ppxnsh sáng thứ 5 nhóm 2

Kết quả biến tính protein bởi nhiệt độ và acid yếu Các ống nghiệm được thêm vào hoá chất và đem đi đun nóng thì xảy ra các hiện tượng Hình 1.2 Kết quả phản ứng biến tính protein bởi nhiệ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM SINH HÓA

Giảng viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện

TRƯƠNG THỊ MINH THẠNH 21126501

Tháng 6/2024

i

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC i

DANH SÁCH CÁC HÌNH iv

DANH SÁCH CÁC BẢNG v

Bài 1 CHẨN ĐOÁN PROTEIN VÀ ỨNG DỤNG 1

1.1 Mục đích và ứng dụng của các phương pháp chuẩn đoán protein 1

1.2 Thời gian và địa điểm 1

1.3 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 1

1.4 Vật liệu 2

1.5 Phương pháp 2

1.5.1 Phản ứng nhận diện các liên kết peptide 2

1.5.2 Biến tính protein bởi nhiệt độ và acid yếu 2

1.5.3 Biến tính protein bởi acid mạnh và không đun nóng 2

1.5.4 Định lượng Albumin trên thiết bị sinh hóa bán tự động 2

1.6 Kết quả 2

1.6.1 Kết quả phản ứng nhận diện các liên kết peptide 3

1.6.2 Kết quả biến tính protein bởi nhiệt độ và acid yếu 3

1.6.3 Kết quả biến tính protein bởi acid mạnh và không đun nóng 4

1.6.4 Kết quả định lượng albumin trên thiết bị sinh hoá 4

1.7 Kết luận 5

Bài 2 CHẨN ĐOÁN GLUCOSE VÀ ỨNG DỤNG 6

2.1 Đặt vấn đề 6

2.2 Nguyên tắc và mục tiêu 6

2.2.1 Định tính glucose bằng thuốc thử Benedict 6

2.2.2 Định tính glucose bằng thuốc thử Fehling 6

2.2.3 Định lượng glucose trên thiết bị sinh hóa bán tự động 7

2.2.4 Mục tiêu 7

2.3 Vật liệu và phương pháp 7

2.3.1 Vật liệu 7

ii

2.3.2 Phương pháp 7

2.3.2.1 Pha thuốc thử Benedict 7

2.3.2.2 Pha thuốc thử Fehling 7

2.3.2.3 Định tính glucose bằng thuốc thử Benedict và thuốc thử Fehling 8

2.3.2.4 Định lượng glucose trên thiết bị sinh hóa bán tự động 8

2.4 Kết quả 8

2.4.1 Định tính glucose bằng thuốc thử Benedict 8

2.4.2 Định tính glucose bằng thuốc thử Fehling 9

2.4.3 Định lượng glucose trên thiết bị sinh hóa bán tự động 9

2.5 Kết luận 9

Bài 3 CHUYỂN HÓA LIPID 11

3.1 Khảo sát sự hòa tan của lipid trong dung môi 11

3.1.1 Nguyên tắc 11

3.1.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 11

3.1.2.1 Vật liệu 11

3.1.2.2 Phương pháp nghiên cứu 11

3.1.3 Kết quả 11

3.1.4 Kết luận 13

3.2 Sự hình thành nhũ tương phân chia lipid thành micelles 13

3.2.1 Nguyên tắc 13

3.2.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 13

3.2.2.1 Vật liệu 13

3.2.2.2 Phương pháp nghiên cứu 13

3.2.3 Kết quả 14

3.2.4 Kết luận 15

3.3 Xác định chỉ số acid và hàm lượng acid béo tự do 15

3.3.1 Nguyên tắc 15

3.3.2 Vật liệu và phương pháp 15

3.3.2.1 Vật liệu 15

3.3.2.2 Phương pháp nghiên cứu 16

3.3.3 Kết quả 16

3.3.4 Kết luận 17

iii

3.4 Định lượng cholesterol toàn phần trên thiết bị sinh hóa bán tự động 17

3.4.1 Đặt vấn đề 17

3.4.2 Vật liệu và phương pháp 17

3.4.2.1 Vật liệu 17

3.4.2.2 Phương pháp nghiên cứu 18

3.4.3 Kết quả 18

3.4.4 Thảo luận 18

iv

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Kết quả phản ứng nhận diện các liên kết peptide 3

