Ở người và động vật, việc phát hiện bệnh brucellosis ởcấp độ phân tử là rất quan trọng để đáp ứng các mục tiêu dịch tễ học và phòng ngừa.Ứng dụng sinh tin học trong việc thiết kế primer
TỔNG QUAN VỀ BRUCELLA ABORTUS
Brucella abortus
Brucella spp là một chi vi khuẩn gram âm, được đặt theo tên của Thiếu tướng
David Bruce, người đã phân lập B melitensis từ những người lính Anh đã chết vì sốt Malta Nó bao gồm ít nhất mười loài có đặc điểm di truyền rất giống nhau, mặc dù mỗi loài có đặc tính vật chủ hơi khác nhau
Vi khuẩn Brucella có hình cầu hoặc bầu dục ngắn, kích thước khoảng 0,5 - 1,0 μm Brucella có cấu trúc màng tế bào gram âm điển hình, với lớp peptidoglycan dày và lớp màng ngoài lipopolysaccharide (LPS) Chúng là vi khuẩn nội bào bắt buộc, có nghĩa là chúng chỉ có thể sinh trưởng và phát triển bên trong tế bào vật chủ Brucella có khả năng xâm nhập và sinh sống trong nhiều loại tế bào khác nhau của cơ thể vật chủ, bao gồm tế bào bạch cầu, tế bào gan, tế bào sinh sản,
Brucella abortus là một trong bốn loài vi khuẩn Brucella chính gây bệnh ở người Loại vi khuẩn này lây truyền qua đường tiêu hóa khi người tiếp xúc với thực phẩm, sữa hoặc thịt động vật bị nhiễm bệnh Ngoài ra, vi khuẩn này còn có thể lây truyền qua đường hô hấp khi tiếp xúc với dịch tiết của động vật bị bệnh.
Thiệt hại gây ra
Bệnh brucellosis do Brucella abortus gây ra phổ biến ở nhiều nơi trên thế giới, đặc biệt là ở các khu vực chăn nuôi gia súc Brucellosis lây truyền qua tiếp xúc gần gũi với máu, phân, nước tiểu và nhau thai của vật chủ bị nhiễm bệnh hoặc qua hít phải bụi,
Hình 2.1 Hình ảnh Brucella abortus quan sát được dưới kính hiển vi khí dung bị ô nhiễm Thiệt hại kinh tế do nhiễm trùng gây ra bởi Brucella là khá đáng kể đối với chủ sở hữu vật nuôi được thuần hóa Ở người, việc tiếp xúc có thể dẫn đến tình trạng viêm cấp tính ở nhiều cơ quan và các triệu chứng giống cúm Brucella abortus chủ yếu liên quan đến gia súc Tuy nhiên, nhiễm trùng có thể xảy ra ở cừu, dê, lợn, bò rừng, trâu, ngựa, nai sừng tấm và nhiều loài động vật khác Bệnh có thể lây từ động vật hoang dã sang đàn gia súc Cũng có mối lo ngại tiềm ẩn về việc sử dụng Brucella làm vũ khí khủng bố sinh học Tiêm phòng cho động vật, đặc biệt là ở các vùng lưu hành bệnh là cách kinh tế và quan trọng nhất để kiểm soát và loại trừ bệnh brucellosis Điều này cũng sẽ giảm thiểu khả năng lây nhiễm ở người
Hiện tại không có loại vắc-xin nào được phê duyệt chống nhiễm trùng ở người và việc sử dụng vắc xin động vật ở người có những hạn chế nghiêm trọng Nhiều nghiên cứu đã tập trung vào việc phát triển các loại vắc xin hiệu quả cho gia súc, một số ít sử dụng vắc xin sống giảm độc lực Tuy nhiên, hiệu lực và hiệu quả của các loại vắc xin này tương đối kém do có nhiều nhược điểm, bao gồm: cản trở xét nghiệm chẩn đoán bằng cách tạo ra kháng thể kháng LPS, có độc lực đối với người, gây nhiễm trùng dai dẳng ở động vật được tiêm phòng, có nguy cơ đảo ngược độc lực, tiết dịch. vào sữa, gây sẩy thai ở động vật mang thai dù chỉ với một liều duy nhất và không có tác dụng bảo vệ lâu dài.
