Tiểu luận môn kỹ thuật phân tích sinh hoá tên Đề tài quang phổ hồng ngoại trong phân tích hợp chất sinh học

Sự hấp thụ bức xạ hồng ngoại và hình thành các đỉnh trên phổ IRBức xạ hồng ngoại có bước sóng dài hơn bước sóng khả kiến từ 0.5μm đến1000μm và nó có năng lượng yếu nên không có khả năng

BỘ CÔNG THƯƠNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG THƯƠNG TP.HỒ CHÍ MINH

KHOA SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG

TIỂU LUẬN MÔN: KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SINH HOÁ

TÊN ĐỀ TÀI: QUANG PHỔ HỒNG NGOẠI TRONG PHÂN TÍCH HỢP

MỤC LỤC

DANH MỤC HÌNH ii

DANH MỤC BẢNG iii

1 Sự hấp thụ bức xạ hồng ngoại và hình thành các đỉnh trên phổ IR 1

2 Ứng dụng của phổ hồng ngoại 3

2.1 Trong kỹ thuật phân tích 3

2.2 Trong phân tích các hợp chất sinh học 5

2.2.1 Protein và amino acid 5

2.2.2 Một số hợp chất có hoạt tính sinh học 8

3 Máy quang phổ hồng ngoại và một số chú ý khi đo 10

3.1 Máy quang phổ hồng ngoại 10

3.2 Chuẩn bị mẫu đo quang phổ IR 14

3.3 Một số chú ý khi ghi và xử lý phổ IR 15

KẾT LUẬN 16

TÀI LIỆU THAM KHẢO 17

DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Phổ điện từ 1 Hình 1.2 Các kiểu dao động chính của phân tử khi có sự kích thích của bức xạ hồng ngoại 2

Hình 2.1 Quá trình phân tích định lượng bằng phương pháp quang phổ hồng ngoại 4

Hình 2.2 Ứng dụng phổ hồng ngoại trong phương pháp định tính qua việc so sánh phổ với chất chuẩn 5 Hình 2.3 Cấu tạo chung của amino acid 5 Hình 2.4 Dao động rung đặc trưng loại I và II của hai liên kết peptide 7

Hình 2.5 Phổ hồng ngoại của chitosan, pectin và chitosan trộn pectin trong

nghiên cứu màng bao tổng hợp từ Cyclea Barbata Miers 10

Hình 3.1 Sơ đồ cấu tạo của hệ thống máy đo phổ hồng ngoại 12 Hình 3.2 Giao thoa kế Michelson của máy quang phổ FTIR 13

1 Sự hấp thụ bức xạ hồng ngoại và hình thành các đỉnh trên phổ IR

Bức xạ hồng ngoại có bước sóng dài hơn bước sóng khả kiến từ 0.5μm đến1000μm và nó có năng lượng yếu nên không có khả năng để khích thích E, chỉ làcho phân tử co dãn hay quay quanh trục điều đó cho ta biết thông tin nhóm chứchiện diện trong phân tử Đặt tính về mặt hóa lí, lượng tử, bản chất của 1 sự quay haychuyển động của phân tử có tính lượng tử vì vật chất luôn có tính song hạt, sóng hạtcàng nhỏ thì tính sóng hạt thể hiện càng lớn Lượng tử hóa (quantization) là quátrình chuyển đổi từ một quan niệm cổ điển của hiện tượng vật lý sang một quanniệm mới hơn được biết đến trong cơ học lượng tử Nó là một thủ tục để xây dựngmột lý thuyết trường điện tử bắt đầu từ một trường cổ điển

Hình 1.1 Phổ điện từ - Nguồn [2]

