bài tập thực hành nhóm 12 ca 3 thứ 3

Ở người và động vật, việc phát hiện bệnh brucellosis ởcấp độ phân tử là rất quan trọng để đáp ứng các mục tiêu dịch tễ học và phòng ngừa.Ứng dụng sinh tin học trong việc thiết kế primer

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINHKHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINHKHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÀI TẬP THỰC HÀNH

BÁO CÁO BÀI TẬP THỰC HÀNH MÔN HỌC SINH TIN HỌC

Giáo viên hướng dẫn

PGS.TS NGUYỄN BẢO QUỐC

Sinh viên thực hiện

1 NGUYỄN VƯƠNG HUYỀN TRÂM 21126213

2 NGUYỄN ĐINH BẢO TRÂN 21126547

3 VÕ LINH THƯ 21126525

TP Thủ Đức, 06/2024

iii

1.3 Nội dung thực hiện 2

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN VỀ BRUCELLA ABORTUS 3

2.1 Brucella abortus 3

2.2 Thiệt hại gây ra 3

CHƯƠNG 3 QUY TRÌNH THỰC HIỆN 5

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ 12

4.1 Cặp primer 1 12

4.1.1 Trình tự 12

4.1.2 Kết quả kiểm tra đặc hiệu trên Insilico PCR 13

4.1.3 Kết quả kiểm tra đặc hiệu trên Primer Blast 13

4.2 Cặp primer 2 18

4.2.1 Trình tự 18

4.2.2 Kết quả kiểm tra đặc hiệu trên Insilico PCR 19

4.2.3 Kết quả kiểm tra đặc hiệu trên Primer Blast 20

4.3 Cặp primer 3 22

4.3.1 Trình tự 22

4.3.2 Kết quả kiểm tra đặc hiệu trên Insilico PCR 24

4.3.3 Kết quả kiểm tra đặc hiệu trên Primer Blast 24

ii

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 4.1 Các thông số cần quan tâm của cặp primer 1 12Bảng 4.2 Các thông số cần quan tâm của cặp primer 2 19Bảng 4.3 Các thông số cần quan tâm của cặp primer 3 23

DANH SÁCH CÁC HÌN

Hình 2.1 Hình ảnh Brucella abortus quan sát được dưới kính hiển vi 3

YHình4.1. Kết quả trình tự cặpprimer……… 12

Hình 4.2.Kết quả kiểm tra đặc hiệu cặp primer 1 trên Insilico PCR 13

Hình 4.3 Kết quả kiểm tra đặc hiệu trên Primer Blast 16

Hình 4.4 Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu với Clostridium 16

Hình 4.5 Kết quả kiểm tra đặc hiệu với Bacillus 17

Hình 4.6 Kết quả trình tự cặp primer 2 18

Hình 4.7 Kết quả kiểm tra đặc hiệu cặp primer 2 trên Insilico PCR 19

Hình 4.8.Kết quả kiểm tra đặc hiệu trên Primer Blast 21

Hình 4.9 Kết quả kiểm tra đặc hiệu với Bacillus 21

Hình 4.10 Kết quả kiểm tra đặc hiệu với Clostridium 22

Hình 4.11 Kết quả trình tự cặp primer 3 23

Hình 4.12 Kết quả kiểm tra đặc hiệu cặp primer 3 trên Insilico PCR 24

Hình 4.13 Kết quả kiểm tra đặc hiệu trên Primer Blast 26

Hình 4.14 Kết quả kiểm tra đặc hiệu với Clostridium 26

Hình 4.15 Kết quả kiểm tra đặc hiệu với Bacillus 27

iv

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ1.1.Đặt vấn đề

Brucella là một chi cầu khuẩn gram âm, hiếu khí và không di động Brucellaabortus là tác nhân gây bệnh brucellosis ở động vật nhai lại nhỏ và gia súc Các dấu

hiệu lâm sàng quan trọng nhất của bệnh brucellosis ở động vật là sẩy thai, rối loạn sinhsản, ứ đọng nhau thai ở con cái và viêm tinh hoàn, viêm mào tinh hoàn ở con đực Sựbùng phát bệnh brucellosis ở bò thường xảy ra khi sảy thai trong 3 tháng cuối của thai

kỳ, dẫn đến bê yếu và bò vô sinh Bên cạnh đó, B abortus còn là mầm bệnh ở người.