Hình 1.2 Kết quả phản ứng biến tính protein bởi nhiệt độ và acid yếu 3

Hình 1.3 Kết quả phản ứng biến tính protein bởi acid mạnh và không đun nóng 4

Hình 1.4 Kết quả định lượng albumin trên thiết bị sinh hoá 4

Hình 2.1 Định tính glucose bằng thuốc thử Benedict 8

Hình 2.2 Định tính glucose bằng thuốc thử Fehling 9

Hình 2.3 Kết quả định lượng glucose trên thiết bị sinh hóa bán tự động 9

Hình 3.1 Tính tan của lipid trong 4 ống nghiệm chứa dung môi khác nhau 12

Hình 3.2 Sự hình thành nhũ tương của lipid ở 3 ống nghiệm 14

Hình 3.3 Kết quả chuẩn độ 16

Hình 3.4 Kết quả định lượng trên thiết bị sinh hóa bán tự động 18

v

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Thành phần phản ứng biến tính protein bởi nhiệt độ và acid yếu 2

Bảng 3.1 Thành phần các dung môi trong ống nghiệm 11

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát sự hoà tan của lipid trong dung môi 12

Bảng 3.3 Thành phần các dung dịch trong ống nghiệm 14

Bảng 3.4 Thành phần cho thí nghiệm 18

Bài 1 CHẨN ĐOÁN PROTEIN VÀ ỨNG DỤNG

1.1 Mục đích và ứng dụng của các phương pháp chuẩn đoán protein

Protein là những đại phân tử, cấu tạo từ một hoặc nhiều mạch acid amin liên kết với nhau bằng liên kết peptide Protein là một trong những thành phần dưỡng chất quan trọng mà cơ thể cần bổ sung hàng ngày, giúp duy trì sự sống và tăng cường sức khỏe

Protein trong cơ thể gồm 3 thành phần chính là: albumin, globulin và fibrinogen Protein tham gia vào quá trình phát triển của cơ thể từ việc cấu tạo hình thành cơ, đổi mới phát triển, phân chia tế bào Hơn nữa, protein còn là xúc tác cho các phản ứng sinh hóa và trao đổi chất trong cơ thể

Với các chức năng kể trên, protein có thể ảnh hưởng trực tiếp đến các hoạt động sinh lý bình thường Người ta thường ứng dụng các kĩ thuật phân tích sinh hóa giúp chuẩn đoán chỉ số protein trong máu và nước tiểu, từ đó trực tiếp suy ra tình trạng sức khỏe của người bệnh Nồng độ protein trong máu thay đổi hoặc xuất hiện protein trong nước tiểu là những dấu hiệu bất thường về sức khỏe

Nồng độ protein trong máu người dao động từ 60 - 80 g/L, trong đó albumin từ

38 - 54 g/L và globulin từ 26 - 42 g/L Việc tăng hoặc giảm nồng độ protein trong máu

có thể là vì cơ thể đã bị các triệu chứng sau: viêm tụy cấp, viêm tủy xương, loét dạ dày

tá tràng, đái tháo đường, hội chứng thận hư, viêm cầu thận mạn,

Bình thường trong nước tiểu sẽ không có protein hoặc có một lượng rất nhỏ dưới

150 mg/24 giờ Nếu kiểm tra thấy có protein xuất hiện trong nước tiểu thì có thể là vì các nguyên nhân sau: nhiễm trùng đường tiết niệu, các bệnh lý suy giảm chức năng thận, mang thai,

1.2 Thời gian và địa điểm

Thời gian: 8 giờ, sáng thứ năm, ngày 04/04/2024

Địa điểm: Phòng 317, tòa nhà A1, Trường Đại học Nông Lâm TP HCM

1.3 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị

Hóa chất: NaOH 40%, NaOH 10%, CuSO4 1%, CH3COOH 1%, CH3COOH 10%, NaCl bão hòa, HNO3 đặc, thuốc thử Albumin fluid Mono

