Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Ảnh hưởng của một số chất hữu cơ bổ sung lên quá trình sinh trưởng và phát triển chồi lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) in vitro

Đốt thân mang chồi ngủ của cây lan Kim Tuyến in vitro 8tuần tuổi được nuôi cay trên môi trường Murashige va Skoog MS có bé sung riêng lẻ và kết hợp dịch nghiền hữu cơ chuối, khoai tây, c

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

ANH HUONG CUA MOT SO CHAT HỮU CƠ BO SUNG LÊN QUA TRINH SINH TRUONG VA PHAT TRIEN CHOI LAN

KIM TUYẾN (Anoectochilus setaceus Blume) IN VITRO

Nganh hoc : CONG NGHE SINH HOCSinh viên thực hiện : NGUYÊN THỊ MỸ DUYÊN

Mã số sinh viên : 19126036

Niên khóa : 2019 — 2023

TP Thủ Đức, 03/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

ANH HUONG CUA MOT SO CHAT HỮU CƠ BO SUNG LÊN

QUA TRINH SINH TRUONG VA PHAT TRIEN CHOI LAN

KIM TUYEN (Anoectochilus setaceus Blume) IN VITRO

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

ThS NGUYEN THỊ QUYEN NGUYEN THỊ MỸ DUYEN

TP Thủ Đức, 03/2024

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực hiện Dé tài “Ảnh hưởng của một số chất hữu cơ bổ sunglên quá trình sinh trưởng và phát triển chỗồi cây lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceusBlume) in vitro”, em đã nhân được nhiều sự hỗ trợ và giúp đỡ

Trước tiên, em xin cảm ơn Khoa Khoa học sinh học, Trường Đại học Nông Lâm

đã tạo môi trường học tập, rèn luyện kỹ năng, kiến thức để em chọn hướng nghiên cứuđúng đắn và hoàn thành tốt khóa luận của mình

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến hướng dẫn khoa học ThS.Nguyễn Thị Quyên, cô đã cho em những trao đổi, góp ý, câu hỏi và xây dựng nhữngphương pháp nghiên cứu giúp em hoàn thành tốt đề tài nghiên cứu này

Em xin cảm ơn các bạn sinh viên phòng thí nghiệm Nuôi cấy mô tế bào thực vật

đã giúp đỡ, hỗ trợ hết mình dé em có thé thực hiện đề tài thuận lợi về đề tai của mình

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn ủng hộ em cả sức mạnh tinhthần và vật chất, động viên và tạo điều kiện tốt nhất dé em có thé nỗ lực hoàn thành tốt

bài nghiên cứu.

Em xin chân thành cám ơn.

Tp Hồ Chi Minh, ngày 28 tháng 02 năm 2024

Người việt cam đoan

NGUYEN THỊ MỸ DUYEN

ll

TÓM TẮT

Mục đích của nghiên cứu này là khảo sát ảnh hưởng của các dịch nghiền hữu cơđến quá trình sinh trưởng và phát triền chồi lan Kim Tuyến in vitro Đề tài đánh giá anhhưởng của hai nhóm hợp chất hữu cơ khác nhau: (i) nhóm chuối, khoai tây, cà rốt, nướcdừa; (ii) nhóm tảo Spirulina Đốt thân mang chồi ngủ của cây lan Kim Tuyến in vitro 8tuần tuổi được nuôi cay trên môi trường Murashige va Skoog (MS) có bé sung riêng lẻ

và kết hợp dịch nghiền hữu cơ (chuối, khoai tây, cà rốt, nước dừa, tảo) ở các nồng độkhác nhau lên quá trình sinh trưởng và phát triển của chồi cây lan Kim Tuyến(Anoectochilus setaceus Blume) in vitro Kết quả cho thay cả hai nhóm chất hữu cơ khi

bồ sung riêng lẻ vào môi trường đều có tác dụng làm gia tăng số chdi và chiều cao chỗi,đặc biệt là tao Spirulina kích thích số lượng chéi phát triển mạnh, ty lệ sống của chồiđạt 100% và số chéi đạt cao nhất là 4,82 chồi/ mẫu và ở nồng độ 40 mgz/1 Trong nhómchuối, khoai tây, cà rốt, nước dừa khi b6 sung riêng lẻ, nồng độ 20 g/l khoai tây có tácđộng mạnh mẽ lên quá trình tạo chỗi và số lượng chéi đạt cao nhất là 3,56 chồi/mẫu vàchiều cao đạt 1,51 cm Khi khảo sát kết hợp giữa chuối với khoai tây và chuối với cà rốtthì nồng độ kết hợp giữa 10 g/1 chuối và 15 g/1 khoai tây đạt kết quả tốt nhất với số lượngchổi 4,41 chồi/mẫu và chiều cao đạt 2,78 cm

