Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Đánh giá khả năng phát hiện Bacillus cereus trong thực phẩm của môi trường thạch sinh màu RAPID'B.cereus theo TCVN 4992:2005 (ISO 7932:2004)

Hai loại môi trường được sử dụng để tiến hành đánh giátrên 5 nhóm mẫu thực phẩm, bao gồm: ngũ cốc và sản phẩm từ ngũ cốc; bột và tinh bột;rau củ và sản phẩm từ rau củ; sữa và sản phẩm từ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀOTẠO

-TRUONG ĐẠI HỌC NÔNG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHAT HIEN Bacillus cereus TRONG

THUC PHAM CUA MOI TRUONG THACH SINH MAU

RAPID’B.cereus THEO TCVN 4992:2005 (ISO 7932:2004)

Nganh hoc : CONG NGHE SINH HOCSinh viên thực hiện : VÕ THỊ NHƯ BÍCH

Mã số sinh viên : 19126013Niên khóa : 2019 — 2023

TP Thủ Đức, 08/2023

; BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀOTẠO

-TRƯỜNG ĐẠI HỌC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÁT HIEN Bacillus cereus TRONG THỰC PHẨM CỦA MÔI TRƯỜNG THẠCH SINH MÀURAPID°Z.cereus THEO TCVN 4992:2005 (ISO 7932:2004)

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

TS TRƯƠNG HUỲNH ANH VŨ VÕ THỊ NHƯ BÍCH

LỜI CẢM ƠN

Đề hoàn thành dé tài tốt nghiệp “Đánh giá khả năng phát hiện Bacillus cereustrong thực phẩm của môi trường thạch sinh màu RAPID’B.cereus theo TCVN4992:2005 (ISO 7932:2004)” tôi nhận được rất nhiều sự ủng hộ và giúp đỡ từ gia đình,thầy cô và bạn bè

Đầu tiên, tôi xin chân thành cảm ơn đến Ban Giám Hiệu cùng tất cả quý Thầy Cô

Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM, Ban chủ nhiệm Khoa Khoa học Sinh học, PGS.

TS Lê Đình Đôn và tập thể các bạn sinh viên lớp DH19SM đã tạo điều kiện và giúp đỡtôi trong quá trình học tập tại trường Cảm ơn quý Thầy Cô đã tận tâm trong quá trìnhgiảng đạy và truyền đạt những kiến thức quý báu

Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Trương Huỳnh Anh Vũ và cácAnh Chi dang làm việc tại phòng Vi sinh — Trung tâm Dich vu Phân tích Thí nghiệmTP.HCM (CASE) đã tạo điều kiện, nhiệt tình chỉ bảo và truyền đạt rất nhiều kiến thức,kinh nghiệm trong lĩnh vực vi sinh giúp tôi thực hiện tốt hướng nghiên cứu của mình

Xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban lãnh đạo Trung tâm Dịch vụ Phântích Thí nghiệm TP.HCM (CASE) và Công ty TNHH Khoa Học Hợp Nhất đã tạo điềukiện thuận lợi, hỗ trợ tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn của bản thân đến gia đình Cảm ơn gia đình

đã luôn là chỗ dựa vững chắc, luôn theo doi và ủng hộ con trong suốt quá trình thực hiệnkhóa luận tốt nghiệp cũng như trong quá trình học tập tại trường

XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN

Tôi tên Võ Thị Như Bích, MSSV: 19126013, Lớp: DH19SM (Số di động:

0935905936, Email: 19126013@st.hcmuaf.edu.vn) thuộc Khoa Khoa học Sinh học,trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh Tôi xin cam đoan: Đây là khóa luận tốtnghiệp do bản thân tôi trực tiếp thực hiện, các số liệu và thông tin trong nghiên cứu làhoàn toàn trung thực và khách quan Tôi xin hoan toàn chịu trách nhiệm trước hội đồng

về những cam kết này

Tp Hồ Chí Minh, ngày 28 tháng 7 năm 2023

Người việt cam đoan

Võ Thị Như Bích

TÓM TẮT

Trong nghiên cứu nay, khả năng phát hiện Bacillus cereus của môi trường thạchtạo màu mới (RAPID’B cereus) được so sánh với môi trường chọn lọc tiêu chuẩn (MYP)được các cơ quan quản lý thực phẩm khuyến nghị dùng để phân lập, nhận dạng vàđịnh lượng Bacillus cereus Hai loại môi trường được sử dụng để tiến hành đánh giátrên 5 nhóm mẫu thực phẩm, bao gồm: ngũ cốc và sản phẩm từ ngũ cốc; bột và tinh bột;rau củ và sản phẩm từ rau củ; sữa và sản phẩm từ sữa; bánh mứt kẹo (N = 164).Kết quả khảo sát mức độ nhiễm Bacillus cereus trên môi trường thạch tạo màuRAPID'°Đ.cerews (124/164 mau, chiếm 75,61%) nhạy hơn so với môi trường chọn lọctiêu chuẩn MYP (115/164 mẫu, chiếm 70,12%), trong đó có 46,09% mẫu không đạt

so với tiêu chuẩn của Bộ Y tế về giới hạn tối đa cho phép của Bacillus cereus trongthực phẩm Tiến hành kiểm tra hiệu năng của môi trường RAPID’B.cereus theoTCVN 12365-2:2018 (ISO 16140-2:2016) với các thông số: độ phát triển, độ chọn lọc,

độ đặc hiệu, độ đúng tương đối và độ chính xác, kết quả phân tích đều đạt các tiêu chítheo tiêu chuẩn: độ phát triển (Pa) của 2 môi trường lần lượt là 0,97 và 0,81; môi trườngMYP có sự hiện diện số lượng lớn các khuẩn lạc không dién hình; cả hai môi trườngđều cho phép phát hiện Bacillus cereus với độ chênh lệch là 0,14 So với tiêu chichấp nhận theo quy định, các nhóm mẫu dùng trong nghiên cứu đều phù hợp để

định lượng trên môi trường mới với độ chính xác giữa hai phương pháp là tương đương.

Từ những kết quả nghiên cứu cho thay rằng việc sử dụng môi trường RAPID'.cereus

để định lượng nhanh Bacillus cereus là phù hợp và có độ tin cậy cao đối với cácnhóm mẫu được thử nghiệm, đồng thời thé hiện nhiều ưu điểm như: khuẩn lạc đặc trưngđược nhận biết dé dàng và chính xác; tiết kiệm chi phí, thời gian phân tích và giảm thiểukhả năng nhiễm chéo nhờ vào việc lượt bỏ một số phản ứng sinh hóa giai đoạnkhẳng định: hạn chế việc sử dụng và tiếp xúc thường xuyên với kháng sinh, từ đó giá trị

sử dụng kết qua thử nghiệm được đảm bảo và có tính ổn định cao

Từ khóa: Bacillus cereus, môi trường thạch tạo màu, thẩm định phương pháp, độ đúngtương đối, độ chính xác

In this study, the ability to detect Bacillus cereus of the new chromogenic culture media (RAPID'B.cereus) was compared with the standard selectiv\e culture media

(MYP) recommended by food authorities for isolation, identification and quantification

of Bacillus cereus Two types of media were used to conduct the assessment on five categories of food, mcluding: cereals and cereal products; flour and starch; vegetables and vegetable products; milk and dairy products; confectionery (N = 164) The results of the survey on the level of Bacillus cereus contamination on

RAPID'B cereus agar (124/164 samples, accounting for 75.61%) were more sensitive

than MYP agar (115/164 samples, accounting for 70.12%), of which 46.09% of the samples did not meet the standards of the Ministry of Health on the maximum allowable limit of Bacillus cereus in food Conducting performance testing of RAPID'B.cereus agar according to TCVN 12365-2:2018 (SO 16140-2:2016) with parameters: growth, selectivity, specificity, relative trueness and accuracy profile, the analysis results all met the criteria according to the standard: the development (Pr) of the two media were 0,97 and 0,81 respectively; a high level of background microflora was

present on the MYP plates while if it was not the case on the RAPID’B.cereus plates;

both media allowed the detection of Bacillus cereus with a difference of 0,14 Compared with the acceptance criteria as prescribed, the categories used in the study were all suitable for assessment in the new media with the accuracy between the two methods being equivalent From the research results, it is shown that the use of RAPID'B cereus agar for rapid quantification of Bacillus cereus is suitable and highly reliable for the groups of samples tested, and at the same time presents many advantages such as: characteristic colonies are easily and accurately identified; saving cost, analysis time and minimizing the possibility of cross-contamination by omitting several

confirmation stage biochemical reactions; limit the use and frequent exposure to

antibiotics, so that the use value of the test results is guaranteed and highly stable.

Keywords: Bacillus cereus, chromogenic culture media, method validation, relative trueness, accuracy profile.

MỤC LỤC

Trang

LOT CÁ MÔ N bang toan no nha ng HE 2D GIGIGSGIENDEEOEIEGEENINEAGHIAREHUCEIEESSINGIGAEENGHSHSIEENGHNNEUnNG 1

ANT NHẨN XÃ I ĐC N ce ec-eok.cu gi h2 H2 cjighưgpg tưng citgrro.2060i0 6e ii

133 Me tiêu của để lÃÍ coccceesidnikinnecDElSE 01H th gHH1g H-GH0H0SihgEg0V 0316 00020014/3002000140165977 51.3 NG1.duiø th NI H seeesesseiieksdleidvledAddesddEeidu ngED41 d0 1124018000-040 002c0200 g2m20 2CHƯƠNG 2 TONG QUAN TÀI LIỆU -2- 2 5222222EE22E22EE22E22EE22E222222EZEzzzxe2 32.1 Tình hình vệ sinh an toàn thực phẩm -2- 22 2+2S+EE+EE2EE+EE2EE2EEEEEeEE.rEerxered 32.1.1 Tình hình vệ sinh an toàn thực phẩm trên thé giới 22 252z+cs55zzcse-s3

2.2.2 Tình hình vệ sinh an toàn thực phẩm GO) VICE NHI asssrersoasriddtidssessesrssnsemsai 4

2.2 Tình hình nhiễm Bacillus cereus trên thé giới và tại Việt Nam -5-55¿ 42.2.1 Tình hình nhiễm Bacillus cereus trên thé giới -. 52-©5222222222222222z22zze 4

2.2.2 Tình hình nhiễm Bacillus cereus ở Việt NÑam +-222222+22E22222E2Ezzzcc, 52.3 Tổng quan Bacillus COreus -5 55: 52252S222222225221225212212112121121121211211121121 212 xe 6