Bệnh brucellosis ở người chủ yếu là hậu quả của việc tiếp xúc với động vật bị nhiễmbệnh hoặc tiêu thụ các sản phẩm sữa chưa tiệt trùng Người dân ở khu vực Địa TrungHải, Trung Đông và Mỹ Latinh có nguy cơ mắc bệnh brucellosis cao Vi khuẩn nàygây sốt nhiễm trùng huyết hoặc nhiễm trùng cục bộ ở xương, mô và các cơ quan khácở người

Chẩn đoán chủng Brucella trong các mẫu nghi ngờ thường dựa trên xét nghiệmnuôi cấy và huyết thanh học Việc xác định các chủng Brucella phân lập ở cấp độ loài

bằng phương pháp vi khuẩn cổ điển là tiêu chuẩn vàng, nhưng tốn thời gian và yêu cầuthời gian ủ bệnh dài cũng như nhiều xét nghiệm kiểu hình Các gen khác nhau là ứng

cử viên để phát hiện bệnh brucellosis và xác định các loài Brucella bằng phản ứng

chuỗi polymerase (PCR)

Các phương pháp phân tử để phát hiện bệnh brucellosis nhanh hơn và nhạy hơncác phương pháp truyền thống Ở người và động vật, việc phát hiện bệnh brucellosis ởcấp độ phân tử là rất quan trọng để đáp ứng các mục tiêu dịch tễ học và phòng ngừa.

Ứng dụng sinh tin học trong việc thiết kế primer đặc hiệu cho loài B abortus giúp

nâng cao độ nhạy khi PCR, đem lại kết quả chính xác hơn cũng như giảm thời giancho ra kết quả.

1.2.Mục tiêu

Thực hành thiết kế primer đặc hiệu trong việc phát hiện Brucella abortus hỗ trợtrong việc chuẩn đoán nhanh và chính xác phát hiện sự có mặt của Brucella abortus

trong cơ thể Từ đó, có biện pháp cảnh báo phòng ngừa cũng như phát triển vắc-xinchống lại vi khuẩn.

1.3.Nội dung thực hiện

Sử dụng các phần mềm hỗ trợ như MEGAX (MEGA Software), Chromas, cùngvới các trang web chuyên dụng như NCBI, Simulation of T-RFLP, để xác định và thiết

kế 3 đoạn primer đặc hiệu cho loài Brucella abortus.

2

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN VỀ BRUCELLA ABORTUS

2.1 Brucella abortus

Loài: Brucella abortus.Chi: Brucella.

Họ: Brucellaceae.Bộ: Rhizobiales.

Lớp: Alphaproteobacteria.Ngành: Gammaproteobacteria.Giới: Bacteria.

Vực: Proteobacteria.

Brucella spp là một chi vi khuẩn gram âm, được đặt theo tên của Thiếu tướng

David Bruce, người đã phân lập B melitensis từ những người lính Anh đã chết vì sốt

Malta Nó bao gồm ít nhất mười loài có đặc điểm di truyền rất giống nhau, mặc dù mỗiloài có đặc tính vật chủ hơi khác nhau

Vi khuẩn Brucella có hình cầu hoặc bầu dục ngắn, kích thước khoảng 0,5 - 1,0μm Brucella có cấu trúc màng tế bào gram âm điển hình, với lớp peptidoglycan dày

và lớp màng ngoài lipopolysaccharide (LPS) Chúng là vi khuẩn nội bào bắt buộc, có

nghĩa là chúng chỉ có thể sinh trưởng và phát triển bên trong tế bào vật chủ Brucella

có khả năng xâm nhập và sinh sống trong nhiều loại tế bào khác nhau của cơ thể vậtchủ, bao gồm tế bào bạch cầu, tế bào gan, tế bào sinh sản,

Brucella abortus là một trong bốn loài vi khuẩn Brucella chính gây bệnh ở

người Cụ thể, B abortus gây bệnh lao bò truyền nhiễm ở gia súc và lây sang người

qua đường tiêu hóa hoặc tiếp xúc trực tiếp với dịch tiết của động vật bị bệnh

2.2 Thiệt hại gây ra

Bệnh brucellosis do Brucella abortus gây ra phổ biến ở nhiều nơi trên thế giới,đặc biệt là ở các khu vực chăn nuôi gia súc Brucellosis lây truyền qua tiếp xúc gần gũivới máu, phân, nước tiểu và nhau thai của vật chủ bị nhiễm bệnh hoặc qua hít phải bụi,

