Khóa luận tốt nghiệp Nông học: Đánh giá khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật của một số chủng vi khuẩn Pseudomonas spp. phân lập tại các vùng nhiễm mặn tỉnh Bến Tre

Xuất phát từ thực tiễn trên, với mong muốn giúp cây trồng sinh trưởng phát triểntốt trên nền đất nhiễm mặn, tăng năng suất, chất lượng và đem lại hiệu quả kinh tếcao, dé tài “ Đánh giá k

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRUONG ĐẠI HỌC NÔNG LAM TP HO CHÍ MINH

RRR KEKREKEREKRER

VO TRAN QUOC THANG

ĐÁNH GIA KHẢ NANG THUC DAY TANG TRƯỞNG

THUC VAT CUA MOT SO CHUNG VI KHUAN

Pseudomonas spp PHAN LAP TAI CAC VUNG

NHIEM MAN TINH BEN TRE

LUAN VAN THAC SI CONG NGHE SINH HOC

Thanh phố Hồ Chi Minh, tháng 11 năm 2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOĐẠI HỌC NÔNG LAM TP HO CHÍ MINH

3 28 28 28 28 28 OB OK 2K OK 2K 2K ok ok 2 2 28

VO TRAN QUOC THANG

ĐÁNH GIA KHẢ NANG THUC DAY TANG TRUONG THUC VAT CUA MOT SO CHUNG VI KHUAN

Pseudomonas spp PHAN LAP TAI CAC VUNG

NHIEM MAN TINH BEN TRE

Chuyén nganh: Công nghệ Sinh học

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG THUC DAY TANG TRƯỞNGTHỰC VAT CUA MOT SO CHUNG VI KHUANPseudomonas spp PHAN LAP TAI CAC VUNG

NHIEM MAN TINH BEN TRE

VO TRAN QUOC THANG

Hội đồng chấm luận văn:

1 Chủ tịch: TS HUỲNH VĂN BIẾT

Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM

2 Thư ký: TS BÙI MINH TRÍ

Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM

3 Phản biện 1: TS BIỆN THỊ LAN THANH

Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM

4 Phản biện2: TS NGUYEN HOÀNG DŨNG

Viện Sinh học Nhiệt đới

5 Ủy viên: PGS TS HO VIET THE

Trường Dai học Công Nghiệp Thực Pham TP.HCM

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi, các sô liệu, kêt quả được

nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bô Tôi xin hoàn toàn

chịu trách nhiệm trước Hội đông về những cam kêt này

(Ký tên và ghi rõ họ và tên HV)

LỜI CẢM ƠN

Con xin chân thành cảm ơn và nhớ ơn Ba Mẹ suốt đời, là người đã sinh thành,

nuôi dưỡng và dạy bảo con Gia đình là nguồn động viên to lớn, giúp con có nhiềuđộng lực dé phan dau, vuot qua được những khó khăn, thử thách trong học tap va

công việc.

Xin chân thành cảm on Ban giám hiệu nhà Trường, cùng toàn thé quý Thay

Cô trong Khoa Khoa Học Sinh học, Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi

trường, Phòng Sau Đại học, cùng toàn thể cán bộ công nhân viên Trường Đại học

Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh đã tận tình giảng dạy, giúp đỡ, truyền đạt nhữngkinh nghiệm, kiến thức quý báu cho em trong suốt quá trình học tập

Xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Vũ Phong và TS TrươngPhước Thiên Hoàng đã tận tâm giúp đỡ, góp ý và hướng dẫn từng bước, chia sẽ nhữngkiến thức, kinh nghiệm quý báu, luôn động viên tạo điều kiện cho em trong suốt thờigian thực hiện và hoàn thành đề tài này

Xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ, động viên, đóng góp ý kiến, kinh nghiệm và

kiến thức của ThS Lê Phước Thọ, cảm ơn các bạn sinh viên phòng Vi Sinh ứng dung,cùng toàn thể các bạn lớp cao học Công nghệ Sinh học khóa 2020 đã luôn luôn hỗtrợ, giúp đỡ trong quá trình học tập và thực hiện đề tài

TÓM TẮT

Đề tài nghiên cứu “ Đánh giá khả năng thúc đây tăng trưởng thực vật của một

số chủng vi khuân Pseudomonas spp phân lập tại các vùng nhiễm mặn tỉnh Bến Tre”

được thực hiện từ tháng 01 năm 2023 đến tháng 11 năm 2023 tại Khoa Khoa HocSinh học và Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường Pseudomonas là

chi vi khuẩn sở hữu nhiều cơ chế đa dạng trong việc thúc day tăng trưởng thực vậtchống chịu với các điều kiện bất lợi của thời tiết Từ 20 mẫu đất nhiễm mặn thu tại

huyện Ba Tri, Giồng Trôm và Châu Thành tỉnh Bến Tre phân lập được 12 chủng vikhuẩn có khả năng sinh trưởng tốt trong môi trường King B và phát huỳnh quang khiquan sát dưới tia UV, đã chon lọc được 10 chủng vi khuẩn được ký hiệu PI, P2, P3,P4, P5, P6, P§, P9, P10, P11 có khả năng chịu mặn tốt ở nồng độ NaCl 7%, có khảnăng sinh tổng hợp IAA, cô định nitơ, hòa tan photpho, hình thành biofilm và sinhtong hợp các enzyme cellulase, protease Trong đó, 3 chủng vi khuẩn P3, P5 và P11

có khả năng sinh tổng hợp IAA cao sau 3 ngày là 62,45 pg/mL (P3), 39,52 ug/mL(P5) và 28,75 pg/mL (P11), kha năng cố định nito sau 4 ngày với hàm lượng amoni

là 0,911 pg/mL (P3), 1,485 pg/mL (P5) và 1,334 pg/mL (P11) Chung vi khuân P3

và P5 có hiệu quả rõ rệt so với đối chứng trong thí nghiệm đánh giá ty lệ nảy mam vathúc đây tăng trưởng cà chua, cải thiện các thông số sinh trưởng của cây ở ngoài nhàlưới trong điều kiện bình thường và điều kiện đất nhiễm mặn Chủng vi khuẩn P3 cótrình tự ving 16S - rRNA tương đồng 100% với loài Pseudomonas hunanensis

Chung P5 có độ tương đồng 99,79% với loài Pseudomonas juntendi và 99,86% với

loài Pseudomonas taiwanensis Kết quả của nghiên cứu là cơ sở dé tạo chế phẩm sinhhọc và ứng dung Pseudomonas spp vào lĩnh vực nông nghiệp trong điều kiện đấtnhiễm mặn

Từ khóa: Pseudomonas spp., chịu mặn, IAA, cố định nitơ, enzyme ngoại bào, cảchua.

The study "Evaluation of the Plant Growth - Promoting Ability of Pseudomonas

spp Strains isolated in saline affected areas of Ben Tre province" was conducted at

the Faculty of Biological Sciences, and the Research Institute for Biotechnology and Environment from January 2023 to November 2023 Pseudomonas a bacterial genus possess diverse properties for promoting plant growth and enhancing the resistance

to adverse weather conditions From 20 saline soil samples collected in Ba Tri, Giong

Trom, and Chau Thanh districts, Ben Tre Province 12 strains capable of thriving in

King B medium and fluorescing under UV light were isolated Ten strains labeled P1, P2, P3, P4, P5, P6, P§, P9, P10, and P11 demonstrated a good salt tolerance at NaCl 7% These strains also exhibited the ability to synthesize [AA, nitrogen fixation, phosphate solubilization, biofilm formation, cellulase and protease production Among them, P3, P5, and P11, showed the most efficient IAA synthesis of 62.45 ug/mL (P3), 39.52 ug/mL (P5), and 28.75 ug/mL (P11) after 3 days, as well as nitrogen fixation of 0.911 ug/mL (P3), 1.485 ug/mL (P5), and 1.334 pg/mL (P11) after 4 days Strains P3 and P5 significantly enhanced seed germination rates and promoted the growth of tomatoes under both normal and saline soil conditions in greenhouse conditions The P3 was exhibited 100% similarity to Pseudomonas hunanensis, while the PŠ strain showed 99.79% similarity to Pseudomonas juntendi

and 99.86% similarity to Pseudomonas taiwanensis The results of this study provide

a foundation for biofertilizer production and applying Pseudomonas spp in agriculture.

Keywords: Pseudomonas spp., salt tolerance, IAA, nitrogen fixation, extracellular

enzymes, tomatoes.

MỤC LỤC

TRANG Trang tựa

TarieyiDfẲf ƯẾggaousannniiiiidiSEGEIGIGRUHGSUGGĐDSRSREGROEONGESUGRGGISIEHIIESVEGEGEGEGI il;ý |ịch.€4HHẦN, ác, ca sionhinabninnsinn nbn nest nnsntninoieetanaienr nannies ii

J01:eginiDBieeseeeseskeses=srtoessddokssgiorosasgibsieztdtotrslbooltindogEggpistiiiouiroa.dlinsrlbigd:nertlogdanllsszz.g.Ut58, ili LOD CAMION, czs9n0ps4t8nEEGCESSESSS0E0908.SBEBEASERMNGEHEEGEGIASISSSGBESISIRSRĐIBSEEIGES2RE4GMEEliGĐSESEESSEQNRBESGHHI IV

(ẤDSUEdGŨ ssseessiindbiatiriadbsdiesuibssecsSzagoclEnuinutiksuipbargakdentisdisoioitzlorloztsidenilcuzllinueuagiruclksdiuglgi2e vi

Mug lOG! sac:a.nc1sescmwenn ems neon eR i ces een VilDanh sách các chữ viét tắt - 2-5222 21 2122122122122121212121211121212121 2 xe xiDatta S ACCS 6! ĐẤN DheesssesesrresanuiraerbshsiEogtdirosgougtravgtSieskisugifipugkodg0t0dmbrtijfzdigpauhdgbsiioubgrdjetairszrusát xii DRTIH.EOEHT,HÌNH GHÍUsssscsssesestieeiezgSS0G500GH005E2500S5GG06GG308EDIGHAVSSEU401380/203827gE2G/3g0ã20000400 xiii

007105 |

1 TŨNG DU HN SE 6 ha th go nhgh nhưng 0g h00000001000007 8irnmimgproiiurgtzortprpoirgigoreo 31.1 Tổng quan tình hình xâm nhập mặn tại tỉnh Bến Tre - 2-22-5252: 31.1.1.3#e để miệt phim XHẾNgeaeagnesnnspnagsottrdttsgG000905433000008190101600/800180830/003800 3l;]„2, Neuyen nhân gầy HH: eeersessesenarnnooiibooitdgtinigbTSiE00003310040000919EE1G020008S05E0180008997.S61 31.1.3 Xâm nhập mặn tại tỉnh eS | mm 41.1.4 Ảnh hướng của đất nhiễm mặn đến đặc điểm sinh ly, sinh hóa của cay 41.2 Tổng quan về vi khuân PsewOiOi45 -2+-252©722©7222Z++2c+c2ccsczrsrrrsrrcee 5Tom an TT mẽ ốc ốc in 51.2.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý, Sinh hóa và SINH thal seseeseesessssssrssieaesane 61.3 Sự tương tác của Pseudomonas với vùng rễ thực vật -2- 252525522 7

