Sắc ký nhóm 5 ca sáng thứ 3

LY TRÍCH CHẤT CHIẾT THÔ TRONG NGUYÊN LIỆU BẰNG CÁC DUNG MÔI KHÁC NHAU .... Ly trích chất chiết thô từ nguyên liệu lá ngũ sắc sử dụng 2 loại dung môi khác nhau dưới sự hỗ trợ của sóng siê

TP Thủ Đức, 11/2024

KỸ THUẬT SẮC KÝ NÂNG CAO

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

NGUYỄN DƯƠNG PHƯƠNG YẾN 21126593

LÃ CHÍ ĐAN 21126296

HUỲNH THỊ KIM TUYẾN 21126567

TP Thủ Đức, 11/2024

i

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC i

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii

DANH SÁCH CÁC HÌNH iv

DANH SÁCH CÁC BẢNG v

BÀI 1 LY TRÍCH CHẤT CHIẾT THÔ TRONG NGUYÊN LIỆU BẰNG CÁC DUNG MÔI KHÁC NHAU 1

1.1 Tổng quan tài liệu 1

1.1.1 Lá ngũ sắc 1

1.1.2 Phương pháp ly trích bằng sóng siêu âm 3

1.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 3

1.2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 3

1.2.2 Vật liệu nghiên cứu 4

1.2.3 Phương pháp nghiên cứu 4

1.2.3.1 Xác định độ ẩm nguyên liệu thông qua phương pháp sấy 4

1.2.3.2 Ly trích chất chiết thô từ nguyên liệu lá ngũ sắc sử dụng 2 loại dung môi khác nhau dưới sự hỗ trợ của sóng siêu âm 5

1.3 Kết quả và thảo luận 5

1.3.1 Kết quả 5

1.3.2 Thảo luận 7

ii

BÀI 2 PHÂN TÁCH SẮC TỐ THỰC VẬT BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ CỘT 9

2.1 Tổng quan tài liệu 9

2.1.1 Giới thiệu kỹ thuật sắc ký cột 9

2.1.2 Giới thiệu về cây sài đất 9

2.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 10

2.2.1 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 10

2.2.2 Phương pháp tiến hành 10

2.3 Kết quả và thảo luận 12

2.3.1 Kết quả 12

2.3.2 Thảo luận 12

BÀI 3 PHÂN TÁCH SẮC TỐ THỰC VẬT BẰNG KỸ THUẬT TLC 13

3.1 Tổng quan tài liệu 13

3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 13

3.2.1 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị thí nghiệm 13

3.2.2 Phương pháp nghiên cứu 14

3.3 Kết quả và thảo luận 14

3.3.1 Kết quả 14

3.3.2 Thảo luận 17

BÀI TẬP SẮC KÝ ĐỒ 18

BẢNG PHÂN CÔNG CÔNG VIỆC 22

TÀI LIỆU THAM KHẢO 23

iii

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

TLC : Thin Layer Chromatography

UAE : Ultrasound assisted extraction

BHA : Beta Hydroxy Acids

TLC : Thin Layer Chromatography

iv

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Lá cây ngũ sắc 1

Hình 1.2 Mẫu lá cây ngũ sắc 4

Hình 1.3 Mẫu lá ngũ sắc được cân 4

Hình 2.1 Cây sài đất 9

Hình 2.2 Cân bột cây sài 11

Hình 2.3 Dịch chiết 11

Hình 2.4 Cân silica 11

Hình 2.5 Đưa mẫu vào 11

Hình 2.6 Kết quả phân tách sắc tố thực vật 12

Hình 3.1 Đưa dịch chiết cây sài đất lên bản mỏng 15

Hình 3.2 Kết quả sắc kỹ bản mỏng 15

Hình 3.3 Sắc ký bản mỏng sử dụng pha động Acetone:hexan (3:7) 16

Hình 3.4 Sắc ký bản mỏng sử dụng pha động Acetone:hexan (4:6) 16

Hình 1 Biều đồ đường chuẩn Protocatechuic acid 18

Hình 2 Biều đồ đường chuẩn Chlorogenic acid 19

Hình 3 Biều đồ đường chuẩn Caffeic acid 21

v

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Số liệu ghi nhận cho thí nghiệm so sánh hiệu suất chiết thô của 2 loại dung