Từ khóa: Lan Kim Tuyến, dịch nghiền hữu co, tao Spirulina

il

The aim of study was to investigate the influence of organic crushing fluid on the growth and devolopment of Kim Tuyen orchid buds in vitro The topic assessed the effects of two different groups of organic compounds: (i) bananas, potatoes, carrots, coconut water; (ii) the Spirulina algae group The steams of 8 week old in vitro Kim Tuyen orchids cultured on Murashige and Skoog (MS) media with individual addtition and combination of organic crushing fluid (banana, potato, carrot, coconut water, algae)

in differrent concentrations on the growth and development of Kim Tuyen orchid buds (Anoectochilus setaceus Blume) in vitro The results show that both of groups organic matter when added individually to the enviroment had the effect of increasing the number of buds and height, especially Spirulina algae stimulates the number of buds to grow strongly and the survival rate of buds reached 100% and the highest number of buds was 4.82 buds/sample at a concentration of 40 mg/l In the group of bananas, potatoes, carrots, coconut water when added individually with a concentration of 20 g/1 potatoes had a strong effect on the bud formation process and the highest number of buds was 3.56 buds/sample and height reached 1.51 cm When examining the combination of bananas with potatoes and bananas with carrots, the combined concentration of 10 g/l bananas and 15 g/l potato achieved the best results with the number of buds 4.41 buds/sample and height reached 2.78 cm.

Keywords: Anoectochilus setaceus Blume, organic crushing fluid, Spirulina algae.

Iv

MỤC LỤC

Trang

XÁC NHAN VA CAM ĐOAN -2- 2-22 21 2122122122122122122121211211121112111 1 xe ii

PRIS TRON Có, Ì: eset ceseetron esas tt tr ta ad iv

10906 V

DANH SÁCH CHỮ VIET TẮTT 2-C+z+©2EE+x+Evrrrxrrtrrrxrrrrrrxrrrrrrerrire viiiDANH SÁCH CAC BẢNG - HH ixTIE, Bê (le Eee tsar snenemsanetonvennsr ieee gstnersinersstonmanmamveomennsnent x

1.1 Đặt vấn đề 2- + s2 2 32212212111211211112111111211211111121111211011122211222 11 co |

I0 1= 2 125; ING sd Bie Th HÌST#nassisintoititGBIGHIENGRRAHNGTGJS.RGSIGHH-HIENGEGIIQGSINHISADENIGSSIGNiHiGSSHHS8fSiASnng 2

7.1, TÔng cyan very: lan im TUYỂN weve cincs curvasinnnsriecowrceananwoeviintnlsviwvennenianiceneninronianinss 3

Dc cls VI, LO Ei cress terse etter ce is GR eR 3

2.1.2 Nguồn gốc và phân b6 o ccccccccceccessessessessessessessessessessessessesstssessessetiessessessesseeseeseess 32.1.3 Thành phần hóa học cây lan Kim Tuyến 2- 2 ©2222222222E£22E22+2EEzzzzzzzzex 32.1.4 Đặc điểm hình thái 222 eee cseceeseeseceessesessessesssessesssessesssesseseeseeseeees 42.1.5 Giá trị kinh tế và ý nghĩa dược học cây Lan Kim a 42.1.6 Các dich nghiền hữu CO c.ccccccssesssessesssessessuessessessesssssessessiesseesessiessessessesstessees 52.1.7 Giới thiệu về tảo Spirulina - 2-2 2222+2222E2212221221221122122122112212211221 21.2 xe W2.1.8 Tình hình nghiên cứu về cây lan Kim Tuyến -2-©22©22222222222zz2zz22zze2 lý2.1.9 Các nghiên cứu về dịch nghiền hữu CO 2-222-52222222222vzszrxrrrrrrrrrrsrred 82.2 Tổng quan về nuôi cấy mô tế bao thực vật 2: 2©222222Ez22E22z22xzzxzzzzeex 92.2.1 Khái niệm nuôi cấy mô 2-2 ® 2S1+SE+EE9EE2EE2EEE7E22122122121212122121221 22 xe 92.2.2 Cơ sở khoa học của nuôi cây mô tế bào thực vật - + ssccczrxererrrrerreree 93.3.3 Lợi kh tôi Gây 106 sec là 2g ha khán 3ä làn 11108 G0613410114084043400118409381284181888 102.2.4 Môi trường nuôi cấy mô thực vật -2+-22-2s+222 222k Crerkrrrerkrrrrerrees 10