1.4 Cơ chế thúc day tăng trưởng thực vật của Psewdoionas -. -. - 8

1.4.1 Pseudomonas spp hoạt động như một loại phan bón sinh hoc 9

1.4.1.1 Khả năng cố định nitƠ - 2: 222<22E22E22EE22E12212211221221122122112112212122 xe 9

1.4.1.2 Làm giàu dinh dưỡng cho đất nhờ quá trình phân hủy sinh học 10

1.4.1.4 Hịa tan các hợp chất chữa KaÏÌ cĩ HH 160,6 11

1.4.2 Cảm ứng sự phat triển hệ 16 oo cece ccc ccc eccecsessessesseseessessessessessessessesseeseeseees 111.4.2.1 Sự sản sinh Indole Acetic Acid (LA A)) -c2-<<+cssccsererererrerrree 11

1.4.3 Bảo vệ thực vật chống chịu các điều kiện bat lợi của mơi trường 13

1.5 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Pseudomonas cĩ hoạt tính kích thích tăng

trưởng thực vật ở ngồi nước và trong TNƯỚC 5+ +-<+++scc+seeexeeesxee 13 1,5.l Pđh.Hình:rphiếnm CUBA GOAL HƯIỔ seseesuiecoebtiiiiinlginkadBldiSigiB403.03.08381043160840014830/5E 13

1.5.2 Tình hình nghiên cứu trong TưỚC - - + 2252 + S2 *S2*+2E£zE+s£zsereererrrreree 16

2 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHAP NGHIÊN CỨU -2 52Z 18

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu -+- 2 2+22222++2E+2E+zEEz2EzExerrrzrxsres 18DON ASU ere eer are ee ee ee ee eee es 18

2.2.2 Dụng cụ thiết bi, hĩa chat, thuốc thử va mơi trường nuơi cấy -.- 182.2.2.1 Dụng cụ và thiét bị 2 222221221221221221221221221221217121212121 212 cce 182.2.2.2 MGi trudng MUO CA 18

92.09, ae Tell (eo i kesseesesebdidbsidiekgoioteosgogttedbngttoispsggeoisftoogiekedndtboslok.lpestser 19

2.3, Phong: phaping bi Ci Ct esescsssescsnrswesensseonneesmunceneavecnsmesaawsewessanvasenastanensanncsetnces 202.3.1 Nội dung 1: Phân lập vi khuan Pseudomonas spp từ dat nhiễm mặn 202.3.1.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn Pseudomonas SpỤ -. -: -5- 202.3.1.2 Phương pháp giữ giống vi khuân Pseudomonas Sp - - 202.3.1.3 Xác định mật độ vi khuẩn Pseudomonas SD ly seyssscsbatGSes2todisvogtsgtnipbdbgdacrenidti 202.3.1.4 Nuơi cay và chuẩn bị huyền phù vi khuân -2-©2255z55z25+c+2 21

2.3.2 Nội dung 2: Khao sát các đặc điểm sinh hĩa và các đặc tính sinh học của

các chủng vi khuẩn Pseudomonas spp . . -22-552552©55222522css2cssscxscc+2 21255.1 Wiig đầu tiệm trí lữ NGasnusaonnisonnnnnotitgotintsirogiudtggigfisuiSis0ingig1onABig03 212.3.2.2 Khảo sát các hoạt tinh sinh học của các chủng Pseudomonas Spp 22 A) Khao Sat Kkhámăng Chi AN aN ss ccssesestensssnemcenesenenasesacnensaveseancornemonanersunnmentmacennncceans 22b) Khao sát khả năng sinh tong hop IAA bằng phương pháp Salkowski 22

c) Khảo sát khả năng có định nito của vi khuân Pseudomonas spp bằng phương

pháp so màu với thuốc thử Nessler 2-22 22222222EE22E+22zz2zzzzzzzez 23

d) Khảo sát khả năng hòa tan photpho - eee + +52 + SE 22*+2E£2E£zErerrkrrrrerrrree 23

e) Xác định khả năng hình thành màng biofilm - - ©5525 cece cece eee 23 f) Khảo sát khả năng sinh các enzyme ngoại bào - 5555 ccS+cs+sccexereses 232.3.3 Nội dung 3: Khảo sát khả năng thúc đây tăng trưởng cà chua của các

chủng vi khuẩn Pseudomonas sp trong điều kiện stress mặn 24

2.3.3.1 Khảo sát tỉ lệ nảy mầm của hạt cà chua trong điều kiện stress mặn khi

được xử lý với vi khuẩn ở điều kiện i wif7o -2z55¿52+2s+2s+zszzsee 242.3.3.2 Khảo sát khả năng chống chịu với stress mặn của cây cà chua khi được

xử lý với vi khuan ở điều kiện ngoài nhà lưới 2222 +25 252.3.4 Dinh danh vi khuẩn bằng kỹ thuật sinh học phân tử -2- 2-5 26

A, S0 1í oo Tr thẳng Tổ coannaunaastatoetrgiiotgG909008)0180v0000110000065009800g00G 80800083 37

3 KET QUA VÀ THẢO LUẬN 2-52-5221 21221221221212211211212121 2E cze 283.1 Phân lập các chủng Pseudomonas spp từ đất nhiễm mặn tỉnh Bến Tre 28

3.1.1: Ret Bình gáo: chỉ Hiếu tủa tấn đổ ks»e-«zxeiseersesoihotesbosoirsoithdig0siiei:bohdbregi 28

3.1.2 Kết qua phân lập các chủng Pseudomonas spp từ mẫu đất nhiễm mặn 293.1.3 Đặc điểm hình thái, sinh hóa các chủng vi khuẩn phân lập - 293.2 Các đặc tinh sinh học của các chủng vi khuẩn -222©2255z2522z2sz>s+ 343.2.1 Khả năng chịu mặn của các chủng vi khuân -2-s+222E+ESE2EcEzExzErrerxee 343.2.2 Khả năng sinh IAA của các chủng vi khuẩn -5-55 ccccccscee 353.2.3 Khả năng có định nitơ của các chủng vi khuân -: 5z©52555z-: 363.2.4 Kha năng hòa tan photpho của các chủng vi khuân - 373.2.5 Kết quả sự hình thành mang biofilm của các chủng vi khuẩn 393.2.6 Khả năng sinh enzyme ngoại ĐÀO ssicssesssiisseasessaesiLi81S111546146855155 E645 15550869356 393.3 Khả năng thúc đây tăng trưởng cà chua trong điều kiện stress mặn của các

chủng vi khuẩn Pseudomonas SpỤ . -2 22-552552552255222S2c+>csszrxszrxesrea 413.3.1 Tỉ lệ nảy mam của hạt cà chua trong điều kiện stress mặn khi được xử lý

với vi khuân - - s11 1119111 111111 1kg xxx x2 42

3.3.2 Khả năng kích thích tăng trưởng cà chua của vi khuẩn trong điều kiện

lis801i090i) 800 43

3.4 Định danh vi khuẩn bằng kỹ thuật sinh học phân tử - 2-2-2252: 50

KET LUẬN VÀ ĐÈ NGHỊ, 2-22-5222 2212212221221221121122121122122 22 re 53TÀI LIEU THAM KHAO ooo ccccccccccccccsecsessesseessscscsessessesseseessesseseesseesesseeeeees 54PHỤ 0) 0, OR 63

DANH SÁCH CÁC CHU VIET TAT

Bp: Base pair - cap bazơ

CFU: Colony forming units - Số đơn vị khuẩn lạc

CMC: Carboxymethyl cellulose

ctv: cộng tác viên

DNA: Deoxyribo Nucleic Acid

EC: Electrical conductance - Độ dan điện

EPS: Exopolysaccharide

IAA: Indole Acetic Acid

NT: Nghiệm thức

OD: Optical Density - Mật độ quang

PCR: Polymerase chain reaction

PGPR: Plant growth promoting rhizobacterium - Vi khuẩn vùng rễ

thúc đây tăng trưởng thực vật

PVK : Pikovskaya Agar

SXL: Sau xu ly

Tryp: Tryptophan

TSA: Tryptone Soya Agar

TSB: Tryptone Soya Broth

TXL: Trước xử lý

UV: Untraviolet

DANH SÁCH CÁC BANG

BANG TRANG

Bảng 2.1 Thanh phan cho một phan ứng PCR với cặp primer - 26Bảng 2.2 Chu trình nhiệt cho một phan ứng PCR với cặp prImer - 27Bảng 3.1 Kết quả đo chỉ tiêu mẫu đất - 2 222222222E22EE2EE22E2EEcZEezrrcrev 28Bảng 3.2 Đặc điểm hình thái của 12 chủng vi khuẩn 2-22- 225525522552 31Bảng 3.3 Đặc điểm hình thái của 12 chủng vi khuẩn -. - 32Bảng 3.4 Mật độ vi khuân (log10 CFU/mL) trên môi trường King B ở các nồng

ho H08‹4/ 100/0 34

Bang 3.5 Hàm lượng IAA sau 3 ngày tăng sinh - 5-5525 <<+<c<sxs+cezces 36Bảng 3.6 Hàm lượng NH¿Ÿ của các chủng vi khuẩn -2-©52552 55252252522 36Bang 3.7 Chỉ số hòa tan photpho của các chủng vi khuân - 252552 38Bảng 3.8 Đường kính vòng phân giải cơ chất casein va CMC của vi khuẩn 40Bảng 3.9 Đặc điềm thúc day tăng trưởng thực vật của các chủng vi khuẩn 42

Bảng 3.10 Chiều cao cây cà chua (cm) trước xử lý (TXL) và sau xử lý (SXL)

vi khuẩn của các nghiệm thức qua từng giai đoạn - 44Bảng 3.11 Số lá cà chua sau xử lý vi khuẩn ở các nghiệm thức qua từng giai

Bảng 3.12 Ảnh hưởng của vi khuan đến chiều dài rễ (cm) ở giai đoạn 28 ngày 47Bang 3.13 Ảnh hưởng của vi khuẩn đến sinh khối (g) cây cà chua ở giai đoạn 48Bảng 3.14 Ảnh hưởng của vi khuân đến số nhánh, số chùm hoa và số hoa của

cây ca chua ở giai đoạn 28 ngày - 5-2 S+c S2 ++serrrrrerrrrrrrerree 49

DANH SÁCH HÌNH ANH

HÌNH TRANG

Hình 1.1 Tóm lược các cơ chế thúc đây tăng trưởng thực vật được sử dụng bởi

PSCudOMONGS SDP tiiesstsssoibcitl854Eg5uẸ1-G83E0S2d0880032SG8ESuAU5NSEEtMSStiS808580084000401 300L 8

Hình 3.1 Các mau đất được phan lập trên môi trường King B - 29

Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn trên môi trường King B 30

Hình 3.3 Khả năng phát huỳnh quang dưới UV36snm của các chủng vi khuẩn trên môi trường King B +52 +52 + 2+2 2222 Errrrrrreereree 31 Hình 3.4 Hình thái tế bào của các chủng vi khuân dưới kính hiển vi độ phóng Gái 10s nnsezeeabsathitoestieolfvsetitoesslplloevgl)SQ0OS1823850129102499.082-Đ28I 19 Hình 3.5 Phản ứng catalase dương tính của 12 chủng vi khuẩn - 33

Hình 3.6 Phản ứng oxidase đương tính của 12 chủng vi khuẩn 33

Hình 3.7 Phản ứng màu với thuốc thử Salkowski của các chủng vi khuan 35

Hình 3.8 Phản ứng màu với thuốc thử Nessler của các chủng vi khuan 37

Hình 3.9 Kha năng hòa tan photpho của các chủng vi khuẩn trên môi trường Pikovskaya, A BẤTissevenbagxcba115260233393559403589948950390-G615E0450313803138048358238 38 Hình 3.10 Sự hình thành biofilm của 10 chủng vi khuân -2- 5-52 39 Hình 3.11 Vòng phân giải cơ chất tinh bột của các chủng vi khuẩn 40

Hình 3.12 Vòng phân giải cơ chat CMC của các chủng vi khuẩn 41

Hình 3.13 Vòng phân giải cơ chat casein của các chủng vi khuân -.- 41

Hình 3.14 Hạt cà chua nảy mầm khi xử lý với vi khuân ở điều kiện stress 0,4% Na@ Losg3z gpxxãg5i01000301 00585005092 mae ES 43 Hình 3.15 Cây cà chua ở giai đoạn 28 ngày sau xử lý vi khuân - 48

Hình 3.16 Kết quả điện di sản phẩm PCR vùng 16S rRNA -5:5¿ 50 Hình 3.17 Cây pha hệ dựa trên vùng 16S - rRNA của vi khuẩn 51

MỞ ĐẦU

Đặt van đề

Xâm nhiễm mặn tác động nghiêm trọng làm giảm diện tích đất canh tác nông

nghiệp, hạn chế năng suất và chất lượng cây trồng Bến Tre là một trong những địaphương chịu ảnh hưởng nặng nề do biến đổi khí hậu như nhiệt độ trung bình có xu

hướng tăng cao, lượng mưa nhiều khu vực giảm rõ rệt, mực nước biển dâng cao cộngthêm tình trạng hạn hán nặng như ở các năm 2016 và năm 2017 làm tình trạng xâm

nhập mặn càng thêm trầm trọng hơn Theo Đài khí tượng Thủy văn tỉnh Bến Tre, tình

trạng xâm nhập mặn mùa khô năm 2022 - 2023 xảy ra sớm hơn trung bình các năm.

