báo cáo bài tập thực hành nhóm 13

QUY TRÌNH THIẾT KẾ PRIMER ĐẶC HIỆU CHO VI KHUẨN Brucella suis 1.1.. Tất cả các loài Brucella đều gây nhiễm trùng ở các nhóm động vật cụ thể dẫn đến các bệnh tương tự.. Những vi khuẩn này

BÁO CÁO THỰC HÀNH QUY TRÌNH THIẾT KẾ PRIMER CHO VI KHUẨN

Brucella suis

Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Môn học : SINH TIN HỌC

Nhóm thực hiện : NHÓM 13- THỨ 3- CA 3 Niên khóa : 2021-2025

TP Thủ Đức, 06/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH QUY TRÌNH THIẾT KẾ PRIMER CHO VI KHUẨN

Brucella suis

Giảng viên hướng dẫn Nhóm sinh viên thực hiện

DƯƠNG VÕ PHƯƠNG NGÂN ĐẶNG THỊ BẢO QUYÊN

TP Thủ Đức, 06/2024

DANH SÁCH THÀNH VIÊN NHÓM 13

STT Họ và tên MSSV Chữ ký xác nhận

MỤC LỤC

Trang

QUY TRÌNH THIẾT KẾ PRIMER ĐẶC HIỆU CHO VI KHUẨN Brucella suis 1

1.1 Tổng quan Brucella suis 1

1.2 Triệu chứng nhiễm bệnh của heo 1

2.1 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2

2.2 Các bước tiến hành 2

3.1 Kết quả cặp primer khuếch đại DNA vi khuẩn Brucella suis 8

3.1.1 Cặp Primer 1 8

3.1.2 Cặp primer 2 9

4.1 Thảo luận 11

TÀI LIỆU THAM KHẢO 12

i

QUY TRÌNH THIẾT KẾ PRIMER ĐẶC HIỆU CHO

VI KHUẨN Brucella suis

1.1 Tổng quan Brucella suis

Bệnh Brucellosis là một nhóm bệnh do các loài vi khuẩn gây ra thuộc chi

Brucella Chi Brucella là một chi vi khuẩn gram âm, không di động, có hình que Các loài trong chi này gây bệnh Brucellosis ở nhiều loài động vật có vú Chi Brucella có

bộ gen dài khoảng 3,2 M nucleotide được phân chia trên hai nhiễm sắc thể tròn

Tất cả các loài Brucella đều gây nhiễm trùng ở các nhóm động vật cụ thể dẫn đến các bệnh tương tự Sự khác biệt giữa các vi khuẩn trong chi này có thể được tìm thấy ở

các gen mã hóa bề mặt protein bị phơi nhiễm Brucella suis lây nhiễm ở lợn, trong khi Brucella melitensis lây nhiễm cho dê và lạc đà Brucella canis lây nhiễm cho chó

Những vi khuẩn này cũng có khả năng lây nhiễm sang người và có thể lây truyền qua đường hô hấp chất thải động vật bị nhiễm bệnh, tiếp xúc trực tiếp với vết thương

hở hoặc nuốt phải các nhóm thực phẩm bị ô nhiễm như sữa chưa tiệt trùng Ở người, nhiễm Brucella có thể dẫn đến đau đầu, mệt mỏi, sốt, đổ mồ hôi, sụt cân và đau cơ Con người

nhiễm trùng có thể được điều trị bằng một đợt kháng sinh kết hợp để ngăn ngừa các triệu chứng

Hình 1.1 Vi khuẩn Brucella suis.

1.2 Triệu chứng nhiễm bệnh của heo

Nhiễm Brucella suis ở lợn có thể gây ra các dấu hiệu lâm sàng Heo con yếu ớt

hoặc chết non, sảy thai, viêm tinh hoàn, đi khập khiễng và liệt nửa sau do viêm khớp

C

Các tổn thương liên quan có thể bao gồm viêm nhau thai, viêm túi tinh, viêm mào tinh hoàn, viêm khớp và áp xe các mô khác nhau Sự lây truyền ở lợn thường xảy ra qua đường hoa liễu cũng như do tiếp xúc với bào thai bị sẩy hoặc các sản phẩm khác của quá trình sinh nở

Nhiễm trùng Brucella suis ở người và các loài khác có thể xảy ra qua đường khí

dung và đường uống, cũng như qua các vết nứt ở lớp biểu bì và có thể nghiêm trọng

Có một số báo cáo về việc Brucella suis bị các công nhân lò mổ và thợ săn lây nhiễm

khi giết mổ hoặc pha chế lợn bị nhiễm bệnh trên đồng ruông

Vậy nên, việc thiết kế primer đặc hiệu cho Brucella suis để xác định mẫu vi sinh

vật gây bệnh là điều cấp thiết để đưa ra hướng giải quyết đúng mục tiêu

2.1 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Kết hợp các cơ sở dữ liệu sinh học lớn trên thế giới và các công cụ tìm kiếm, bao gồm:

Cơ sở dữ liệu NCBI – National Center for Biotechnology Information

-http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

Primer3plus - https://www.primer3plus.com/

In silico PCR amplification - http://insilico.ehu.es/PCR/

Primer BLAST NCBI - https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

2.2 Các bước tiến hành

Bước 1: Truy cập dữ liệu trang NCBI, ở mục dữ liệu chọn protein, sau đó nhập tên

loài vi khuẩn cần tìm: Hypothetical protein Brucella suis sau đó nhấn Search.

