nhóm 5 thứ 3 ca sáng

Để gây bệnh, Salmonella cần phải xâm nhiễm thành công vào bên trong thành ruột, thích nghi và vơ hiệu hố hệ thống phịng vệ của vật chủ, sau đó nhân lên và phát tán đến các mô đích.. Giới

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

Môn học : Thực hành Vi sinh trong y học Giảng viên : PGS.TS Nguyễn Bảo Quốc

Nhóm thực hiện : Nhóm 5

TP Thủ Đức, 05/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

Trần Phạm Thảo Nguyên 21126131 DH21SHB

TP Thủ Đức, 05/2024

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH SÁCH CÁC HÌNH iii

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu 1

1.3 Nội dung thực hiện 1

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.1 Tổng quan về kỹ thuật PCR 2

2.1.1 Giới thiệu 2

2.1.2 Nguyên lý 2

2.1.3 Thành phần tham gia vào phản ứng PCR 3

2.1.4 Ứng dụng 3

2.2 Tổng quan về kỹ thuật điện di 4

2.2.1 Định nghĩa 4

2.2.2 Điện di trên gel agarose 4

2.2.3 Thành phần của kỹ thuật điện di trên gel agarose 5

2.3 Tổng quan về Salmonella 6

2.3.1 Giới thiệu chung về Salmonella 6

2.3.2 Đặc điểm hình thái 6

2.3.3 Đặc điểm gây bệnh của Salmonella 6

2.3.3.1 Cơ chế gây bệnh 6

2.3.3.2 Nguồn lây nhiễm 7

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 8

3.1 Thời gian và địa điểm thực hành 8

3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 8

3.2.1 Vật liệu nghiên cứu 8

3.2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 8

3.2.1.2 Thiết bị và dụng cụ 9

3.2.2 Phương pháp nghiên cứu 9

3.2.2.1 Điện di DNA tổng số 9

3.2.2.2 Chạy PCR 16S RNA 9

3.2.2.2 Chạy PCR với mồi Salmonella sp 11

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 13

4.1 Điện di DNA tổng số 13

4.1.1 Kết quả 13

4.1.2 Thảo luận 13

4.2 Chạy PCR 16S RNA 14

4.2.1 Kết quả 14

4.2.2 Thảo luận 14

4.3 Chạy PCR với mồi Salmonella sp 15

4.3.1 Kết quả 15

4.3.2 Thảo luận 15

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 4.1 Kết quả điện di DNA tổng số 13 Hình 4.2 Kết quả điện di DNA vi khuẩn 14

Hình 4.3 Kết quả điện di DNA Salmonella sp 15

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Salmonella lần đầu tiên được phân lập ở Mỹ vào năm 1885bởi Salmon và tên gọi của nó được bắt nguồn từ đó.Salmonella là vi khuẩn đường ruột enterobacteriaceae có

hơn 2400 kiểu huyết thanh Đây là trực khuẩn Gram âm, thường bắt màu ở hai đầu, kích

thước khoảng 0,6 - 2,0 µm, di động nhờ nhiều lông xung quanh thân (trừ S.gallinarum

và S.pullorum) Cơ chế gây bệnh của Salmonella qua đường tiêu hóa, trực khuẩn xâm

nhập vào cơ thể qua đường miệng Sau khi xuyên qua hàng rào acid dạ dày, vi khuẩn di động về phía ruột non và sinh sản ở đó, tiếp tục chui qua màng nhày và vào thành ruột Các tế bào Paneth của niêm mạc ruột tiết ra một loại peptide có tính chống lại sự xâm

nhập của tác nhân gây bệnh Sự xâm nhiễm Salmonella vào cơ thể vật chủ và gây bệnh

với biểu hiện phổ biến nhất là gây tiêu chảy, đôi khi gây bệnh là thương hàn và phó

thương hàn Để gây bệnh, Salmonella cần phải xâm nhiễm thành công vào bên trong

thành ruột, thích nghi và vô hiệu hoá hệ thống phòng vệ của vật chủ, sau đó nhân lên và

phát tán đến các mô đích

Hiện nay, có nhiều phương pháp chẩn đoán Salmonella như phương pháp nuôi

cấy phân lập, miễn dịch học, sinh học phân tử như PCR đơn mồi, PCR đa mồi, real time PCR… Với độ nhạy và độ đặc hiệu cao phương pháp sinh học phân tử rất có giá trị trong chẩn đoán chính xác mầm bệnh trong các mẫu bệnh phẩm Vì vậy, việc áp dụng phương pháp PCR vùng 16S ribosome sẽ giúp nhanh chóng xác định được mầm bệnh với độ chính xác cao