Từ nửa cuối tháng 12, hạn mặn bắt đầu xâm nhập vào khu vực gần cửa sông Độ mặn

cao nhất và xâm nhập sâu nhất xuất hiện vào tháng 2, tháng 3 năm 2023 Dự báo độ

mặn 4%o có thé xâm nhập cách cửa sông khoảng 45 - 57 km; độ mặn 1%o có thể xâmnhập cách cửa sông khoảng 54 - 68 km.

lon muối trong đất làm giảm mạnh khả năng hấp thu dinh dưỡng của rễ, làm

cho cây trồng trở nên còi cọc và dé bị các loại virus, vi khuẩn tắn công Bên cạnh đó,

sâu bệnh gây ra những ton thất nặng nề trong suốt quá trình sản xuất và lưu trữ cácsản pham trồng trọt Người nông dân theo tập quán canh tác lâu nay vẫn duy trì việc

sử dụng phân bón và các thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc hóa học trên ruộng

vườn Hệ lụy của quá trình này không chỉ là những ảnh hưởng trực tiếp đến môitrường sống mà còn ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm và sự an toàn cho ngườidùng Hiện trạng trên đặt ra những thách thức, không chỉ trong việc chọn giống câytrồng chịu mặn, mà còn phải cải tạo hệ sinh thái đất thông qua việc tương tác của rễthực vật với hệ vi sinh vật trong đất nhiễm mặn

Vi khuẩn vùng rễ thúc đầy tăng trưởng thực vật (PGPR - plant growth promotingrhizobacterium) là những vi sinh vật cư trú tại vùng rễ cây, xung quanh hay trên bề

cơ chế khác nhau như: tổng hợp nitơ, giúp cây trồng thu nhận sắt, tăng cường hap thụ

photpho, điều hoà nồng độ ethylene, trực tiếp hoặc gián tiếp ức chế các mầm bệnh

Các chủng PGPR có thé giúp giảm nhu cầu sử dụng thuốc trừ sâu và phân bón hoá

học trong sản xuất, góp phần giảm ô nhiễm môi trường Việc ứng dụng vi khuẩn vùng

rễ thúc đây tăng trưởng thực đã được báo cáo ở một loạt các chi như Bacillus,Pseudomonas, Actinobacteria, Acetobacter, Serratia, Burkholderia va Rhodococcus.Trong số đó, Pseudomonas spp phân bố rộng rãi trong dat, nước và các hệ sinh thái

nông nghiệp, nhờ sự đa dạng về các quá trình biến dưỡng và sinh lý, có khả năng

thích nghi cao với những yếu tố bat lợi từ môi trường như nhiệt độ, độ 4m, hàm lượngoxy và dinh dưỡng, sự hiện diện của các chất độc hại Bên cạnh đó, khả năng tổnghợp hàng loạt các chất biến dưỡng có giá trị, khả năng làm sạch môi trường khỏi cácchất gây ô nhiễm, điều kiện nuôi cấy cực kỳ đơn giản cùng với tốc độ tăng trưởngcực nhanh, trở thành đối tượng ứng dụng day tiềm năng trong lĩnh vực nông nghiệp

Xuất phát từ thực tiễn trên, với mong muốn giúp cây trồng sinh trưởng phát triểntốt trên nền đất nhiễm mặn, tăng năng suất, chất lượng và đem lại hiệu quả kinh tếcao, dé tài “ Đánh giá khả năng thúc day tăng trưởng thực vật của một số chủng vikhuẩn Pseudomonas spp phân lập tại các vùng nhiễm mặn tỉnh Bến Tre” đã đượcthực hiện.

Mục tiêu đề tài

Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn Pseudomonas có khả năng chịumặn, có hoạt tính thúc đây tăng trưởng thực vật trong điều kiện tress mặn, giúp câytrồng sinh trưởng phát triển tốt

Yêu cầu thực hiện

Phân lập các chủng vi khuân Pseudomonas spp từ đất nhiễm mặn

Khao sát các đặc tính sinh học của các chung vi khuẩn phân lập được

Đánh giá kha năng thúc day tăng trưởng thực vat trong điều kiện in vitro vàngoài nhà lưới.

Định danh chủng vi khuẩn đã tuyển chọn dựa trên hình thái, sinh hóa và trình

tự vùng 16S - rRNA.

và nhiễm độc ion, làm cho kết cầu đất bị suy thoái (Setter và ctv, 2009).

1.1.2 Nguyên nhân gây mặn

Do hạn hán, mực nước sông thấp, nước biển theo các con sông vào kênh rạch

rồi đi vào đồng ruộng gây mặn Mặt khác, những vùng ở xa sông thì do nước ngầmmặn di chuyền tầng đất mặt gây mặn Đất mặn là nhóm dat phù sa ven biển, chịu ảnh

hưởng trực tiếp của nước mặn biển theo thủy triều tràn vào hoặc gián tiếp do mach

nước mặn từ biển ngắm vào Ở Việt Nam, đất mặn phát sinh là do ngập nước mặn ởven biển; do anh hưởng của các mạch nước mặn ngắm lên mặt đất hay do mẫu chấtmặn nội địa trong điều kiện khí hậu bán khô hạn, về mùa khô, muối hòa tan theo các

mao quản dẫn lên làm đất nhiễm mặn; do nước bốc hơi dé lại muối hòa tan trong đất

(Hồ Quang Đức và ctv, 2010)

1.1.3 Xâm nhập mặn tại tỉnh Bến Tre

Sông Mê Kông có chín cửa đồ ra biển Đông tại Đồng bằng sông Cửu Long thì

trong đó có bốn cửa sông thuộc tỉnh Bến Tre, đây là nguyên nhân cho việc Bến Tre

chịu ảnh hưởng nặng nề nhất bởi xâm nhập mặn và sạt lở Theo số liệu của Sở Nôngnghiệp và Phát triển nông thôn tỉnh Bến Tre, trong mùa khô năm 2015 - 2016, mặntăng cao đột ngột và xâm nhập rất sâu vào đất liền, ước tính giá trị thiệt hại của riêngngành nông nghiệp là hơn một nghìn tỉ đồng Mùa khô năm 2019 - 2020, tỉnh BếnTre tiếp tục đối mặt với đợt xâm nhập mặn khốc liệt nhất trong lịch sử Độ mặn 2%ohầu như bao phủ trên toàn tỉnh, có thời điểm độ mặn lên đến 5%o

Theo nhận định của Đài Khí tượng Thủy văn tỉnh Bến Tre, tổng lượng dòngchảy từ thượng lưu sông Mê Kông về hạ lưu và vùng Đồng bằng sông Cửu Longtrong tháng 10 và tháng 11 năm 2022 6 mức cao hơn trung bình nhiều năm từ 15 -25%, trong tháng 12 cao hơn trung bình nhiều năm 10 - 15% Mùa khô 2022 - 2023,nhận định xâm nhập mặn ở mức sớm hơn trung bình nhiều năm Từ nửa cuối tháng

12 năm 2022, mặn bắt đầu xâm nhập vào khu vực gần cửa sông Xâm nhập mặn sâunhất ở mức xấp xỉ và thấp hơn mùa khô 2021 - 2022 Độ mặn cao nhất và xâm nhậpsâu nhất xuất hiện vào tháng 2 và tháng 3 năm 2023 Dự báo độ mặn 4%o có thê xâm

nhập cách các cửa sông khoảng từ 45 - 57 km; độ man 1% có thể xâm nhập cách các

cửa sông khoảng từ 54 - 68 km.

1.1.4 Ảnh hưởng của đất nhiễm mặn đến đặc điểm sinh lý, sinh hóa của cây

Khi nước mặn xâm nhập vào ao, mương trong vườn sẽ tích tụ các muối hòa tantrong đất Khi tưới nước cho cây trồng, hàm lượng muối hòa tan cao làm cho áp suấtthâm thấu của dung dịch đất lớn hơn áp suất thâm thấu của tế bào Chính sự chênhlệch áp suất này làm cho hệ thống rễ cây không hút được nước và chất đinh dưỡng,đồng thời làm cho màng tế bào rễ bi phá vỡ dẫn đến cây bị mat nước, trường hopnặng có thể dẫn đến chết cây

Đất nhiễm mặn gây trở ngại cho sinh trưởng và phát triển cây trồng, gây rối loạn

sự hấp thu nước và chất dinh dưỡng, phá hủy cấu trúc đất Đất bị nén chặt kìm hãm

sự phát triển bình thường của rễ, giảm tính thấm và thoát nước, gây hạn sinh lý và

cây bị héo lâu dai Kha năng hap thụ khoáng của cây bị hạn chế dẫn đến thiếu các

khoáng chất cần thiết, thiếu phospho nên quá trình phosphoryl hóa bị kìm hãm và cây

bị thiếu năng lượng Sự vận chuyền và phân bố các chất đồng hóa trong mạch libe bị

kìm hãm làm các chất hữu cơ tích lũy trong lá, ảnh hưởng đến quá trình tích lũy vào

cơ quan dự trữ Sự dư thừa các ion trong đất làm rối loạn tính thắm của màng nên làm

rÒ ri các ion ra ngoài rễ, quá trình trao đồi chất, đặc biệt là trao đôi protein bi rồi loan,

dẫn đến tích lũy các acid amin va amit trong cây Sự tong hợp cytokinine bi ngừng vì

rễ là cơ quan tổng hợp phytohormone này nên cây thiếu cytokinine ảnh hưởng đến

sinh trưởng của các cơ quan trên mặt đất

Không có điểm độ mặn tới hạn nào mà thực vật không phát triển được Khi độmặn tăng, tốc độ tăng trưởng giảm dần đến khi cây bị nhiễm độc Clo và chết Thựcvật khác nhau có khả năng chịu được lượng muối khác nhau (Abrol và ctv, 1988).1.2 Tổng quan về vi khuẩn Pseudomonas

1.2.1 Đặc điểm phân loại

Pseudomonas là một giống thuộc họ Pseudomonadaceae, bộ Pseudomonadales,lớp Gammaproteobacteria, ngành Proteobacateria, gồm các loài có quan hệ gần gũivới Pseudomonas aeruginosa thuộc nhóm tương đồng DNA - rRNA nhóm 1, lớp

“Gammaproteobacteria” Các loài trong nhóm này đôi khi còn được gọi là

“Pseudomonas thật” hoặc “Pseudomonas huỳnh quang” do khả năng tiết sắc tổ huỳnhquang tan trong nước Dù vậy, không phải tất cả các loài “Pseudomonas huỳnh

quang” thực sự sản sinh sắc tố phát huỳnh quang như trường hop Pseudomonas

stutzeri, Pseudomonas medocima, Pseudomonas alclogenes Thuật ngữ

“Dseudomonad” cũng thường được sử dụng với nghĩa bao gồm cả các loài gần giốngvới các loài thuộc chi Pseudomonas (Palleroni và Moore, 2004).