Các liên kết của các hợp chất khi nhiệt độ ở điều kiện chuẩn thì đã có sự daođộng, khi có tác động nhẹ của bức xạ hồng ngoại thì làm cho các phân tử chuyểnđộng mạnh mẽ hơn Có hai dạng chuyển động, chuyển động hóa trị là chuyển độngtheo chu kì dọc theo trục liên kết làm thay đổi khoảng cách giữa các nguyên tử cóliên kết với nhau trong phân tử Chuyển động biến dạng là thay đổi góc giữa các

liên kết hoặc chuyển động của nhóm các nguyên tử so với phần còn lại của phân tử( xoắn, uốn, cắt kéo, )

Hình 1.2 Các kiểu dao động chính của phân tử khi có sự kích thích của bức xạ

hồng ngoại – Nguồn [2]

Dùng một lò xò để nối hai khối cầu lại thì năng lượng cần thiết uốn cong bé hơn

so với năng lượng để kéo chung ra xa nhau hay ép chúng lại gần nhau Hoặc nănglượng để hai khối cầu quay quanh trục ít hơn năng lượng để kéo hai khối cầu lại gầnhay ra xa Bởi thế mà năng lượng dao động biến dạng cần phải yêu cầu bé hơnnăng lượng dao động hóa trị cần tương ứng Năng lượng quay cực phân tử đượcchuyển hóa từ phân tử hữu cơ hấp thụ bức xạ hồng ngoại có bước sóng từ 100μm

Sự hấp thụ năng lượng cũng được lượng tử hóa do đó phổ quay của phân tử baogồm các vạch rõ ràng Phân tử hữu cơ hấp thụ bức xạ hồng ngoại có bước sóng 1-100μm chuyển thành năng lượng dao động phân tử trên phổ xuất hiện những đỉnhrộng hơn vì năng lượng của bức xạ hồng ngoại yếu nên không làm thay đổi trạngthái năng lượng của electron mà chỉ đủ để thay đổi trạng thái dao động từ đó phổ IR

còn được các nhà khoa học gọi là phổ dao động

Sau này nhà khoa học Enrico Fermi phát hiện ra rằng khi năng lượng dao độngthì hai liên kết kề sát gần nhau chúng có thể tương tác và bắt cặp với nhau Ở đây sẽ

có hai trương hợp xảy ra, một sự tương tác đó đủ mạnh thì đỉnh hấp thụ ban đầubiến mất và hình thành đỉnh hấp thụ mới Còn tương tác đó yếu thì có thể sẽ không

làm mất đỉnh ban đầu mà còn thêm đỉnh mới Các đỉnh mới xuất hiện trên phổ cóthể do tự bội tần nhân đôi hay nhân ba số đỉnh ban đầu Mặt khác có thể xuất hiện

sự ghép đôi chính giữa các đỉnh bội tần với các đỉnh thích hợp Hiện tưởng này

được gọi là cộng hưởng Fermi.

2 Ứng dụng của phổ hồng ngoại

2.1 Trong kỹ thuật phân tích

Khác với phổ UV-VIS, việc phân tích phổ hồng ngoại nhằm mục đích địnhlượng một chất bất kỳ không mang tính chính xác như so với phổ UV-VIS Tuy vậy,phổ IR (Infrared Spectroscopy) lại mang đặc điểm ưu việt trong phân tích định tính(đặc biệt là trong xác định thành phần nhóm chức trong một cấu trúc phân tử) Do

vậy, ứng dụng chính của phổ hồng ngoại là định tính các hợp chất Tuy nhiên, sự tiến bộ vượt bậc của kỹ thuật thế hệ mới đã mở ra cánh cửa cho phương pháp định lượng quang phổ hồng ngoại chuyển dạng Fourier (FTIR) Việc phân tích định

lượng bằng phổ hồng ngoại vẫn là một lựa chọn khả thi nhưng phải đòi hỏi một sốphương pháp hỗ trợ khác kèm theo như sắc ký lỏng hiệu năng cao – HPLC, sắc kýkhí – GS, điện di mao quản và các loại quang phổ (cộng hưởng từ hạt nhân – NMR,UV) [3]