môi 7

Bảng 3.1 Hệ số Rf của các sắc tố trong mẫu 17

Bảng 1 Thời gian phát hiện và diện tích pic của chất chuẩn ở bốn nồng độ 18

Bảng 2 Thời gian phát hiện và diện tích pic của chất chuẩn ở bốn nồng độ 19

Bảng 3 Thời gian phát hiện và diện tích pic của chất chuẩn ở bốn nồng độ 20

1

BÀI 1 LY TRÍCH CHẤT CHIẾT THÔ TRONG NGUYÊN LIỆU

BẰNG CÁC DUNG MÔI KHÁC NHAU

1.1 Tổng quan tài liệu

đơn giản và có mùi nồng khi vò nát L camara có hoa lưỡng tính, nhiều màu sắc Đây là

loài rất dễ thích nghi, có thể sống trong nhiều hệ sinh thái khác nhau

o Đặc điểm phân bố

Cây có nguồn gốc từ các nước Trung Mỹ, sau phổ biến khắp vùng nhiệt đới và cận nhiệt

đới trên thế giới L camara cũng đã lan rộng khắp các khu vực của Châu Phi, Nam Âu,

chẳng hạn như Tây Ban Nha và Bồ Đào Nha, và cả Trung Đông, Ấn Độ, Châu Á nhiệt đới,

Úc, New Zealand và Hoa Kỳ, cũng như nhiều đảo Đại Tây Dương, Thái Bình Dương và

Ấn Độ Dương Tại Việt Nam cây được trồng làm cảnh hoặc mọc dại rải rác ven rừng, các bãi hoang, ven đường, đồi trung du hoặc ven bờ biển

o Công dụng cây ngũ sắc

2

Hoa ngũ sắc thường được sử dụng để trị sốt lâu không dứt, quai bị, phong thấp đau xương Ngoài ra, hoa cũng được sử dụng để trị lao và hạ huyết áp Lá được sử dụng để đắp trực tiếp lên vết thương, vết loét hoặc để cầm máu Nó cũng được sử dụng để trị ghẻ lở, viêm da, các vết chàm và để chườm nóng trị thấp khớp Lá thường được sử dụng tươi hoặc sấy khô Các nghiên cứu được tiến hành ở Ấn Độ đã phát hiện ra rằng lá Lantana có thể có

đặc tính kháng khuẩn , diệt nấm và diệt côn trùng L camara cũng đã được sử dụng trong

các loại thuốc thảo dược truyền thống để điều trị nhiều loại bệnh, bao gồm ung thư , ngứa

da, bệnh phong , thủy đậu , sởi , hen suyễn và loét

o Các hợp chất có giá trị trong cây hoa ngũ sắc :

Chiết xuất từ lá (LE) và hoa (FE) từ L camara đã được thử nghiệm về hàm lượng

polyphenol (phenol,flavonoid, alkaloid) và tiềm năng chống oxy hóa [tổng hoạt động chống oxy hóa, hoạt động tạo phức sắt và hoạt động của enzym (peroxidase và polyphenol oxidase)] Phân tích hóa thực vật định tính cho thấy sự tồn tại của tannin, steroid, flavonoid, Phlobatannin, quinon, phenol, caumarin, alkaloid trong cả FE và LE Terpenoid, saponin

và anthocyanin chỉ được tìm thấy trong FE Glycoside, glycoside tim, anthraquinone chỉ được tìm thấy trong LE Alkaloid, flavonoid, tannin và coumarin có nhiều trong LE trong khi phenol có nhiều trong cả FE và LE Trong đó, Alkaloid là hợp chất nitơ thứ cấp có tiềm năng chống oxy hóa đã biết, terpenoid đã được sử dụng như một tác nhân bảo vệ chống lại các bệnh do stress oxy hóa gây ra Saponin được sử dụng như một chất chống oxy hóa tự nhiên và cũng kích thích quá trình apoptosis trong các tế bào khối u Quinone có nguồn gốc từ thực vật cho thấy hoạt động chống oxy hóa tốt hơn so với các chất chống oxy hóa tổng hợp như BHA và mang lại hoạt động dọn siêu oxit Anthraquinone, Coumarin và Anthocyanin được trang bị nhiều hoạt tính sinh học như kháng khuẩn, chống oxy hóa, chống viêm và chống ung thư Steroid là chất cho điện tử, tác động lên các gốc tự do và biến chúng thành hợp chất ổn định hơn, Nghiên cứu phân tử tiếp tục cho thấy rằng các hóa

chất thực vật (Loliolide, axit eicosapentaenoic, este axit salicylic và Phytol ) của Lantana

camara có thể nhắm mục tiêu vào các enzyme của các tác nhân gây bệnh thực vật, có thể