Dụng cụ: Ống nghiệm, pipet thủy tinh, micropipette,

Thiết bị: Bếp điện từ, thiết bị sinh hóa bán tự động,

1.4 Vật liệu

Lòng trắng trứng, nước tiểu của thành viên trong nhóm

1.5 Phương pháp

1.5.1 Phản ứng nhận diện các liên kết peptide

Bước 1: Pha các hóa chất NaOH 40% và CuSO4 1%

Bước 2: Chuẩn bị một ống nghiệm, cho vào đó 1 mL lòng trắng trứng

Bước 4: Lắc đều và quan sát màu

1.5.2 Biến tính protein bởi nhiệt độ và acid yếu

Bước 2: Chuẩn bị 5 ống nghiệm và đánh số từ 1 đến 5

Bước 3: Cho hóa chất vào ống nghiệm với nồng độ như bảng 1.1

Bảng 1.1 Thành phần phản ứng biến tính protein bởi nhiệt độ và acid yếu

Bước 4: Đun cách thủy các ống nghiệm trong vòng 1 phút, quan sát hiện tượng

1.5.3 Biến tính protein bởi acid mạnh và không đun nóng

Bước 1: Chuẩn bị một ống nghiệm, cho vào đó 2 mL lòng trắng trứng

Bước 2: Thêm vào ống nghiệm 1 mL HNO3 đặc

Bước 4: Lắc đều và quan sát màu

1.5.4 Định lượng Albumin trên thiết bị sinh hóa bán tự động

Bước 1: Chuẩn bị hai ống nghiệm chuyên biệt cho thiết bị sinh hóa bán tự động Bước 2: Cho vào ống thứ nhất 1 mL thuốc thử Albumin fluid Mono và 10 µL mẫu chất chuẩn, ống thứ hai 1 mL thuốc thử Albumin fluid Mono và 10 µL nước tiểu

Bước 3: Ủ hai ống nghiệm trong thiết bị sinh hóa bán tự động 5 phút

Bước 4: Đo nồng độ protein ở bước sóng 578 nm Ghi nhận số liệu

1.6 Kết quả

1.6.1 Kết quả phản ứng nhận diện các liên kết peptide

Hình 1.1 Kết quả phản ứng nhận diện các

liên kết peptide

Khi có mặt peptide của lòng trắng trứng, ion Cu2+ trong CuSO4 1% được thêm vào

sẽ hình thành phức hợp màu tím trong dung dịch kiềm NaOH 40%, đây còn được gọi là phản ứng màu biure

1.6.2 Kết quả biến tính protein bởi nhiệt độ và acid yếu

Các ống nghiệm được thêm vào hoá chất và đem đi đun nóng thì xảy ra các hiện tượng

Hình 1.2 Kết quả phản ứng biến tính protein bởi nhiệt độ và

acid yếu. (1) Ống đối chứng; (2) Ống có acid acetic 1%; (3) Ống

có acid acetic 10%; (4) Ống có NaCl bão hoà và acid acetic 10%;

(5) Ống có NaOH 10%

khác nhau Ở ống đối chứng, lòng trắng trứng chuyển sang màu trắng đục, đông đặc lại Hai ống (2), (4) thấy xuất hiện kết tủa trắng ở phía dưới đáy ống nghiệm Ống (3) cũng xuất hiện kết tủa trắng nhưng với nồng độ acid cao thì kết tủa sẽ tan, như vậy có thể cho thiếu acid hoặc đun chưa đủ thời gian nên vẫn còn kết tủa trong ống, còn ống (5) chỉ thấy lượng nhỏ lòng trắng trứng bị kết tủa và gần như không thấy hiện tượng gì khác xảy ra

1.6.3 Kết quả biến tính protein bởi acid mạnh và không đun nóng

Sau khi thêm HNO3 đậm đặc vào lòng trắng trứng có chứa protein, hiện tượng trong ống nghiệm từ dịch lỏng dần tạo kết tủa nitro không tan có màu vàng và làm cấu trúc dịch lỏng bị thay đổi

1.6.4 Kết quả định lượng albumin trên thiết bị sinh hoá

Kết quả định lượng của albumin lòng trắng trứng đo được là 1,269 g/dl

Kết quả định lượng của albumin trong nước tiểu đo được là 1,278 g/dl

1.7 Kết luận

Ở phản ứng nhận diện các liên kết peptide, khi có mặt protein, các ion Cu2+ trong CuSO4 1% sẽ hình thành phức hợp màu tím trong dung dịch kiềm NaOH 40% Ống nghiệm đổi màu có nghĩa đã xảy ra phản ứng màu biuret, chứng tỏ trong lòng trắng trứng có protein