QUY TRÌNH THỰC HIỆN
Bước 1: Vào NCBI Protein (ncbi.nlm.nih.gov/protein), dùng từ khóa
“hypothetical protein + tên loài chỉ định” để tìm kiếm Chỉ chọn những protein có chiều dài trong khoảng từ 90 - 150 amino acid.
Bước 2: Tiến hành Run BLAST - blastp (protein-protein BLAST).
Bước 3: Sau khi có kết quả BLAST, chọn trình tự sắp xếp tương đồng cao nhất với đối tượng.
Bước 4: Vào Identical Proteins của trình tự đã chọn, ưu tiên chọn những
CDS Region in Nucleotide theo chiều âm (-) và lấy FASTA.
Bước 4: Lấy trình tự FASTA dán vào Primer3web, đặt điều kiện giới hạn độ dài đoạn dùng để thiết kế tùy thuộc vào độ dài trình tự Nhấn Pick Primer để tiến hành thiết kế primer.
>NC_006933.1:c1079012-1078668 Brucella abortus bv 1 str 9-941 chromosome II, complete sequence
ATGTATCAGTTGCGCTACGAAGATGTCATGAATGACGATATGGCGAGCGC CAAGGAACGCGAGCGGATGCTTTTCGACCGCTCCATTGCGATGCTCGAAG CGGCGAGGGCAAATGGAGCCGAATCGCGCGAGGGGATCGATGCTGCCTAT TTCACTTCAAAACTCTGGACGACGATCATCGATGATCTGGGATCGGAGGA AAACGCCCTGCCGAAAGAATTGCGGGCGGCGATCATTTCCATCGGCATCTT CGTGCTGAAGGAGATTGAACGTATCCGCCAGGGTGAGAGCAATGATTATG CAACGCTCATCGAGATCACCCAGTCGATTCGGGACGGGCTTTGA
>AM040264.1:c47059-46781 Brucella melitensis biovar Abortus 2308 chromosome I, complete sequence, strain 2308
ATGACACTAAATTTTTACTATAAATTGAATAAAGTTTTATGCGAATTACCT GCGACCCGGAACATAAAAAAGCGCCCCGGAAATATCCGGGGCGCCACGCG GCTTTTGGGGGGAGAGAGGGGGATAAAGCCGCGATGCCGGGCCGTCAGGC CAGTTATTGGCAAAACCCGTCTTGCGGGAACAAGGCCGCCGGAGCACTTTT TATCTCAAAAGTGTCCGGCCTTGCTGTGTGCGAAACCTGTTAAGGCACTGA TCTCATTGAGACCAAATGCGCATTAA
>AM040264.1:c1350660-1350379 Brucella melitensis biovar Abortus 2308 chromosome I, complete sequence, strain 2308
TTGCTTGCCCGGCGCCGCCGGGCGGGTGATCGAAAAGGTCCGCAACCACA ATCAGCGATGTTTCGGCTTCAGGGCCTTATGAAACAGGAAGCTGATCCGAT GGTCGGGTTCCAATTAAATCGAAAAGAGGGGGCGCTCCTTGCGTCCCCTTT TATCCTCGGCGTTTTATGCTGGGTCTGGTCGCCAATATATAGCGAACAAAA AGAACCCAAATTCTACGTCATGTTTTTTGTTTCGTGCGCTTCGGGGAACAA AACAATTGCGAATATCTTTATTCCATAG
Bước 5: Kiểm tra cặp primer vừa thiết kế: tỉ lệ bắt cặp, tỉ lệ phần trăm GC, nhiệt độ chênh lệch, chiều kẹp tóc Nếu các chỉ số này đều nằm trong khoảng cho phép, tiến hành vào In silico PCR Amplification để kiểm tra tính chuyên biệt.
Chọn APPLY TO ALL Brucella để kiểm tra cho tất cả các loài thuộc chiBrucella.
Bước 6: Với kết quả kiểm tra trên In silico cho ra primer chuyên biệt với loài mục tiêu, tiếp tục kiểm tra chéo trên Primer-BLAST.