CHƯƠNG 3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP -2- 2+222S+222E22E2E22Ezzzzxzz, 123.1 Thời gian và địa điểm thực hiện nghiên cứu 2222 2222z+2zz2zz+z+zzzzzzxzex 12

E2NN CU PS Fs Be FS a SP an in eco oc ẽ ThasadS 12

37.1,Đỗi trương tghÌÊN CG ceeeeesoethohiopitnckrostogtgginfgsggletsi6g3i0000010550910240005101100149030500/00 T83.2.2 Trang thiết bị và TIO ssn anette oe vr ae i a 123.2.3 Hóa chat sử dụng trong nghiên Ctr ceccecccssesseeseessesseessessesstessesstessesseessees 12

3.2.4 Môi trường sử dung nghién cỨU - cee cee eee cee cee E1 212121 HH HH rệt 12

K6) 0.0 0 8n n6 '-44dd)ậgậAH H 13

3.3 PHƯơng Phap phiến CUU wesc nemencentemanitnen enumerate hensien 13

3.3.1 Nội dung 1: Khao sát ảnh hưởng riêng lẻ và kết hợp của chuối, khoai tây, cà rốt,nước dừa lên quá trình sinh trưởng và phát triển chồi lan Kim Tuyến (Anoectochilus

SELACEUS BUME) I 0/7/2205 13

3.3.1.1 Thi nghiệm 1: Khao sát ảnh hưởng của nước dừa đến quá trình sinh trưởng vàphát triển chồi lan Kim Tuyến it viffO -2-552©22222222222222E222E2EE22E2EEcrErrrrrree 133.3.1.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của dịch nghiền chuối lên quá trình sinhtrưởng và phát triển chồi lan Kim Tuyến i7 Vi/70 2 22©22522222222222222+z2xzzzzzz+z 133.3.1.3 Thí nghiệm 3: Khao sát ảnh hưởng của dịch nghiên cà rốt lên quá trình sinhtrưởng và phát triển chồi lan Kim Tuyến i7 Vi/rO 2-©2-52252222222222z22z2zz>zzzse2 143.3.1.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của dịch nghiền khoai tây lên quá trìnhsinh trưởng và phát triển chồi lan Kim Tuyến if vifr0 2 2 5525522522522: 143.3.1.5 Thí nghiệm 5: Khao sát ảnh hưởng kết hợp của dịch nghiền chuối và khoai tâyđến quá trình sinh trưởng và phát triển chéi lan Kim Tuyến 222-5252 153.3.1.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng kết hợp của dịch nghiền chuối và cà rốt lênquá trình sinh trưởng và phát triển chồi lan Kim Tuyến it vitro . - 16

3.3.2 Nội dung 2: Khao sat anh hưởng của tao Spirulina lên quá trình sinh trưởng va

phát triển chồi lan Kim Tuyến ir Vi/fO 2-22 52222222222222EE2EE22EE22E22E222E2Ezzrcrev 16

CHƯƠNG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN -2-©22©222222222++22zzzzzsrscees 184.1 Nội dung 1: Khảo sát ảnh hưởng riêng lẻ và kết hợp của chuối, khoai tây, cà rốt,nước dừa lên quá trình sinh trưởng và phát triển chồi lan Kim Tuyến (Anoectochilus