ức chế sự phát triển của chúng

3

1.1.2 Phương pháp ly trích bằng sóng siêu âm

Chiết xuất với sự hỗ trợ siêu âm (UAE) sử dụng năng lượng siêu âm là sóng cơ học

có tần số cao hơn dải tần tai người nghe được (20 Hz đến 20 kHz) Những sóng này bao gồm một loạt các chu kỳ nén và phản xạ lan truyền qua môi trường rắn, lỏng hoặc khí gây

ra sự dịch chuyển và đánh bật các phân tử khỏi vị trí ban đầu của chúng Ở sóng âm cường

độ cao, áp suất âm trong quá trình phản xạ vượt quá lực hấp dẫn liên kết các phân tử lại với nhau, kéo chúng ra xa nhau và tạo ra bọt khí Những bong bóng này phát triển thông qua quá trình hợp nhất và sau đó tan vỡ trong giai đoạn nén tạo ra nhiệt độ và áp suất cao cục

bộ Điều này giúp đẩy nhanh các phản ứng sinh hóa trong vùng lân cận xung quanh

Tạo bọt âm thanh (acoustic cavitation) là cơ chế chính liên quan đến quá trình chiết xuất có sự hỗ trợ của siêu âm Bọt bong bóng và sóng âm thanh có thể gây ra một hoặc sự kết hợp của các hiện tượng như phân mảnh, xói mòn cục bộ, hình thành lỗ rỗng, lực cắt, tăng khả năng hấp thụ và chỉ số trương nở trong hệ tế bào thực vật Các bong bóng tạo lỗ rỗng tạo ra sóng xung kích và sự va chạm giữa các hạt được tăng tốc gây ra sự phân mảnh trong cấu trúc tế bào Sự phân mảnh nhanh chóng dẫn đến sự hòa tan của thành phần hoạt tính sinh học trong dung môi do giảm kích thước hạt, tăng diện tích bề mặt và tốc độ truyền khối cao trong lớp biểu mô tế bào Siêu âm làm tăng khả năng hấp thụ nước của bã nhờ đó tăng cường khả năng tiếp cận của nước dưới dạng dung môi đối với các hợp chất hoạt tính sinh học được chiết xuất cùng với khả năng khuếch tán tăng lên của chính các hợp chất hoạt tính sinh học Siêu âm cũng làm tăng chỉ số trương nở của ma trận mô thực vật giúp giải hấp và khuếch tán các chất hòa tan dẫn đến tăng chiết xuất Sự gia tăng sản lượng khai thác của UAE không thể do một cơ chế duy nhất mà do tác động tổng hợp của tất cả các cơ chế

1.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

1.2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian: 8 giờ ngày 5/11/2024

Địa điểm: Phòng BIO 304, tòa A2, Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

4

1.2.2 Vật liệu nghiên cứu

Vật liệu nghiên cứu: bột lá ngũ sắc đã được xay nhuyễn

Dụng cụ, thiết bị và hóa chất:

Dụng cụ: hủ thủy tinh đựng mẫu, bình thủy tinh hút ẩm, cốc đong, giấy lọc, đĩa thủy tinh, muỗng, phễu lọc, pipet thủy tinh,…

Thiết bị: tủ sấy, cân điện tử, bồn sóng siêu âm

Hóa chất: dung môi acetone và ethyl acetate

Hình 1.2 Mẫu lá cây ngũ sắc 1.2.3 Phương pháp nghiên cứu

1.2.3.1 Xác định độ ẩm nguyên liệu thông qua phương pháp sấy

Bước 1: Cân 2g mẫu Lá Ngũ Sắc cho vào chén thủy tinh đã sấy khô ở nhiệt độ 105˚C và làm nguội trong bình hút ẩm chứa silicagel Cân khối lượng chén trước khi cho mẫu

Hình 1.3 Mẫu lá ngũ sắc được cân

5

Bước 2: Đem sấy chén và mẫu ở 105˚C đến khối lượng không đổi

Bước 3: Để nguội trong bình hút ẩm chứa silicagel và cân tổng khối lượng chén và mẫu Ghi nhận số liệu; tính toán và xác định độ ẩm của nguyên liệu

1.2.3.2 Ly trích chất chiết thô từ nguyên liệu lá ngũ sắc sử dụng 2 loại dung môi khác nhau dưới sự hỗ trợ của sóng siêu âm