1.2 Mục tiêu

Kiểm tra sự hiện diện của DNA vi khuẩn Salmonella sp trong mẫu đã ly trích DNA

bằng kỹ thuật PCR

1.3 Nội dung thực hiện

Nội dung 1: Kiểm tra chất lượng mẫu DNA

Nội dung 2: PCR 16S RNA xác định vi khuẩn

Nội dung 3: PCR với mồi Salmonella sp.

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về kỹ thuật PCR

2.1.1 Giới thiệu

PCR (Polymerase Chain Reaction) - Phản ứng chuỗi trùng hợp là kỹ thuật sinh học phân tử cho phép khuếch đại nhanh chóng một đoạn DNA mong muốn trong hệ gen của cơ thể sinh vật thành nhiều bản sao Kỹ thuật PCR được Kary Mullis phát minh năm

1985, đến năm 1993 ông đã đoạt giải thưởng Nobel về Hóa học cho thành tự này.Kỹ thuật này đã mở ra một kỷ nguyên mới trong nghiên cứu sinh học trên toàn thế giới

2.1.2 Nguyên lý

Kỹ thuật PCR là một phương pháp tổng hợp DNA ngoài cơ thể dựa trên mạch khuôn là một trình tự DNA đích ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase, một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA đích và các nucleotid tự do

Mỗi phản ứng PCR gồm từ 30 – 40 chu kỳ lặp lại liên tiếp, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn: biến tính, gắn mồi, kéo dài

Giai đoạn biến tính: Là quá trình sử dụng nhiệt độ cao để tách DNA sợi đôi thành DNA sợi đơn Ở nhiệt độ 94℃, DNA bị biến tính do liên kết hydrobị đứt gãy và kết quả chuỗi DNA sợi đôi bị biến tính thành chuỗi DNA sợi đơn Thời gian thực hiện biến tính thường từ 2 - 5 phút

Giai đoạn gắn mồi: Là giai đoạn thứ 2 của phản úng PCR thường được thực hiện

ở nhiệt độ từ 40℃ đến 65℃ Sau khi DNA sợi đôi biến tính thành DNA sợi đơn, sự giảm nhiệt độ cho phép các đoạn mồi có thể gắn vào chuỗi DNA cầnkhuếch đại theo nguyên tắc bổ sung Nhiệt độ gắn mồi càng cao thì quá trình gắn mồi càng đặc hiệu Thời gian gắn mồi thường kéo dài từ 30 - 60 giây

Giai đoạn kéo dài: Enzym DNA polymerase gắn vào đầu 3’ của đoạn mồi đặc hiệu và tổng hợp theo nguyên tắc bổ sung với DNA khuôn theo chiều 5’-3’ để tạo nên mạch đơn mới Giai đoạn này thường được thực hiện ở 70℃ đến 72℃, thời gian kéo dài sẽ phụ thuộc vào độ dài của đoạn DNA đích cần khuếch đại

Một phản ứng PCR bao gồm nhiều chu kỳ lặp lại liên tục, sản phẩm tạo ra ở chu

kỳ trước sẽ là khuôn để tổng hợp mạch DNA mới ở chu kỳ sau Như vậy, khi phản ứng PCR kết thúc từ 1 bản sao DNA ban đầu chúng ta sẽ thu được số lượng bản sao DNA quan tâm tăng theo cấp số nhân

2.1.3 Thành phần tham gia vào phản ứng PCR

DNA khuôn: DNA khuôn tinh sạch là một yếu tố quan trọng để đảm chất lượng sản phẩm PCR được chính xác Mẫu DNA dùng cho phản ứng PCR có thể được thu thập

từ nhiều nguồn khác nhau như: máu ngoại vi, tủy xương, mẫu niêm mạc và thậm chí là DNA thu được từ các mẫu đã bị phân hủy như vết máu, vết tinh dịch đã lâu ngày, tóc và xương của người chết,

