Sắc ký sáng thứ 3, nhóm 2

LY TRÍCH CHẤT CHIẾT THÔ TRONG NGUYÊN LIỆU BẰNG CÁC DUNG MÔI KHÁC NHAU .... LY TRÍCH CHẤT CHIẾT THÔ TRONG NGUYÊN LIỆU BẰNG CÁC DUNG MÔI KHÁC NHAU 1.1.. Qua đó cho thấy, hiệu suất chiết c

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

KỸ THUẬT SẮC KÝ NÂNG CAO

Giảng viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện Mã số sinh viên

TS Trịnh Thị Phi Ly Nguyễn Minh Đức 21126305

Phạm Thị Mỹ Hạnh 21126054 Phan Trung Hậu 21126057

Lê Ngọc Thế Hoa 21126346

Thành phố Thủ Đức, 11/2024

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC i

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii

DANH SÁCH CÁC HÌNH iv

DANH SÁCH CÁC BẢNG v

THÍ NGHIỆM 1 LY TRÍCH CHẤT CHIẾT THÔ TRONG NGUYÊN LIỆU BẰNG CÁC DUNG MÔI KHÁC NHAU 1

1.1 Tổng quan về cây điều 1

1.2 Vật liệu 1

1.2.1 Đối tượng nghiên cứu 1

1.2.2 Thiết bị và dụng cụ 1

1.2.3 Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 2

1.3 Phương pháp nghiên cứu 2

1.3.1 Xác định độ ẩm nguyên liệu 2

1.3.2 Hiệu suất chiết cao 2

1.4 Kết quả 3

1.4.1 Xác định độ ẩm của nguyên liệu 3

1.4.2 Hiệu suất chiết cao 3

1.5 Kết luận 4

THÍ NGHIỆM 2 PHÂN TÁCH SẮC TỐ THỰC VẬT BẰNG KĨ THUẬT SẮC KÝ CỘT 5

2.1 Tổng quan 5

2.1.1 Giới thiệu về sắc ký cột 5

2.1.2 Giới thiệu về cây ngũ sắc 5

2.2 Vật liệu 5

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 5

2.2.2 Thiết bị và dụng cụ 5

2.2.3 Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 5

2.3 Phương pháp nghiên cứu 6

2.3.1 Chuẩn bị dịch chiết sắc tố 6

2.3.2 Chuẩn bị cột sắc ký 6

2.3.3 Đưa mẫu vào cột 7

2.3.4 Rửa giải 7

2.4 Kết quả 7

2.5 Thảo luận 7

THÍ NGHIỆM 3: PHÂN TÁCH SẮC TỐ THỰC VẬT BẰNG KỸ THUẬT TLC 9

3.1 Tổng quan 9

3.2 Vật liệu và thiết bị 9

3.2.1 Vật liệu 9

3.2.2 Dụng cụ và thiết bị 10

3.2.3 Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 10

3.3 Phương pháp nghiên cứu 10

3.3.1 Phân tách sắc tố thực vật bằng kỹ thuật TLC và tính toán chỉ số Rf 10

3.4 Kết quả và thảo luận 11

BÀI TẬP 13

TÀI LIỆU THAM KHẢO 15

PHỤ LỤC 16

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ctv: cộng tác viên

TLC: thin layer chromatography

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Mẫu bột lá điều 1

Hình 1.2 Sấy mẫu bột ở 105oC 2

Hình 1.3 Ly trích mẫu lá điều bằng hai dung môi có độ phân cực khác nhau 3

Hình 1.4 Sấy bã ở 105oC 3

Hình 2.1 Quy trình chuẩn bị dịch chiết sắc tố 6

Hình 2.2 Quy trình chuẩn bị cột sắc ký 6

Hình 2.3 Quy trình rửa giải 7

Hình 3.1 Dịch chiết hoa ngũ sắc 9

Hình 3.2 Bảng mỏng silica gel F254 10

Hình 3.3 Kết quả phân tích sắc ký bản mỏng 11

Hình 3.4 Kết quả phân tích TLC khi chiếu dưới đèn UV 12

Hình 3.5 Đường chuẩn diện tích peak của protocatechuric acid 13

Hình 3.6 Đường chuẩn diện tích peak của chlorohenic acid 13

Hình 3.7 Đường chuẩn diện tích peak của caffeic acid 14

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Độ ẩm của nguyên liệu bột lá điều 3 Bảng 1.2 Hiệu suất chiết cao của các dung môi khác nhau 4 Bảng 3.1 Chỉ số Rf của từng hợp chất có trong dịch chiết lá hoa ngũ sắc 12