Bước 1: Chuẩn bị 1 bình erlen, tiến hành cân 1g mẫu lá ngũ sắc vào mỗi bình

Bước 2: Đong tiếp 15 mL dung dịch ethyl acetate cho vào bình thứ nhất, đong tiếp 15 mL dung dịch acetone cho vào bình thứ 2

Bước 3: Bịt kín miệng bình (hạn chế sự bay hơi của dung môi) và đưa bình vào bồn sóng siêu âm trong 15 phút

Bước 4: Gấp giấy lọc và tiến hành cân, ghi nhận khối lượng thu được

Bước 5: Lọc dịch chiết lần thứ nhất, tiếp tục lặp lại bước 2 và 3 cho 15 mL dung môi ethyl acetate vào bình thứ 1 và 15 mL acetone vào bình thứ 2, tiến hành xử lý siêu âm trong 15 phút

Bước 6: Lọc lần 2 đối với phần bã còn lại (phần bã cần được lọc tối đa có thể tránh sự thất thoát lớn trong quá trình ly trích)

Bước 7: Sấy phần bã đến khi khối lượng không đổi, ghi nhận hình ảnh, số liệu thu được và tiến hành đánh giá hiệu suất chiết của 2 dung môi thông qua kết quả tính toán thu được dựa trên khối lượng bã sau khi sấy

1.3 Kết quả và thảo luận

W1 : khối lượng của mẫu thử và chén trước khi sấy (g)

W2 : khối lượng của mẫu thử và chén sau khi sấy (g)

Khối lượng mẫu cân lần 2: mbanđầu2 = 2,0047 g

Kết quả ghi nhận được sau khi sấy:

Khối lượng chén và mẫu 1 sau sấy: W2.1=21,9293g

Khối lượng chén và mẫu 2 sau sấy: W2.2= 33,0089g

Độ ẩm trung bình của mẫu lá ngũ sắc nhóm thực hiện là 9,63%

o Thí nghiệm ly trích chất chiết thô từ nguyên liệu lá ngũ sắc sử dụng 2 loại dung môi

Công thức tính hàm lượng chất chiết thô :

Trong đó : m1 : khối lượng nguyện liệu khô ban đầu

.m2 : khối lượng bã khô còn lại trên giấy lọc

7

Bảng 1.1 Số liệu ghi nhận cho thí nghiệm so sánh hiệu suất chiết thô của 2 loại dung môi

Vì khối lượng ban đầu của mẫu còn chứa độ ẩm nên cần tính lại khối lượng lúc sau:

m1.1 khô= (100 - W ) x m1.1 =90,37% x 1,0008 = 0,9044 g

m1.2 khô= (100 - W ) x m1.2 = 90,37% x 1,0004 = 0,9041 g

Hàm lượng chất chiết thô (%, hiệu suất chiết cao)

H1 ethyl acetate = 100* (m1.1 khô- m2.1)/m1.1 =100 x (0,9044 - 0,8524)/ 0,9044 = 5,75 %

H2 acetone = 100* (m1.2 khô- m2.2)/m1.2 = 100 x (0,9041 - 0,8274)/ 0,9041 = 8,48 %

1.3.2 Thảo luận

o Thí nghiệm xác định độ ẩm nguyên liệu thông qua phương pháp sấy

Độ ẩm ở mức vừa phải, phù hợp với các yêu cầu bảo quản lâu dài trong nhiều trường hợp, đặc biệt là các sản phẩm khô Mức độ ẩm dưới 10% có thể giúp hạn chế sự phát triển của nấm mốc và vi sinh vật, giúp mẫu ổn định và dễ bảo quản

8

o Thí nghiệm ly trích chất chiết thô từ nguyên liệu lá ngũ sắc sử dụng 2 loại dung môi

So sánh : hiệu quả chiết của 2 dung môi Ethyl acetate và Acetone dựa vào độ phân cực của

dung môi Sau khi tính toán hiệu suất chiết cao cho thấy mẫu bột lá ngũ sắc sử dụng dung môi Acetone có hiệu suất là 8,48% cao hơn hiệu suất chiết cao của mẫu bột lá ngũ sắc sử dung dung môi Ethyl acetate là 5,75 %

Giải thích kết quả :

Ethyl acetate là dung môi ít phân cực độ phân cực trung bình có chỉ số phân cưc (PI