Database chọn “nr” để web kiểm tra ngẫu nhiên thay vì một loài hoặc chi nào đó, đồng thời xóa dữ liệu ở ô Organism Sau đó nhấn Get Primers.
KẾT QUẢ
Cặp primer 1
Primer forward: 5'-GTTGCGCTACGAAGATGTCA-3' Primer reverse : 5'-CGACTGGGTGATCTCGATGA-3'
Hình 4.1 Kết quả trình tự cặp primer Bảng 4.1 Các thông số cần quan tâm của cặp primer 1
Product size 345 bp Độ dài primer 20 base 20 base
Theo các thông số thu được, cặp primer đã đáp ứng các tiêu chuẩn thiết kế primer, bao gồm: độ dài trong khoảng 18-25 base, nhiệt độ nóng chảy Tm trong khoảng 50-65 độ C và không có chênh lệch lớn giữa hai giá trị Tm Mật độ GC của hai primer lần lượt là 50% và 55%, nằm trong khoảng tối ưu 50-60%, đồng thời không có trình tự lặp lại quá 4 lần ở trình tự đơn hoặc đôi Điều này cho phép tiến hành quy trình kiểm tra độ đặc hiệu tiếp theo.
4.1.2 Kết quả kiểm tra đặc hiệu trên Insilico PCR
Hình 4.2.Kết quả kiểm tra đặc hiệu cặp primer 1 trên Insilico PCR 1 - Brucella abortus A13334; 2 - Brucella abortus S19; 3 - Brucella abortus bv 1 str 9-941; 4 - Brucella canis ATCC 23365 chromosome I; 5 - Brucella canis HSK A52141; 6 - Brucella ceti TE10759-12;
7 - Brucella ceti TE28753-12; 8 - Brucella melitensis; 9 - Brucella melitensis ATCC 23457;
10 - Brucella melitensis M28 chromosome; 11 - Brucella melitensis M5-90; 12 - Brucella melitensis NI; 13 - Brucella melitensis biovar Abortus 2308; 14 - Brucella microti CCM 4915; 15 - Brucella ovis ATCC 25840 chromosome I; 16 - Brucella pinnipedialis B2/94; 17 - Brucella suis 1330; 18 - Brucella suis 1330; 19 - Brucella suis ATCC 23445; 20 - Brucella suis VBI22
Kết quả kiểm tra của cặp primer trên Insilico PCR cho thấy cặp primer chỉ xuất hiện band có kích thước 345bp ở các vị trí 1 - Brucella abortus A13334; 2 - Brucella abortus S19; 3 - Brucella abortus bv 1 str 9-941 và 13 - Brucella melitensis biovar Abortus 2308 (Brucella abortus 2308), tất cả đều thuộc loài Brucella abortus, cặp primer bước đầu kiểm tra có sự đặc hiệu đặc hiệu cho loài cần tìm, đáp ứng yêu cầu kích thước sản phẩm lớn hơn 200bp
4.1.3 Kết quả kiểm tra đặc hiệu trên Primer Blast o Kiểm tra đặc hiệu mồi trên Primer Blast
Không đặc hiệu Brucella abortus
Hình 4.3.Kết quả kiểm tra đặc hiệu trên Primer Blast Đỏ : loài Brucella melitensis; cam : Brucella pinnipedialis; xanh : Brucella suis; tím : Brucella canis; đen : Brucella inopinata; xám : brucella ceti, vàng : Brucella ovis; hồng : Brucella pseudintermedia; xanh lá : Brucella intermedia; khoảng màu cam: đặc hiệu; khoảng trắng : các loài khác Brucella abortus o Kiểm tra chéo độ đặc hiệu primer cho Clostridium và Bacillus
Hình 4.4 Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu với Clostridium
Hình 4.5.Kết quả kiểm tra đặc hiệu với Bacillus
Từ các kết quả thu được sau khi kiểm tra đặc hiệu nhận thấy cặp primer 1 chưa có sự đặc hiệu tốt nhất cho loài Brucella abortus Xuất hiện kết quả bắt cặp cho cả các loài khác trong chi Brucella như Brucella melitensis; Brucella pinnipedialis; Brucella suis; Brucella canis; Brucella inopinata; Brucella ceti, Brucella ovis; Brucella pseudintermedia; Brucella intermedia thể hiện qua khoảng trắng trên hình Kết quả kiểm tra chéo nhận thấy cặp primer không đặc hiệu với Clostridium nhưng lại cho kết quả tương ứng với chi Bacillus và loài Bacillus sonorensis
Kết luận: Cặp primer 1 không có độ đặc hiệu cao cho loài Brucella abortus, chưa có sự đặc hiệu cho chi Brucella; cần được chỉnh sửa, tìm kiếm để có thể thu được cặp primer đặc hiệu tốt hơn.