V2/7/42/00910)0198/0,// 2000087 18

VI

4.1.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nước dừa lên quá trình sinh trưởng va

phát triển chồi lan Kim Tuyến it Vi/fO 22-2252222222222E222E22E222E22E222222E2Exzrxe 194.1.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của dịch nghiền chuối lên quá trình sinh

trưởng và phát triển chéi lan Kim Tuyến it Vi/r0 -2-52-52222222E22E2£E2E22EzZxzzzzea 204.1.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của cà rốt lên quá trình sinh trưởng và pháttriển chOi lan Kim Tuyến i7 Vi/7O 2:22 ©2222222E22E222E22E22212212312212212221 212222 cxe 214.1.4 Thi nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của dịch nghiền khoai tây lên quá trình sinhtrưởng và phát trién chồi lan Kim Tuyến in Vi/r0 22©22-522522222222222zz2zzzzxsrss 224.1.5 Thi nghiệm 5: Khao sát anh hưởng kết hợp của dich nghiền chuối và khoai tâylên quá trình sinh trưởng và phát triển chồi lan Kim Tuyến vi/ro . - 234.1.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng kết hợp của dịch nghiền chuối và cà rốt đếnquá trình sinh trưởng và phát triển chéi lan Kim Tuyến in vi/ro 25

4.2 Nội dung 2: Thi nghiệm khảo sát sát anh hưởng của tao Spirulina lên quá trình

sinh trưởng và phát triển chéi lan Kim Tuyến iw vifro -©22©2255255222+25252522 27GIITNG 6 IE Vu sk |: 305.1 Kết luận 2-52 22s 2 1221212122121121112112111211211121111112112111221212221121 2e 30

|) BƯỚỢPỚỢỸ TT“ 30TAL LIỆU THANH BAG buunna nho th GiuA ng AG.8000G013000186.g6X2000ãgi02601080g08/00 31

PHU LUC

vil

DANH SÁCH CHU VIET TAT

ANOVA : Analysis of Variance

PLBs : Protocorm like bodies

THT : Than hoat tinh

VW : Vacin va Went

viil

DANH SÁCH CÁC BANG

Trang

Bang 3.1 Khao sát ảnh hưởng của nước đừa lên quá trình sinh trưởng và phát triển chồiJan Kim Twy6n 0X 13Bang 3.2 Khao sát ảnh hưởng của dịch nghiền chuối lên quá trình sinh trưởng và phattriển chối fan Kim ThyỂn Ôi VĂN sosconhanhglahĩnGHnhg 0 Gg.L40AGi382402.00Sã3G.2LLS.3128/3638503000338/8 14Bảng 3.3 Khảo sát ảnh hưởng của dịch nghiền cà rốt lên quá trình sinh trưởng và pháttriển chồi lan Kim Tuyến i ViffO 2 2-©52©2+22ESE22EEEE2EEEEECEEEEEEErErrrrrkrrrrervee 14Bảng 3.4 Khảo sát ảnh hưởng của dịch nghiền khoai tây đến quá trình sinh trưởng vàphát triển chồi lan Kim Tuyến ¿7 Vi/7O 2-©2252222222222222EE22E22EE2EE2EEE2EEcEEzrrcrev 15Bảng 3.5 Khảo sát ảnh hưởng kết hợp của dịch nghiền chuối và khoai tây lên quá trìnhsinh trưởng và phát triển chéi lan Kim Tuyến it wif7O -2-©2-55255225+2s+2sczcze2 15Bang 3.6 Khao sát anh hưởng kết hợp của dich nghiền chuối va cà rốt lên quá trình sinhtrưởng và phát triển chồi lan Kim Tuyến i7 vi/rO - 2-52 5225222222222222Eczzczzzsse2 16Bảng 3.7 Khảo sát ảnh hưởng của tảo Spirulina lên quá trình sinh trưởng và phát triểnch6i lan Kim Tuyến i ViffO 5-52-5252 S22222EE‡EEEEE921223221232121212121212121 21 xe 17Bang 4.1 Khao sát ảnh hưởng của nước dừa lên quá trình sinh trưởng và phát triển chồiLeith Retr Tay 7y, NNm 19Bang 4.2 Khao sát ảnh hưởng của dịch nghiền chuối lên quá trình sinh trưởng và phattriển dhủi km im Tuyển Di NẴNG vs gio danhatghgihintgBuikioSUfsg055080.01898480ã8BxSuf0gELgtsf c1 i680 20Bang 4.3 Khao sát ảnh hưởng của dịch nghiền cà rốt lên quá trình sinh trưởng và pháttriển ch6i lan Kim Tuyến int Vif7O 22-22-52: S222222E22E22E22322322121221212121 2122 2xe2 21Bang 4.4 Khảo sát anh hưởng của dịch nghiền khoai tây lên quá trình sinh trưởng vaphát triển chồi lan Kim Tuyến ¡7 Vi/70 -.-©22-©2252222222222EE2EE2EE2EE22E22EEcEEzrrcrev 22,Bang 4.5 Khảo sát ảnh hưởng kết hop của dich nghiền chuối va khoai tây lên quá trìnhsinh trưởng và phát triển chéi lan Kim Tuyến it vif7o -5-©5-55255255252252sz2s2 24Bang 4.6 Khao sát anh hưởng kết hợp của dich nghiên chuối va cà rốt lên quá trình sinhtrưởng và phát trién chồi lan Kim Tuyến i7 Vi/70 2-©22©22552222222222z22xzzzzzzrsrez 25Bảng 4.7 Khảo sát ảnh hưởng của tao Spirulina lên quá trình sinh trưởng và phát triểnive | Tu Wie Tuyển vite, sưngggicongiaExgiiuguggglictg200100180025021005600G)485200/008308.0E000 3g 28