THÍ NGHIỆM 1 LY TRÍCH CHẤT CHIẾT THÔ TRONG NGUYÊN LIỆU BẰNG CÁC DUNG MÔI

KHÁC NHAU

1.1 Tổng quan về cây điều

Cây điều được biết đến với tên Latin là A occidentale, là một thành viên của họ Anacardiaceae A occidentale được trồng rộng rãi ở các nước nhiệt đới như Malaysia,

Ấn Độ và Brazil, xuất hiện rộng rãi ở Senegal và được gọi là Darkassou (Jaiswal và ctv, 2017) Điều được tiêu thụ phổ biến trên thế giới trong lĩnh vực thực phẩm Lá và vỏ của

nó được sử dụng để pha trà để duy trì sức khỏe, được chỉ định trong các nghiên cứu dân tộc thực vật để điều trị ung thư, được coi là một vấn đề sức khỏe cộng đồng nghiêm trọng trên toàn thế giới (Costa và ctv, 2020)

Thiết bị: hệ thống chiết xuất hỗ trợ siêu âm, tủ sấy, cân điện tử

Dụng cụ: giấy lọc định tính, phễu lọc, chén thủy tinh, bình hút ẩm

1.2.3 Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

Methanol (CAT#67-56-1, Xilong), ethyl acetate (CAT#141-78-6, Xilong)

1.3 Phương pháp nghiên cứu

1.3.1 Xác định độ ẩm nguyên liệu

Độ ẩm và hàm lượng chất bay hơi của nguyên liệu được xác định bằng cách sấy

ở 105oC đến khi không có sự thay đổi về khối lượng

Cân 2 g nguyên liệu ở dạng bột vào chén thủy tinh chuyên dùng để xác định độ

ẩm (chén đã được sấy ở nhiệt độ 105oC và ghi nhận khối lượng sau khi để nguội) Sấy chén có chứa mẫu ở nhiệt độ 105oC đến khi khối lượng không đổi và ghi nhận khối lượng Thí nghiệm được lặp lại 2 lần

Độ ẩm của nguyên liệu được tính bằng công thức:

W(%) = 𝑤1 −𝑤 2

𝑚 × 100%

Trong đó:

m : khối lượng của mẫu thử trước khi sấy (g);

w1 : khối lượng của chén và mẫu thử trước khi sấy (g);

w2 : khối lượng của chén và phần mẫu thử sau khi sấy (g)

Hình 1.2 Sấy mẫu bột ở 105oC

1.3.2 Hiệu suất chiết cao

Cân 1 g nguyên liệu hòa với 15ml dung môi (dung môi được sử dụng là methanol

và ethyl acetate) với tỉ lệ nguyên liệu và dung môi là 1:15, tiến hành chiết 2 lần có sự hỗ trợ sóng siêu âm nhiều lần trong 15 phút/lần Mẫu chiết sẽ được lọc qua giấy lọc để thu lại bã nguyên liệu

Phần bã nguyên liệu sau khi ly trích sẽ được sấy ở nhiệt độ 105oC tới khối lượng không đổi, để nguội và ghi nhận khối lượng Hiệu suất chiết cao của nguyên liệu được xác định bằng công thức:

Hchiết (%)=𝑚0 −𝑚 1

𝑚0 × 100%

Trong đó:

Hchiết : Hiệu suất chiết cao (%);

m0 : Khối lượng nguyên liệu khô ban đầu (g);

m1 : Khối lượng bã khô còn lại trên giấy lọc (g)

Hình 1.3 Ly trích mẫu lá điều bằng hai dung môi có độ phân cực khác nhau (a) Chiết

mẫu; (b) Lọc mẫu

Hình 1.4 Sấy bã ở 105oC

1.4 Kết quả

1.4.1 Xác định độ ẩm của nguyên liệu

Độ ẩm của nguyên liệu được thể hiện qua Bảng 4.1

Bảng 1.1 Độ ẩm của nguyên liệu bột lá điều

Bột lá điều 11,75 ± 0,38

Từ kết quả Bảng 4.1, độ ẩm của nguyên liệu bột lá điều được xác định là 11,75 ± 0,38 %