2.3.1 Đặc điểm Bacillus cếf€0S 5-5552 52CS E22 2112121121121 1e 62.3.4 Độc tố và cơ chế sinh độc tố của Bacillus €erểiws -5-55-52+5222+cc2z+csccsc- 72.3.5 Triệu chứng ngộ độc thực phẩm do Bacillus C€FØ1S 52-55 555<<S<s+sesssess 7

2.4 Tình hình nghiên cứu phương pháp kiểm nghiệm Bacillus cerews . §

2.4.1 Tình hình nghiên cứu phương pháp kiểm nghiệm Bacillus cereus trên thé giới 82.4.2 Tình hình nghiên cứu phương pháp kiểm nghiệm Bacillus cereus ở Việt Nam I ]

2.5 Ý nghĩa của việc xác nhận lại giá trị sử dụng của môi trường mới (RAPID’B.cereus)C211 111221112211211122112111.111211 21 1111111121121 ca llCHƯƠNG 3 VAT LIEU VA PHƯƠNG PHAP © 0 0 1.sosscsoesssssseesesseseesetseesesneseseeseees 123.1 Thời gian và địa điểm nghiên Cir cece cecceecseesssessseesseeseesseecseeeseessessseesseesseeesees 12BoD WE kiểu 1rphT1EHijGT1s:cs«.-¿.=es eseeztes-setriecckbrsdirksiitdStiur=dginiocEciindscis2 DgS2 i rn sone 123.2.1 DOi twong 0i) 7 1 135 123.2.2 Chung vi sinh vật được sử dụng cho nghiên cứu - -=<-ce<c+<czercee 12

Na 3.6.7.7 MS m 1233:4 KIỔI trường, hóa dhÏeecsseesookininooldieisgi0105:0080S0102150s6001AE2:031030941800g/E:400100 300 12

3.3;:Phưỡng;:PHáĐ ñghiệH:GỮÍĨ-eseeeseeesmaetiactissGauebiiosadpgicsgg88xigigEBriusEgiaggslolu-iirgEepagis tee 13

3.3.1 Phương pháp định lượng Bacillus cereus bằng phương pháp đếm khuân lạc trên

môi trường thạch MYP và môi trường thạch tạo màu RAPID?.cereiis 13

3.3.2 Nội dung 1: Khảo sát mức độ nhiễm Bacillus cereus của các nhóm thực phẩm 16

3.3.3 Nội dung 2: Nghiên cứu độ phát triển, độ chọn lọc và độ đặc hiệu của môi trườngthach tao mau RAPID’ B Cereus 000058755 16

3.3.4 Nội dung 3: So sánh, đánh giá hiệu năng của môi trường thạch sinh mau

RAPID’B.cereus so với môi trường MYP theo TCVN 4992:2005 (ISO 7932:2004) 183.4 Phương pháp xử lý số liệu - ¿2-22 ©22222222222E221221221211221 72121122121 xe 26CHƯƠNG 4, KET QUÁ VA THẢO LUẬN KEEZ.Eeiekaleraer 274.1 Nội dung 1: Khảo sát mức độ nhiễm Bacillus cereus của các nhóm mẫu thực phẩm

an ớ acc 274.2 Nội dung 2: Nghiên cứu độ phát triển, độ chọn lọc và độ đặc hiệu của môi trườngthạch tao Mati RAPID’ 5: đổi GIÁ toa cosbotoD Gáti8 IÊRGIIOANELISĐBDLIGDGSAIAIGSARIXGLGEREISGSSSEEnSguqgs 294.2.1 Nghiên cứu độ phát triển của môi trường RAPID'Ö.cerews - - 294.2.2 Nghiên cứu độ chọn lọc và độ đặc hiệu của môi trường RAPID’B.cereus 31 4.3 Nội dung 3: So sánh, đánh giá hiệu năng của môi trường thạch sinh mau RAPIDˆB.cerewus so với môi trường MYP theo TCVN 4992:2005 (ISO 7932:2004) 334.3.1 Nghiên cứu độ đúng tương đối theo TCVN 12365-2:2018 -. 334.3.2 Nghiên cứu độ chính xác theo TCVN 12365-2:2018 c2-c<c++ 47CHƯƠNG 5 KET LUẬN VÀ KIEN NGHỊ 2 2 ¿2S2E22E+2E22E22E2E2E2Eezxe2 545.1 Kết luận - + 2 2221221 2152122121271211212121121211121111111111111111121121111211111 2211 re 54

5.2 Đề nghị

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHU LỤC

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIET TAT

AFNOR_ : Association Frangaise de Normalisation - French Standardization Association AOAC _ : Association of Official Analytical Chemists

ATCC : American Type Culture Collection

BAM : Business Activity Monitoring

BYT :BộYtế

CFU : Colony Forming Units

CoA : Certificate of Analysis

FDA : Food and Drug Administration

MRD : Maximum Recovery Diluent

MYP : Mannitol Egg Yolk Polymyxin

NCBI : National Center for Biotechnology Information

ICMSF _ : International Commission on Microbiological Specifications for Foods

ISO : International Organization for Standardization

TCVN _ : Tiêu chuẩn Việt Nam

TSA : Tryptone Soya Agar

WHO : World Health Organization

DANH SÁCH CAC BANG

Bang 3.1 Chung vi sinh vật nguồn gốc thương mại sử dụng cho nghiên cứu 12Bang 3.2 Giới hạn cho phép Bacillus cereus có mặt trong thực phẩm theo Quyết định

số 46-2007/QĐ-BYT 2¿222+222221221122122112112211211211211211211211211211211 1c ee l6Bảng 3.3 Chủng vi sinh và môi trường đối chứng sử dụng trong nghiên cứu độ chọn

lọc và độ đặc hiệu của môi trường RAPID’ B cereus cece 5552 cS+cssrrersrrsrerxee 17

Bảng 3.4 Các nhóm và số lượng mẫu sử dụng trong nghiên cứu độ đúng tương đối 19Bang 3.5 Kết quả thống kê đối với tat cả các nhóm -2 222 22222+2z22E2z22522 20Bang 3.6 Kết quả của nghiên cứu độ chính xác 2 2¿©22222+222+22E+z2x+zzxzzrxrcr 23Bang 3.7 Các kết qua thống kê của nghiên cứu so sánh 22 2+s+2z22s+2zz25e2 25Bang 4.1 Kết quả kiểm tra độ phát triển của môi trường RAPID'B.cereus 30Bảng 4.2 Kết quả kiểm tra độ chọn lọc và độ đặc hiệu của môi trường RAPID’B.cereus

ý20G0200I59001i0138008380/1089000/GI9380053038000480000010100G000Đ10007.0.HHGH5I2XSGH0GCG0DNGERS eee ETRY 31

Bảng 4.3 Kết quả nghiên cứu độ đúng trên nhóm mẫu Ngũ cốc và sản phẩm từ ngũ cốc

jšadõiga tui gia eS Sci TE Gn li a sis Te BURR Wh ein ek Si gögXG Maa aaa 34

Bang 4.4 Kết quả nghiên cứu độ đúng trên nhóm mẫu Bột va tinh bột 37Bảng 4.5 Kết quả nghiên cứu độ đúng trên nhóm Rau củ và các sản phẩm từ rau củ.39Bảng 4.6 Kết quả nghiên cứu độ đúng trên nhóm mẫu Sữa và sản phẩm từ sữa 41Bảng 4.7 Kết quả nghiên cứu độ đúng trên nhóm mẫu Bánh mứt kẹo 43Bang 4.8 Tóm tắt việc tính toán các giá trị các nhóm MAU - 2 252522 45Bảng 4.9 Các giá trị dữ liệu độ chệch kết quả giữa phương pháp chuẩn và phương phápthay thế năm mrưoễi giá tr] giới hạm, c2 2 011 102Á 104 k00008011400100.15 46Bảng 4.10 Mẫu sử dụng trong nghiên cứu độ chính xác và mức gây nhiễm tương

DANH SÁCH CÁC HÌNH

TrangHình 1.1 Bacillus cereus đưới kính hiển vi - 5 -525225c222 22 ecvcrrerrerrrrrrees 7Hình 3.1 Khuan lac Bacillus cereus trên môi trường MYP 2525525525522 14Hình 3.2 Khuan lạc Bacillus cereus trên môi trường RAPID'Ö.cerews - 15Hình 3.3 Đồ thi của kết quả phương pháp chuẩn so với phương pháp thay thế đối vớimột nhóm sản phẩm riêng lẻ -2- 2-2522 +S2E+SE£EEEE£EEEEEEE2E22EEEZEZEzEzEezree 20Hình 3.4 Đồ thị chênh lệch Bland-Altman đối với tất cả các nhóm - 22Hình 3.5 Độ chính xác đối với một nhóm trong nghiên cứu so sánh phương pháp .26Hình 4.1 Tông quát số lượng mẫu nhiễm và không nhiễm Bacillus cereus của các nhóm

Hình 4.9 Khuan lac Bacillus cereus nhóm Bột và tinh bột 5-5+sscs+scs2 38

Hình 4.10 Đồ thị điểm kết quả phương pháp chuẩn so với phương pháp thay thé đốivới Thom Botwa tĩnh Gt seseeaebebiegeigittse t4 th p4013x5I41LEEGAS0S880440380u8e 0iSEgsEillOi0kEsooe 38Hình 4.11 Khuẩn lạc Bacillus cereus nhóm Rau củ và sản phẩm từ rau củ 40Hình 4.12 Đồ thị điểm kết quả phương pháp chuẩn so với phương pháp thay thé đối

với nhóm Rau củ và sản phẩm từ rau CỦ 222 ©22222S22E+2EEEzEzEzxrrxrxerrree 40

Hình 4.13 Khuẩn lạc Bacillus cereus nhóm Sữa và sản phẩm từ sữa 42Hình 4.14 Đồ thị điểm kết quả phương pháp chuẩn so với phương pháp thay thé đối

với nhóm Sữa và sản phẩm từ SữỮa 2-2- ©2222 2222222E2E232232112312312112121 22 22 2xe2 42