Mồi (primer): Mồi có vai trò là yếu tố quyết định tính đặc hiệu của phản ứng PCR

và là yếu tố khỏi động hoạt động của enzym Taq DNA polymerase do enzym chỉ có thể bắt đầu tổng hợp mạch bổ sung với mạch khuôn khi nó nhận dạng được đầu 3’ tự do đang ở dạng sợi đôi

Các nucleotid tự do (dNTP): Nucleotid tự do cần cho phản ứng PCR gồm 4 loại: dATP, dTTP, dGTP, dCTP, đóng vai trò là cơ chất của enzym DNA polymerase, được enzym DNA polymerase vận chuyển và nối với sợi tổng hợp tại đầu 3’OH tự do

Taq DNA polymerase: Là yếu tố quan trọng quyết định hiệu quả của phản ứng PCR, có vai trò xúc tác cho quá trình lắp ráp các nucleotid A, T, G, C vào mạch DNA mới tổng hợp Mỗi loại enzyme DNA polymerase có đặc tính và vai trò khác nhau trong phản ứng PCR

Dung dịch đệm (Buffer): Là một thành phần quan trọng của phản ứng PCR Dung dịch đệm dùng trong phản ứng PCR phụ thuộc vào loại DNA polymerase, thường chứa các chất cần thiết cho hoạt động của enzym DNA polymerase như Mg2+, K+, Tris… Trong đó, Mg2+ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng nhiều đến phản ứng PCR Mg2+ đóng vai trò là cofactor cho enzym DNA polymerase Nồng độ Mg2+ tối ưu cho phản ứng PCR dao động từ 0,5 – 3,5 mM, nếu nồng độ Mg2+ trong phản ứng PCR quá cao sẽ tạo nhiều sản phẩm phụ và ngược lại Mg2+ quá thấp sẽ không tạo được sản phẩm PCR

2.1.4 Ứng dụng

PCR được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau, cả trong khoa học công nghệ và đời sống Một số ứng dụng của PCR có thể được kể đến như:

- Tách dòng gen, xây dựng ngân hàng gen, lập bản đồ gen và giải trình tự gen

- Chẩn đoán sớm các bệnh lý di truyền

- Ứng dụng trong chuyển gen nhằm tạo ra các giống mới

- Nghiên cứu nguồn gốc của các loài sinh vật

- Xác định huyết thống và truy vết tội phạm

2.2 Tổng quan về kỹ thuật điện di

2.2.1 Định nghĩa

Điện di (Electrophoresis) nghĩa là sự di động trong điện trường Trong kỹ thuật điện di phân tử tích điện di chuyển về phía điện cực tích điện trái dấu với nó, nhưng điện trường sẽ được loại bỏ trước khi nó chạm tới điện cực Sự di chuyển khác nhau của các loại vật chất tích điện trong một điện trường là dựa trên điện tích và qua đó giúp phân tách chúng Sự di chuyển của hạt tích điện được làm chậm bằng việc bổ sung thêm gel polymer bởi vậy giúp có đủ thời gian để phân tách mẫu Gel polymer mang tính chất trơ, không tích điện đồng thời cũng không liên kết với các vật chất được điện di, do đó không cản trở chúng theo cách này Thay vào đó, gel polymer hình thành các lỗ với kích thước khác nhau (phụ thuộc vào mật độ polymer) và mẫu phải di chuyển thông qua những lỗ này và dẫn đến sự di động trong điện trường bị giảm

Điện di là kỹ thuật được dùng để phân tách và đôi khi để tinh sạch các đại phân

tử đặc biệt là các protein và các nucleic acid trên cơ sở kích thước khối lượng, điện tích

và cấu hình của chúng

2.2.2 Điện di trên gel agarose

Điện di trên gel agarose là kỹ thuật được sử dụng để xác định kích thước của acid nucleic có khối lượng phân tử cao (ADN và ARN) Agarose là chuỗi polymer mạch thẳng được cấu tạo bởi galactose và 3,6-galactose khan (anhydrogalactose) được liên kết thông qua liên kết glycosidic, agarose được tách chiết từ tảo biển Polyme agarose