Hình 2.1 Hình ảnh Brucella abortus quan

sát được dưới kính hiển vi

khí dung bị ô nhiễm Thiệt hại kinh tế do nhiễm trùng gây ra bởi Brucella là khá đáng

kể đối với chủ sở hữu vật nuôi được thuần hóa

Ở người, việc tiếp xúc có thể dẫn đến tình trạng viêm cấp tính ở nhiều cơ quan

và các triệu chứng giống cúm Brucella abortus chủ yếu liên quan đến gia súc Tuy

nhiên, nhiễm trùng có thể xảy ra ở cừu, dê, lợn, bò rừng, trâu, ngựa, nai sừng tấm vànhiều loài động vật khác Bệnh có thể lây từ động vật hoang dã sang đàn gia súc Cũng

có mối lo ngại tiềm ẩn về việc sử dụng Brucella làm vũ khí khủng bố sinh học Tiêm

phòng cho động vật, đặc biệt là ở các vùng lưu hành bệnh là cách kinh tế và quan trọngnhất để kiểm soát và loại trừ bệnh brucellosis Điều này cũng sẽ giảm thiểu khả nănglây nhiễm ở người

Hiện tại không có loại vắc-xin nào được phê duyệt chống nhiễm trùng ở ngườivà việc sử dụng vắc xin động vật ở người có những hạn chế nghiêm trọng Nhiềunghiên cứu đã tập trung vào việc phát triển các loại vắc xin hiệu quả cho gia súc, mộtsố ít sử dụng vắc xin sống giảm độc lực Tuy nhiên, hiệu lực và hiệu quả của các loạivắc xin này tương đối kém do có nhiều nhược điểm, bao gồm: cản trở xét nghiệm chẩnđoán bằng cách tạo ra kháng thể kháng LPS, có độc lực đối với người, gây nhiễmtrùng dai dẳng ở động vật được tiêm phòng, có nguy cơ đảo ngược độc lực, tiết dịch.vào sữa, gây sẩy thai ở động vật mang thai dù chỉ với một liều duy nhất và không cótác dụng bảo vệ lâu dài.

4

CHƯƠNG 3 QUY TRÌNH THỰC HIỆNBước 1: Vào NCBI Protein (ncbi.nlm.nih.gov/protein), dùng từ khóa

“hypothetical protein + tên loài chỉ định” để tìm kiếm Chỉ chọn những proteincó chiều dài trong khoảng từ 90 - 150 amino acid.

Bước 2: Tiến hành Run BLAST - blastp (protein-protein BLAST).

Bước 3: Sau khi có kết quả BLAST, chọn trình tự sắp xếp tương đồng cao

nhất với đối tượng.

Bước 4: Vào Identical Proteins của trình tự đã chọn, ưu tiên chọn những

CDS Region in Nucleotide theo chiều âm (-) và lấy FASTA.

Bước 4: Lấy trình tự FASTA dán vào Primer3web, đặt điều kiện giới hạn độ

dài đoạn dùng để thiết kế tùy thuộc vào độ dài trình tự Nhấn Pick Primer đểtiến hành thiết kế primer.

FASTA:Primer 1 :

WP_002966647.1 - 114aa

>NC_006933.1:c1079012-1078668 Brucella abortus bv 1 str 9-941 chromosome II, complete sequence

Primer 2:

CAJ09999.1 – 92aa, GenBank: AAX73465.1

>AM040264.1:c47059-46781 Brucella melitensis biovar Abortus 2308 chromosome I,complete sequence, strain 2308

Primer 3:

CAJ11354.1 – 93aa, GenBank: AAX74706.1

>AM040264.1:c1350660-1350379 Brucella melitensis biovar Abortus 2308 chromosome I, complete sequence, strain 2308

8

Bước 5: Kiểm tra cặp primer vừa thiết kế: tỉ lệ bắt cặp, tỉ lệ phần trăm GC,

nhiệt độ chênh lệch, chiều kẹp tóc Nếu các chỉ số này đều nằm trong

khoảng cho phép, tiến hành vào In silico PCR Amplification để kiểm tra

tính chuyên biệt.

Chọn APPLY TO ALL Brucella để kiểm tra cho tất cả các loài thuộc chiBrucella.