Hình 4.15 Khuẩn lac Bacillus cereus nhóm Bánh mứt kẹo 2-5252 22s+Ss+54 44

Hình 4.16 Đồ thị điểm kết quả phương pháp chuẩn so với phương pháp thay thế đối

\XUS00ii8057i16iii8‹ 2011 Ố- - ,ÔỎ 44

Hình 4.17 Đồ thị chênh lệch Band-Altman tất cả các nhóm mau - 2-2 45

Hình 4.18 — Kết quả nghiên cứu độ chính xác trên nhóm Ngũ cốc và sản phẩm từ ngũCOG i sai snncnsisstannnsttitonnnasitvomnaat tea tinaai dear oinatantltahawed oan eaten tonalite dlp romeo ac 48Hình 4.19 Kết qua nghiên cứu độ chính xác trên nhóm Bột và tinh bột 49Hình 4.20 Kết quả nghiên cứu độ chính xác trên nhóm Rau củ và sản phẩm từ rauOlly 5 Ste 080g ae Se Se ee Oe eS ee ee 50Hình 4.21 Kết quả nghiên cứu độ chính xác trên nhóm Sữa va sản phẩm từ sữa 5Hình 4.22 Kết quả nghiên cứu độ chính xác trên nhóm Banh mứt kẹo 52

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Ngộ độc thực phẩm do nhiễm vi sinh vật là van đề nghiêm trọng trên toàn thé giới,ảnh hưởng nặng nề đến sức khỏe cộng đồng và nền kinh tế Theo Tổ chức Y tế Thế giới(WHO), hàng năm trên thế giới xảy ra khoảng 600 triệu ca ngộ độc thực phẩm, gây racái chết của khoảng 420.000 người, trong đó số ca ngộ độc do vi sinh vật gây ra chiếmtới 66% Đáng kế đến như Salmonella spp., Escherichia coli, Shigella spp.,Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Cac vi sinh vat nay phan bé va phat triénrộng rai trong môi trường và dé dàng nhiễm vào thực phẩm, nguồn nước sử dụng chocon người, vật nuôi khi quy trình sản xuất, sử dụng không đảm bảo các yêu cầu vệ sinh

Để đảm bảo việc tự giám sát an toàn vệ sinh trong quá trình sản xuất của mỗi đơn

vị doanh nghiệp, hay công tác quản lý và giám sát chất lượng của thực phẩm thì

các công tác kiểm nghiệm đóng vai trò vô cùng quan trọng Đối với các đơn vị

kiểm nghiệm, việc lựa chọn, thâm định các phương pháp ngoài việc đảm bảo cácphương pháp sử dụng có độ chính xác cao và phù hợp, thì hiện nay yêu cầu rút ngắnthời gian phân tích từ phía các cơ quan quan lý nhà nước, doanh nghiệp, nha maysản xuất - kinh doanh ngày cảng trở thành một mối quan tâm lớn

Được tìm thấy trong một số lượng lớn thực phẩm, Bacillus cereus được biết đếnnhư một trong những nguyên nhân quan trọng gây ngộ độc thực pham (Schoeni va ctv,2005; Park và ctv, 2009) Đặc điểm hình thành bảo tử của chúng đảm bảo sự sống sótqua hầu hết quy trình chế biến Mặt khác, món ăn sau khi được chế biến, nếu được để

nguội vài giờ trước khi ăn, bào tử của chúng có thể trở lại trạng thái sinh trưởng và

nhân lên, lúc nay Bacillus cereus không bị cạnh tranh bởi các vi khuẩn khác, do các

vi khuân khác đã bị tiêu diét trong lúc nấu trước đó (Goepfert và ctv, 1972) Việt Nam

là nước có điều kiện khí hậu nóng âm tạo điều kiện thuận lợi cho Bacillus cereusphát triển trong thực phẩm và giải phóng ra độc tố, đặc biệt là việc sử dung rất nhiều cácsản phẩm thực phẩm có nguồn gốc từ gạo làm cho tỷ lệ ngộ độc thực phẩm do Bacilluscereus là không nhỏ Do đó, việc phát hiện và định lượng mầm bệnh này là một nhiệm

vụ quan trọng đối với các phòng thí nghiệm chân đoán lâm sàng và thực phẩm vi sinh

Hầu hết công tác kiểm nghiệm Bacillus cereus đều liên quan đến kỹ thuật trải đĩa

sử dụng thạch Mamnitol Egg Yolk Polymyxin (MYP) theo phương pháp chuẩntruyền thống — TCVN 4992:2005 (ISO 7932:2004), có thời gian phân tích ít nhất 3 ngày

và các khuẩn lạc riêng lẻ trên đĩa thạch thường có xu hướng kết hợp với nhau gâykhó khăn trong việc đếm khuẩn lạc (Goepfert va ctv, 1972; Harmon va ctv, 1992)

Hiện nay, ngày càng nhiều những phương pháp và môi trường chọn lọc thay thé;

các phương pháp này thường nhanh và dé thực hiện hon so với các phương pháp chuẩntruyền thống Trong đó, hãng Bio-Rad đã nghiên cứu và sản xuất một môi trườngthạch sinh màu mới để định lượng nhanh Bacillus cereus trong vòng 21 - 24 giờ

mà không cần thâm định lại Tuy nhiên, để các phòng thí nghiệm lựa chọn sử dụng mộtmôi trường phân tích nhanh mới thì việc thâm định lại sự phù hợp, hiệu năng, độ đúngtương đối và độ chính xác của môi trường trước khi đưa vào sử dụng phải được

tiến hành một cách chặt chẽ và khách quan Vì vậy, dé tài “Đánh giá khả năng phát

hiện Bacillus cereus trong thực phẩm của môi trường thạch sinh màuRAPID’B.cereus theo TCVN 4992:2005 (ISO 7932:2004)” được thực hiện.

1.2 Mục tiêu của đề tài

Xác định mức độ nhiễm Bacillus cereus của các nhóm thực phẩm

Đánh giá hiệu năng môi trường thạch tạo màu RAPID’B.cereus định lượng nhanh

Bacillus cereus về độ phát triển, độ chọn lọc và độ đặc hiệu

Nghiên cứu độ đúng tương đối để so sánh các kết quả phân tích thu được bằngmôi trường chuẩn và môi trường mới trên các nền mẫu, xác định được các nền mẫu phù

hợp và chưa phủ hợp.

Nghiên cứu độ chính xác dé so sánh kết hợp độ chum và độ đúng của môi trườngchuẩn và môi trường mới

1.3 Nội dung thực hiện

Nội dung 1: Khảo sát mức độ nhiễm Bacillus cereus của các nhóm mẫu thực phẩm.Nội dung 2: Nghiên cứu độ phát triển, độ chọn lọc và độ đặc hiệu của môi trườngthạch tạo màu RAPID’B.cereus.

Nội dung 3: So sánh, đánh giá hiệu năng của môi trường thạch tạo mau

RAPIDˆB.cerewus so với môi trường MYP theo TCVN 4992:2005 (ISO 7932:2004).

CHUONG 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Tình hình vệ sinh an toàn thực phẩm

2.1.1 Tình hình vệ sinh an toàn thực phẩm trên thế giới

Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), hon 1/3 dân số các nướcphát triển bị ảnh hưởng của các bệnh do thực phẩm gây ra mỗi năm Đối với các nướcđang phát triển, tình trạng lại càng trầm trọng hơn nhiều, hàng năm gây tử vong hơn2.2 triệu người, trong đó hầu hết là trẻ em Năm 2015 có hơn 200 các loại bệnhlây truyền qua thực phẩm không an toàn Vệ sinh an toàn thực phẩm đã đượcđặt lên hàng đầu nghị trình tại nhiều hội nghị y tế và sức khỏe cộng đồng toàn cầu,nhưng tình hình gần như không được cải thiện đáng kê, nhất là khi thế giới liên tiếpxảy ra thiên tai và nguồn nước sạch ngày càng khan hiếm Tiến sĩ Margaret Chan,Tổng giám đốc WHO cho biết, mỗi tháng Liên Hợp Quốc nhận được khoảng

200 báo cáo từ 194 quốc gia về các trường hợp thực phẩm bị nhiễm độc Bà nhắn mạnh:

"Một lần nữa, tôi xin khang định, về vệ sinh an toan thực phẩm là vấn dé chung của cảnhân loại chứ không riêng một nước nao".

Theo WHO đã thống kê và cho biết mỗi năm những ca bị ngộ độc ở một số nước

trên thế giới như sau: Tại Mỹ có 76 triệu người bị ngộ độc thực phẩm, trong đó có

325.000 người phải nhập viện, 5020 người tử vong hàng năm (Mead và ctv, 1999),

Tại Anh mỗi năm có 190 ca ngộ độc/1.000 dân Tại Nhật Bản cứ 100.000 người có

40 ca ngộ độc thực phẩm mỗi năm Tại Úc có Luật Thực phẩm từ năm 1908 nhưngmỗi năm vẫn có khoảng 4.2 triệu người bị ngộ độc thực phẩm, trung bình mỗi ngày

có 11.500 ca mắc bệnh cấp tính do ăn uống gây ra Tại Nhật Bản, vụ ngộ độc thực phẩm

do sữa tươi giảm béo bị ô nhiễm Staphylococcus aureus tháng 7/2000 đã làm cho

14.000 người ở 6 tỉnh bị ngộ độc thực phẩm Tại Hàn Quốc, tháng 6 năm 2006 có

3.000 học sinh ở 36 trường học bị ngộ độc thực phẩm

Bat chấp những cải tiến điển hình trong ngành công nghiệp thực phẩm nói chung

và những nỗ lực chưa từng có của các tô chức công và tư nhân, các vi sinh vật gây bệnhvẫn có khả năng thích nghi với những ngóc ngách mới, phương tiện lây truyền mới vàvật chủ mới, đông thời có được cơ chê kháng thuôc và độc lực mới Các môi nguy

vi sinh vật trong nước và thực phẩm tiếp tục đặt ra gánh nặng đáng kể đối với sức khỏecộng đồng và tính kinh tế của sản xuất thực phẩm (Vugia va ctv, 2003).