2

Bước 2: Chọn các axit amin trong khoảng 90 đến 200 axit amin để tiến hành thiết kế

primer để tìm Primer đặc hiệu (Do trong khoảng rộng hơn 90 - 200 nhóm chưa tìm được primer đặc hiệu và lượng dữ liệu quá rộng nên chia nhỏ các khoảng axit amin để tiềm kiếm, tiếp đến sẽ mở rộng khoảng dữ liệu

Những đoạn gen có thể được lựa chọn để thiết kế Primer đặc hiệu cho vi khuẩn

đó là những đoạn gen sau kiểm tra cho kết quả so sánh trình tự tương đồng cao với vi

khuẩn Brucella suis.

Bước 3: Click vào các trình tự lựa chọn phù hợp trong khoảng 90-150 axit amin và

nhấn Run Blast, nhấn Blast Để kiểm tra trình tự có trùng với các loài khác không trước khi thực hiện các thao tác khác

Bước 4: Sau khi kiểm tra nhận thấy trình tự chuyên biệt cho Brucella suis thì Click

Accession

Bước 5 Click Identical Protein  INSDC (Ưu tiên dữ liệu theo chiều âm từ chiều 5’

đến 3’)

4

Bước 6: Click chọn FASTA để copy trình tự đã tìm

Bước 7: Copy trình tự vừa tìm dán vào Primer3Plus tiến hành thiểt kế primer chọn

Pick Primer

Bước 8: Lựa chon primer tránh trường hợp kẹp tóc, bắt cặp và kiểm tra nhiệt độ nóng

chảy, tỷ lệ GC

6

Bước 9: Sau khi có các cặp Primer ta vào trang wed “In silico PCR amplification” để

kiểm tra khả năng bắt cặp và độ đặc hiệu của Primer: Chọn “Brucella” sau đó “Next

step”, copy cặp primer phù hợp Chọn Apply to all Brucella và nhấn Amplify

Bước 10: Nếu xuất hiện band ta tiếp tục kiểm tra xem độ dài của mẫu có trùng khớp

với độ dài của Primer ban đầu hay không (dựa vào các số nhỏ hiển thị bên dưới >200), tiếp tục Blast primer trên NCBI để kiểm tra độ đặc hiệu của cặp Primer

Bước 11: Nếu các mẫu có độ đặc hiệu cao với đối tượng quan tâm, ghi nhận lại trình

tự primer vừa thu được

3.1 Kết quả cặp primer khuếch đại DNA vi khuẩn Brucella suis

3.1.1 Cặp Primer 1

Có Accession là AQNV01000001.1, Protein product ENR22165.1 và chiều dài

là 91 axit amin

8

Bảng 3.1 Thông số primer thứ 1

Chiều dài Tm

o C Tỷ lệ GC% Trình tự Left

primer 20bp 59,3 55%

5’ GCATGAACATACCCAGCGTC 3’

Right

primer 20bp 59,9 55% 5’ CCGCTTCGTTCGATCTGAGA 3’

3.1.2 Cặp primer 2

Có Accession là AHN47095, Protein product AHN47095.1 và chiều dài là 150 axit amin

Bảng 3.2 Thông số primer thứ 2

Chiều dài Tm

o C Tỷ lệ GC% Trình tự Left

primer 18bp 62,7 66,7%

5’ TGCTTCGCCAGGAGATTTCC 3’

Right

primer 18bp 60,4 66,7% 5’ CTGCCCGGGTAAAGTCCATT 3’

10

4.1 Thảo luận

Kết quả nhóm tìm được 2 cặp primer chuyên biệt với vi khuẩn Brucella suis

trong khoảng 90-150 axit amin Đối với cặp primer thứ 1,2, khi kiểm tra trên In silico

độ dài đoạn primer trên 200 và hiện band 1 và 3 band trong khoảng 17 – 19 dữ liệu

trên In silico là thuộc loài Brucella suis

So sánh với các kết quả nghiên cứu trước đây theo tác giả Bricker BJ và ctv (1994) xét nghiệm PCR bao gồm năm mồi oligonucleotide có thể xác định biovar của

bốn loài Brucella Các biovar riêng lẻ trong một loài không có sự khác biệt Xét

nghiệm khai thác tính đa hình phát sinh từ việc định vị loài cụ thể của yếu tố di truyền

IS711 trong nhiễm sắc thể Brucella Danh tính được xác định bởi (các) kích thước của

(các) sản phẩm được khuếch đại từ các mồi lai ở các khoảng cách khác nhau tính từ phần tử

Việc lựa chọn primer phù hợp sẽ phụ thuộc vào mục đích sử dụng Ví dụ, nếu cần độ nhạy cao, primer IS711 hoặc bvrB có thể được sử dụng Nếu cần độ đặc hiệu cao, primer IS711 có thể được ưu tiên hơn

Các xét nghiệm dựa trên primer cần được kết hợp với các phương pháp chẩn đoán khác để xác nhận kết quả

Đề nghị mở rộng khoảng axit amin, kiểm tra vùng IS711 và bvrB để tìm kiếm thêm các cặp primer chuyên biệt khác

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Bricker BJ, Halling SM. 1994. Differentiation of Brucella abortus bv 1, 2, and 4, Brucella melitensis, Brucella ovis, and Brucella suis bv 1 by PCR J Clin Microbiol 32:

https://doi.org/10.1128/jcm.32.11.2660-2666.1994

2 TCVN: 2018 do Chi cục Thú y vùng II - Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học

và Công nghệ công bố

3 Cabicompendium.68584, CABI Compendium, doi:10.1079/cabicompendium.68584, CABI International, brucellosis (Brucella suis), (2022)

12