1.4.2 Hiệu suất chiết cao

Hiệu suất chiết cao của nguyên liệu được thể hiện ở Bảng 4.2

Bảng 1.2 Hiệu suất chiết cao của các dung môi khác nhau

Ethyl acetate 5,11

Từ kết quả Bảng 4.2, hiệu suất chiết cao lần lượt của 2 loại dung môi ethyl acetate

và methanol là 5,11% và 20,03% Qua đó cho thấy, hiệu suất chiết cao của dung môi methanol độ phân cực cao hơn sẽ có hiệu quả chiết cao hơn so với dung môi có độ phân cực thấp như ethyl acetate do các dung môi phân cực sẽ hòa tan tốt các chất phân cực, các dung môi kém phân cực sẽ hòa tan các chất phân cực yếu

1.5 Kết luận

Độ ẩm của nguyên liệu lá điều được xác định là 11,75 ± 0,38 % Hiệu suất chiết cao của nguyên liệu bột lá điều được xác định của 2 loại dung môi ethyl acetate và methanol là 5,11% và 20,03%

ái lực cao hơn với pha tĩnh

2.1.2 Giới thiệu về cây ngũ sắc

Lantana camara đã được sử dụng ở nhiều nơi trên thế giới để điều trị nhiều loại

rối loạn khác nhau Lantana camara được sử dụng trong các bài thuốc dân gian chữa

ung thư và khối u Một loại trà được chế biến từ lá và hoa đã được dùng để chống sốt, cúm và đau dạ dày Ở Trung và Nam Mỹ, lá được làm thành thuốc đắp để điều trị vết loét, thủy đậu và sởi Sốt, cảm lạnh, thấp khớp, hen suyễn và huyết áp cao đã được điều trị bằng các chế phẩm từ cây này (Neena và ctv, 1982)

2.2 Vật liệu

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Nguyên liệu: cây ngũ sắc khô xay nhuyễn

2.2.2 Thiết bị và dụng cụ

Dụng cụ: ống nghiệm, bông gòn thủy tinh, pipet Pasteur, cốc thủy tinh, ống nhỏ giọt, muỗng múc hóa chất, ống đong định mức, khay đựng ống nghiệm

Thiết bị: máy siêu âm (tần số 40 KHz, công suất 300 W), cân điện tử 4 số

2.2.3 Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

Hóa chất: hexane, acetone, silica gel (0.015-0.04 mm)

Hình 2.2 Quy trình chuẩn bị cột sắc ký (a) silica gel, (b) 0,75

g silica gel ngâm trong 10 ml hexane 5 – 10 phút được nạp vào pipet Pasteur.

Hình 2.1 Quy trình chuẩn bị dịch chiết sắc tố (a) cây ngũ sắc khô xoay nhuyễn, (b) ống nghiệm chứa 1 g cây ngũ sắc khô xoay nhuyễn, (c) hỗn hợp 1 g cây ngũ sắc khô xoay nhuyễn và

10 ml dung môi hexane : aceton (8:2) được lắc siêu âm trong 5 phút, (d) ) hỗn hợp 1 g cây ngũ sắc khô xoay nhuyễn và 10 ml dung môi hexane : aceton (8:2) sau khi lắc siêu âm trong 5 phút.

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.3 Đưa mẫu vào cột

Khi pha động cách bề mặt pha tính 1 mm, thêm khoảng 1 mL hỗn hợp sắc tố vào cột dọc theo thành, tránh xao động bề mặt tĩnh, tiếp tục cho pha động là 5 mL n – hexane qua cột, tránh để cột khô, sau đó để cho phép tốc độ nhỏ giọt khoảng 1 giọt mỗi giây

2.3.4 Rửa giải

Nhóm carotenoid màu vàng cam được rửa giải trước, thu vào ống nghiệm, sử dụng dung môi phân cực hơn là 5 – 10 mL 70% n – hexane + 30% acetone để rửa giải diệp lục tố

2.4 Kết quả

Dùng kỹ thuật sắc ký cột phân tách sắc tố thực vật của cây ngũ sắc thu được: carotenoid màu vàng cam và diệp lục tố màu xanh lá cây Carotenoid được thu sau khi rửa giải bằng pha động 5 ml n - hexane, diệp lục tố thu được sau khi rửa giải tiếp bằng pha động 5 – 10 ml hexane : acetone (7:3)