Cặp primer 2
Primer forward: 5'-TATGCGAATTACCTGCGACC-3' Primer reverse : 5'-CTTAACAGGTTTCGCACACAG-3'
Hình 4.6.Kết quả trình tự cặp primer 2
Bảng 4.2 Các thông số cần quan tâm của cặp primer 2
Product size 209 bp Độ dài primer 20 base 21 base
Qua các giá trị thông số thu được cặp primer đáp ứng các tiêu chí trong nguyên tắc thiết kế primer: có độ dài primer nằm trong khoảng 18 – 25 base, có nhiệt độ nóng chảy Tm nằm trong khoảng 50 – 65 o C, không có sự chệnh lệch quá lớn giữa 2 giá trị Tm của 2 primer Mật độ GC của primer forward là 50% không vượt khoảng giá trị tối ưu 50 – 60%, primer reverse có mật độ 47.62% nằm ngoài khoảng giá trị tuy nhiên giá trị lệch không quá lớn so với khoảng có thể xem xét điều chỉnh Không có sự lặp lại quá 4 lần ở trình tự đơn hoặc đôi có thể tiến hành quy trình kiểm tra độ đặc hiệu tiếp theo.
4.2.2 Kết quả kiểm tra đặc hiệu trên Insilico PCR
Hình 4.7 Kết quả kiểm tra đặc hiệu cặp primer 2 trên Insilico PCR 1 - Brucella abortus A13334; 2 - Brucella abortus S19; 3 - Brucella abortus bv 1 str 9-941; 4 - Brucella canis ATCC 23365 chromosome I; 5 - Brucella canis HSK A52141; 6 - Brucella ceti TE10759-12; 7 - Brucella ceti TE28753-12; 8 - Brucella melitensis; 9 - Brucella melitensis ATCC 23457; 10 - Brucella melitensis M28 chromosome; 11 - Brucella melitensis M5-90; 12 - Brucella melitensis NI; 13 - Brucella melitensis biovar Abortus 2308; 14 - Brucella microti CCM 4915; 15 - Brucella ovis ATCC 25840 chromosome I; 16 - Brucella pinnipedialis B2/94; 17 - Brucella suis 1330; 18 - Brucella suis 1330; 19 - Brucella suis ATCC 23445; 20 - Brucella suis VBI22.
Kết quả kiểm tra của cặp primer trên Insilico PCR cho thấy cặp primer chỉ xuất hiện band có kích thước 209bp ở các vị trí 1 - Brucella abortus A13334; 2 - Brucella abortus S19; 3 - Brucella abortus bv 1 str 9-941 và 13 - Brucella melitensis biovar Abortus 2308 (Brucella abortus 2308), tất cả đều thuộc loài Brucella abortus, cặp primer bước đầu kiểm tra có sự đặc hiệu đặc hiệu cho loài cần tìm, đáp ứng yêu cầu kích thước sản phẩm lớn hơn 200bp
4.2.3 Kết quả kiểm tra đặc hiệu trên Primer Blast o Kiểm tra đặc hiệu của cặp Primer Blast
Hình 4.8.Kết quả kiểm tra đặc hiệu trên Primer Blast Đỏ : loài Brucella melitensis; cam : Brucella pinnipedialis; xanh : Brucella suis; tím : Brucella canis; đen : Brucella inopinata; xám : brucella ceti, vàng : Brucella ovis; hồng : Brucella pseudintermedia; xanh lá : Brucella intermedia o Kiểm tra chéo độ đặc hiệu của primer với Clostridium và Bacillus
Hình 4.9 Kết quả kiểm tra đặc hiệu với Bacillus
Hình 4.10 Kết quả kiểm tra đặc hiệu với Clostridium
Từ các kết quả thu được sau khi kiểm tra đặc hiệu nhận thấy cặp primer 2 chưa có sự đặc hiệu tốt nhất cho loài Brucella abortus Xuất hiện kết quả bắt cặp cho cả các loài khác trong chi Brucella như Brucella melitensis; Brucella pinnipedialis; Brucella suis; Brucella canis; Brucella inopinata; Brucella ceti, Brucella ovis; Brucella pseudintermedia; Brucella intermedia thể hiện qua khoảng trắng trên hình, không có sự xuất hiện của các loài khác thuộc chi khác.
