol và lắc nhẹ.
Bước §: Mang hỗn hợp đi ủ lạnh - 20°C (tủ lạnh Sanyo - Nhật) trong 30 phút.
15
Bước 9: Hết thời gian ủ lạnh mang hỗn hợp ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút
và loại bỏ dịch nôi.
Bước 10: Rửa DNA bang cách thêm 500 ul Ethanol 70%, sau đó ly tâm 12.000 vòng/phút trong 3 phút và loại bỏ dich nồi.
Bước 11: Lặp lại bước 10 một lần nữa.
Bước 11: Phơi eppendoorf cho đến khi không còn dung dich.
Bước 12: Thêm vào eppendorf có kết tủa DNA 50 pl dung dich TE 1X và bảo quan
ở - 20°C.
Sau khi quá trình ly trích kết thúc sé tiễn hành kiểm tra định tinh DNA 3.2.2.3. Định tính sản phẩm bằng kỹ thuật điện di
Pha gel agarose với nồng độ 1%: dùng cân điện tử (Ohaus — Mỹ) cân 0,5 g agarose cho vào 50 ml dung dich Tris — Acetate - EDTA (TAE) 0,5X . Dun sôi bang lò viba (Electrolux) ở 500W trong 1 phút cho agarose tan thật đều. Dé hỗn hợp hơi nguội khoảng
15 phút.
Đồ gel vào khay đã gắn lược 13 giếng sẵn. Chờ khoảng 30 phút thì gel đông đặc hoàn toàn. Kiểm tra gel đã đủ độ cứng, sau đó gỡ lược khỏi gel và đặt gel vào bề điện di (máy điện di — Biorad) theo đúng chiều (đầu có giếng đặt ở cực âm nguồn điện) và cho dung dịch đệm TAE 0,5 X vào ngập miếng gel.
Các mau được bơm vào giếng với tỉ lệ 10 pl loading dye 5X và 5 ul DNA mau.
Day nắp bồn điện di sau đó cắm điện. Điện di DNA tổng số ở hiệu điện thé 100 V, trong 15 phút. Sau đó kết quả được quan sát ở buồng chiếu tia UV.
Kết quả điện di thé hiện sự hiện điện DNA có trong mẫu ly trích. Các mẫu có chứa DNA sẽ xuất hiện một băng trên miếng gel sau khi được chiếu đèn UV và chụp ảnh.
Những mẫu cho băng sáng rõ sẽ được tiếp tục thực hiện các quá trình tiếp theo.
3.2.2.4. Phan ứng PCR với chỉ thị ISSR
Tiến hành sàng lọc 20 primer ISSR ở bảng 3.2 bằng cách chọn ngẫu nhiên một mẫu DNA dé chạy PCR với các primer trên để khao sát sự đa hình và tìm ra nhiệt độ bắt cặp (Ta) tối ưu của các primer ở 6 nhiệt độ từ 50°C - 55°C. Chọn nhiệt độ mà tai đó kết
16
quả khảo sát cho sản pham rõ nhất. Những primer cho sản phẩm có tỉ lệ đa hình cao, băng sáng, rõ đạt tiêu chuẩn sẽ được giữ lại dé tiếp tục thực hiện phản ứng ISSR — PCR
với tất cả các mẫu.
Bảng 3.2. Danh sách 20 primer cho phản ứng PCR - ISSR
STT Tén primer Trinh tự primer (5’-3’)
1 UBC809 (AG)sG
2 UBC810 (GA)sT 3 UBC811 (GA)sC 4 UBC814 (CT)sA
5 UBC825 (AG)sT
6 UBC840 (GA)sCTT
7 UBC841 (GA)sCTC
8 UBC843 (GA)sTC 9 UBC844 (GA)sCC
10 UBC845 (CT)sRG
lỗi UBC848 (CA)sAGG 12 UBC850 (GT)sCTC 13 UBC854 (TC)sAGG
14 UBC855 (AC)sCTT
15 UBC860 (TG)sRA
16 UBC861 (ACC%
17 UBC873 (GACA%
18 UBC880 (GGAGA)3
19 UBC888 CGTAGTCGT(CA})
20 UBC890 ACGACTACG(GT%
R=(I1G); Y= (C, 1). (Behera va ctv, 2008; Anil và ctv, 2015)
Mẫu DNA sau khi được ly trích và bảo quản ở -20°C sẽ được pha loãng nồng độ 10 lần dé tiếp tục tiến hành phản ứng PCR.
Phản ứng PCR với primer ISSR được thực hiện với phan ứng khuếch dai ở thé tích 12,5 ul bao gồm: Master mix (Meridian Bioscience) với nồng độ đầu 2X và nồng độ cuối 1X: 6,25 ul; primer (Sigma): 0,5 ul; DNA mau: 1 wl; nước khử ion: 4,75 wl. Quá trình mix mẫu DNA được thực hiện trong tủ an toàn sinh học cấp 2. Phan ứng PCR được
thực hiện trên máy PCR (Applied Biosystems 2720) với chu trình nhiệt ở bang 3.3.
Vi
Bảng 3.3. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR
Giai đoạn Nhiệt độ Chu kì Thời gian
Tiền biến tính 94°C | 2 phút Biến tính 94°C 30 giây
Bắt cặp Te 40 45 giây
Kéo dai IPC 2 phút Hau kéo dai TC | 10 phút T°C: nhiệt độ tùy thuộc vào từng primer
Sản phẩm của phản ứng PCR-ISSR được điện di trên gel agarose 1,5 % trong môi trường TAE 1X với điện thế 100V và thời gian điện di là 45 phút. Thang chuẩn 1 kb DNA được dùng làm thước đo kích cỡ của các đoạn DNA khuếch đại. Sau đó, đọc kết quả bằng tủ chiếu đèn UV và chụp hình, tiếp theo mã hóa dữ liệu và dùng cho các phân tích số liệu.
3.3. Xử lý số liệu
Từ kết qua phản ứng PCR với chỉ thị ISSR trên gel, dir liệu sẽ được chuyền thành dạng ma trận nhị phân trên Excel. Dữ liệu được mã hóa theo quy ước: Số “1” là có hiện diện băng DNA, số “0” là không hiện diện băng DNA và thực hiện lần lượt với các primer trong bài. Ở hàng trên cùng ghi tên file với dau “ đầu câu. Hàng thứ 2 cột đầu tiên ghi số 1 (dữ liệu tổng hợp trên một file); cột số 2 ghi số hàng chứa dit liệu, cột thứ 3 ghi số cột chứa dữ liệu và thêm ky tự “L” phía sau, cột thứ 4 ghi số 0 (không có 6 trồng di liệu).
Sau khi hoàn thành thống kê dữ liệu, sao chép tat cả dữ liệu sang Notepad (.txt) dé đưa vào phần mềm NTSYSpc 2.1 dé xây dựng cây phân loại di truyền biéu diễn mối quan hệ xa gần của giữa các cá thé thông qua xác định hệ số tương đồng di truyền hay hệ số khoảng cách di truyền theo công thức của Nei (1972).
Dữ liệu được phân nhóm dựa vào hệ số tương quan Dice, kiểu phân nhóm sử dung phương pháp nhóm đôi các giá trị trung bình số học UPGMA (Unweighted Pair group Method with Arithmetic Mean) và biéu đồ cây phân loại đi truyền được vẽ theo phương pháp SAHN (Sequential agglomerative hierarchical non-overlapping) trên phần mềm
NTSYSpe 2.1.
18