Ứng dụng định lượng phân tích định lượng phổ hồng ngoại được chia làm nhiềugiai đoạn như mô hình bên dưới (Hình 2.3) Ban đầu, mẫu dữ liệu quang phổ được

xử lý đưa ra giá trị X nhằm hình thành mẫu đường chuẩn Khi phân tích đánh giákết quả chính xác, giá trị R2 tiến gần đến giá trị 1, sai số chuẩn thấp (RMSEC,RMSECV, RMSEP hoặc bình phương tổng sai số dư dự đoán [PRESS]) và các giátrị phần trăm chênh lệch tương đối (RPD) phải ít nhất là 2,4 hoặc cao hơn Phân tíchbằng quang phổ hồng ngoại là lý tưởng nếu kết quả đánh giá cho thấy các giá trịhiệu chuẩn R2 mô tả độ tuyến tính của đường cong hiệu chuẩn được hình thành từ

dữ liệu phổ hồng ngoại (giá trị X) với dữ liệu nồng độ được đo bằng phương pháptham chiếu (giá trị Y) Giá trị R2 gần bằng 1 cho thấy dữ liệu phổ hồng ngoại có thểgiải thích nồng độ của các hợp chất là biến phụ thuộc Trước khi dựng mô hìnhđường chuẩn cho dữ liệu, giai đoạn sàng lọc giá trị biến (variable selection) và tiền

xử lý quang phổ (spectra processing) có thể được tiến hành để loại bớt những tín

hiệu nhiễu không cần thiết nhằm thu được độ tương quan với nồng độ chất phântích tốt hơn

Hình 2.3 Quá trình phân tích định lượng bằng phương pháp quang phổ hồng

ngoại – Nguồn [3]

Ứng dụng của việc phân tích định tính phổ hồng ngoại có thể được chia thànhhai nhánh lớn đó là nhận biết được nhóm chức đặc biệt trong một phân tử bất kỳ(aldehyde, carbonyl, alcohol…) và dự đoán tính chất thông qua việc so sánh chất đóvới một phổ chuẩn từ chất chuẩn nào đó (Hình 2.4) Điều này là cực kỳ ưu việt vàhữu ích trong một số ngành khoa học Điển hình là ngành dược học đã tận dụng phổ

IR trong việc nghiên cứu và phát triển một thế hệ thuốc mới bất kỳ dựa trên loạithuốc trước đó [4] Trong dược học, bốn công đoạn được ứng dụng phổ hồng ngoại

đó là nhận dạng (identity), thử nghiệm độ tinh sạch (test purity), cấu trúc tinh thểthuốc, tương tác giữa hoạt chất và tá dược và bằng sáng chế của kháng sinh Chẳnghạn trong thử nghiệm độ tinh sạch của kháng sinh Cloramphenicol, các nhà kiểmnghiệm ứng dụng phổ hồng ngoại với mục đích kiểm tra mẫu kháng sinh này có bị

nhiễm lẫn với dichlor acetic acid hay không thông qua sự hiện diện của vạch phổ

1745 cm -1 [4]

Hình 2.4 Ứng dụng phổ hồng ngoại trong phương pháp định tính qua việc so

sánh phổ với chất chuẩn – Nguồn [5]

2.2 Trong phân tích các hợp chất sinh học

2.2.1 Protein và amino acid

Các phân tử protein và amino acid được xem là những đối tượng nghiên cứuđặc biệt của sinh hoá học trong lĩnh vực phân tích và nghiên cứu Để tìm hiểu chitiết hơn về các phân tử này, phổ hồng ngoại được sử dụng như là một công cụ thiết

yếu trong nghiên cứu chuyên sâu

Trên cơ sở cấu tạo chung của amino acid baogồm nhóm amino và nhóm carboxyl nhưng chỉ

khác biệt nhau bởi gốc R - side chain (Hình 2.5).