Kết quả kiểm tra chéo nhận thấy cặp primer không đặc hiệu với Clostridium và Bacillus.
Kết luận: Cặp primer 2 có độ đặc hiệu chưa cao cho loài Brucella abortus, tuy nhiên có sự đặc hiệu cho các loài thuộc chi Brucella; có thể xem xét kiểm tra kỹ hơn để sử dụng cho chi Brucella thay cho loài Brucella abortus
Cặp primer 3
Primer forward: 5-TGATCGAAAAGGTCCGCAAC-3 Primer reverse: 5-CGCAATTGTTTTGTTCCCCG-3
Hình 4.11.Kết quả trình tự cặp primer 3
Bảng 4.3 Các thông số cần quan tâm của cặp primer 3
Product size 238 bp Độ dài primer 20 base 20 base
Qua các thông số, cặp primer đáp ứng các tiêu chí thiết kế primer: độ dài 18-25 base, nhiệt độ nóng chảy 50-65 độ C, chênh lệch nhỏ giữa Tm của 2 primer Mật độ GC của cả 2 primer là 50%, nằm trong phạm vi 50-60% Trình tự đơn hoặc đôi lặp lại không quá 4 lần, đủ điều kiện để kiểm tra độ đặc hiệu.
4.3.2 Kết quả kiểm tra đặc hiệu trên Insilico PCR
Hình 4.12 Kết quả kiểm tra đặc hiệu cặp primer 3 trên Insilico PCR 1 - Brucella abortus A13334; 2 - Brucella abortus S19; 3 - Brucella abortus bv 1 str 9-941; 4 - Brucella canis ATCC 23365 chromosome I; 5 - Brucella canis HSK A52141; 6 - Brucella ceti TE10759-12; 7 - Brucella ceti TE28753-12; 8 - Brucella melitensis; 9 - Brucella melitensis ATCC 23457; 10 - Brucella melitensis M28 chromosome; 11 - Brucella melitensis M5-90; 12 - Brucella melitensis NI; 13 - Brucella melitensis biovar Abortus 2308; 14 - Brucella microti CCM 4915; 15 - Brucella ovis ATCC 25840 chromosome I; 16 - Brucella pinnipedialis B2/94; 17 - Brucella suis 1330; 18 - Brucella suis 1330; 19 - Brucella suis ATCC 23445; 20 - Brucella suis VBI22.
Kết quả kiểm tra của cặp primer trên Insilico PCR cho thấy cặp primer chỉ xuất hiện band có kích thước 238bp ở các vị trí 1 - Brucella abortus A13334; 2 - Brucella abortus S19; 3 - Brucella abortus bv 1 str 9-941 và 13 - Brucella melitensis biovar
Abortus 2308 (Brucella abortus 2308), tất cả đều thuộc loài Brucella abortus, cặp primer bước đầu kiểm tra có sự đặc hiệu đặc hiệu cho loài cần tìm, đáp ứng yêu cầu kích thước sản phẩm lớn hơn 200bp
4.3.3 Kết quả kiểm tra đặc hiệu trên Primer Blast o Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu trên Primer Blast
Hình 4.13.Kết quả kiểm tra đặc hiệu trên Primer Blast Đỏ : loài Brucella melitensis; cam : Brucella pinnipedialis; xanh : Brucella suis; tím : Brucella canis; đen : Brucella inopinata; xám : brucella ceti, vàng : Brucella ovis; hồng : Brucella pseudintermedia; xanh lá : Brucella intermedia o Kết quả kiểm tra chéo với Clostridium và Bacillus
Hình 4.14 Kết quả kiểm tra đặc hiệu với Clostridium
