BÁO CÁO THỰC HÀNH
QUY TRÌNH THIẾT KẾ PRIMER CHO VI KHUẨN
Brucella suis
Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Môn học : SINH TIN HỌC
Nhóm thực hiện : NHÓM 13- THỨ 3- CA 3 Niên khóa : 2021-2025
TP Thủ Đức, 06/2024BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC
Trang 2BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC
BÁO CÁO THỰC HÀNH
QUY TRÌNH THIẾT KẾ PRIMER CHO VI KHUẨN
Brucella suis
Giảng viên hướng dẫn Nhóm sinh viên thực hiện
DƯƠNG VÕ PHƯƠNG NGÂN ĐẶNG THỊ BẢO QUYÊN
Trang 3TP Thủ Đức, 06/2024
DANH SÁCH THÀNH VIÊN NHÓM 13
STTHọ và tênMSSVChữ ký xác nhận
Trang 4MỤC LỤC
Trang
QUY TRÌNH THIẾT KẾ PRIMER ĐẶC HIỆU CHO VI KHUẨN Brucella suis 1
1.1 Tổng quan Brucella suis 1
1.2 Triệu chứng nhiễm bệnh của heo 1
2.1 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2
Trang 5QUY TRÌNH THIẾT KẾ PRIMER ĐẶC HIỆU CHO
VI KHUẨN Brucella suis
1.1 Tổng quan Brucella suis
Bệnh Brucellosis là một nhóm bệnh do các loài vi khuẩn gây ra thuộc chi
Brucella Chi Brucella là một chi vi khuẩn gram âm, không di động, có hình que Cácloài trong chi này gây bệnh Brucellosis ở nhiều loài động vật có vú Chi Brucella có
bộ gen dài khoảng 3,2 M nucleotide được phân chia trên hai nhiễm sắc thể tròn.
Tất cả các loài Brucella đều gây nhiễm trùng ở các nhóm động vật cụ thể dẫn đếncác bệnh tương tự Sự khác biệt giữa các vi khuẩn trong chi này có thể được tìm thấy ở
các gen mã hóa bề mặt protein bị phơi nhiễm Brucella suis lây nhiễm ở lợn, trong khiBrucella melitensis lây nhiễm cho dê và lạc đà Brucella canis lây nhiễm cho chó
Những vi khuẩn này cũng có khả năng lây nhiễm sang người và có thể lây truyềnqua đường hô hấp chất thải động vật bị nhiễm bệnh, tiếp xúc trực tiếp với vết thươnghở hoặc nuốt phải các nhóm thực phẩm bị ô nhiễm như sữa chưa tiệt trùng Ở người,nhiễm Brucella có thể dẫn đến đau đầu, mệt mỏi, sốt, đổ mồ hôi, sụt cân và đau cơ.Con người
nhiễm trùng có thể được điều trị bằng một đợt kháng sinh kết hợp để ngăn ngừa cáctriệu chứng.
Hình 1.1 Vi khuẩn Brucella suis.
1.2 Triệu chứng nhiễm bệnh của heo
Nhiễm Brucella suis ở lợn có thể gây ra các dấu hiệu lâm sàng Heo con yếu ớt
hoặc chết non, sảy thai, viêm tinh hoàn, đi khập khiễng và liệt nửa sau do viêm khớp.
C
Trang 6Các tổn thương liên quan có thể bao gồm viêm nhau thai, viêm túi tinh, viêm mào tinhhoàn, viêm khớp và áp xe các mô khác nhau Sự lây truyền ở lợn thường xảy ra quađường hoa liễu cũng như do tiếp xúc với bào thai bị sẩy hoặc các sản phẩm khác củaquá trình sinh nở
Nhiễm trùng Brucella suis ở người và các loài khác có thể xảy ra qua đường khí
dung và đường uống, cũng như qua các vết nứt ở lớp biểu bì và có thể nghiêm trọng.
Có một số báo cáo về việc Brucella suis bị các công nhân lò mổ và thợ săn lây nhiễm
khi giết mổ hoặc pha chế lợn bị nhiễm bệnh trên đồng ruông.
Vậy nên, việc thiết kế primer đặc hiệu cho Brucella suis để xác định mẫu vi sinh
vật gây bệnh là điều cấp thiết để đưa ra hướng giải quyết đúng mục tiêu.
2.1 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Kết hợp các cơ sở dữ liệu sinh học lớn trên thế giới và các công cụ tìm kiếm, baogồm:
Cơ sở dữ liệu NCBI – National Center for Biotechnology Information-http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
Primer3plus - https://www.primer3plus.com/
In silico PCR amplification - http://insilico.ehu.es/PCR/
Primer BLAST NCBI - https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
2.2 Các bước tiến hành
Bước 1: Truy cập dữ liệu trang NCBI, ở mục dữ liệu chọn protein, sau đó nhập tên
loài vi khuẩn cần tìm: Hypothetical protein Brucella suis sau đó nhấn Search.
2
Trang 7Bước 2: Chọn các axit amin trong khoảng 90 đến 200 axit amin để tiến hành thiết kế
primer để tìm Primer đặc hiệu (Do trong khoảng rộng hơn 90 - 200 nhóm chưa tìmđược primer đặc hiệu và lượng dữ liệu quá rộng nên chia nhỏ các khoảng axit amin đểtiềm kiếm, tiếp đến sẽ mở rộng khoảng dữ liệu.