2.2.2 Tình hình vệ sinh an toàn thực phẩm ở Việt Nam

Việt Nam đang phải đối mặt với những vấn đề lớn về phát triển thị trường,hội nhập quốc tế và kiểm soát những hành vi không an toàn trong điều kiện kinh tế

thị trường Ngộ độc thực phẩm là một vấn đề đang được quan tâm hàng đầu, việc ra đời

của Cục An toàn thực phẩm (trực thuộc BYT) năm 1999 đã đánh dấu một bước tiếnquan trọng trong công tác quản lý và chăm sóc sức khỏe cho nhân dân trong đó bao gồm

cả các bệnh lây truyền qua đường thực phẩm Theo báo cáo của Cục An toàn thực phẩm,năm 2016, có gần 10.000 người ngộ độc thực phẩm; năm 2017, cả nước xảy ra

139 vụ ngộ độc thực phẩm với 3.869 người mắc, trong đó có 24 trường hợp tử vong

Từ đầu năm 2018 đến nay, toàn quốc đã xảy ra 79 vụ ngộ độc thực phẩm với2.847 người mắc, trong đó có 16 trường hợp tử vong Trong năm 2022, cả nước xảy ra

54 vụ ngộ độc thực phẩm, 1.359 người bị ngộ độc trong đó 18 người tử vong Thực tế

theo các chuyên gia thì phải gấp ít nhất 10 lần con số được công bố Nguyên nhân gâyngộ độc thực phẩm chủ yếu là do vi sinh vật (42,2%), sau đó là hoá chất (24,9%) và

độc té tự nhiên trong thực phẩm (25,2%) còn lại không xác định được nguyên nhân.

2.2 Tình hình nhiễm Bacillus cereus trên thế giới và tại Việt Nam

2.2.1 Tình hình nhiễm Bacillus cereus trên thế giới

Bacillus cereus lần đầu tiên được Frankland phân lập và mô tả vào năm 1887.Tuy nhiên, cho đến năm 1950, vi khuẩn nay mới được Hauge và ctv chứng minh làcăn nguyên gây ra các vụ dịch ngộ độc thực phẩm Sự thật là vì ảnh hưởng của vi sinhvật này ít được biết đến, ít được báo cáo là nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm Sau

đó, hàng loạt nghiên cứu đã chỉ ra rang, Bacillus cereus tồn tại rộng rãi trong các loạithực phẩm khác nhau, chang hạn như thực phẩm giàu tinh bột và gạo, rau sống và xay

nhuyễn, bánh mì, sữa và các sản phẩm từ sữa, sản phẩm thịt, thực phẩm ăn liền và là

nguyên nhân của rất nhiều đợt bùng phát ngộ độc thực phẩm (Samapando và ctv, 201 1)

Từ năm 1972 và năm 1983 các trường hợp ngộ độc thức ăn do Bacillus cereus

chiếm 2% tổng số các dịch bệnh truyền qua thực phẩm Năm 1981, 8 6 dich đã được

báo cáo chủ yêu liên quan đến gạo, còn nhiều vụ dịch khác không được báo cáo hoặc

bị chân đoán sai với các triệu chứng tương tự nhiễm độc Staphylococcus aureus

(Bacillus cereus loại gay nôn) hoặc Clostridium perfringens (Bacillus cereus loại tiêuchay) (Ehling-Schulz, Fricker va Scherer, 2004) Tai chau Au từ năm 1990 - 1995,các vụ ngộ độc thực phẩm do Bacillus cereus chiếm khoảng 17,8% các trường hop

ngộ độc thực phẩm, tại Ha Lan là 19% (Schoeni và Lee Wong, 2005) và ở Đài Loan

nó xếp thứ 3 trong các nguyên nhân chính gây ngộ độc thực phẩm (Schoeni và

Lee Wong, 2005) và chiếm khoảng 33% trong tổng số các nguyên nhân gây ngộ độc

thực phẩm ở Na Uy (1988 - 1993), 47% ở Iceland (1985 - 1992) và tỷ lệ thấp hơn ởcác quốc gia khác: Canada (2,2%), Mỹ (1,3%), Scotland (0,8%) và Nhat Bản (0,7%)(Schoeni và Lee Wong, 2005).

Ước tính khoảng 27.000 ca bệnh do thực phẩm hang năm ở Hoa Kỳ là doBacillus cereus gây ra từ năm 1993 đến 1997 (Schoeni và Lee Wong, 2005) Tại Hoa

Ky, 1,74% các vụ bùng phat do thực phẩm được báo cáo từ năm 1998 đến 2008 và ở

Trung Quốc, 6,8% các vụ bùng phát đo vi sinh vật gây bệnh từ năm 1992 đến 2001 là

do Bacillus cereus (Zhang và ctv, 2017) Trong vòng 5 năm, 2011 - 2015, có gần 300

vụ bùng phát ngộ độc thực phẩm do Bacillus cereus đã được báo cáo ở các quốc giaChâu Âu Theo một báo cáo của Cơ quan An toàn Thực phẩm Châu Âu (EFSA) vàTrung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa Dịch bệnh Châu Âu (ECDC) năm 2015,nguyên nhân phố biến thứ tư gây bùng phát dịch bệnh do thực phẩm ở Liên minhChâu Âu là Bacillus cereus (Zhang va ctv, 2017) Năm 2019, một chang trai 20 tuổi ở

Bi từng suy gan, vì ăn món mì ống đã để 5 ngày, chứa lượng lớn vi khuẩn này.Cùng năm, một bài báo công bồ trên tạp chí Frontiers in Microbiology, ước tính 63.000trường hợp ngộ độc thực phẩm do Bacillus cereus gây ra mỗi năm ở Hoa Kỳ

2.2.2 Tình hình nhiễm Bacillus cereus ở Việt Nam

Mặc dù đã xảy ra rất nhiều vụ ngộ độc thực phẩm mà căn nguyên là doBacillus cereus nhưng chúng ta chưa có một công bố nào về tình hình ngộ độc

thực phẩm do Bacillus cereus gây ra tại Việt Nam và chưa có nhiều nghiên cứu

nhằm xác định thực trạng ô nhiễm của vi khuẩn này trong thực phẩm Các cuộcgiám sát tình trạng ô nhiễm thực phẩm trong những năm vừa qua chủ yếu tập trung vàoviệc đánh giá thực trạng 6 nhiễm của thực phẩm với Salmonella spp., Escherichia coli,Staphylococcus aureus, Vibrio spp

Việt Nam là quốc gia có khí hậu nóng âm, điều đó tạo điều kiện thuận lợicho Bacillus cereus phát triển trong thực phẩm và giải phóng ra độc tố, ý thức củangười dân chưa đầy đủ và đặc biệt là việc sử dụng rất nhiều các sản phẩm thực phẩm

có nguồn gốc từ gạo góp phan làm cho tỷ lệ ngộ độc thực phẩm do Bacillus cereus làkhông nhỏ ở Việt Nam Theo báo cáo, năm 2012 hàng chục trẻ mầm non ở Cần Thơcũng nhập viện do ăn phở và sữa chua nhiễm Bacillus cereus Năm 2020, thức ăn từ

cơ sở bán đồ chay ở Đà Nẵng bị nhiễm Escherichia coli, Staphylococcus aureus vaBacillus cereus, khién 230 người bị ngộ độc V1 khuẩn Bacillus cereus là một trongnhững tác nhân gây ngộ độc thực phẩm hàng dau, xếp sau Salmonella có mặt trongmẫu cánh gà chiên nước mắm khiến hơn 600 học sinh ở Nha Trang ngộ độc thực phẩmtrong đó có 1 em tử vong (Trương Hữu Khanh, 2023) Theo Nguyễn Thị Mộng Ngọc(2023) cho biết, Bacillus cereus cũng là nguyên nhân khiến hơn 80 công nhân tại

Công ty sản xuất linh kiện điện tử (CCIPY) tại Khu công nghiệp An Phú, xã An Phú,

thành phố Tuy Hòa bị ngộ độc thực phẩm Hay liên quan đến vụ ngộ độc tập thê sau khi

ăn chè đậu trắng xảy ra tại xã Long Điền A, huyện Chợ Mới, tỉnh An Giang,chiều 10/2/2023, Chi cục An toàn vệ sinh thực phẩm tinh An Giang đã có báo cáo tácnhân gây ra vụ ngộ độc là vi khuẩn Bacillus cereus có trong mẫu chè với 50 trường hợp

có triệu chứng ngộ độc nhẹ, 4 ca ngộ độc nang, | trường hợp đã tử vong.

2.3 Tổng quan Bacillus cereus

Theo cơ sở dữ liệu về phân loại trên NCBI thi Bacillus cereus thuộc giới Bacteria,ngành (phylum) Firmicutes, lớp (class) Bacilli, bộ (order) Bacillales, ho (family) Bacillaceae, chi (genius) Bacillus, loai (species) cereus Trong chi Bacillus nay ngoailoài cereus còn có một số loài như Bacillus subtilis, Bacillus coagulans, Bacillusthuringiensis, Bacillus natto, Paenibacillus larva.

2.3.1 Dac diém Bacillus cereus

Bacillus cereus là trực khuẩn, gram đương, tạo nội bao tử Kích thước 0,5 - 1,5 X

2 - 4 um Vi khuẩn không tạo giáp mô, không có khả năng di động Thích nghi vớinhững môi trường sống rất khác nhau, từ môi trường nhiệt lạnh đến nóng, trải dải từ

núi cao đến đất ôn đới (Stetten va ctv, 1999) và từ thực phẩm làm lạnh đến thực pham

mat nước (Pirttijarvi va ctv, 1998; Guinebretiere và Nguyen The, 2003)

Đặc điểm nuôi cấy Bacillus cereus: dé mọc, hiểu khí và ki khí tùy nghi, nhiệt độtối ưu ở 35 đến 40°C; pH thích hợp là 7,0 - 7,2 Trên môi trường NA hay TSA sau

24 giờ tạo khóm lớn, nhăn nheo, xù xì Trên môi trường BA tạo dung huyết rộng.Trên môi trường MYP tạo khóm hồng chung quanh có vòng sáng Trên môi trườngMossel tạo khóm to hồng chung quanh có vòng sáng Còn trên môi trường canh NB hayTSB sẽ đục tạo váng, sau cặn lợn cợn.

Tính chất sinh hóa: Có khả năng lên men glucose trong điều kiện hiếu khí và kịkhí, không lên men mannitol Có kha năng khử nitrat thành nitrit và phân giải Tyrosine.

Có thé mọc trên môi trường NB + 0,001% lysozyme Đòng thời, cho kết qua thử nghiệm

sinh hóa như sau: Phản ứng VP (+), Catalase (+), Citrate (+).