Việc nhận diện và phân loại chính xác các loài thuộc chi nay cần phải được thựchiện với sự liên quan tới rủi ro về khả năng gây bệnh cho thực vật, động vật và cả conngười Đề phân biệt vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas với các chi vi khuẩn khác một

cách hệ thống, cần xem xét dựa trên nhiều đặc điểm: tỉ lệ base trong bộ gene, trình tự

rRNA, thành phần lipid của tế bào, sự biến dưỡng các amino acid, hình thái, sinh hóa

và các protein của tế bào (Palleroni và Moore, 2004)

1.2.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và sinh thái

Vi khuẩn Pseudomonas có tế bào thang hoặc hơi cong nhưng không xoắn,đường kính khoảng 0,5 - 1,0 pm, đài khoảng 1,5 - 5,0 ym Không tạo chồi và khôngđược bao quanh bởi màng bao, không hình thành thé nghỉ, Gram âm, di động bởi mộthoặc một vài lông roi ở 2 cực (hiếm khi không di động) Hiếu khí, sử dụng oxy làm

chất nhận điện tử cuối cùng, một số trường hợp có thể sử dụng nitrat làm chất nhận

điện tử thay thế và cho phép tăng trưởng xảy ra trong điều kiện ky khí Không tạoxanthomonadin Hầu hết, chứ không phải tất cả, các loài không tăng trưởng trongđiều kiện acid (pH 4,5 hoặc thấp hơn) Có thể tăng trưởng trên môi trường khoáng tốithiểu với anmonium hoặc nitrate là nguồn nitơ và một hợp chất hữu cơ làm nguồncarbon và năng lượng, không đòi hỏi các nhân tố tăng trưởng hữu cơ Nhiệt độ tối ưucho sự tăng trưởng là khoảng 28°C, mặc dù một vài loài có thé tăng trưởng ở 4°C

hoặc 41°C Phản ứng oxidase và phản ứng catalase đương tính Chứa các thành phần

acid béo hydroxy hóa 3-OH 10:0 và 12:0, và 2-OH 12:0, và ubiquinone Q-9 Hàm

lượng G+C của DNA khoảng 58 — 69% (theo hệ thống phân loại vi khuân của Bergey)

(Vos và ctv, 2011).

Trên đây là một định nghĩa chính thức, tuy nhiên chưa nhân mạnh tiềm năngứng dụng trong công nghệ sinh học của nhóm vi khuẩn này, chang hạn như kha năngphân hủy một số lượng lớn các hợp chất hữu cơ, khả năng tương tác với thực vật vàliên kết với vùng rễ tạo thuận lợi cho nông nghiệp Một sé chung từ lâu được chứngminh có khả năng kiểm soát sinh học là PGPR Số lượng các chủng này được công

bố ngày một nhiều và những hiểu biết về cơ chế liên quan ngày một tăng Sự hiệndiện rộng rãi trong tự nhiên và có thể thích nghỉ tốt với nhiều 6 sinh thái khác nhau

do nhu cầu dinh dưỡng đơn giản Một số thành viên của chi Pseudomonas là những

vi khuan gây bệnh ở người, động vật, thực vat và là tác nhân gây ô nhiễm thực phẩm(Mercado-Blanco va Bakker, 2007) Một đặc điểm quan trọng khác của PseudomonasSpp là sự sản sinh một loạt các sắc tô, có thê tan trong nước và khuêch tán vào môi

trường nuôi cấy hoặc liên kết với tế bào vi khuẩn Pseudomonas spp có thé tạo cácsắc tố khuếch tán và phát huỳnh quang ở bước sóng UV 365 nm Một số trong số này,như pyoverdine màu vàng xanh (fluorescein) là các siderophore có vai trò sinh lýquan trọng trong việc hấp thu Fe ở vi khuẩn Pyoverdine cũng là một công cụ hiệuqua để nhận diện Pseudomonas spp vì mỗi nhóm di truyền được mô tả bởi cácpyoverdine đặc trưng Các sắc tố khác được tạo ra bởi các loài Pseudomonas spp baogồm pyocyanin (P aeruginosa, màu xanh da trời), pyorubin (P aeruginosa, mau đỏ),chlororaphin (P chlororaphis, màu xanh lục), pyomelanin (P aeruginosa, màu denhoặc nâu) Ngoài ra, P mendocina còn có thé tạo ra các sắc tố carotenoid (Ramos vàFilloux, 2010).

Các thành viên thuộc chi Pseudomonas được biết là có khả năng phân hủy một

phổ rộng các cơ chất như hydrocarbon, các hợp chất có vòng thom và các dẫn xuấtcủa vi khuẩn Một số chất này có nguồn gốc tự nhiên như toluene, styrene,naphthalene, phenol, các chất khác là sản phẩm cuối hoặc trung gian của các hoạtđộng công nghiệp như polychlorobiphenyl, dioxin, nitrotoluene (Novik và ctv, 2015).1.3 Sự tương tác của Pseudomonas với vùng rễ thực vật

Tất cả những đặc điểm có lợi mà một vi khuẩn tiềm năng có thể cung cấp chothực vật sẽ trở nên vô hiệu nếu không thé định cư và bền vững trong vùng rễ hoặctrong các mô rễ của thực vật Quá trình này là kết quả của một sự cân bằng phức tạp,liên tục và giữa rất nhiều các yếu tố sinh học (thực vật, các PGPR, các vi sinh vật

khác) và yếu tố phi sinh học (chủng loại đất, hàm lượng nước và chat khoáng, pH,

nhiệt độ, thành phần dịch tiết từ rễ, chất đinh dưỡng) (Gaiero và ctv, 2013)

PGPR có thể mang lại lợi ích cho cây trồng và giảm bớt tình trạng stress dongập mặn bằng nhiều cơ chế: (1) tạo ra màng sinh học giúp tích tụ độ 4m xung quanh

rễ và tránh sự xâm nhập của các ion độc hại hoặc mầm bệnh, (2) khả năng cung cấpchất dinh dưỡng, chất nền do quá trình hòa tan phosphat hoặc cố định dam trong khíquyền, (3) kích thích sự tăng trưởng và phát triển của rễ thông qua việc phóng thíchcác kích thích tố thực vật và các chất chuyên hóa thứ cấp vào vùng rễ như indole - 3

- acetic acid (IAA) hoặc các phân tử tín hiệu khác dưới dang oxide nitric, (4) tạo ra

siderophores và (5) giảm mức 1 - aminocyclopropane - 1 - carboxylate (ACC), bằngcách tăng ACCdeaminase hoạt động trong vùng rễ, do đó làm giảm nồng độ ethylenetrong các mô thực vật Cũng có báo cáo cho rằng PGPR làm tăng hiệu quả sử dụngnước bằng cách điều chỉnh sự thoát hơi nước và độ dẫn của khí không, đồng thời làm

tăng hàm lượng các loại oxy phản ứng trong thực vật Vi khuân Pseudomonas spp

có các phẩm chất PGPR rất khác nhau, bao gồm (i) tăng trưởng in vitro nhanh va khanăng sản xuất sinh khối; (ii) xâm chiếm va chiếm ưu thé trong tinh cầu, vùng rễ vàbên trong cơ thể thực vật; (iii) san xuất các chất chuyền hóa có hoạt tính sinh học(kháng sinh, chất kích thích tăng trưởng, siderophores và chất dé bay hoi); (iv) sửdụng nhanh dịch chiết từ hạt và rễ; (v) cạnh tranh khốc liệt với các vi sinh vật khác;

và (vi) khả năng chống lại áp lực môi trường Do khả năng sản xuất các hợp chất đã

nêu ở trên, chiu trách nhiệm thúc đây tăng trưởng thực vật và sức đề kháng bam sinhcủa một số loại đất đối với mầm bệnh độc hại (Dashti và ctv, 2012)

1.4 Cơ chế thúc day tăng trưởng thực vật của Pseudomonas

Pseudomonas spp khi đã định cư trong vùng rễ hoặc xâm nhập và nội sinh trong

rễ thực vật, Pseudomonas spp thường sở hữu một hoặc nhiều đặc điểm có lợi cho sự

tăng trưởng của thực vật bao gồm: (1) tăng cường dinh dưỡng ở thực vật, (2) kích

thích sự phát triển hệ rễ, (3) bảo vệ thực vật khỏi các stress sinh học, (4) phi sinh học

và (5) hỗ trợ hoạt động của các PGPR khác

Hình 1.1 Tóm lược các cơ chế thúc đây tăng trưởng thực vật được sử dụng bởi

Các cơ chế thúc day tăng trưởng của Pseudomonas spp có thê được khái quát

như trong Hình 1.1 Trong thực tế, hiệu quả thúc day tăng trưởng thực vật hiếm khi

do một cơ chế riêng lẻ mà thường do tác động cộng gộp của nhiều cơ chế khác nhau

1.4.1 Pseudomonas spp hoạt động như một loại phân bón sinh học

Phân bón sinh học (biofertilizer) được định nghĩa là một chất chứa vi sinh vật

sống mà khi ứng dụng trên hạt giống, các bề mặt thực vật hoặc đất, phân bón sinh

học sẽ xâm chiếm vùng rễ hoặc nội sinh trong thực vật và thúc đây sự tăng trưởng

bằng cách gia tăng hàm lượng hoặc tính sẵn có của các nguồn dinh dưỡng thiết yếu

cho cây Theo định nghĩa này, nhiều loài thuộc chi Pseudomonas có tiềm năng rất lớntrong việc ứng dụng làm phân bón sinh học do có khả năng cô định đạm sinh học,làm giàu các chất hữu cơ cho đất thông qua sự sản sinh của các enzyme thủy phân,cải thiện tính chất vật lý và hóa học của đất, duy trì tính sẵn có của các chất dinhdưỡng trong đất (Tian và ctv, 2020)