Tận dụng đặc tính khác biệt mà này trong nghiêncứu và phân tích, các nhà khoa học có thể dựa vào

tín hiệu phổ đồ hồng ngoại mà ghi nhận các tín hiệu đặc trưng tương ứng với cácdao động của các nhóm thế khác nhau

Nếu gốc R là thuộc nhóm không phân cực và có chứa nhân thơm như làtyrosine, tryptophan và phenylalanine, phổ ghi nhận lúc này sẽ có những tín hiệu

khác nhau [7] Các pic hiển thị đặc trưng được tóm tắt như dưới (Bảng 2.1).

Bảng 2.1 Một số vạch phổ ghi nhận đặc trưng thuộc nhóm R của Tyrosine,

Phenylalanine và Tryptophan – Nguồn [7]

Acid amin Loại liên kết đặc trưng Vạch phổ ghi nhận đơn

1612 m

Đối với phân tử protein, do đơn phân gồm nhiều gốc amino acid liên kết vớinhau bằng liên kết peptide nên trong thành phần cấu tạo của đại phân tử này sẽ hìnhthành liên kết CO – NH đặc trưng Về bản chất hoá học, các liên kết này cũng đượcxem là liên kết amide (R−C(=O)−NHR’R’’) hình thành những kiểu dao động rung

tín hiệu đặc trưng ở những đỉnh và độ dốc khác nhau Theo nhiều nghiên cứu chothấy, phổ IR ghi nhận cho chuyển động rung loại I thường xuất hiện trong khoảng

số sóng  khoảng 1650 cm-1, đối với chuyển động rung loại II là 1550 cm-1 và loạiIII thuộc vùng từ 1400 – 1200 cm-1 [8]

Hình 2.6 Dao động rung đặc trưng loại I và II của hai liên kết peptide – Nguồn

[9]

Ngoài liên kết peptide, phân tử protein vẫn hình thành những liên kết khácđiển hình là liên kết Hydro giữa các chuỗi polypeptide ở các cấu trúc bậc II trở đi.Nhờ vậy, phổ hồng ngoại cho phép ghi nhận ảnh hưởng của liên kết này đến tín hiệuchuyển động của liên kết khác Nghiên cứu chỉ ra rằng tần suất chuyển động củaAmide I có sự chuyển dịch đi xuống khoảng 20 đến 30 cm-1 số sóng khi liên kếtHydro hình thành với nhóm chức carbonyl và con số này khi liên kết này hình thànhvới nhóm NH là 10 đến 20 cm-1 [8]

Một điểm quan trọng khác mà kỹ thuật phổ hồng ngoại được áp dụng trongnghiên cứu protein đó là phân tích và dự đoán cấu trúc bậc II của protein [8] Đâyđược xem là nhánh ứng dụng mạnh và phổ biến của kỹ thuật này ở lĩnh vực phântích hợp chất sinh học Trong đó, dựa vào đặc tính nhạy của chuyển động amide I

trong cấu trúc xoắn, gấp nếp và kết tụ của protein mà người đọc kết quả phổ đồ cóthể dự đoán được cấu trúc bậc II của một protein được phân tích (Bảng 2.2).

Bảng 2.2 Đánh giá cấu trúc bậc II của protein dựa trên băng chuyển động

chất nêu trên có thể được định nghĩa là những hợp chất có hoạt tính sinh học Nhóm

những chất này có thể bao gồm các vitamin, các hợp chất thứ cấp (glycosides,alkaloids, phenolics…)