có thể chứa tới 100 đơn vị monomer, với khối lượng phân tử trung bình vào khoảng

10000 Da Agarose được đúc bằng cách hòa tan bột agarose trắng trong dung dịch đệm

có chứa EDTA và Tris-acetate hoặc Tris-borate (hệ đệm TAE hoặc TBE tương ứng) Khi hỗn hợp được gia nhiệt tới gần nhiệt độ sôi thì bột agarose hòa tan trong đệm tạo thành một dung dịch trong suốt Sau đó dung dịch được làm làm mát tới nhiệt độ phòng, liên kết hydro trong và giữa các đơn vị polygalactose trong dung dịch sẽ hình thành nên loại gel rắn với kích thước lỗ tương đối đồng nhất

Sau khi dung dịch được đun nóng để hòa tan agarose chúng sẽ được làm lạnh ngay tức khắc và và được đổ vào khuôn dạng phiến bịt kín một đầu cùng với Teflon hoặc hoặc lược nhựa Sau khi quá trình polymer hóa dung dịch kết thúc lược nhựa sẽ được lấy ra khỏi gel để lại các lỗ gọi là các giếng, và mẫu ADN hoặc ARN sẽ được tra vào các giếng đó Gel sau đó sẽ được đưa vào buồng điện di và được để hoàn toàn trong đệm TAE hoặc TBE (các đệm được sử dụng để đúc gel) Tiếp theo mẫu acid nucleic sẽ được trộn với một hệ đệm nhớt (chứa 30% glycerol) có chứa thuốc nhuộm đánh dấu dùng để theo dõi quá trình điện di

Các mẫu acid nucleic được đưa vào các giếng của gel, mẫu ADN đã biết trước khối lượng phân tử (số bp) cũng được đưa vào một trong các giếng đó Mẫu chuẩn này được sử dụng để xác định kích thước của mẫu acid nucleic chưa biết sau khi kết thúc quá trình phân tách điện di

2.2.3 Thành phần của kỹ thuật điện di trên gel agarose

Dung dịch đệm: Tất cả các phương pháp điện di đều được thực hiện trong một dung dịch đệm Dung dịch đệm ngoài tác dụng giữ ổn định và bảo vệ các phân tử sinh học chúng còn có tác dụng làm chất dẫn điện Dòng điện chạy qua dung dịch chất điện

ly sẽ gây ra sự thay đổi thành phần hóa học của dung dịch và làm thay đổi pH của dung dịch pH của dung dịch là một trong những yếu tố quan trọng nhất trong quá trình điện

di nên phải giữ cho pH của dung dịch điện di không thay đổi trong suốt quá trình điện

di Do đó, dung dịch điện di phải là dung dịch có khả năng đệm tốt, không quá loãng và không quá đặc, đảm bảo dung dịch đệm phải giữ cho protein ở trạng thái bền vững không

bị biến tính và phân tách tốt hỗn hợp protein thành các cấu tử

Agarose: Agarose là polysaccharide tự nhiên được phân lập từ tảo biển, có kích thước lỗ gel lớn, thích hợp cho phân tách các phân tử DNA có kích thước lớn và điện di dựa trên độ tích điện Thông thường gel có nồng độ agarose cao thì kích thước lỗ càng nhỏ, do đó có thể phân tách phân tử có khối lượng nhỏ hơn trong khi gel có nồng độ agarose thấp sẽ phân tách được phân tử có khối lượng lớn hơn Phạm vi phân tách hiệu quả của gel agarose với nồng độ agarose khác nhau Ngoài ra đảm bảo sử dụng cùng bộ đệm với bộ đệm trong bể điện di (không trộn lẫn các bộ đệm khác nhau và không sử dụng nước)

2.3 Tổng quan về Salmonella

2.3.1 Giới thiệu chung về Salmonella

Cho đến nay đã phát hiện có khoảng 500 loài vi sinh vật khác nhau có thể gây

bệnh thương hàn và phó thương hàn cho người và gia súc Salmonella có thể gây nhiều

bệnh truyền nhiễm cho động vật như phó thương hàn lợn, bệnh sẩy thai cừu và ngựa, bệnh bạch ly gà, bệnh thương hàn chuột, bệnh viêm ruột bò Những bệnh kể trên do