1.4.1.1 Khả năng cố định nitơ

Nitơ là nguyên tổ thiết yếu cho tất cả các sinh vật sống va là nguồn dinh dưỡngquan trọng nhất ảnh hưởng đến sự tăng trưởng và năng suất của cây trồng Mặc dùchiếm tới 78% khí quyền, nhưng đáng tiếc là không có loài thực vật nào có khả năng

có định nitơ khí quyền vào các hợp chất chứa nitơ và sử dụng cho sự sinh trưởng pháttriển Trong khi đó, một số vi sinh vật lại có khả năng chuyên đổi nitơ trong khí quyềnthành ammonia (dạng nitơ được sử dụng bởi thực vật) sử dụng phức hợp enzymenitrogenase gọi là quá trình cố định đạm sinh học Trong suốt một thời gian dài, cácthành viên thuộc chi Pseudomonas được cho là không có khả năng cé định nitơ Tuynhiên, nhận định này đã phải thay đôi khi các chủng có định nitơ lần đầu tiên đượcbáo cáo bởi Proctor và Wilson (1958) Sau đó, Krotzky và Werner (1987) đã phânlập được 2 chủng từ rễ cây cao lương (Sorghum bicolor) You và ctv (1991) đã phanlập chủng Alcaligenes faecalis cô định nito từ lúa, chủng này sau đó được xác định

là P stutzeri Cho đến nay, các chung Pseudomonas cô định nitơ hầu hết được báocáo là P stutzeri Các điều kiện tôi ưu và câu trúc của các gene mã hóa cho enzyme

nitrogenase cũng đã được nghiên cứu chỉ tiết ở P stutzeri (Desnoues và ctv, 2003)

Các PRPR có định nitơ được chia thành: nhóm cộng sinh và nhóm sông tự do.Các chủng Pseudomonas cỗ định nito chủ yếu là các vi khuân sống tự do Cac gene

có định nitơ, được gọi là gene nifH tìm thấy 6 cả hai phương thức cộng sinh và không

cộng sinh Nhóm này bao gồm các gene cấu trúc tham gia vào sự hoạt hóa của cácprotein Fe, sinh tổng hợp các cofactor sắt, molypden, nhận điện tử và các gene điều

hòa cần cho sự sinh tông hợp, hoạt động chức năng các enzyme (Singh, 2015)

Một điều thú vị là rất nhiều PGPR có khả năng cô định nito, nhưng cơ chế dẫn

đến hiệu quả thúc đây tăng trưởng lại không phải từ việc cung cấp nguồn nitơ cho

thực vật Điều này cho thay rang: (1) có lẽ khả năng có định nito chỉ làm cho vi khuẩnthích nghi với cuộc sông ở vùng rễ (nơi mà hàm lượng nito rất thấp do sự hấp thu củathực vật), (2) mặc dù hàm lượng nito cố định có thể không có ý nghĩa trong nôngnghiệp nhưng lại thực sự có lợi với thực vật trong tự nhiên (Vessay, 2003).

1.4.1.2 Lam giàu dinh dưỡng cho đất nhờ quá trình phân hủy sinh học

Pseudomonas spp là nhóm vi sinh vật chiếm ưu thé trong đất và có khả năngphân hủy các chất hữu cơ phức tạp vô cùng hiệu quả Giúp tăng cường chất dinh

dưỡng cho đất thông qua việc phân hủy các vật liệu hữu cơ và làm gia tăng tính sẵn

có của các chất đinh dưỡng Egamberdieva (2007) đã nhận thay P alcaligenes PsA 15

kích thích sự tăng trưởng của bắp và tăng cường hấp thu dinh dưỡng trong điều kiệnđất nghèo dinh dưỡng Tương tự, Kavino và ctv (2010) đã báo cáo P fluorescens làmtăng sản lượng và hàm lượng dinh dưỡng của chuối (Musa spp.) đề nghị rằng các van

đề môi trường do sự lạm dụng phân hóa học có thể được tối thiểu hóa bằng việc áp

dụng hiệu quả các chủng PGPR (Nadeem và ctv, 2016).

1.4.1.3 Hòa tan các hợp chất chứa photpho

Lân (P) là nguyên tố then chốt thứ hai sau nitơ (N) trong dinh dưỡng cây trồng,đóng vai trò quan trọng trong các quá trình chuyên hóa chính của thực vật bao gồmquang hợp, chuyên hóa năng lượng, truyền tín hiệu, sinh tổng hợp các phân tử và hô

hap Mặc dù nguồn P luôn dồi dao và có sẵn trong các loại đất ở cả hai dạng hữu co

và vô cơ nhưng thực vật lại không thể sử dụng vì 95 - 99% P ton tại ở dạng không

tan và có định Thực vật chỉ có thé hap thụ P ở dạng hòa tan (H2PO4) và (HPO¿)?

Pseudomonas là một trong số những chi vi khuẩn có khả năng hòa tan phosphate

mạnh mẽ nhất Rất nhiều loài thuộc chi này như P fluorescens NJ-101, P fluorescensEM85, P aeruginosa, Pseudomonas sp., P chlororaphis, P savastanoi, P pickettii,

P lutea OK2, P rhizophaerae LMG21640, P graminis DSM11363, P striata và P corrugate đã được bao cao (Narayanan va ctv, 2009).

Những ảnh hưởng tích cực lên thực vật từ việc bồ sung các chung vi sinh vật cókhả năng hòa tan và khoáng hóa P hoặc phối hợp với các PGPR khác đã được chứngminh cả trong điều kiện in vitro lẫn ngoài đồng ruộng Mặc dù các vi sinh vật nàyluôn có sẵn trong đất, nhưng thông thường mật độ vi khuẩn không đủ hiệu quả đểcạnh tranh với các vi khuẩn vùng rễ khác Do đó, việc bồ sung dé gia tăng mật độ củacác vi sinh vật này tại vùng rễ là điều cần thiết (Ahmed và Shahab, 2012)

1.4.1.4 Hòa tan các hợp chất chứa Kali

Kali (K) là nguyên tổ thiết yếu thứ ba cho sự tăng trưởng thực vật sau N và P

Mặc dù K là nguyên tố phong phú thứ bảy trong vỏ quá đất, nhưng lượng K hòa tan

trong đất thường rất thấp (chỉ 1 - 2%), phần lớn tồn tại ở dạng khoáng không tan vàkhông thể hấp thụ bởi thực vật Quá trình thâm canh và bón phân không cân đối khiếncho lượng K dự trữ trong đất nhanh chóng cạn kiệt và hệ quả là sự thiếu hụt K đangtrở thành một trong những thách thức với sản xuất nông nghiệp Nếu không có đủ K,

hệ rễ kém phát triển, tăng trưởng chậm, cho hạt nhỏ và giảm năng suất (Jhala, 2017).1.4.2 Cảm ứng sự phát triển hệ rễ

Các PGPR không chỉ làm gia tăng tính sẵn có của các chất dinh đưỡng trong đất

mà còn cảm ứng mạnh mẽ sự phát triển của hệ rễ làm gia tăng diện tích bề mặt hấpthụ đinh dưỡng, đây cũng là đáp ứng phổ biến nhất ở thực vật khi được cấy với cácPGPR Trong đa số trường hợp, sự sản sinh phytohormone bởi PGPR được cho lànguyên nhân dẫn đến sự phát triển của hệ rễ (Vessay, 2003)

1.4.2.1 Su sản sinh Indole Acetic Acid (IAA)

Trong số các chat điều hòa tăng trưởng thực vat, IAA là auxin tự nhiên phổ biến

nhất được tìm thấy ở thực vật và có tác động đối với sự phát triển của rễ Có tới 80%

vi khuẩn vùng rễ có thể tổng hợp IAA Sự sản sinh IAA của vi khuẩn kết hợp với

auxin nội sinh từ thực vật ảnh hưởng đến sự phân chia, kéo dài, biệt hóa tế bào, khởiphát sự hình thành rễ bên, rễ bất định làm gia tăng bề mặt và chiều dài rễ vì thế cung

cấp cho thực vật nhiều khả năng hap thụ dinh dưỡng từ đất Đối lại, IAA vi khuẩn

noi lỏng thành tế bào rễ và dẫn tới sự gia tăng lượng dịch tiết rễ, cung cấp thêm chatdinh dưỡng cho sự tăng trưởng của vi khuẩn Khi nồng độ IAA trong cây ở mức tối

ưu, việc bổ sung IAA từ vi khuẩn có thể có các hiệu quả trung tính, tích cực hoặc tiêucực lên sự tăng trưởng của thực vật Xử lý cây cải dầu với chủng Pseudomonas putidađột biến mat khả năng sinh [AA đã thúc đây sự kéo dài rễ, xác nhận auxin vi khuẩnsản sinh ở nồng độ cao có thé giảm chiều dài rễ (Patten và Glick, 2002)

Tryptophan (Trp) là một amino acid thường được tìm thấy trong dịch tiết rễ, làtiền chất cho việc sinh tổng hợp IAA bởi vi khuẩn Có ít nhất năm con đường tônghợp IAA ở vi khuẩn đã được mô ta và hầu hết cho thấy sự tương đồng với những conđường đã được mô tả ở thực vật, chỉ khác một vài chất trung gian: (1) con đường

thông qua indole-3-pyruvic acid và indole-3-acetic aldehyde được tìm thấy ở phần

lớn vi khuẩn như Erwinia herbicola, Agrobacterium, Pseudomonas, Bradyrhizobium,Rhizobium, Azospirillum, Klebsiella, va Enterobacter; (2) con đường thông qua sự hình thành tryptamine như ở Pseudomonad va Azospirilla; (3) con đường thong qua

sự hình thành indole-3-acetamide đã được báo cáo ở các vi khuẩn gây bệnh thực vậtnhư Agrobacterium tumefaciens, P syringae và E herbicola; các loài Pseudomonadhoại sinh như P putida và P fluorescens; (4) con đường chuyên đổi tryp thànhindole-3-acetonitrile được tìm thay ở cyanobacterium (Synechocystis sp.) và (5) con

đường không phụ thuộc vào tryp, phổ biến hơn ở thực vật nhưng cũng được tìm thấy

ở azospirilla va cyanobacteria (Ahemad va Kibret, 2014).

Các nhân tô môi trường ảnh hưởng tới khả năng sinh tong hợp IAA ở vi khuẩnbao gồm pH acid, stress thâm thấu, chất nền và sự giới hạn nguồn carbon Bên cạnh

đó, yếu tố đi truyền bao gồm vị trí gene và kiểu biểu hiện của gene cũng ảnh hưởngtới mức độ sản sinh IAA Ở Pseudomonas savastanoi pv savastanoi, các gene nàyđịnh vi trên plasmid trong khi ở Pseudomonas syringae pv syringae, các gene nàyđịnh vị trên nhiễm sắc thé (NST) Các gene định vi trên plasmid thường hiện diện

nhiều bản sao, hệ quả là lượng IAA san sinh bởi P savastanoi pv savastanoi cao hơn

so với P syringae pv Sự sản sinh IAA ở P syringae pv syringae cũng có thé gia

tăng nhiều lần bằng cách chuyên vào một plasmid đa ban sao mang operon sinh tổng

hợp IAA Tuy nhiên, ké cả ở nồng độ thấp, các phytohormone nguồn gốc vi khuẩnvẫn có thể đạt hiệu quả cao do được sản sinh liên tục và tiết ra ngay trên bề mặt rễ(Singh, 2015).

1.4.3 Bảo vệ thực vật chống chịu các điều kiện bắt lợi của môi trường

Điểm mau chốt dé một chủng PGPR có thể hoạt động hiệu quả trong điều kiệnthực tế là khả năng ton tại trong điều kiện sông bất lợi và liên tục thay đôi.Pseudomonas spp có kha năng biến dưỡng vô cùng linh hoạt và khả năng tôn tạitrong những điều kiện stress đa dạng Sự hình thành biofilm và sản sinhexopolysaccharide (EPS) không chỉ giúp chống chịu với stress hạn, stress mặn, nhiệt

độ cực đoan, nồng độ cao của các chất ô nhiễm mà còn có thể bảo vệ thực vật duy trì

được sự tăng trưởng ôn định dưới những điều kiện stress này EPS có thê liên kết vớicác cation, bao gồm cả Na" cho thấy vai trò trong việc giảm nhẹ stress mặn cho thực

vật Trong trường hợp stress hạn, EPS giúp vi khuẩn duy trì được sự tăng trưởng vừabảo vệ thực vật khỏi sự khô hạn (Singh, 2015).