Trong kỹ thuật phân tích, việc xác định các hợp chất này mang ý nghĩa quantrọng trong ngành dược liệu Vì thế, phương pháp phân tích quang phổ hồng ngoại

một chiết xuất thiên nhiên bất kỳ Nghiên cứu của  A Rohman và cộng sự trongứng dụng phổ hồng ngoại chuyển chuyển dạng Fourier trong phân tích định lượnghoạt chất curcumin từ dịch chiết nghệ rễ vàng và nghệ ta [10] Kết quả của nghiêncứu cho thấy giá trị curcumin thu nhận được có có độ tin cậy cao với giá trị R2 là0,99 và 0,96 ở cả hai dịch chiết Một nghiên cứu khác của Wulandari L, vàcộng sự cũng đã sử dụng kỹ thuật quang phổ hồng ngoại để định lượng thànhphần flavonoid có trong dịch chiết lá của những cây thảo mộc [11] Nghiên cứu nàycũng đã so sánh hàm lượng flavonoid thu được từ hai cây thuốc đã được thương mạihoá ở Indonesia là lá của cây diệp hạ châu thân xanh và cây nguyệt quế Kết quảnghiên cứu cũng chỉ ra rằng phổ hồng ngoại thu được hàm lượng flavonoid cao hơnnhưng lại cho giá trị sai số cao hơn so với phổ UV-VIS (Bảng 2.3) Tuy vậy, mộtđiểm ưu việt của phổ hồng ngoại so với phổ UV-VIS cũng như sắc ký đó là việckhông gây phá mẫu và không phải sử dụng thuốc thử [13].

Bảng 2.3 So sánh giữa hàm lượng flavonoid thu được bằng hai phương pháp

tính cấu trúc hoá học của màng bao này từ phổ IR [12] Từ kết quả phổ đồ, vùng tín

đỉnh ở 3200 – 3500 cm-1 nên có thể chứng minh sự hiện diện của nhóm alcohol I,lẫn bậc II và bậc III Quan trọng hơn cả đó là sự biểu hiện của đỉnh 950 đến 1200

động của nhóm N–H amin và hydroxyl, tương ứng với liên kết hydro trong chitosan

pic tương tự đã được tìm thấy trong hỗn hợp chitosan và pectin Sự giảm nhóm OH

có thể liên quan đến liên kết chéo giữa chitosan và pectin Điều này cũng khẳngđịnh không có sự phá hủy cấu trúc hóa học của gel màng hỗn hợp giữa hợp chấtchitosan và pectin

Hình 2.7 Phổ hồng ngoại của chitosan, pectin và chitosan trộn pectin trong

nghiên cứu màng bao tổng hợp từ Cyclea Barbata Miers – Nguồn [12]

3 Máy quang phổ hồng ngoại và một số chú ý khi đo

3.1 Máy quang phổ hồng ngoại

Máy quang phổ hồng ngoại (infrared spectrometers) có nhiều loại khác nhaunhưng lại hoạt động dựa vào nguyên lý chung đó là sự hấp thu của bức xạ hồngngoại để ghi nhận các chuyển động của phân tử từ phổ đồ Tất cả loại máy phổ đều

có một nguồn phát ra tất cả bức xạ IR Chúng  phân bố năng lượng bức xạ theobước sóng gần với phân bố của vật đen lý thuyết, trong đó năng lượng đạt cực đại ởbước sóng (µm) bằng 2897/T, trong đó T là nhiệt độ tuyệt đối (K) Nhiệt độ hoạtđộng sao cho năng lượng bức xạ thường đạt cực đại gần giới hạn bước sóng ngắncủa quang phổ (thường là ~2 µm) và giảm dần khi bước sóng dài hơn [14]

Tất cả máy quang phổ phải có một số loại đầu dò Nhưng thiết bị này biến nănglượng bức xạ thành tín hiệu điện có thể được khuếch đại và xử lý để tạo ra quangphổ Các thành phần chính của máy quang phổ hồng ngoại bao gồm:

 Nguồn bức xạ hồng ngoại được phát ra từ nguồn đốt nóng bằng điện

dưới dạng dây tóc hay ống, được điều chế bằng các zirconi oxyd, thori,

ceri hay bằng silic carbid, vật mẫu nơi đặt mẫu để phân tích.