2.5 Thảo luận

Pha tĩnh silica gel là hạt phân cực nên carotenoid màu vàng cam được rửa giải trước diệp lục tố chứng tỏ carotenoid ít tương tác ái lực với silica gel hơn diệp lục tố, hay nói cách khác carotenoid ít phân cực hơn diệp lục tố

Bên cạnh đó, có nhóm thực hành phân tác được sắc tố: carotenoid màu vàng cam, diệp lục tố a màu xanh nhạt và diệp dục tố b màu xanh đậm (diệp lục tố a ít phân cực hơn diệp lục tố b) Ngoài carotenoid diệp lục tố, dùng kỹ thuật sắc ký cột phân tách sắc

Hình 2.3 Quy trình rửa giải (a) rửa giải carotenoid bằng dung môi n – hexane, (b) carotenoid và diệp lục tố sau khi rửa giải

tố thực vật của cây ngũ sắc có thể thu được: Alkaloids, flavonoids, phenolic compounds, essential oils, axit ascorbic và glycosides

THÍ NGHIỆM 3: PHÂN TÁCH SẮC TỐ THỰC VẬT

BẰNG KỸ THUẬT TLC

3.1 Tổng quan

TLC (thin layer chromatography) hay sắc ký bảng mỏng là một phương pháp sắc

ký lỏng, có pha động là chất lỏng là pha rắn là một lớp vật liệu hấp phụ được phủ trên

bề mặt của một mặt phẳng Hỗn hợp các chất tan sẽ bị kéo theo bởi ái lực của chúng với pha động, và tùy thuộc vào ái lực của từng thành phần trong chất tan mà lần lượt các thành phần riêng biệt sẽ di chuyển trên pha tĩnh với một tốc độ khác nhau, cho sản phẩm cuối cùng là từng thành phần riêng biệt đã được phân tách khỏi hỗn hợp ban đầu (Fried

và Sherma, 1999)

Sắc ký bản mỏng có thể được phân loại dựa trên nguyên tắc phân tách của pha tĩnh, gồm: hấp phụ, phân giải, trao đổi ion và dựa vào kích thước Tuy nhiên hấp phụ là phương pháp phổ biến nhất vì có độ nhạy cao nhất cho việc phân tách các hợp chất có

độ phân cực khác biệt với nhau (Santiago và Strobel, 2013)

3.2 Vật liệu và thiết bị

3.2.1 Vật liệu

Nguyên liệu: Dịch chiết lá hoa ngũ sắc ở thí nghiệm 2

Hình 3.1 Dịch chiết hoa ngũ sắc.

Pha tĩnh: Bảng mỏng silica gel F254 Khi chiếu vào ánh sáng có bước sóng 254

nm, bản mỏng sẽ phát ra ánh sáng huỳnh quang Dùng bút chì đánh dấu vạch xuất phát

Hình 3.2 Bảng mỏng silica gel F254

Pha động: Thực hiện lần lượt thí nghiệm với hai loại pha động khác nhau: acetone:hexan với tỉ lệ 3:7 và acetone:hexan với tỉ lệ 4:6

3.2.2 Dụng cụ và thiết bị

Cốc thủy tinh, bình tam giác

3.2.3 Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

Acetone, hexan

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phân tách sắc tố thực vật bằng kỹ thuật TLC và tính toán chỉ số Rf

Quá trình phân tách bằng kỹ thuật TLC gồm các bước: đưa dịch chiết lên bảng mỏng, mỗi lần 3 µL, thêm từ 5-7 lần cho một lần phân tích Sau đó sẽ đưa bảng mỏng vào bên trong bình ly giải có sẵn pha động đã chuẩn bị từ trước Sau khi pha động đã chạm đến vạch mức quy định trước, đem bảng mỏng ra bên ngoài và tiến hành quan sát,

đo đạc kết quả

Độ phân cực của từng sắc tố có trong hỗn hợp dịch chiết là tác nhân chính cho

sự khác nhau về tốc độ di chuyển trên pha tĩnh của chúng Độ phân cực đó được biểu hiện qua chỉ số Rf, được xác định bằng công thức:

Rf = 𝑅𝑎

𝑅𝑏

Trong đó:

Rf: hệ số làm chậm

Ra: khoảng cách di chuyển của chất tan trên bảng mỏng (cm)

Rb: khoảng cách di chuyển của dung môi trên bảng mỏng (cm)