1.5 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Pseudomonas có hoạt tính kích thích tăngtrưởng thực vật ở ngoài nước và trong nước

1.5.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

VỊ sinh vật kích thích tăng trưởng thực vật được xem là những công cụ tiềmnăng cho sản xuất nông nghiệp bền vững và là xu hướng phát triển cho tương lai.Trên thế giới các nhà khoa học đã nghiên cứu đề tìm hiểu thêm về sự thích nghi của

vi sinh vật kích thích tăng trưởng vùng rễ, cơ chế của rễ, hiệu ứng sinh lý, sinh hóa

và sự kích thích tăng trưởng ở những loài này để sản xuất các loại phân bón vi sinhphục vụ cho sự phát triển của nông nghiệp Trong số các vi sinh vật liên quan đếnthực vật, vi khuân vùng rễ kích thích tăng trưởng thực vật đã có hiệu quả trong việccải thiện khả năng chịu stress của thực vật Xác định và sử dụng các vi sinh vật chịu

mặn không chỉ có thể tăng cường khả năng chịu mặn của cây trồng mà còn giảm áplực lên vùng trồng trọt (Etesami và ctv, 2017).

Nghiên cứu của Pandey và ctv (2020) cho thấy rang Pseudomonas sp chủng S3

có thể được khám phá như một chất kích thích tăng trưởng thực vật hiệu quả, kíchthích tăng trưởng và cải thiện khả năng phục hồi của cây cà chua trong điều kiệnnhiễm mặn Pseudomonas stutzeri ISE12 kích thích tăng trưởng và giảm thiêu áp lực

do nhiễm mặn đối với lúa mạch Tăng cường kiểm soát sinh học cho cây trồng với

các chủng vi khuân chịu mặn có thể làm giảm stress mặn và thúc đây sự phát triển

của cây trồng (Szymanska va ctv, 2022) Nghiên cứu của Vimal và ctv (2018), khảosát sự ảnh hưởng của hai chủng vi khuẩn Bacillus sp và Pseudomonas sp chịu mặnlên sự phát triển của lúa mì trong điều kiện đất nhiễm mặn Kết quả cả 2 chủng đều

có tính hiệu quả trong việc thúc đây tăng trưởng thực vật So với chủng Pseudomonas

sp hạt lúa mì được cấy chủng Bacillus sp giúp tăng chiều cây thêm 32,32%, chiềudài rễ tăng 37,84%, trọng lượng tươi tăng 28,2% và trọng lượng khô tăng 15,51%

Những nghiên cứu trước đây đều tập trung vào các vi khuân thuộc chỉ

Rhizobium, Azotobacter, Azospirillum có khả năng sinh tông hợp IAA Sau này cáccông trình lại tập trung nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp IAA của vi khuẩn thuộcchi Pseudomonas (Cassan và Diaz-Zorita, 2016) Các nghiên cứu về sử dụng các visinh vật có khả năng sinh IAA giúp kích thích tăng trưởng thực vật hiệu quả Nghiêncứu của Phour và Sindhu (2020), đã phân lập vi khuẩn Pseudomonas argentinensis

chủng HMM5S57 và P azotoformans chủng JMM15 có khả năng sinh trưởng tốt ở nồng

độ muối 8% NaCl, sinh tổng hợp IAA, hòa tan photpho và kích thích sự tăng trưởngcây cải xanh như chiều dài thân, chiều dài rễ, sinh khối cây trong điều kiện mặn, cótiềm năng lớn trong ứng dụng làm phân bón sinh học trong đất nông nghiệp bị ảnhhưởng mặn Nghiên cứu Khumairah và ctv (2022), đã phân lập chủng vi khuẩnPseudomonas stutzeri S3 có khả năng sinh tông hợp IAA, hòa tan photpho, cải thiện

sự phát triển của cây lúa trong điều kiện stress mặn Nghiên cứu của Iqbal và Hasnain(2013), các chủng PNS-4, PNS-6 và PNS-15 được xác định bằng giải trình tự gen

16S rRNA cho thấy sự tương đồng tối đa với Pseudomonas mendocina (99%),

Pseudomonas alcaliphila (99%) và Pseudomonas sp (99%) tương ứng Các chủngchọn lọc được phát hiện có khả năng sản xuất auxin có và không có sự bố sung L-

tryptophan ngoại sinh, một tiền chất chính cho quá trình tổng hợp sinh hoc auxin và

là thành phần quan trọng của dịch tiết ra từ rễ cây Hiệu quả của các chủng này đốivới sự phát triển của cây lúa mì đã được kiểm tra trong điều kiện phòng thí nghiệm

và ngoài đồng ruộng Tất cả các loài Pseudomonas được phát hiện cải thiện đáng kể

tỷ lệ nảy mầm của hạt và các thông số tăng trưởng (chiều dài chdi, rễ, trọng lượngtươi và khô) của cây lúa mì.

Các nghiên cứu mới cũng đã chứng minh các vi sinh vật cố định nitơ, có khảnăng hòa tan photpho, sinh các enzyme ngoại bào và tạo màng sinh học có khả năng

kích thích tăng trưởng thực vật Nghiên cứu của Ghadamgahi và ctv (2022), đã phan

lập được chủng Pseudomonas aeruginosa FG106 từ vùng rễ cây cà chua có khả năngsinh enzyme protease, lipase, đồng thời tao ra siderophore, cố định nito, hòa tanphotpho, sinh tổng hợp IAA và màng sinh hoc biofilm giúp thúc day sự phát triển củathực vật, kiểm soát sinh học, có khả năng bảo vệ tốt, chống lại mầm bệnh trên cácloại cây trồng Nghiên cứu của Lami va ctv (2020), đã phân lập Pseudomonas stutzeriMJL19 cải thiện tỉ lệ nảy mầm của hạt đậu nành, thúc day sự tăng trưởng của câytrong điều kiện mặn nhờ khả năng chịu mặn, hòa tan photpho, sinh tổng hợp JAA,tạo mang sinh học và có tiềm năng ứng dụng tạo chế phẩm phân bón sinh học chocây trồng Nghiên cứu của Li va ctv (2022), chủng Pseudomonas sp CM11 có tác

động đến hiệu suất của cây trồng, tập trung vào sự phát triển của rễ và cho thay khả

năng thúc đây tăng trưởng thực vật trong mô hình các loài cây trồng khác nhau, cảithiện các đặc điểm về thể trạng của cây trồng như chồi lớn, đâm chéi nhanh hơn vanăng suất hạt cao hơn Nghiên cứu của Singh va ctv (2023), hai chủng Pseudomonaskoreensis CY4 và Pseudomonas entomophila CN11 có khả năng thúc đây sự pháttriển của cây mía, có tiềm năng được sử dụng như một loại phân bón sinh học, hấpthụ nitơ và giảm lượng phân bón nitơ hóa học trong cánh đồng nông nghiệp Nghiêncứu của Costa-Gutierrez và ctv (2020), Pseudomonas putida KT2440 có khả năngthúc đây tăng trưởng thực vật, có khả năng sinh trưởng ở nồng độ muối cao, có đặc

tính sinh tổng hợp IAA và hòa tan photpho giúp cải thiện đáng ké kha năng nảy mầmcủa hạt, chiều dài rễ và thân của cây đậu tương và ngô trong điều kiện mặn

1.5.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

So với thế giới thì tình hình nghiên cứu trong nước về PGPR còn khá khiêmtốn, tập trung chủ yếu vào hướng nghiên cứu phân lập, tuyên chọn chủng, khảo sát

một số đặc điểm sinh hóa liên quan như khảo sát các vi sinh vật có khả năng chịu

mặn, sự tông hợp IAA, khả năng cố định nito và hòa tan photpho ảnh hưởng đến khả

năng thúc đây tăng trưởng thực vật, đánh giá hiệu quả tác động lên thực vật hoặc hiệu

quả kiểm soát sinh học Nghiên cứu của Thái Thành Được và Nguyễn Hữu Hiệp(2022), đã phân lập được 50 dòng vi khuân có khuẩn lạc phát triển mạnh trên 3 loạimôi trường vô đạm và có khả năng tổng hợp amoni trong môi trường lỏng tại ngày 2,

4 và 6 nuôi cấy có trung bình dao động từ 0,82 mg/L đến 4,28 mg/L Sáu dòng vikhuẩn có khả năng có định nitơ tốt nhất được giải trình tự gene 16S rRNA thuộc 3

chi khác nhau gồm Bacillus, Pseudomonas và Klebsiella Nghiên cứu của Chu

Nguyên Thanh va ctv (2020), đã phân lập được 7 chủng vi khuẩn thuộc chỉPseudomonas từ Bến Tre, có kha năng sống trên điều kiện mặn Trong đó 3 chủng vikhuẩn BT00S02, BT00P03 và BT02E01 được chon lọc dựa trên khả năng hòa tanphotpho, cô định nitơ và sinh tong hợp IAA Chung vi khuân BT00P03 có khả năngkích thích tăng trưởng cây đậu phộng cả trong điều kiện bình thường và điều kiệnstress mặn, cho thay tiềm năng của chủng này trong thực hành nông nghiệp bền vững.Nguyễn Đức Thành và ctv (2019), đã phân lập được 2 chủng vi khuẩn Pseudomonasoryzihabitans T2917 và Burkholderia sp T3602 từ vùng dat trồng bưởi Da xanh vùngđất nhiễm mặn ở tỉnh Bến Tre có khả năng chịu nồng độ muối NaCl > 3%, có hoạttính phân giải lân vô cơ, có tiềm năng trong sản xuất chế phẩm vi sinh sử dụng trongnông nghiệp, đặc biệt ở vùng đất bị nhiễm mặn Nghiên cứu của Nguyễn Thị HuỳnhNhư va ctv (2013) đã phân lập và tuyển chọn vi sinh vật nội sinh trên cây chuỗi có

khả năng sinh IAA Trong khi đó các dòng vi khuẩn trên môi trường NFb cho kết qua

tong hop IAA tốt hơn, hai dòng D1 và D5 cho kết quả cao nhất với nồng độ IAA lầnlượt là 3,16 g/mL và 3,07 pg/mL So sánh mức độ tương đồng chuỗi nucleotide 16S

rRNA, đòng N12 được xác định là vi khuân Achromobacter sp với độ tương đồng97%, dòng DI là loài Pseudomonas aeruginosa với độ tương đồng 94% Nghiên cứucủa Chu Nguyên Thanh va ctv (2018), đã đánh giá khả năng kích thích tang trưởngthực vật của hai chủng Pseudomonas phân lập từ vùng rễ cây bắp Kết quả nghiêncứu bước dau cho thấy hai chủng vi khuân khảo sát thuộc chi Pseudomonas Cả hai

chủng đều thể hiện những đặc điểm có lợi trong điều kiện sinh trưởng của thực vật

trong điều kiện in vitro lẫn điều kiện thực nghiệm trong nhà lưới, cho thay tiềm năngtrong thực hành nông nghiệp Kết quả nghiên cứu tạo tiền đề cho những nghiên cứutiếp theo nhằm phát triển một chế phẩm ứng dụng trong thực tế Nghiên cứu củaNguyễn Thu Hương va ctv (2018), từ các mẫu dat thu thập ở các xã thuộc huyện GiaLộc, Hải Dương, 14 chủng vi khuẩn có khả năng phân giải phosphate khó tan đã đượcphân lập và tuyên chọn Trong đó, hai chủng GL2 và HD3 biểu hiện hoạt tính phângiải photpho cao nhất, có khả năng sinh tổng hợp IAA, siderophore, sinh trưởng vàbiểu hiện hoạt tính phân giải phosphate mạnh nhất khi được nuôi trong môi trườngNBRIP với nguồn carbon là glucose va fructose, nguồn nitơ là cao nắm men hoặc cácmuối (NH4)2SO4, NHsH2PO4, NH4NO3 tại 30°C, pH 5-7 Chung vi khuẩn HD3 đượcđịnh danh và ký hiệu là P aeruginosa HD3 Nghiên cứu của Nguyễn Hữu Hiệp vàctv (2019), hai dòng vi khuẩn Pseudomonas stutzeri HP1 và Pantoea agglomeransHP2 đã giúp cho cây lúa tăng chiều cao cây, chiều dai rễ, số chồi/bụi, số bông/bụi,giúp giảm được một lượng đáng kể phân đạm và lân khuyên cáo góp phan làm giảmchỉ phí, tăng lợi nhuận cho nông dân và góp phần làm giảm thiêu ô nhiễm môi trường