2.3.4 Độc tố và cơ chế sinh độc tố của Bacillus cereus

Bacillus cereus gây bệnh bang cách sinh nội độc tố, Bacillus cereus gây ngộ độcthức ăn sinh ra 2 loại độc tố bao gồm: 1) Độc tố gây tiêu chảy (Diarrhoeal toxin):

Vi khuẩn sản sinh độc tố trên thịt, rau quả, gia vị với bản chất là một loại protein gâyhủy hoại biểu bì và niêm mạc ruột gây tiêu chảy có thé nguy hiém dén tinh mang.2) Độc tổ gây nôn mửa (Emetic toxin): Vi khuẩn nhiễm trong gạo, mì ống, khoai tây,đậu các loại (Rajkovic và ctv, 2020) với bản chất độc tố là photpholipit có tính 6n địnhcao không bi phân hủy ở nhiệt độ cao và dịch dạ dày Ngoài ra vi khuẩn còn có enzymehemolyzin, một protein gây độc mạnh có thể gây chết người

2.3.5 Triệu chứng ngộ độc thực phẩm do Bacillus cereus

Bacillus cereus ở ruột hình thành bào tử tiết độc tố Ở nhiệt độ phòng, các bảo tửnày có thể tăng số lượng Khi gặp điều kiện không thuận lợi như khô, nóng do quá trình

xử lý, chế biến, bảo quản thực phẩm thì Bacillus cereus vẫn có thé tồn tại ở dạngbảo tử Bao tử vi khuẩn khá dé kháng với các biện pháp khử khuan phổ biến như nhiệt,tia xạ, siêu âm, dung dich ion, ozon, hoá chất khử nhiễm, pH thấp Bacillus cereuschi bị tiêu diét khi hấp ướt 121°C trong 20 phút hoặc say khô 160°C trong 1 giờ Nhưngđây lại không phải là điều kiện nhiệt độ thường gặp trong các kiểu chế biến thức ăn.Thực phẩm chứa vi khuẩn ở mật độ 10° CFU/g đủ gây ngộ độc.

Bacillus cereus có thé gây ngộ độc thực phẩm, nhiễm trùng mắt và bệnh nha chu

ở người (Drobniewski, 1993; Helgason va ctv, 2000) Các triệu chứng ngộ độc do

Bacillus cereus thường nhẹ và nhanh chóng hồi phục, được rất nhiều tác giả khác nhau

đề cập tới với hai dạng ngộ độc chính: 1) Xảy ra rất nhanh, buồn nôn, nôn thường xuấthiện trong vòng 5 giờ sau khi ăn phải thức ăn bị ô nhiễm độc tố của Bacillus cereus,thé nhẹ có thé bình phục trong vòng 12 - 24 giờ (Singh va ctv, 2019) 2) Tiêu chảythường xảy ra sau 8 - 16 giờ sau khi ăn phải thức ăn bị nhiễm độc tố của Bacillus cereus,thé thông thường thường không cấp tinh, 1 - 2 ngày sau khi ăn phải thức ăn 6 nhiễmBacillus cereus sẽ thay một lượng lớn Bacillus cereus trong mẫu phân, khi bình phụccác chất nhanh chóng được bai tiết ra khỏi co thé Nguyên nhân của triệu chứng này là

do sự sản sinh ra độc tố đường ruột trong thời kỳ sinh trưởng của Bacillus cereus trongruột non từ việc ăn vào bụng các tế bào hay bào tử của vi khuẩn Dạng ngộ độc gây tiêuchảy bị gây ra bởi loại vi khuẩn Bacillus cereus có cau trúc phan tử protein lớn.Loại vi khuẩn này rất dé đính lên các nhóm thực phẩm như thịt, sữa, rau và cá

Các bác sĩ đã ghi nhận được các biểu hiện lâm sàng đáng chú ý khác với những

người bị ngộ độc bởi loại vi khuẩn Bacillus cereus một khi không được chữa tri kip thời

và triệt dé Đó là biểu hiện bệnh não cấp tính (Ichikawa và ctv, 2010), suy gan cấp tính

(Mahler va ctv, 1997; Pósfay-Barbe va ctv, 2008) và tử vong (Dierick và ctv, 2005; Mahler va ctv, 1997; Shiota va ctv, 2010).

2.4 Tinh hình nghiên cứu phương pháp kiểm nghiệm Bacillus cereus

2.4.1 Tình hình nghiên cứu phương pháp kiểm nghiệm Bacillus cereus trên thé giới

Cho đến nay, đã có nhiều phương pháp thử nghiệm khác nhau được áp dụng

dé định lượng Bacillus cereus Theo truyền thống, có nhiều phương pháp được tiêu

chuẩn hóa bởi các tô chức bao gồm Cục Quản ly Thực phẩm và Dược phẩm (FDA),

Tổ chức Tiêu chuẩn Quốc tế (ISO) và Hiệp hội Chuẩn hóa Pháp (AFNOR, AOAC,

BAM, NMKL, ) Bacillus cereus có kha năng sản sinh lecithinase và không có

khả năng lên men mannitol nên môi trường thạch mannitol lòng đỏ trứng polymyxin

(MYP) và thạch polymyxin pyruvate lòng do trứng mannitol bromothymol (PEMBA)

là môi trường chon lọc thường được sử dụng bởi nhiều cơ quan quan lý thực phẩm,

mỹ phẩm và dược phẩm Tuy nhiên, đối với thực phẩm có hệ vi sinh vật nền cao thì

môi trường này không đủ tính chon lọc vì kháng sinh polymyxin B được bồ sung chỉ

ức chế vi khuẩn gram âm (Chon và ctv, 2012) Đồng thời quy trình tốn nhiều công sức

và thời gian đối với các đơn VỊ kiểm nghiệm (AOAC International, 1995; ICMSF, 2002;Brazil, 2003; ISO, 2004).

Các phương pháp phát hiện dựa trên DNA như PCR định lượng (qPCR hay

real-time PCR) đã được sử dung rộng rãi dé phát hiện Bacillus cereus trong cácmẫu thực phẩm (Fernandez-No va ctv, 2011; Oliwa-Stasiak va ctv, 2011; Rantsiou va

ctv, 2012; Dzieciol va ctv, 2013) Tuy nhiên, điều nảy không khả thi trong việc

phân biệt giữa các tế bảo sống và tế bào chết (Cattani và ctv, 2016), cản trởnghiêm trọng việc áp dụng rộng rãi các phương pháp phát hiện dựa trên DNA.

Dé khắc phục hạn chế nay, propidium monoazide (PMA) đã được sử dụng làmthuốc nhuộm xen kẽ axit nucleic dé ức chế quá trình khuếch đại PCR DNA ngoại bào

và DNA từ tế bào chết hoặc tế bào bị tổn thương màng (Martinon và ctv, 2012;Barth và ctv, 2012; Cattani va ctv, 2013; Zhang va ctv, 2015; Lv và ctv, 2016).

Ngoài ra, một vài phương pháp được sử dụng dé phát hiện các độc tố củaBacillus cereus như: xét nghiệm tế bảo HEp-2 (Hughes và ctv, 1988; Szabo và ctv, 1991;Mahler va ctv, 1997); Yamaguchi va ctv (2013) đã phát triển một phương pháp mới déphat hiện nhanh chóng va định lượng độc tố gây nôn Bacillus cereus cereulide trong cácsản phẩm thực phẩm bằng phân tích sắc ký lỏng ghép nối khối phô (LC-MS/MS)

dé chiết xuất cereulide từ thực phẩm bằng cách sử dụng hộp silica gel pha thường.Ngoài LC-MS/MS, LC-MS và LC-Time of Flight Mass Spectrometry (LC-TOF-MS)cũng đã được sử dung dé phát hiện độc tổ cereulide của Bacillus cereus (Thorsen va ctv,2009; Bauer và ctv, 2010; Frenzel và ctv, 2011).

Năm 2013, Hu va ctv đã nghiên cứu và thiết lập một công nghệ phát hiện các

chủng Bacillus cereus khả thi chứa một trong ba gen độc tô Hệ thống phát hiện sử dụng

thuốc nhuộm huỳnh quang bão hòa thế hệ thứ ba SYTO 9 Green để cải thiện độ nhạy

cùng với độ phân giải đường cong nóng chảy và sự kết hợp giữa công nghệ PMAxx vàqPCR giúp xác định chính xác Bacillus cereus khả thi Đồng thời, một bộ phát hiệnPMAxx-qPCR mới đã được xây dựng bằng phương pháp trên, có thể đáp ứng cácyêu cau phát hiện thực tế của Bacillus cereus và có triển vọng ứng dụng rộng rãi.

Dellinger và ctv (2020); Marzulli và ctv (2021) đã phát triển quang phổ hồng ngoại

biến đổi Fourier (FTIR) và quang phô khối thời gian khử/ion hóa bằng laser có hỗ trợ

ma trận (MALDI-TOF) dé tăng tốc độ xác định và mô tả đặc điểm của Bacillus cereuscereulide Tuy nhiên, sự đa dạng về cơ sở dit liệu là yếu tố quyết định dé xác định chínhxác loài và việc trao đôi dữ liệu quang phô dựa trên điện toán đám mây sẽ là cần thiếttrong việc phân biệt dưới loai.

Trong 20 năm qua, một loạt các môi trường thạch tạo màu đã được phát triển vàliên tục cải tiến với độ đặc hiệu cao Công nghệ này là kỹ thuật phân biệt dựa trên

màu sắc Các phản ứng sinh màu dựa trên sự phân cắt phức hợp cơ chất và chất tạo màu

bằng enzym (vi dụ: B-D-glucosidase), đặc hiệu hơn so với môi trường tăng trưởng

vi sinh thông thường Một số cơ chất tạo màu tăng cường phát hiện hoạt động củaPLC tạo điều kiện thuận lợi cho việc nhận dạng khuẩn lạc điển hình Tính chọn lọcđạt được ở cả hai loại môi trường bằng cách bổ sung các chất kháng sinh(ví dụ: polymyxin B hoặc trimethoprim), ức chế sự phát triển của vi khuẩn gram dương

và gram âm không mong muốn (Fricker và ctv, 2008; Tallent và ctv, 2012).Kết quả rất cụ thể và có thể phân biệt rõ ràng bằng mắt thường trong điều kiện ánh sángbình thường Với kỹ thuật này, các khuẩn lạc của vi sinh vật cụ thé có thé đượcphát hiện bằng màu sắc của chúng nhanh chóng

Một số môi trường tạo màu dé phát hiện Bacillus cereus cũng đã được phát trién,

chẳng hạn như môi trường ACA, BCM, CBC và Bacara (Peng và ctv, 2001;

Fricker và ctv, 2008; Tallent và ctv, 2012) Trong đó, Peng và ctv (2001) đã phát triểnmôi trường tạo màu có chứa chất nền chromogen (5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-myo-inositol-I-phosphate) để phát hiện hoạt tinh Phospholipase C đặc hiệu vớiphosphatidylinositol, chọn lọc và khác biệt để phát hiện enzyme PI-PLC trongBacillus cereus Các nghiên cứu trước đây cho rằng thạch tạo màu mang lại độ nhạy và

độ chọn lọc cao hơn cho việc định lượng Bacillus cereus, đặc biệt là trong các sản phẩm

thực phẩm (Fricker và ctv, 2008; Tallent và ctv, 2012).