= 0,228), Acetone có độ phân cực cao hơn có chỉ số phân cực (PI = 0,355) Sau khi tính hiệu suất chiết cao của 2 dung môi ethyl acetate và acetone trong mẫu bột lá ngũ sắc thấy dung môi acetone có hiệu suất chiết cao hơn cho thấy các hợp chất trong lá ngũ sắc có thể bao gồm cà chất phân cực như các hợp chất polyphenol, flavonoid, dễ hòa tan hơn trong dung môi phân cực cao và acetone có khả năng chiết xuất các hợp có độ phân cực cao tốt hơn ethyl acetate, dẫn đến hiệu suất chiết cao hơn

9

BÀI 2 PHÂN TÁCH SẮC TỐ THỰC VẬT BẰNG KỸ THUẬT SẮC

KÝ CỘT

2.1 Tổng quan tài liệu

2.1.1 Giới thiệu kỹ thuật sắc ký cột

Sắc ký cột là quá trình phân tách diễn ra trong một cột hở dựa vào sự hấp phụ khác biệt của các hợp chất với pha tĩnh

Pha tĩnh: vật liệu rắn có khả năng hấp phụ tốt, thường được sử dụng là silica gel (SiO2), alumina (Al2O3)

Pha động: dung môi hoặc hỗn hợp dung môi

2.1.2 Giới thiệu về cây sài đất

Chi : Sphagneticola O.Hoffm

Loài : Wedelia chinensis

Cây sài đất (Wedelia chinensis) còn có tên gọi khác là húng trám, cúc dại, ngổ núi

hay cúc trám, thuộc họ Cúc, là loại cây mọc hoang, thân thảo, mọc bò, thân có thể dài đến 40cm Thân cây sài đất bao phủ lớp lông trắng Lá sài đất có lông mịn ở cả hai mặt, có răng cưa ở mép, mọc đối xứng, hình bầu dục Lá có nhiều gân, gân chính mọc nổi rõ ngay chính giữa Hoa sài đất gồm nhiều cánh màu vàng, mọc từ đầu ngọn và nách lá Kích thước của quả sài đất rất nhỏ, lớp vỏ bên ngoài không có lông Cây sài đất mọc nhiều ở Ấn Độ, Malaysia Ở nước ta, cây thường mọc hoang dại ở ven đường, bãi đất trống và các khu vực

bỏ hoang, Cây sài đất có nhiều hợp chất sinh học tốt cho sức khỏe như: phenolic (acid

Hình 2.1 Cây sài đất

10

caffeic, acid chlorogenic, tanin), flavonoid (wedelolactone, apigenin, luteolin, quercetin, kaempferol), alkaloid, terpenoid, steroid, coumarin và tinh dầu (methyl cinnamate) Các sắc tố thực vật trong hợp chất sinh học: Phenolic gồm Acid caffeic (vàng nhạt đến nâu nhạt), Acid chlorogenic (Màu vàng nhạt hoặc xanh lục nhạt), Tanin (màu nâu hoặc vàng nâu) Flavonoid gồm Wedelolactone (màu vàng nhạt đến màu nâu nhạt), Apigenin (màu vàng), Luteolin (màu vàng sáng, có thể thay đổi từ vàng sang cam hoặc đỏ nhạt), Quercetin (màu vàng đến vàng cam), Kaempferol (màu vàng nhạt) Alkaloid (màu vàng nhạt) Terpenoid (màu vàng đến vàng nâu) Steroid (không màu hoặc vàng nhạt) Coumarin (màu trắng đến vàng nhạt) Tinh dầu (Methyl cinnamate) vàng nhạt hoặc không màu Công dụng của cây sài đất:

- Trị bệnh ngoài da: hoạt chất phenolic trong cây sài đất có khả năng trị viêm nên có thể trị bệnh ngứa ngoài da, rôm sảy, viêm da cơ địa, eczema, mụn trứng cá,

- Bảo vệ gan: hoạt chất demethylwedelolactone, wedelolactone có tác dụng bảo vệ chức năng gan

- Chống viêm, kháng khuẩn, giảm đau: nhờ thành phần hoạt chất Aspirin, Morphine, Indomethacin,…

Ngoài ra, hoạt chất isoflavone trong sài đất có thể hỗ trợ điề trị tình trạng thiếu hụt estrogen, xuất huyết tử cung, bảo vệ niêm mạc dạ dày, ngăn ngừa oxy hóa,

2.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị

Nguyên liệu: Bột cây sài đất xay nhuyễn

Hóa chất: Hexane, aceton, silica gel 60,…

Dụng cụ: becher, ống nghiệm, pipet Pasteur, bông thủy tinh, ống đong,…

Thiết bị: Máy siêu âm

2.2.2 Phương pháp tiến hành

Bước 1: Chuẩn bị dịch chiết sắc tố