để hướng đến nền nông nghiệp sạch và bền vững

Chương 2VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian thực hiện: tháng 01 năm 2023 đến tháng 11 năm 2023

Địa điểm thực hiện đề tài: Khoa Khoa học Sinh học và Viện nghiên cứu Côngnghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm Thành Phó Hồ Chi Minh.2.2 Vật liệu

2.2.1 Mẫu đất

Thu thập 20 mẫu đất nhiễm mặn gồm 5 mẫu đất trồng lúa ở xã An Bình Tây

huyện Ba Tri, 10 mẫu đất trồng sầu riêng ở xã Tân Phú huyện Châu Thành và 5 mẫu

dat trồng cam ở xã Châu Hòa huyện Giồng Trôm tỉnh Bến Tre Mẫu đất được lay ở

độ sâu tầng đất 0 - 30 cm, 0,5 kg đất/mẫu, cho vào lọ nhựa sạch, ghi thông tin mẫuthu thập, vị trí lay mẫu Mẫu được lưu trữ mát chuyên về phòng thí nghiệm Mẫu đất

được phân tích chỉ tiêu pH, EC (dS/m) và nồng độ muối hòa tan (1 dS/m = 0,64%)

trong vòng 24 giờ bằng máy đo EC và máy đo pH

2.2.2 Dung cụ thiết bị, hóa chat, thuốc thử và môi trường nuôi cấy

2.2.2.1 Dụng cụ và thiết bị

Tủ cấy, tủ định ôn, máy lắc, máy votex, micropipet, tu mát, nồi hấp, máy li tâm,

ống nghiệm, đĩa petri, que cấy thủy tinh, que cấy vòng, đèn cồn, đầu tip 1000 pL, đầutip 100 uL, máy đo pH và máy do EC.

2.2.2.2 Môi trường nuôi cấy

Tryptone soya broth (TSB) của hãng Hi - media: Pancreatic digest of Casein

(17 g/L); Enzymatic digest of soya bean (3 g/L); NaCl (5 g/L); K2HPOs (2,5 g/L);

Glucose (2,5 g/L) Hap khử trùng ở 121°C/1atm, pH sau khi hap đạt 7,3 + 0,2 ở 25°C

Trong các thí nghiệm liên quan đến sự sản sinh IAA, Tryp đã được bồ sung vào môitrường ở nồng độ cuối là 0,1 g/L (TSB*).

Tryptone soya agar (TSA) của hãng Hi-media: Pancreatic digest of Casein (17

g/L); Enzymatic digest of soya bean (3 g/L); NaCl (5 g/L); KoHPOs (2,5 g/L);Glucose (2,5 g/L); Agar (15 g/L) Hap khử trùng ở 121°C/latm, pH sau khi hap đạt7,3 + 0,2:6 25°C.

Môi trường King B: peptone (20 g/L); glycerol (10 ml/L); asparagine (2,25 g/L);K2HPOs (1,5 g/L); MgSOa.7HaO (1,5 g/L); agar (20 g/L) Môi trường được bồ sungkháng sinh chloramphenicol 5 mg/L dé hạn chế sự phát triển của các vi khuẩn khác

Môi trường Pikovskaya Agar: Glucose (10 g/L); (NH4)2SOsa (0,5 g/L); NaCl (0,2

g/L); MgSOa.7H2O (0,1 g/L); KCl (0,2 g/L); Yeast extract (0,5 g/L); MnSO4.H20(0,002 g/L); FeSOx.7H›O (0,002 g/L) Hap khử trùng ở 121°C/latm Các nguồn P vô

cơ như Ca3(PO4)2; AlPO4; bột quặng P hoặc các nguồn P hữu cơ như lecithin đượchap khử trùng riêng rẽ và b6 sung vào môi trường ở nồng độ cuối cùng là 5 g/L Điềuchỉnh pH đạt 7,0 + 0,2 ở 25°C.

Môi trường Burk: Sucrose (20 g/L); KH2POs (0,41 g/L); KoHPOs (0,68 g/L); MgSO¿.7H2O (0,1 g/L); NazSOa (0,05 g/L); NazMoOa (0,0025 g/L); CaCl2 (0,2 g/L); FeSOa.7H2O (0,005 g/L) va agar (20 g/L).

2.2.2.3 Các loại thuốc thử

Thuốc thử Salkowski: 0,5 M ferric chloride (FeCls) và 98% acid sunfuric

Thuốc thử Nessler: Nessler A: cân 36 g KI pha trong 100 mL nước cất Cân

13,55 g HgCla pha trong bình định mức 1000 mL với nước cất Trộn 2 dung dịch trênlại với nhau Nessler B: cân chính xác 50 g NaOH hòa tan trong bình định mức vớinước cất vừa đủ 100 mL Trộn 100 mL (dung dich A) và 30 mL (dung dịch B) lắcđều hỗn hợp này, gạn phần nước trong Bảo quản dung dịch trong chai nâu

Muối Xe-nhiet (Natri kalitactract): cân 50 g KNaCaH4Os trong 100 mL nước.Thuốc thử Lugol: cân 2 g KI và 1 g Iod, thêm vào 2 mL nước Lắc hoặc đun cho

đến khi hòa tan hoàn toàn, bổ sung thêm cho đủ 300 mL nước Bao quản trong bình

tối ở nhiệt độ phòng trong một tháng

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nội dung 1: Phân lập vi khuẩn Pseudomonas spp từ đất nhiễm mặn

2.3.1.1 Phuong pháp phân lập vi khuẩn Pseudomonas spp

Cân 10 g mau đất cho vào bình tam giác có chứa sẵn 90 mL nước cất vô trùng,lắc trong 30 phút, ở tốc độ 120 vòng/phút Dé yên 3 phút sau khi lắc Lay 1 mL dịch

mẫu ở độ pha loãng 10°! cho vào ống nghiệm tiếp theo có chứa 9 mL nước muối được

dịch huyền phù có độ pha loãng 102 Sau đó pha loãng tiếp tục đến khi dung dịch có

độ pha loãng 103 đến 10° rồi hút 0,1 mL dung dịch sang dia petri chứa môi trường

King B có b6 sung 1% NaCl cấy trải đều Sau 3 ngày, quan sát va chọn những khuẩnlạc đơn, các khuẩn lạc phát huỳnh quang dưới đèn UV có bước sóng 365 nm đặctrưng trên môi trường King B, dùng que cấy lấy khuan lạc đặc trưng đó, ria sang đĩachứa môi trường King B, quá trình này được thực hiện nhiều lần cho đến khi trên đĩaxuất hiện các khuân lạc đơn đồng nhất (Ngô Lê Phương Trinh và ctv, 2017)

2.3.1.2 Phương pháp giữ giống vi khuẩn Pseudomonas spp

Giữ giống thuần: cấy ria vi khuân đã thuần qua ống thạch nghiêng chứa 10 mLmôi trường King B, làm nút bông, bảo quản trong tủ lạnh 10°C, hoặc giữ trong dungdịch glycerol 20 % có bổ sung pepton 1 % để giữ đông ở nhiệt độ -20°C (Ngô LêPhương Trinh và ctv, 2017).

2.3.1.3 Xác định mật độ vi khuẩn Pseudomonas spp

Số lượng tế bao vi khuẩn được xác định bằng phương pháp pha loãng bật 10 và

nuôi cấy trên môi trường King B Mẫu được lắc đều dùng pipet vô trùng hút 1 mL

dịch chứa vi khuẩn cho vào ông chứa 9 mL dung dịch muối sinh lý vô trùng, trộn đều.Sau đó pha loãng đến nồng độ thích hợp tuỳ theo mật độ vi sinh vật ở mẫu Lay 0,1

mL dịch pha loãng ở nồng độ thích hợp cấy trang trên môi trường thạch King B Mỗinồng độ cấy trang 3 đĩa và đếm số khuẩn lạc (Ngô Lê Phương Trinh va ctv, 2017)

Các đĩa được ủ ở 30°C trong tủ định ôn Sau 48 giờ đến 72 giờ thì đếm số lượngkhuẩn lạc vi khuẩn trên từng đĩa và tính theo công thức:

yc

(n1+0,1xn2).v.d

CFU/(mL) =

Trong đó:

® C: tổng số khuẩn lạc đặc trưng đếm được ở 2 độ pha loãng liên tiếp

nl: số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ 1

n2: sô đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ 2

v: thể tích mẫu cấy trang (mL)

d: độ pha loãng thứ 1 có số khuẩn lạc/đĩa petri nằm trong khoảng đếm

2.3.1.4 Nuôi cấy và chuẩn bị huyền phù vi khuẩn

Ra đông dich bảo quản vi khuẩn và cấy 100 pL vào ống nghiệm chứa 10 mL

môi trường King B Nuôi cấy ở 30°C trong tủ lắc nhiệt với tốc độ lắc 150 vòng/phúttrong 24 giờ Mật độ vi khuẩn sau tăng sinh được ước lượng thông qua giá tri OD 600

nm Huyền phù vi khuân được pha loãng về giá trị thích hợp OD 600 nm = 0,1 tương

ứng 108 CFU/mL (Chu Nguyên Thanh và ctv, 2020).

2.3.2 Nội dung 2: Khảo sát các đặc điểm sinh hóa và các đặc tính sinh học củacác chủng vi khuẩn Pseudomonas spp

2.3.2.1 Mô tả đặc điểm vi khuẩn

Mô tả đặc điểm khuẩn lạc: đo kích thước, mô tả hình thái khuẩn lạc bao gồm

các chỉ tiêu màu sắc, hình dang, độ nôi, dang bia khuan lac, hinh dang té bao.