2.4.2 Tình hình nghiên cứu phương pháp kiểm nghiệm Bacillus cereus ở Việt Nam

Theo báo cáo từ Bộ Y tế, Việt Nam chỉ có khoảng 38 trung tâm y tế có khả năng

kiểm nghiệm được loài vi khuẩn này, khoảng 60% các tỉnh thành có năng lực kiểm

nghiệm Hiện nay, các phòng kiểm nghiệm chủ yếu phân tích chỉ tiêu Bacillus cereustheo các phương pháp sau: TCVN 4992:2005 (ISO 7932:2004), TCVN 7903:2008 (ISO

21871:2006), BAM Chương 14, AOAC 980.31:1981 Việc thực hiện phân tích Bacillus

cereus theo các phương pháp này mất thời gian từ 3 - 5 ngày, độ chính xác không cao,

phụ thuộc vào nền mẫu và yêu cầu mức độ thành thạo của kiểm nghiệm viên khá lớn

Hiện nay, ngày càng nhiều các phương pháp thay thế được áp dụng ở Việt Nam,chủ yếu là các phương pháp độc quyền được sử dụng dé đánh giá chất lượng vi sinhcủa nguyên liệu, thành phẩm và tình trạng ô nhiễm vi sinh của quy trình sản xuất

Các phương pháp này thường nhanh chóng và dé thực hiện hơn so với các phương phápchuẩn tương ứng Trong đó, phương pháp sử dụng môi trường sinh màu

RAPID’B.cereus của hang Bio-Rad được phát triển dé phát hiện và định lượngBacillus cereus trong các sản phẩm thực phẩm ở 30°C trong 21 - 24 giờ mà không cầnkhang định lại Điều này giúp phát hiện Bacillus cereus dé dàng, tiết kiệm thời gian

và mang lại hiệu quả kinh tế cao (Bio-Rad, 2019)

2.5 Ý nghĩa của việc xác nhận lại giá trị sử dụng của môi trường mới(RAPID’B.cereus)

Tham định phương pháp hay ở nghiên cứu này còn gọi là xác nhận giá tri

sử dụng của môi trường mới (RAPID’B.cereus) là công việc cần thiết phải tiến hànhtrước khi phòng thí nghiệm áp dụng môi trường mới đó vào sử dụng với các mục đíchkhác nhau, đặc biệt khi dùng cho kiểm nghiệm hoặc nghiên cứu Việc đánh giá nàygiúp cho người sử dụng nhận định một cách tương đối phương pháp nào là tối ưu hơn

Từ đó, tùy vào điều kiện và các yêu cầu cụ thể sẽ lựa chọn môi trường có tính phù hợp,hiệu quả nhất đáp ứng cho công việc phân tích Đồng thời, việc xác nhận lại giá trị

sử dụng giúp bổ sung những thiếu sót, hạn chế của môi trường và giúp nó trở thành

một môi trường đáng tin cậy và được sử dụng rộng rãi.

CHUONG 3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHAP

3.1 Thời gian và dia điểm nghiên cứu

Thời gian: từ 02/2023 đến tháng 06/2023

Địa điểm nghiên cứu: phòng Vi sinh, Trung tâm Dịch vụ Phân tích Thí nghiệmThành phố Hồ Chi Minh (CASE)

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu thực phẩm sử dụng trong nghiên cứu được khách hàng gửi phân tích tại Trungtâm Dịch vụ Phân tích Thí nghiệm TP.HCM (CASE).

3.2.2 Chung vi sinh vật được sử dụng cho nghiên cứu

Các chủng vi sinh vật được sử dụng trong đề tài bao gồm 01 chủng chứng dương

là Bacillus cereus và 2 chủng chứng âm là các vi khuân được đề xuất theo CoA củamôi trường MYP và môi trường RAPID’B.cereus, cụ thé là: Bacillus subtilis,Escherichia coli Danh sách, nguồn gốc các chủng có nguồn gốc thương mai được trình

bày cụ thể tại Bảng 3.1

Bảng 3.1 Chủng vi sinh vật nguồn gốc thương mại sử dụng cho nghiên cứu

STT Tên chủng Nguồn gốc Nơi lưu trữ

1 Bacillus cereus ATCC 11778 CASE

2 Bacillus subtilis ATCC 6633 CASE

3 Escherichia coli ATCC 25922 CASE

3.2.3 Thiét bi va dung cu

Tủ an toàn sinh học (ESCO), nôi hap tiệt trùng (HIRAYAMA), tủ ủ LABTECH),

tủ ấm 45°C (ESCO), tủ mát (SANYO), Micropipette (JOANLAB), máy dap mẫu

(Stomacher 80 Biomaster), máy trộn mẫu (IKA) và một số thiết bị, dụng cụ thường dùngtrong vi sinh.

3.2.4 Môi trường, hóa chat

Môi trường MYP (Cat#105267, Merck)

Môi trường RAPID’B cereus (Cat#12007304, Bio-Rad)

Môi trường pha loãng Maximum Recovery Diluent (Cat#146809, Merck)

Egg Yolk Emulsion, 50% (Cat#103784, Merck)

Selective Supplement (Cat#109875, Merck)

Môi trường Tryptone Soya Agar (Cat#105458, Merck)

Nutrient Agar (Cat#105450, Merck)

Blood Agar Base (Cat#110886, Merck)

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phương pháp định lượng Bacillus cereus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

trên môi trường thạch MYP và môi trường thạch tạo màu RAPID’B.cereus

3.3.1.1 Phương pháp định lượng Bacillus cereus trên môi trường MYP theo TCVN

4992:2005 (ISO 7932:2004)

a Chuẩn bị, pha loãng mẫu

Tiến hành cân 10 g mẫu thực phẩm cho vảo túi PE, bổ sung 90 ml môi trường phaloãng MRD, đồng nhất bằng stomacher trong 1 phút để có độ pha loãng 101

Dùng pipet vô trùng chuyên 1 ml dung dich ở độ pha loãng 10'! vào ống nghiệm

chứa 9 ml MRD vô trùng, vortex ta được dung dịch có độ pha loãng 10” Tùy theo mức

độ nhiễm ban của mẫu, tiễn hành tương tự dé có độ pha loãng cao hon

b Nuôi cấy, phân lập trên môi trường MYP

Hút 1 ml từ dung dịch mẫu thử 107 (hoặc 100 ul từ mẫu thực phẩm lỏng) cho lên

bề mặt đĩa thạch MYP 130 mm Làm tương tự với các độ pha loãng tiếp theo

Dùng dụng cụ dàn mẫu thủy tỉnh dàn đều dịch cấy lên khắp mặt đĩa thạch sao chocác khuẩn lạc mọc phân tán đều Dé các đĩa có đậy nắp ở nhiệt độ phòng 15 phút rồi lậtngược đưa vào tủ ủ Ủ các đĩa đã cấy mẫu ở 30°C trong 24 giờ Nếu không thấy các

khuẩn lạc ủ thêm 24 giờ nữa

c Đếm các khuẩn lạc điển hình

Khuẩn lạc Bacillus cereus điển hình trên môi trường thạch MYP: det, đường kính

2 —3 mm, bờ hình răng cưa, màu đỏ hồng, xung quanh có vùng đục

Chọn các đĩa ở hai đậm độ pha loãng liên tiếp, đếm các khuẩn lạc điển hình ởcác đĩa này Số lượng Bacillus cereus trong một gam hoặc trong một mililit mẫuđược tính từ số lượng khuẩn lạc thu được trên các đĩa đã chọn ở các mức pha loãng

tạo ra các khuân lạc có thé đếm được

Hình 3.1 Khuan lac Bacillus cereus trên môi trường MYP.

d Khang định Bacillus cereus bằng các phản ứng sinh hóa

Chon từ 5 khuẩn lạc nghi ngờ trên mỗi đĩa cấy sang môi trường thạch nghiêngdinh dưỡng ủ 24 giờ ở 30°C để khang định Bacillus cereus bằng cách thử trênmôi trường Blood Agar (BA) Cấy ria, cây đâm sâu hoặc chấm các khuẩn lạc đã chọnlên mặt môi trường thạch BA U ở 30°C trong 24 giờ Bacillus cereus làm tan máu mạnh

và tạo vùng tan máu hoan toàn (B), đường kính 2 - 4 mm xung quanh vùng phát triển

A: số tế bao vi khuẩn trong 1 g hay 1 mL mẫu (CFU/g hoặc CFU/mL)

N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn

n¡: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i

V: thể tích địch mẫu (mL) cay vào trong mỗi dia

ƒ;: độ pha loãng tương ứng.

- Tính số lượng khuẩn lạc a của Bacillus cereus đã được khang định trên mỗi đĩa,

theo công thức:

trong đó:

A: là số lượng khuẩn lạc nghi ngờ mang đi thử

b: số lượng khuẩn lạc dương tính đã khang định

c: là tổng số khuẩn lạc nghi ngờ đếm được trên đĩa

Làm tròn kết quả đã tính đến hai chữ số có nghĩa.