Bước 6: Với kết quả kiểm tra trên In silico cho ra primer chuyên biệt với

loài mục tiêu, tiếp tục kiểm tra chéo trên Primer-BLAST.

Database chọn “nr” để web kiểm tra ngẫu nhiên thay vì một loài hoặc chinào đó, đồng thời xóa dữ liệu ở ô Organism Sau đó nhấn Get Primers.

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ4.1 Cặp primer 1

4.1.1 Trình tự

Primer forward: 5'-GTTGCGCTACGAAGATGTCA-3'Primer reverse : 5'-CGACTGGGTGATCTCGATGA-3'

Hình 4.1 Kết quả trình tự cặp primerBảng 4.1 Các thông số cần quan tâm của cặp primer 1

Primer forwardPrimer reverse

Qua các giá trị thông số thu được cặp primer đáp ứng các tiêu chí trong nguyêntắc thiết kế primer: có độ dài primer nằm trong khoảng 18 – 25 base, có nhiệt độ nóng

chảy Tm nằm trong khoảng 50 – 65oC, không có sự chệnh lệch quá lớn giữa 2 giá trịTm của cặp primer Mật độ GC của 2 primer lần lượt là 50% và 55% không vượtkhoảng giá trị tối ưu 50 – 60%, không có sự lặp lại quá 4 lần ở trình tự đơn hoặc đôi cóthể tiến hành quy trình kiểm tra độ đặc hiệu tiếp theo.

4.1.2 Kết quả kiểm tra đặc hiệu trên Insilico PCR

Hình 4.2.Kết quả kiểm tra đặc hiệu cặp primer 1 trên Insilico PCR 1 - Brucella abortusA13334; 2 - Brucella abortus S19; 3 - Brucella abortus bv 1 str 9-941; 4 - Brucella canisATCC 23365 chromosome I; 5 - Brucella canis HSK A52141; 6 - Brucella ceti TE10759-12;7 - Brucella ceti TE28753-12; 8 - Brucella melitensis; 9 - Brucella melitensis ATCC 23457;10 - Brucella melitensis M28 chromosome; 11 - Brucella melitensis M5-90; 12 - Brucellamelitensis NI; 13 - Brucella melitensis biovar Abortus 2308; 14 - Brucella microti CCM4915; 15 - Brucella ovis ATCC 25840 chromosome I; 16 - Brucella pinnipedialis B2/94; 17 -Brucella suis 1330; 18 - Brucella suis 1330; 19 - Brucella suis ATCC 23445; 20 - Brucellasuis VBI22

Kết quả kiểm tra của cặp primer trên Insilico PCR cho thấy cặp primer chỉ xuất

hiện band có kích thước 345bp ở các vị trí 1 - Brucella abortus A13334; 2 - Brucella

abortus S19; 3 - Brucella abortus bv 1 str 9-941 và 13 - Brucella melitensis biovarAbortus 2308 (Brucella abortus 2308), tất cả đều thuộc loài Brucella abortus, cặp

primer bước đầu kiểm tra có sự đặc hiệu đặc hiệu cho loài cần tìm, đáp ứng yêu cầukích thước sản phẩm lớn hơn 200bp

4.1.3 Kết quả kiểm tra đặc hiệu trên Primer Blast

o Kiểm tra đặc hiệu mồi trên Primer Blast 12

Đặc hiệu Brucella abortus

Không đặc hiệu Brucella abortus

14

Hình 4.3.Kết quả kiểm tra đặc hiệu trên Primer Blast Đỏ : loài Brucella melitensis; cam: Brucella pinnipedialis; xanh : Brucella suis; tím : Brucella canis; đen : Brucella inopinata;xám : brucella ceti, vàng : Brucella ovis; hồng : Brucella pseudintermedia; xanh lá :Brucella intermedia; khoảng màu cam: đặc hiệu; khoảng trắng : các loài khác Brucellaabortus

o Kiểm tra chéo độ đặc hiệu primer cho Clostridium và Bacillus

Hình 4.4 Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu với Clostridium

Hình 4.5.Kết quả kiểm tra đặc hiệu với Bacillus

16

Từ các kết quả thu được sau khi kiểm tra đặc hiệu nhận thấy cặp primer 1 chưa

có sự đặc hiệu tốt nhất cho loài Brucella abortus Xuất hiện kết quả bắt cặp cho cả cácloài khác trong chi Brucella như Brucella melitensis; Brucella pinnipedialis; Brucella