3.4 Kết quả và thảo luận

Kết quả phân tích TLC cho thấy bên trong hỗn hợp dịch chiết hoa ngũ sắc có ba hợp chất đó là carotene (1), chlorophyl A (2) và chlorophyl B (3) Do pha tĩnh được sử dụng là silica gel, một loại chất hấp phụ có độ phâ cực cao, nên những hợp chất có tính phân cực cao sẽ tương tác mạnh hơn với pha tĩnh trong quá trình hỗn hợp chất hòa tan

bị kéo theo pha động và sẽ di chuyển chậm hơn do bị kéo lại bởi ái lực của pha tĩnh mạnh hơn Carotene có quãng đường di chuyển xa nhất trong cùng một khoảng thời gian, sau đó là chlorophyl A và chlorophyl B cho nên độ phân cực của từng hợp chất

sẽ là carotene < chlorophyl A < chlorophyl B

Kết quả phân tích TLC có thêm chiếu sáng qua đèn UV có bước sóng 254 nm xuất hiện thêm vệt sáng mới, sau khi tham khảo cho ra kết quả là hợp chất xanthophyl Kết luận có những hợp chất cần phải có tín hiệu đèn UV bước sóng 254 nm sẽ phát ánh sáng huỳnh quang và có thể nhận biết bằng mắt

Hình 3.3 Kết quả phân tích sắc ký bản mỏng

A: Bảng mỏng được ngâm trong pha động với tỉ lệ acetone:hexane là 4:6; B Bảng mỏng được ngâm trong pha động với tỉ lệ acetone:hexane là 7:3

Hình 3.4.Kết quả phân tích TLC khi chiếu dưới đèn UV. A: Bảng mỏng được ngâm trong pha động với tỉ lệ acetone:hexane là 4:6; B Bảng mỏng được ngâm trong pha động với tỉ lệ acetone:hexane là 7:3 C: mẫu làm chuẩn.

Chỉ số Rf của từng hợp chất có trong dịch chiết lá hoa ngũ sắc được biểu hiện ở bảng 3.1

Bảng 3.1.Chỉ số Rf của từng hợp chất có trong dịch chiết lá hoa ngũ sắc

Sắc tố Acetone:hexan (4:6) Acetone:hexan (3:7)

Carotene 0.978 0.967

Chlorophyl A 0.511 0.644

Chlorophyl B 0.489 0.622

Qua bảng 3.1 ta có thể thấy chỉ số Rf của carotene ở tỉ lệ pha động 4:6 cao hơn

ở tỉ lệ pha động 3:7, tuy nhiên chỉ số Rf của chlorophyl A và chlorophyl B ở tỉ lệ 4:6 thấp hơn ở tỉ lệ pha động 3:7 Kết luận pha động acetone:hexan tỉ lệ 4:6 sẽ phù hợp cho việc phân tách carotene hơn và pha động acetone:hexan tỉ lệ 3:7 sẽ phù hợp cho việc phân tách chlorophyl A và chlorophyl B hơn

Qua bảng 3.1 ta có thể thấy chỉ số Rf của carotene > chlorophyl A > chlorophyl

B ở cả hai tỉ lệ pha động Kết luận tốc độ di chuyển của carotene > chlorophyl A > chlorophyl B và độ phân cực của carotene < chlorophyl A < chlorophyl B

BÀI TẬP

Hình 3.5 Đường chuẩn diện tích peak của protocatechuric acid

Kết quả đường chuẩn diện tích peak của protocatechuric acid cho ra phương trình

y = 14.372x – 2.2918, có hệ số tuyến tính R2 = 0.9998 Mẫu 2 có diện tích peak là 75.0570 Kết luận nồng độ protocatechuric acid có trong mẫu 2 là 5.381 mg/L

Hình 3.6.Đường chuẩn diện tích peak của chlorohenic acid

Kết quả đường chuẩn diện tích peak của chlorohenic acid cho ra phương trình y

= 20.008x – 9.7092, có hệ số tuyến tính R2 = 0.9996 Mẫu 2 có diện tích peak là

563.4109 Kết luận nồng độ chlorohenic acid có trong mẫu 2 là 29.64 mg/L

Hình 3.7 Đường chuẩn diện tích peak của caffeic acid.

Kết quả đường chuẩn diện tích peak của caffeic acid cho ra phương trình y = 21.456x – 4.1538, có hệ số tuyến tính R2 = 0.9997 Mẫu 2 có diện tích peak là 108.1099 Kết luận nồng độ caffeic acid có trong mẫu 2 là 5.23