Mô tả một số đặc điểm tế bao:

Nhuộm gram: mục đích cho phép quan sát hình thái, kích thước tế bào, kiểm trađược vi khuan thuộc gram âm hay gram dương

Các bước thực hiện: chuẩn bị lam sạch, nhỏ một giọt nước muối sinh lý lên lam

kính, dùng que cấy vòng lấy một ít sinh khối khuẩn lạc phết vào giọt nước và hơ nhẹqua ngọn lửa đèn cồn đến khi khô dé cố định mẫu Nhỏ một đến hai giọt crystal violetlên mẫu chờ 1 phút, rửa mẫu dưới vòi nước chảy nhẹ Tiếp tục phủ một đến hai giọtdung địch lugol trong 1 phút, rửa dưới vòi nước chảy nhẹ Nhỏ cồn 90° lên lam,nghiêng đi nghiêng lại để cho cồn chảy khắp bề mặt lam, rửa nhanh dưới vòi nước

chảy nhẹ và lặp lại cho đến khi vừa phai hết màu tím trên lam kính Nhỏ 1 đến 2 giọtdung dịch safranine, dé yên trong 30 giây, rửa đưới vòi nước chảy nhẹ Tham khô

lam kính giữa 2 lớp giấy thấm, quan sát bằng vật kính dầu (100X) và ghi nhận kết

quả Kết quả: mẫu có màu tím là gram dương (+), màu hồng đỏ là gram âm (-) và xác

định được hình dạng tế bào vi khuẩn (Cappucino và Welsh, 2018)

Phản ứng catalase: mục đích dé phát hiện vi sinh vật có hệ enzyme catalase Vikhuan được nuôi cấy trên môi trường King B agar trong 24 giờ Nhỏ 1 đến 2 giọtthuốc thử H2O2 3% lên lam kính sạch, sau đó dùng que cấy lấy một khuẩn lạc đưavào giọt thuốc thử, quan sát hiện tượng Phản ứng dương tính (+) sẽ tạo ra bọt khí,ngược lại phản ứng âm tính (-) không tạo bọt khí (Cappucino va Welsh, 2018).

Phản ứng oxidase: mục đích để xác định sự có mặt của enzyme cytochromeoxidase của vi khuan Day là nhóm enzyme cuối cùng vận chuyên electron đến oxyphan tử tạo thành nước trong chuỗi hô hấp Dùng que cấy lay một khuẩn lạc cần kiêmtra phết lên đĩa giấy có tâm dung dịch thuốc thử phản ứng oxidase Phản ứng đươngtính khi đĩa giấy xuất hiện màu tim đen (Cappucino va Welsh, 2018)

2.3.2.2 Khao sát các hoạt tính sinh học của các chủng Pseudomonas spp.

a) Khảo sát khả năng chịu mặn

Kha năng chịu mặn được khảo sat bằng cách: nuôi các chủng vi khuẩn trong các

môi trường King B lỏng có bổ sung các nồng độ muối NaCl khác nhau 3%, 4%, 5%,

6%, 7% ở 30°C sau 24 - 48 giờ Đếm mật độ vi khuẩn khi tiến hành cấy trang trên

King B agar với từng nồng độ pha loãng thích hợp Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3lần (Ngô Lê Phương Trinh và ctv, 2017)

b) Khảo sát khả năng sinh tong hợp IAA bằng phương pháp Salkowski

Các chủng vi khuân sau khi làm thuần được nuôi cấy trên môi trường King B

lỏng bổ sung 0,1% Tryptophan, nuôi lắc 125 vòng/phút, ủ trong tối 30°C trong 72giờ Sau thời gian 3 ngày đem dịch ly tâm 3500 vòng/phút trong 20 phút dé thu laydich trong Lay 2 mL dịch trong cho vào 8 mL thuốc thử Salkowski Đối chứng là 2

mL môi trường tăng sinh King B không có dịch khuẩn và 8 mL thuốc thử Salkowski

Phản ứng so màu với thuốc thử Salkowski tạo sản phâm có màu, đo cường độ

màu trên máy quang phổ so màu ở bước sóng 530 nm, dựa vào đồ thị chuẩn IAA sẽ

xác định được hàm lượng JAA Hàm lượng IAA được tinh theo đơn vi ng IAA/mL

(Glickmamn và Dessaux, 1995).

c) Khảo sát khả năng cố định nito của vi khuẩn Pseudomonas spp bằng phương

pháp so màu với thuốc thử Nessler

Tăng sinh các dòng vi khuẩn trong môi trường Burk lỏng không đạm, trên máylắc 60 vòng/phút, ở nhiệt độ phòng trong 4 ngày, thí nghiệm lặp lại 3 lần Xác địnhnồng độ NH4* theo nguyên tắc Amoni trong môi trường kiềm phản ứng với thuốc thửNessler (KzHgl¿), tạo thành phức có màu vàng hay vàng nâu sam Định lượngammoium (NH¿?) do vi khuẩn tạo ra ở ngày thứ 4 sau khi bổ sung vi khuẩn vào môi

trường Hút 50 mL dịch vi khuẩn đã ly tâm và thêm 0,5 mL dung dich Xe nhiet, 1 mL

thuốc thử Nessler Lắc đều, sau 10 phút tiến hành đo độ hap thu mau (OD) ở bướcsóng 425 nm, thé giá trị OD42snm vào phương trình đường chuẩn, suy ra nồng độ NH4"(Phạm Thị Ngọc Lan và Nguyễn Thị Việt, 2016)

d) Khảo sát khả năng hòa tan photpho

Vi khuân được tăng sinh trong môi trường King B lỏng, ủ 30°C trong 24 giờ, cấyhuyền phù vi khuẩn (OD600 nm = 0,1) tại 3 điểm, mỗi điểm 0,5 uL dịch khuẩn trênmôi trường Pikovskaya Agar Chờ khô rồi ủ ở 30°C trong 3 ngày Sự hiện diện củavòng tan xung quanh khuẩn lạc chỉ ra khả năng hòa tan photpho Chỉ số hòa tanphotpho được tính bằng cách lấy tổng đường kính vòng tan (khuẩn lạc + vòng tan)chia cho đường kính khuẩn lạc (Chu Nguyên Thanh và ctv, 2020)

e) Xác định khả năng hình thành màng biofilm

Chuẩn bị huyền phù vi khuẩn (OD600 nm = 0,1) Cay 100 uL vào ống nghiệmthủy tinh chứa 10 mL môi trường TSB Nuôi cấy ở 30°C trong 48 giờ đến 72 giờ,nhẹ nhàng đồ bỏ dịch nuôi cấy Rửa ống nghiệm với nước cất, để khô rồi nhuộmdung dich Crystal Violet 0,1 % trong 30 phút ở nhiệt độ phòng Đồ bỏ thuốc nhuộm

và rửa bằng nước cất 3 lần Sự hình thành biofilm trên thành ống được phát hiện khi

có một vạch hoặc các mảng bắt màu thuốc nhuộm bám trên thành hoặc đáy ốngnghiệm (Tran Thúy Hang, 2011)

f) Khao sat kha nang sinh cac enzyme ngoai bao

Mục đích: đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào của các dòng vi khuẩnbằng phương pháp đục lỗ thạch

Cách tiến hành: các chủng vi khuân được nuôi tăng sinh trong môi trường King

B lỏng ở 30°C trong 48 giờ Dịch nuôi cấy ly tâm 5000 vòng/phút ở 4°C trong 15

phút, thu dich lỏng phía trên được enzyme thô Đồng thời tiến hành đục lỗ trên môi

trường King B agar có bổ sung cơ chất với đường kính mỗi lỗ là 5 mm Sau đó nhỏ

40 uL dịch ly tâm đã thu đối với mỗi chủng vi khuẩn vào lỗ thạch Ủ ở 30°C trong

48 giờ để cho lượng dịch trong lỗ thạch phân hủy cơ chất Quan sát vòng phân giảitạo thành Hoạt tính enzyme của các chủng vi khuẩn tuyển chọn được tinh bằng đườngkính vòng phân giải (AD):

AD=D-d(mm) Trong đó

D: đường kính vòng phân giải (mm)

2.3.3 Nội dung 3: Khảo sát khả năng thúc day tăng trưởng cà chua của các chủng

vi khuẩn Pseudomonas sp trong điều kiện stress mặn

2.3.3.1 Khảo sát tỉ lệ nảy mầm của hạt cà chua trong điều kiện stress mặn khiđược xử lý với vi khuẩn ở điều kiện in vitro

Hat cà chua được khử trùng bề mặt với cồn 70% trong 1 phút, dung dịch javen

5% trong 5 phút và rửa lại nhiều lần với nước cất khử trùng Thí nghiệm được thựchiện trên dia petri chứa môi trường water agar được bồ sung các nồng độ muối NaClkhác nhau: 0%, 0,2% và 0,4% và 0,6% (Pandey va ctv, 2020), hat được ngâm vớinước cất trong 60 phút trước khi gieo Tỉ lệ nảy mầm của hạt được ghi nhận sau 72giờ Tại nồng độ gây ức chế 50% tỉ lệ nảy mầm, khảo sát hiệu quả của vi khuẩn lên

sự nảy mầm của hạt Hạt được khử trùng sau đó ngâm trong huyền phù vi khuan 108CFU/mL (OD600 nm = 0,1) trong 60 phút trước khi gieo Mỗi nghiệm thức gieo 30hạt Các nghiệm thức được lặp lại 3 lần

2.3.3.2 Khảo sát khả năng chống chịu với stress mặn của cây cà chua khi được

xử lý với vi khuẩn ở điều kiện ngoài nhà lưới

Hạt cà chua được khử trùng trước khi gieo Cây con 14 ngày tuổi với 2 lá mầmđược chuyên ra chậu Cây con được trồng trong chậu (4 kg đất trồng/chậu) Dat trồng

gồm xơ dừa, đất sạch, đất tribat với tỉ lệ (1:1:1), trộn đều và được hấp khử trùng

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 6 nghiệm thức, mỗi nghiệmthức 15 chậu cây cà chua:

NTO: không stress mặn và không bổ sung khuẩn

NTI: stress mặn 0,4% muối và không bổ sung khuẩn

NT2: không stress mặn, bổ sung vi khuẩn P3 (108 CFU/mL)

NT3: stress mặn 0,4% muối và bố sung vi khuân P3 (108 CFU/mL)

NT4: không stress mặn và b6 sung vi khuẩn P5 (108 CFU/mL)

NTS: stress mặn 0,4% muối và bổ sung vi khuẩn P5 (108 CFU/mL)

Thí nghiệm không sử dụng phân bón hóa học Các chậu được tưới nước hai lầnmột ngày Dịch huyền phù vi khuân mật độ 108 CFU/mL được tưới lên gốc mỗi chậu

50 mL (7 ngày/lần) (Pandey và ctv, 2020)

Các nghiệm thức stress mặn 0,4% NaCl: mỗi chậu đất được bồ sung | lần với

4 g NaCl/kg đất (4 kg đất trồng/chậu) trộn đều ở các nghiệm thức stress mặn

Cây con 14 ngày tuôi với 2 lá mam được trồng trong chậu, đồng thời vi khuẩnđược tưới vào gốc ở NT2, NT3, NT4 và NTS Thời gian theo dõi là 7, 14, 21 và 28ngày sau khi bổ sung vi khuẩn trong chậu Các chỉ tiêu theo đõi bao gồm:

Chỉ tiêu sinh trưởng: chiều cao cây (cm); số lá; chiều dài rễ (cm); khối lượngsinh khối tươi (g) cân toàn bộ thân, rễ, lá; khối lượng sinh khối khô (g), số nhánh, sốchum hoa và số hoa của cây

Đánh giá khả năng tổn tại của các chủng vi khuẩn: vi khuẩn được bồ sung ở giaiđoạn cây con 35 ngày tudi, đến giai đoạn 42 ngày tiến hành lay mẫu đất xung quanhchậu (cách vùng rễ 5 cm) của từng nghiệm thức, phân lập và nhận diện vi khuẩn cókhả năng phát huỳnh quang.