Báo cáo kết quả theo số Bacillus cereus có trong một ml hoặc một gam mẫu, đượcbiểu thị theo số từ 1,0 đến 9,9 nhân 10%, trong đó x là luỹ thừa tương ứng của 10

3.3.1.2 Phương pháp định lượng Bacillus cereus trên môi trường thạch tạo màu RAPID’B.cereus theo Bio-Rad năm 2019

a Pha loãng mau

Tiến hành cân 10 g mẫu thực phẩm cho vào túi PE, bồ sung 90 ml môi trường phaloãng MRD, đồng nhất bằng Stomacher trong 1 phút để có độ pha loãng 101

Dung pipet vô trùng chuyển 1 ml dung dich ở độ pha loãng 107 vào ống nghiệm

chứa 9 ml MRD vô trùng, vortex ta được dung dich có độ pha loãng 10 Tùy theo mức

độ nhiễm ban của mẫu, tiến hành tương tự dé có độ pha loãng cao hon

b Nuôi cấy, phân lập trên môi trường RAPID 'B.cereus

Hút 1 ml từ dung dịch mẫu thử 101 (hoặc 100 ul từ mẫu thực phẩm lỏng) cho lên

bề mặt đĩa thạch RAPID’B.cereus 130 mm Làm tương tự với các độ pha loãng tiếptheo Dùng dụng cụ dàn mẫu thủy tỉnh dàn đều dịch cấy lên khắp mặt đĩa thạch sao chocác khuẩn lac mọc phân tán đều Dé các đĩa có đậy nắp ở nhiệt độ phòng 15 phút rồi lậtngược đưa vào tủ ủ U các đĩa đã cay mẫu ở 30°C trong 24 + 3 gid

c Đếm các khuẩn lạc điển hình

Khuẩn lac Bacillus cereus điển hình trên môi trường thạch RAPID’B.cereus: màu

đỏ được bao quanh bởi một quang sáng mờ đục hoặc không có quang sáng trong một sốtrường hợp hiếm gap

Hình 3.2 Khuan lạc Bacillus cereus trên môi trường RAPID’B.cereus

d Tinh kết quả: Tinh toán tương tự 3.3.1.1

3.3.2 Nội dung 1: Khảo sát mức độ nhiễm Bacillus cereus của các nhóm thực phẩm

Thực hiện khảo sát mức độ nhiễm Bacillus cereus ở 5 nhóm mẫu: 1) Ngũ cốc vàsản phẩm từ ngũ cốc; 2) Bột và tinh bột; 3) Rau củ và sản phẩm từ rau củ; 4) Sữa và sản

phẩm từ sữa; 5) Bánh mứt kẹo (những nhóm mẫu thường có sự xuất hiện của Bacillus

cereus) trên môi trường MYP theo TCVN 4992:2005 (ISO 7932:2004) so với Quyết định số46-2007/QĐ-BYT của Bộ y tế

Bang 3.2 Giới han cho phép Bacillus cereus có mặt trong thực phẩm theo Quyết định

số 46-2007/QD-BYT

Minn ait

1 Ngũ cốc và san phẩm từ ngũ cốc 10! (có xử lý nhiệt trước khi sử dụng)

2 Bột và tỉnh bột 102 (có xử lý nhiệt trước khi sử dụng)

3 Rau củ và sản phẩm từ rau củ 10

4 Sữa và sản phẩm từ sữa 10

5 Bánh mứt kẹo 10!

Phuong pháp định lượng: thực hiện tương tự mục 3.3.1.1.

Xử lý số liệu: Số liệu được xử lý bằng phương pháp thống kê mô tả, lấy trung bìnhtheo phần mềm Microsoft Excel 2016

3.3.3 Nội dung 2: Nghiên cứu độ phát triển, độ chọn lọc và độ đặc hiệu của môitrường thạch tao màu RAPID’B.cereus

3.3.3.1 Nghiên cứu độ phát triển

Khảo sát này nhằm mục đích khảo sát mức độ phục hồi của vi sinh vật mục tiêu làBacillus cereus từ môi trường nuôi cấy dưới điều kiện xác định

Chủng chứng dương được sử dụng để đánh giá độ phát triển của môi trường

RAPID’B.cereus là: Bacillus cereus ATCC 11778.

Quy trình xác định độ phat triển được thực hiện như sau:

- Chuan bị dung dịch chủng khoảng 10? CFU/ml

- Cay các dung dịch chủng vào các môi trường cần kiểm tra (RAPID ’B cereus),môi trường chuẩn (MYP) và môi trường tham chiếu (TSA) Sau đó đem đi ủ theo điềukiện quy định của phương pháp tương ứng với môi trường.

- Sau khi ủ, đếm số lượng khuẩn lạc trên các môi trường.

- Độ phát triển Pa (Hiệu suất) được xác định theo công thức sau:

trong đó:

Ns: tông số khuẩn lạc thu được trên môi trường kiểm tra

No: tổng số khuẩn lạc thu được trên môi trường tham chiếu

- Tiêu chí chấp nhận hiệu năng: Pa > 0.5

3.3.3.2 Độ chọn lọc và độ đặc hiệu

Mục đích: xác định mức độ ức chế vi sinh vật không mục tiêu (chủng chứng âm)trên môi trường RAPID°ð8.eere„s dưới điều kiện quy định của phương pháp

Quy trình xác định độ chọn lọc và độ đặc hiệu được thực hiện như sau:

- Chuan bị dung dich chủng chứng âm: 10 CFU/mL

Chủng chứng âm được khảo sát về độ chọn lọc của môi trường RAPID?B.cerewus

là Escherichia coli ATCC 25922 Chủng chứng âm được khảo sát về độ đặc hiệu của

môi trường RAPID’B.cereus là Bacillus subtilis ATCC 6633 Đây là các chủng vi sinh

theo CoA của nhà sản xuất được trình bày tại Bảng 3.3

Bảng 3.3 Chủng vi sinh và môi trường đối chứng sử dụng trong nghiên cứu độ chọnlọc và độ đặc hiệu của môi trường RAPID’B cereus

STT Tiêu chí đánh giá Chủng/Nguồn gốc chủng Môi trường đối chứng

1 Độ chọn lọc Escherichia coli ATCC 25922 Tryptone Soya Agar

2 Độ đặc hiệu Bacillus subtilis ATCC 6633 Tryptone Soya Agar

- Cay dịch chủng vào môi trường kiểm tra (RAPID’B cereus), môi trường chuẩn(MYP) và môi trường đối chứng phù hợp với từng chủng chứng âm theo Bảng 3.3 Sau

đó đem đi ủ 2 môi trường đã cấy chủng theo điều kiện quy định của phương pháp, cònmôi trường đối chứng thì ủ ở nhiệt độ và điều kiện thích hợp với từng chủng chứng âm.Sau khi ủ, đánh giá sự phát triển của các chủng vi sinh trên các đĩa môi trường

- Đối với các trường hợp chủng âm có sự phát triển trên môi trườngRAPID'ˆB.cereus:

+ Độ đặc hiệu: chỉ đánh giá ở mức độ trực quan.

+ Độ chọn lọc: tiến hành xác định hệ số chon lọc Sr.

Hệ số chon lọc Sr:

- Môi trường nuôi cấy chọn lọc và môi trường tham chiếu không chọn lọc được

gây nhiễm với các độ pha loãng khác nhau của chủng chứng âm.

- Độ chọn lọc vi sinh Sr của môi trường nuôi cấy chọn lọc được tính toán như sau:

Sr = Do - Ds trong do:

Do: độ pha loãng cao nhất cho khuẩn lạc phát triển trên trên môi trường tham chiếuDs: độ pha loãng cao nhất có thé so sánh được trên môi trường kiểm tra

Sr, Do và Ds được thể hiện ở dang đơn vị logio

Vị dụ:

Do 104 = logi04.0

> Sr = 1.0

Ds 10° = logio3.0

- Tiêu chí: Đối với môi trường thạch chọn lọc Sp > 2

3.3.4 Nội dung 3: So sánh, đánh giá hiệu năng của môi trường thạch sinh màu

RAPID’B.cereus so với môi trường MYP theo TCVN 4992:2005 (ISO 7932:2004)

3.3.4.1 Nghiên cứu độ đúng tương đối theo TCVN 12365-2:2018

Nghiên cứu độ đúng tương đối nhằm mục đích so sánh giữa các kết quả thu đượcbằng phương pháp chuẩn và phương pháp thay thế có tương đương hay không Nghiên

cứu đã thu thập và sử dụng các mẫu nhiễm Bacillus cereus tự nhiên Nghiên cứu nayđược thực hiện sử dụng các mẫu nhiễm tự nhiên và/hoặc mẫu gây nhiễm nhân tạo Các

nhóm, kiéu/loai và mẫu khác nhau được sử dụng trong nghiên cứu nay

a Chọn các nhóm dé thử nghiệm

Việc chọn các nhóm và kiểu/loại sử dụng trong thâm định phụ thuộc vào loại hoặcnhóm vi sinh vật và phạm vi đánh giá Đối với phương pháp dùng áp dụng cho nhiềuloại thực phẩm thì nên nghiên cứu ít nhất 5 nhóm thực phẩm Đối với tất cả các nhómđược chọn, nên có ít nhất 03 kiéu/loai khác nhau cho mỗi nhóm đưa vào nghiên cứu.Khi chọn mẫu dé nghiên cứu, ưu tiên là những mẫu bị nhiễm tự nhiên đã khảo sát ở nộidung 1 Các mẫu có dai nhiễm Bacillus cereus càng rộng càng tốt

Cần đảm bảo rằng với việc chọn các loại nền mẫu có hệ vi sinh vật cao và thấp (tự

nhiên) khác nhau, các kiểu/loại stress khác nhau do chế biến và nguyên liệu thô (chưachế biến) như stress nhiệt, stress pH, stress hoạt độ nước, được đưa vào nghiên cứu

Các nhóm mẫu sử dụng cho thí nghiệm được trình bày tại Bảng 3.4.

Một số mẫu nhiễm tự nhiên có thé chứa số lượng cao vi sinh vật đích và điều này

có thé làm khó khăn cho nghiên cứu dé có được dải nồng độ nhiễm theo yêu cầu củaTCVN 12365-2:2018 Trong trường hop này, mau bị nhiễm tự nhiên có thé được

“pha loãng” với các nguyên liệu không bị nhiễm của cùng mẫu sản phẩm

Sau đó, các phương pháp chuẩn và phương pháp thay thế phải được thực hiện vớicùng một mẫu càng chính xác càng tốt

Số lượng mẫu sử dụng cho mỗi nhóm thí nghiệm được trình bày tại Bảng 3.4

Bảng 3.4 Các nhóm và số lượng mẫu sử dụng trong nghiên cứu độ đúng tương đối

c Tỉnh và diễn giải nghiên cứu độ đúng tương doi

Các kết quả thu được được phân tích bằng cách sử dụng phương pháp Altman Xây dựng đồ thị điểm cho dữ liệu kết quả của từng mẫu trên từng nhóm và chomỗi mẫu trong tất cả các nhóm và vẽ đường nhận dạng trên đó có tất cả các điểm nếuhai phương pháp cho kết quả giống nhau đối với từng mẫu phân tích (y=x)

Bland-Hình 3.3 cho ví dụ về một nhóm cụ thé Đồ thị của một nhóm cần cho thấy kết quảcủa mỗi loại được thử nghiệm bang một biểu tượng khác biệt Đồ thị điểm của tat cả cácnhóm cần biểu dién với một biểu tượng khác nhau Điều này cho phép đánh giá trựcquan nhanh về mức độ mà hai phương pháp (không) thống nhất

Logio cfu/g phương pháp chudn

Hình 3.3 Đồ thị của kết quả phương pháp chuẩn so với phương pháp thay thế đối

với một nhóm sản phẩm riêng lẻ Nguồn: TCVN 12365-2:2018

Xác định giá trị trung bình của mỗi cặp dữ liệu và chênh lệch giữa các giá trị như

trong Bảng 3.5 và vẽ đồ thị (xem Hình 3.4) cho mỗi nhóm va cho tất cả các nhóm déminh họa mức độ sai lệch và sự thiếu đồng nhất của dữ liệu Hình 3.4 cho thấy đườngnhận diện (chênh lệch zero), đường của độ chệch và giới hạn độ tin cậy (CL) trên va

dưới 95 % của độ chệch.