Ở thử nghiệm biến tính protein bởi nhiệt độ và acid yếu, ta thấy được phần lớn protein bị đông tụ khi đun nóng trong môi trường trung tính hay acid yếu Trong môi trường acid mạnh, có nhiều ion H+ nên protein bị khử nước, các nhóm COO- được trung hoà còn các nhóm NH3+ không được trung hoà, vì vậy phân tử protein trong môi trường acid mạnh sẽ mang điện tích dương, khi bị đun nóng protein sẽ không tạo tủa Nhưng ở ống nghiệm 3 vẫn thấy có kết tủa, điều này có thể là vì cho thiếu acid hoặc đun chưa đủ thời gian

Ở thử nghiệm biến tính protein bởi acid mạnh và không đun nóng, sau khi thêm HNO3 đậm đặc vào protein lòng trắng trứng, protein sẽ tạo tủa do mất lớp áo nước và trung hoà điện tích Vậy nên mới có hiện tượng kết tủa nitro không tan có màu vàng và làm cấu trúc dịch lỏng bị thay đổi

Với kết quả định lượng albumin trên thiết bị sinh hoá, nồng độ albumin mẫu nước tiểu của bạn sinh viên trong nhóm có kết quả đo dưới 30 g/dL đồng nghĩa với việc sức khoẻ của bạn đó bình thường

Bài 2 CHẨN ĐOÁN GLUCOSE VÀ ỨNG DỤNG

2.1 Đặt vấn đề

Glucose (đường) là thành phần được tạo ra từ chế độ ăn uống hằng ngày Đây cũng

là nguồn năng lượng chính cho hầu hết các tế bào trong cơ thể Glucose chuyển hóa thành glycogen có trong gan và acid béo ở các mô mỡ Khi glucose trong máu bị thiếu hụt hay dư thừa đều gây ra các vấn đề về sức khoẻ: nếu tăng không kiểm soát sẽ gây ra bệnh đái tháo đường, stress, nhiễm độc; nếu giảm sẽ dẫn đến suy gan, dùng insulin quá liều Ở người bình thường, trị số glucose trong máu là 3,9 – 5,5 mmol/L Trị số bình thường trong nước tiểu không có glucose Vì vậy, việc theo dõi lượng glucose trong máu

là cần thiết Để kiểm tra nhanh sự hiện diện của glucose có thể dùng các loại thuốc thử như Benedict và Fehling thông qua các phản ứng định tính và định lượng glucose có trong nước tiểu bằng thiết bị sinh hóa bán tự động

2.2 Nguyên tắc và mục tiêu

2.2.1 Định tính glucose bằng thuốc thử Benedict

Thuốc thử Benedict là thuốc thử nhận biết sự có mặt của đường khử Thuốc thử này là hỗn hợp của muối natri carbonate, natri citrate và đồng (II) sulfate ngậm 5 phân

tử nước (CuSO4.5H2O).Sự oxy hóa đường khử bởi phức cupric (Cu2+) trong thuốc thử tạo ra cuprơ (Cu+), kết tủa dưới dạng đồng (I) oxide màu đỏ, không tan (Cu2O) Kết quả dương tính khi màu sắc thuốc thử đổi từ dung dịch xanh lam trong suốt sang kết tủa đỏ gạch Thuốc thử Benedict bán định lượng nên được sử dụng nhiều

2.2.2 Định tính glucose bằng thuốc thử Fehling

Thuốc thử Fehling là một thuốc thử được sử dụng để phân biệt giữa nhóm chức aldehyde và ketone (>C=O) hòa tan trong nước Thuốc thử này cũng dùng để thử đường khử và đường không khử Theo đó thì thử nghiệm Fehling sẽ bao gồm một dung dịch thường, được chuẩn bị mới trong phòng thí nghiệm Ban đầu dung dịch sẽ tồn tại ở hai dạng dung dịch riêng biệt và được người thực hiện đánh dấu theo loại Fehling A và Fehling B Fehling A sẽ là dung dịch có chứa CuSO4 (đồng sulfat) màu xanh lam Fehling B sẽ là dung dịch lỏng có màu trong suốt chứa muối Kali Natri Tartrate và một hoạt chất có tính kiềm mạnh như NaOH (Natri hydroxide) Hai dung dịch A và B sau