Những đoạn gen có thể được lựa chọn để thiết kế Primer đặc hiệu cho vi khuẩnđó là những đoạn gen sau kiểm tra cho kết quả so sánh trình tự tương đồng cao với vi
khuẩn Brucella suis.
Trang 8Bước 3: Click vào các trình tự lựa chọn phù hợp trong khoảng 90-150 axit amin và
nhấn Run Blast, nhấn Blast Để kiểm tra trình tự có trùng với các loài khác khôngtrước khi thực hiện các thao tác khác.
Bước 4: Sau khi kiểm tra nhận thấy trình tự chuyên biệt cho Brucella suis thì Click
Bước 5 Click Identical Protein INSDC (Ưu tiên dữ liệu theo chiều âm từ chiều 5’
đến 3’)
4
Trang 9Bước 6: Click chọn FASTA để copy trình tự đã tìm
Bước 7: Copy trình tự vừa tìm dán vào Primer3Plus tiến hành thiểt kế primer chọn
Pick Primer
Trang 10Bước 8: Lựa chon primer tránh trường hợp kẹp tóc, bắt cặp và kiểm tra nhiệt độ nóng
chảy, tỷ lệ GC.
6
Trang 11Bước 9: Sau khi có các cặp Primer ta vào trang wed “In silico PCR amplification” để
kiểm tra khả năng bắt cặp và độ đặc hiệu của Primer: Chọn “Brucella” sau đó “Next
step”, copy cặp primer phù hợp Chọn Apply to all Brucella và nhấn Amplify
Bước 10: Nếu xuất hiện band ta tiếp tục kiểm tra xem độ dài của mẫu có trùng khớp
với độ dài của Primer ban đầu hay không (dựa vào các số nhỏ hiển thị bên dưới >200),tiếp tục Blast primer trên NCBI để kiểm tra độ đặc hiệu của cặp Primer.
Trang 12Bước 11: Nếu các mẫu có độ đặc hiệu cao với đối tượng quan tâm, ghi nhận lại trình
tự primer vừa thu được.
3.1 Kết quả cặp primer khuếch đại DNA vi khuẩn Brucella suis
3.1.1 Cặp Primer 1
Có Accession là AQNV01000001.1, Protein product ENR22165.1 và chiều dàilà 91 axit amin.
8
Trang 13Bảng 3.1 Thông số primer thứ 1Chiều
oCTỷ lệ
GC%Trình tựLeft
primer 20bp 59,3 55%
5’ GCATGAACATACCCAGCGTC 3’
Right
primer 20bp 59,9 55% 5’ CCGCTTCGTTCGATCTGAGA 3’3.1.2 Cặp primer 2
Có Accession là AHN47095, Protein product AHN47095.1 và chiều dài là 150axit amin.
Trang 14Bảng 3.2 Thông số primer thứ 2Chiều
oCTỷ lệ
GC%Trình tựLeft
Trang 154.1 Thảo luận
Kết quả nhóm tìm được 2 cặp primer chuyên biệt với vi khuẩn Brucella suis
trong khoảng 90-150 axit amin Đối với cặp primer thứ 1,2, khi kiểm tra trên In silicođộ dài đoạn primer trên 200 và hiện band 1 và 3 band trong khoảng 17 – 19 dữ liệu
trên In silico là thuộc loài Brucella suis
So sánh với các kết quả nghiên cứu trước đây theo tác giả Bricker BJ và ctv(1994) xét nghiệm PCR bao gồm năm mồi oligonucleotide có thể xác định biovar của
bốn loài Brucella Các biovar riêng lẻ trong một loài không có sự khác biệt Xét
nghiệm khai thác tính đa hình phát sinh từ việc định vị loài cụ thể của yếu tố di truyền
IS711 trong nhiễm sắc thể Brucella Danh tính được xác định bởi (các) kích thước của
(các) sản phẩm được khuếch đại từ các mồi lai ở các khoảng cách khác nhau tính từphần tử.
Việc lựa chọn primer phù hợp sẽ phụ thuộc vào mục đích sử dụng Ví dụ, nếucần độ nhạy cao, primer IS711 hoặc bvrB có thể được sử dụng Nếu cần độ đặc hiệucao, primer IS711 có thể được ưu tiên hơn.
Các xét nghiệm dựa trên primer cần được kết hợp với các phương pháp chẩnđoán khác để xác nhận kết quả.
Đề nghị mở rộng khoảng axit amin, kiểm tra vùng IS711 và bvrB để tìm kiếmthêm các cặp primer chuyên biệt khác.
.
Trang 16TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Bricker BJ, Halling SM. 1994. Differentiation of Brucella abortus bv 1, 2, and 4, Brucellamelitensis, Brucella ovis, and Brucella suis bv 1 by PCR J Clin Microbiol 32:
2 TCVN: 2018 do Chi cục Thú y vùng II - Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Pháttriển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa họcvà Công nghệ công bố.
3 Cabicompendium.68584, CABI Compendium, doi:10.1079/cabicompendium.68584, CABIInternational, brucellosis (Brucella suis), (2022)
12