Bảng 3.5 Kết quả thống kê đối với tất cả các nhóm

; Logio CFUNhấm “yg Trung binh Chênh lệch

chuân thay thê

Bảng 3.5 Kết quả thống kê đối với tất cả các nhóm

: Logio CFUNhóm =" My — 'TmngBinh Chênh lệch

/Loại Phương pháp Phương pháp

chuân thay thê

Trung bình của tất cả các nhóm Dia

Độ lệch chuẩn của tất cả các nhóm Spati

TCVN 12365-2:2018.

Tính chênh lệch trung bình D độ lệch chuẩn của các chênh lệch sp va các giới hanthông nhật đôi với từng nhóm va tat cả các nhóm sử dụng công thức sau:

D+T.Sp J1 +

Trong đó ø là số cặp dữ liệu, 7 là phần trăm của phân bố Student-/ đối với xác suất 2

của dai đã chon và (n - 1) bậc tự do, đó là: (2

Các điểm vẽ theo Hình 3.4 là chênh lệch của từng mẫu riêng lẻ so với các giá trịtrung bình trên đồ thị thể hiện đường nhận dạng (chênh lệch zero - không chênh lệch),đường của độ chệch và giới hạn tin cậy trên và dưới 95% của độ thống nhất (CL) của

độ chệch đối với tất cả các nhóm Điều nay minh họa độ chệch và (mức độ thiểu) thống

nhất của dữ liệu Hình 3.4 cho thầy biểu đồ đối với từng giá trị cùng với đường nhậndang (chênh lệch zero), đường độ chệch và các giới hạn độ tin cậy trên và dưới 95% của

= = — tuyến tính (giới hạn trên 95 %)

s ~— tuyến tính (giới hạn dưới 95%)

Trung bình của log: cfu/g

Hình 3.4 Đồ thị chênh lệch Bland-Altman đối với tất cả các nhóm Nguồn:

TCVN 12365-2:2018.

Các kết quả của độ chênh lệch và đồ thị phân tán sẽ được giải thích dựa trên quan

sát trực quan về mức độ chệch và các kết quả cực đoan Điều này được mong đợi rằng

không nhiều hơn 01 trong 20 giá trị đữ liệu sẽ nằm ngoài các giá trị CL Mọi sự khôngphù hợp so với dự kiến cần được ghi nhận

3.3.4.2 Nghiên cứu độ chính xác theo TCVN 12365-2:2018

Nghiên cứu nhằm mục đích so sánh kết quả của phương pháp chuẩn và phươngpháp thay thế trong các mẫu gây nhiễm nhân tạo bằng cách phân tích lặp lại của các mẫu

trong các nhóm mẫu nghiên cứu.

a Chọn các nhóm dé sử dung

Tương tự như nghiên cứu độ đúng tương đối

b Số lượng mẫu

Đối với mỗi nhóm được kiểm tra, ít nhất 1 kiéu/loai phải được thử nghiệm, sử dụng

6 mẫu cho mỗi kiểu/loại Trong số 6 mẫu, nên có 2 mức nhiễm thấp, 2 nhiễm mức trung

bình và 2 mức nhiễm cao Các mức này phải bao gồm toàn bộ dai nhiễm của kiéu/loai

được chọn Đối với mỗi mẫu, thực hiện 5 lần lặp lại cho 5 phần mẫu thử khác nhau từ

cùng một mẫu.

c Tinh và diễn giải về nghiên cứu độ chính xác

Lập bảng các kết quả như trong Bảng 3.6 dựa vào số đếm được chuyền đổi log.Bang 3.6 Kết quả của nghiên cứu độ chính xác (tính bằng logioCFU/g)

Phương pháp chuẩn Phương pháp thay thếHạng mục

Ký hiệu sau được sử dụng:

i đề cập đến mau và q là số lượng mẫu (1 <i <q);

7 đề cập đến các phần mẫu thử và ø là số lượng phần mẫu thử (1 <7 <7)

Các phép tính được thực hiện cho mỗi nhom/kiéu/loai theo trình tự các thao tác sau:

xy, kết quả thử nghiệm đã chuyền đổi logo của mẫu i đối với lần lặp lại 7 với 1 <i

<q val <7 <z sử dụng phương pháp chuẩn;

yy, kết quả thử nghiệm đã chuyền đổi logio của mẫu i đối với lần lặp lại j với 1 <i

<q và 1 <j <z sử dụng phương pháp thay thé.

Đối với từng mẫu, các phép đo được thực hiện trong các điều kiện lặp lại cho cảhai phương pháp, các giá trị yi được coi là phân bố chuẩn.

Giới hạn chấp nhận được đặt ở là AL = + 0,5 logio đơn vị Điều này được thé hiện

như sự khác biệt giữa phương pháp chuẩn và phương pháp thay thê

Bước 1: Đối với mỗi mẫu i, tính giá trị trung bình X; theo trung bình của các số chuyểnđối về logio thu được bằng phương pháp chuẩn, xy Các giá trị này là các giá trị củaphương pháp chuẩn của các mẫu thẩm định:

X; = median (xj)

Bước 2: Đối với từng mau /, tinh giá trị trung bình Y; theo trung bình của các số chuyénđổi về logio thu được bằng phương pháp thay thé, y Các giá trị này là các giá trị thaythé của các mẫu thâm định:

Y; = median (yi)

Bước 3: Đối với mỗi mau i, tính độ lệch chuẩn phương pháp thay thé sai như sau:

1

-Salti — [uu — yi)?

Bước 4: Tính độ lệch chuẩn kết hợp phương pháp thay thé sa như sau:

al

Bước 5: Tinh độ lệch chuan kết hợp của phương pháp chuẩn set (tương tự Bước 3 vaBước 4), như sau:

1 = x _ 1 q 2

Srefji — [tae — Xj)? va Step = ae Sref,i

Bước 6: Đối với mỗi mẫu i, tính độ chệch tuyệt đối theo chênh lệch của các trung bìnhtính được từ hai phương pháp B; = Y; - X: Đây là ước tinh độ thiếu chính xác của phươngpháp thay thế so với phương pháp chuẩn

Bước 7: Đối với mỗi mẫu i, tính các giới han dung sai dự kiến B-ETI Đây là khoảng

mà tỷ lệ dự kiến của các kết qua trong tương lai sẽ dao động là ÿ Đối với mỗi mẫu,

B-ETI được biéu thị như sau: fe + T Saye J1 + |

Trong đó T là phan trăm của phân bố Student-/ đối với B xác suất đã chon và g X (n - 1)

bậc tự do, đó là: Tem, Theo ISO 16140-2:2016, trong nghiên cứu nay được

=" )ia(n-1)°

đặt là 80% T là hệ số phủ của B-ETI của mẫu thâm định Điều này xác định giới hantrên Uj; và giới hạn dưới Li:

U; = Bị + T-San Fes và L; = B,— T.Sar fa ++

Bước 8: Đối với mỗi nhóm, lập bảng các giá trị chênh lệch tính được cho các mẫu nhưtrong Bảng 3.7.

Bảng 3.7 Các kết quả thống kê của nghiên cứu so sánh

Giá trị Giá trị

Nhóm Mẫu trungtâm trungtâm Độ chệch

(chuân) (thay thê)

B-ETI B-ETI AL AL trên dưới trên dưới

Mau 1 Xi Yi Bi Ui Li +AL -AL

Mau 2Mẫu 3

Nhom 1] _

Mau 4

Mau 5Mau 6

Nguồn: TCVN 12365-2: 2018.

Dựng đồ thị của các kết quả tính được như sau:

- trục hoành là các giá trị chuẩn Xi, tính theo các đơn vị logio

- trục tung là độ chéch, các giới hạn chấp nhận và giới hạn khoảng dung sai U; - X;

và L; - X; tat cả tính bang đơn vị logio theo chênh lệch giá trị chuẩn tương ứng của mẫu

Vẽ biểu đồ như vi dụ nêu trong Hình 3.5 Các giới hạn khoảng dung sai trên vàdưới được nối thành đường để nội suy các giới hạn giữa các mức khác nhau của các mẫuthâm định Đường ngang thé hiện các giá trị chuẩn thu được với phương pháp chuẩn.Chênh lệch giữa các giá trị chuẩn và các mức nhiễm trung bình được thé hiện bằng cácdau cham màu đen Bat cứ khi nào không có độ chéch, các giá trị thu hồi này nằm trênđường tham chiếu nằm ngang Ngoài ra, các giới hạn chấp nhận được thể hiện bằng haiđường ngang đứt và giới hạn B-ETI là các đường vạch liền

Nếu đối với tat cả mẫu ¿ trong độ chính xác U; < + AL và 1; >- AL thì phươngpháp thay thế được chấp nhận là tương đương với phương pháp chuẩn đối với các nhóm

CHUONG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN

4.1 Nội dung 1: Khao sát mức độ nhiễm Bacillus cereus của các nhóm mẫu thực

phẩm

Khao sát được thực hiện nhằm mục đích khảo sát mức độ nhiễm Bacillus cereuscủa 164 mẫu thực phẩm được khách hàng gửi tại CASE ở 5 nhóm mẫu thường nhiễm

vi sinh vật đích trên môi trường MYP theo TCVN 4992:2005 (ISO 7932:2004).

Hình 4.1 cho thay tổng quát số lượng mẫu nhiễm và không nhiễm Bacillus cereus

của các nhóm mâu thực phâm.

8 Số mẫu nhiễm #8 Số mẫu không nhiễm

Tôngsô Sômâu Tỉ lệnhiêm

oo mẫuthử nhiễm (%)

1 Ngũ cốc và sản phẩm từ ngũ cốc 50 37 74,00

2 Bột va tinh bột 36 a7 75,00

3 Rau củ và san phẩm từ rau củ 31 17 54,84

4 Sữa và san pham tur stra 21 16 76,19