đó sẽ được trộn theo tỷ lệ thể tích bằng nhau nhằm thu được dung dịch Fehling cuối

cùng có màu xanh lam đậm

2Na+ + 2C4H4O6 + 2K+ + Cu2+ + 2OH- → Cu(C4H4O6)2 + 2Na+ + 2K+

2.2.3 Định lượng glucose trên thiết bị sinh hóa bán tự động

Nguyên tắc của phương pháp này là sử dụng một hệ thống mẫu chứa mẫu cần định lượng và các dung dịch chuẩn có nồng độ glucose biết trước để xác định nồng độ của mẫu Sau đó, sử dụng thuốc thử glucose oxidase - peroxidase (GOD - POD) hoặc glucoenzymes để oxy hóa glucose trong mẫu thành gluconic acid và hydrogen peroxide

Glucose + H2O → Acid gluconic + H2O2Tiếp theo, hydrogen peroxide phản ứng với peroxidase và được xúc tác bởi 4 - aminoantipyrine tạo thành sản phẩm có màu có thể được đọc bởi máy đọc mẫu tự động

2H2O2 + Phenol + 4 - aminoantipyrine → Quinonemin + 4H2O

2.2.4 Mục tiêu

Nhận diện nhanh sự có mặt của glucose trong máu hoặc nước tiểu bằng định tính glucose bằng thuốc thử Benedict và Fehling hoặc định lượng glucose trên thiết bị sinh hóa bán tự động

2.3.2 Phương pháp

2.3.2.1 Pha thuốc thử Benedict

Cân 5 g natri carbonate và 8,65 g natri citrate dihydrate, khuấy tan trong 42,5 mL nước Sau đó, cân 0,865 g đồng (II) sulfate, khuấy tan trong 5 mL nước Cuối cùng, cho

2 dung dịch vừa pha được vào bình định mức lên 50 mL

2.3.2.2 Pha thuốc thử Fehling

Đầu tiên, với Fehling A cân 2 g CuSO4.5H2O định mức 50 mL Fehling B cân 10

g Kali natri tartrate hoà tan với 7,5 g NaOH, sau đó định mức lên 50 mL Hòa 2 dung dịch A và B theo tỉ lệ 1:1

2.3.2.3 Định tính glucose bằng thuốc thử Benedict và thuốc thử Fehling

Bước 1: Chuẩn bị 5 ống nghiệm, ghi số thứ tự từ 1 – 5

Bước 2: Thêm vào mỗi ống nghiệm 2 mL thuốc thử và 0,2 mL mẫu

Bước 3: Đun cách thủy 5 phút Quan sát màu và giải thích hiện tượng

2.3.2.4 Định lượng glucose trên thiết bị sinh hóa bán tự động

Bước 1: Cho vào ống nghiệm 1 mL thuốc thử và 10 uL mẫu

Hình 2.1 Định tính glucose bằng thuốc thử Benedict A) Trước phản ứng; B) Sau phản ứng;

ống 1 – 5 chứa thuốc thử và mẫu cần kiểm tra

Định tính glucose bằng thuốc thử Benedict cho kết quả như sau: âm tính với glucose ở mẫu 1 và 2; dương tính ở các mẫu 3, 4 và 5

Khi glucose tác dụng với thuốc thử Benedict sẽ gây ra phản ứng đổi màu từ xanh lam sang đỏ gạch Mức độ đậm nhạt của kết tủa màu đỏ gạch phụ thuộc vào nồng độ glucose trong mẫu thử Nồng độ glucose càng cao thì kết tủa càng đậm tương ứng với màu sắc là xanh dương < xanh lá hoặc vàng < cam < đỏ

Để chính xác cần đem các mẫu đi định lượng Vì vậy màu sắc của thuốc thử sau phản ứng được sắp xếp tương ứng với nồng độ glucose trong mẫu theo thứ tự từ thấp đến cao: 1, 2 < 5 < 3 < 4