 Bộ phận đơn sắc hoá (monochromatic system) tách các bức xạ hồng

ngoài thành các tần số riêng biệt

 Hệ thống quang học giúp dẫn và tập trung bức xạ hồng ngoại từ nguồn

đến mẫu và sau đó đến bộ phận phát hiện

 Bộ phận phát hiện (detector): có thể là một cặp nhiệt điện (Chuyển đổi

nhiệt độ do bức xạ hồng ngoại gây ra thành tín hiệu điện) hay điện trởnhiệt (Đo sự thay đổi điện trở do nhiệt độ thay đổi khi hấp thụ bức xạhồng ngoại)

 Hệ thống máy ghi phổ: sự chênh lệch tín hiệu giữa 2 chùm tia được

khuếch đại và chuyển trực tiếp ra máy ghi hay máy vẽ thành phổ IR qua

biểu thị độ truyền qua T theo số sóng Thời gian ghi phổ bị giới hạn bởitốc độ di chuyển của bút ghi.

Hình 3.8 Sơ đồ cấu tạo của hệ thống máy đo phổ hồng ngoại

Nguồn: https://www.geeksforgeeks.org/infrared-spectroscopy/

Giữa nguồn và máy dò, máy quang phổ phải có một số phương tiện phân tíchbức xạ để có thể suy ra cường độ cho từng phần tử phân giải bước sóng Hai loạithiết bị hoàn toàn khác nhau được sử dụng, cụ thể là máy đơn sắc và máy giao thoa.Máy đơn sắc có mạng hoặc lăng kính được sử dụng trong các thiết bị phân tán vàmáy giao thoa được sử dụng trong các thiết bị biến đổi Fourier

Máy quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier cho phép thực hiện nhiều quá trìnhquét với tốc độ cao, xử lý dữ liệu kết hợp và loại bỏ nhiễu trước khi in phổ FTIR có

thể cho phổ phân giải cao nhanh và chỉ cần một lượng mẫu nhỏ, đặc biệt hữu íchtrong phân tích nhanh các hợp chất từ cột sắc ký.

Bức xạ từ nguồn được tạo song song và chiếu vào bộ tách chùm tia, thường là ởgóc 45º [14] Lý tưởng nhất là bộ tách chùm tia truyền một nửa bức xạ chiếu vào nó

và phản xạ một nửa còn lại Một loại bộ tách chùm tia là một lớp germanium mỏngđược phủ trên một giá đỡ truyền IR Các chùm tia truyền và phản xạ rời khỏi bộtách chùm tia theo góc vuông và cả hai đều chiếu vào gương, đưa hai chùm tia trởlại bộ tách chùm tia Hai chùm tia kết hợp lại tại bộ tách chùm tia và cho thấy sựgiao thoa Bức xạ rời khỏi bộ tách chùm tia có thể quay trở lại nguồn hoặc có thể đitheo góc vuông, đi qua mẫu và đi đến máy dò do khoảng cách của nó so với bộ táchchùm tia có thể thay đổi Nếu sử dụng nguồn đơn sắc như tia laser, năng lượng bức

xạ đến máy dò sẽ thay đổi theo hàm cosin của độ trễ.  Phản ứng của máy dò sẽ đạtcực đại mỗi khi độ trễ là một số nguyên của bước sóng của bức xạ Tại thời điểmnày, các chùm tia từ hai gương kết hợp tại bộ tách chùm theo pha đối với chùm tia

đi đến máy dò và cho thấy giao thoa tăng cường Nếu sau đó gương di động được dichuyển một phần tư bước sóng bức xạ, độ trễ sẽ thay đổi một nửa bước sóng Cácchùm tia từ hai gương kết hợp tại bộ tách chùm lệch pha một nửa bước sóng đối với

Chú thích: Bên trái: bức xạ nguồn được truyền đi và cũng được phản xạ bởi bộ chia chùm tia tới hai gương Bên phải: cả hai gương đều phản xạ bức xạ trở lại bộ chia chùm tia, nơi xảy ra hiện tượng giao thoa