Salmonella gây ra người ta gọi là bệnh truyền nhiễm nguyên phát, ngoài ra có thể phát

hiện Salmonella trong chất bài tiết của động vật lành

Những Salmonella thường gây ngộ độc thường gặp là S typhimurium, S choleraesuis và S enteritidis Do đó việc chuẩn đoán chính xác các loại trực khuẩn này

ở động vật có một ý nghĩa rất quan trọng về mặt bảo vệ sức khỏe, vệ sinh công cộng, dự phòng truyễn nhiễm

2.3.2 Đặc điểm hình thái

Salmonella thuộc họ Enterobacteriaceae, tộc Salmonelleae và giống Salmonella Salmonella là vi khuẩn hình gậy, mập, ngắn, trực khuẩn gram âm, hai đầu hơi tròn, kích

thước 0,4 – 0,6 x 1 – 3 µm, sống kị khí tùy nghi, không hình thành giáp mô và nha bào,

có khả năng di động nhờ lông mao có khoảng 7 đến 12 lông mao chung quanh thân, trừ

S gallinarum và S pullorum gây bệnh cho gia cầm Salmonella dễ dàng nuôi cấy ở 37℃

trên môi trường nuôi cấy bình thường, chúng phát triển khuẩn lạc có đường kính 2 – 4

nm, trơn, sáng và đồng nhất

2.3.3 Đặc điểm gây bệnh của Salmonella

2.3.3.1 Cơ chế gây bệnh

Vi khuẩn vào ruột rồi phát triển tại đó, sau đó theo hệ thống bạch huyết và tuần hoàn gây nên tình trạng nhiễm trùng huyết Do đó trong thời kỳ đầu, lấy máu người bệnh truyền cấy sẽ phát hiện vi khuẩn Vi khuẩn gây viêm ruột, phá hỏng tế bào niêm mạc ruột, tiết ra độc tố Độc tố này thấm qua thành ruột vào máu Ngoài ra, vi khuẩn trong

hệ tuần hoàn cũng tiết ra nội đọc tố Nội độc tố chủ yếu tác động trên hệ thần kinh vận động của huyết quản, làm giảm độ bền của thành mao quản và giảm chức năng điều tiết

thân nhiệt của cơ thể Như vậy, Salmonella gây bệnh là do độc tố ruột (enterotoxin) và

có lẽ còn do cytotoxin và neurotoxin

Các kiểu bệnh chính do vi khuẩn Salmonella gây ra: viêm ruột, nhiễm trùng máu,

bệnh thương hàn và phó thương hàn

2.3.3.2 Nguồn lây nhiễm

Thực phẩm bị nhiễm bệnh là nguồn lây bệnh dễ dàng và nhanh nhất do vi khuẩn

có thể phát triển nhanh trong thực phẩm, nhất là thực phẩm chưa nấu chín, rau tươi, quả, rau salát, bánh bao, bánh rán, sữa chưa thanh trùng, nhuyễn thể, tôm, cua sống trong khu vực có nguồn nước thải ô nhiễm cao do nguồn phân người và động vật Các loại thực

phẩm có nguy cơ cao bị nhiễm Salmonella cao là thịt gia cầm, sản phẩm thịt, trứng và

các sản phẩm từ trứng, thủy hải sản

Thực phẩm bị nhiễm Salmonella thường không làm thay đổi tính chất lý hóa và

trạng thái cảm quan của thực phẩm, vì thế rất khó phát hiện Nhìn chung, thực phẩm gây ngộ độc thường có độ ẩm cao, pH không acid, đặc biệt là thức ăn đã nấu chín dùng làm thức ăn nguội như món đông, patee, xúc xích, dồi tiết thường là nguyên nhân của những

vụ ngộ độc thức ăn do Salmonella

Ngoài ra, hoa quả và các loại rau ăn sống mặc dù có rửa sạch trước khi ăn nhưng

không thể hết nguy cơ nhiễm Salmonella do chúng có thể phát triển thành số lượng lớn

hơn nhiều nếu không qua chế biến, nguyên nhân chủ yếu là do sử dụng phân bón hữu

cơ cho rau quả và sử dụng nguồn nước bị ô nhiễm