suis; Brucella canis; Brucella inopinata; Brucella ceti, Brucella ovis; Brucellapseudintermedia; Brucella intermedia thể hiện qua khoảng trắng trên hình Kết quả

kiểm tra chéo nhận thấy cặp primer không đặc hiệu với Clostridium nhưng lại cho kết

quả tương ứng với chi Bacillus và loài Bacillus sonorensis

Kết luận: Cặp primer 1 không có độ đặc hiệu cao cho loài Brucella abortus, chưa

có sự đặc hiệu cho chi Brucella; cần được chỉnh sửa, tìm kiếm để có thể thu được cặpprimer đặc hiệu tốt hơn

4.2 Cặp primer 2 4.2.1 Trình tự

Primer forward: 5'-TATGCGAATTACCTGCGACC-3'Primer reverse : 5'-CTTAACAGGTTTCGCACACAG-3'

Hình 4.6.Kết quả trình tự cặp primer 2

Bảng 4.2 Các thông số cần quan tâm của cặp primer 2

Primer forwardPrimer reverse

Qua các giá trị thông số thu được cặp primer đáp ứng các tiêu chí trong nguyêntắc thiết kế primer: có độ dài primer nằm trong khoảng 18 – 25 base, có nhiệt độ nóngchảy Tm nằm trong khoảng 50 – 65oC, không có sự chệnh lệch quá lớn giữa 2 giá trịTm của 2 primer Mật độ GC của primer forward là 50% không vượt khoảng giá trị tốiưu 50 – 60%, primer reverse có mật độ 47.62% nằm ngoài khoảng giá trị tuy nhiên giátrị lệch không quá lớn so với khoảng có thể xem xét điều chỉnh Không có sự lặp lạiquá 4 lần ở trình tự đơn hoặc đôi có thể tiến hành quy trình kiểm tra độ đặc hiệu tiếptheo.

4.2.2 Kết quả kiểm tra đặc hiệu trên Insilico PCR

Hình 4.7. Kết quả kiểm tra đặc hiệu cặp primer 2 trên Insilico PCR 1 - Brucellaabortus A13334; 2 - Brucella abortus S19; 3 - Brucella abortus bv 1 str 9-941; 4 - Brucellacanis ATCC 23365 chromosome I; 5 - Brucella canis HSK A52141; 6 - Brucella cetiTE10759-12; 7 - Brucella ceti TE28753-12; 8 - Brucella melitensis; 9 - Brucella melitensisATCC 23457; 10 - Brucella melitensis M28 chromosome; 11 - Brucella melitensis M5-90; 12- Brucella melitensis NI; 13 - Brucella melitensis biovar Abortus 2308; 14 - Brucella microtiCCM 4915; 15 - Brucella ovis ATCC 25840 chromosome I; 16 - Brucella pinnipedialisB2/94; 17 - Brucella suis 1330; 18 - Brucella suis 1330; 19 - Brucella suis ATCC 23445; 20 -Brucella suis VBI22.

18

Kết quả kiểm tra của cặp primer trên Insilico PCR cho thấy cặp primer chỉ xuất

hiện band có kích thước 209bp ở các vị trí 1 - Brucella abortus A13334; 2 - Brucella

abortus S19; 3 - Brucella abortus bv 1 str 9-941 và 13 - Brucella melitensis biovarAbortus 2308 (Brucella abortus 2308), tất cả đều thuộc loài Brucella abortus, cặp

primer bước đầu kiểm tra có sự đặc hiệu đặc hiệu cho loài cần tìm, đáp ứng yêu cầukích thước sản phẩm lớn hơn 200bp

4.2.3 Kết quả kiểm tra đặc hiệu trên Primer Blast

o Kiểm tra đặc hiệu của cặp Primer Blast

Hình 4.8.Kết quả kiểm tra đặc hiệu trên Primer Blast Đỏ : loài Brucella melitensis;

cam : Brucella pinnipedialis; xanh : Brucella suis; tím : Brucella canis; đen :Brucella inopinata; xám : brucella ceti, vàng : Brucella ovis; hồng : Brucellapseudintermedia; xanh lá : Brucella intermedia

o Kiểm tra chéo độ đặc hiệu của primer với Clostridium và Bacillus