1X

DANH SÁCH CÁC HÌNH

; Trang Binh? LC ay Lani Rati Dy Ci ss ssa cas acon se ssau sn snn anus ateetonasseomaasasisan asec bans G6006.58: 38006040 0gã 3

Hình 4.1 Chéi lan Kim Tuyến sau 6 tuần nuôi cấy . 2 22222222z222z22szz 23Hình 4.2 Chéi lan Kim Tuyến sau 6 tuần khi bố sung kết hợp chuối và khoai tay 25Hình 4.3 Chéi lan Kim Tuyến sau 6 tuần khi bổ sung kết hợp chuối và ca rét 2dHình 4.4 Chéi lan Kim Tuyến bổ sung tao Spirulina sau 6 tuần -222+¿ 29

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Lan Kim Tuyến là một chi thực vật có giá trị làm thuốc, thuộc họ lan(Orchidaceae) Chúng được dùng trong điều trị các chứng bệnh như đau ngực, đau bụng,huyết áp cao, rối loan gan, lá lách, tiéu đường (Nguyễn Tiến Ban, 2005) Các loài thuộcchi lan Kim Tuyến (4zoeefoehiius Blume) hiện nay đang đứng trước môi trường sống

bị mat mát và một số van nạn: suy thoái, động vật sử dụng làm thức ăn, việc khai thácmột cách bừa bãi và nhu cầu sử dụng ngày càng tăng của con người khiến cho nguồngen tự nhiên ngày càng suy giảm (Zhang và ctv, 2013) Chi lan Kim Tuyến bị khaithác nhiều để buôn bán làm thuốc từ rất lâu nên lan Kim Tuyến bị đe dọa nghiêm trọng,rất có thể sẽ bị tuyệt chủng ngoài tự nhiên nếu không có biện pháp bảo tồn hữu hiệu.Hiện nay, lan Kim Tuyến đang được xếp vào nhóm IA, trong nghị định 06/2019/ ND-

CP ngày 22/01/2019 nghiêm cấm khai thác vì mục đích thương mại và nhóm thực vậtđang nguy cấp (Sách đỏ Việt Nam, 2007)

Nhằm bảo tồn và phát triển tai nguyên quý này nhiều đơn vị trong và ngoài nướcđang tập trung vào nghiên cứu nhân giống và nuôi trồng lan Kim Tuyến Ở Việt Nam,lan Kim Tuyến có thê nhân giống bằng phương pháp giâm cành Mặt khác, với xu hướngnông nghiệp sử dụng công nghệ cao hiện nay thì kỹ thuật nuôi cay mô tế bao thực vật làmột trong những phương pháp hiệu quả nhất dé nhân nhanh loài lan Kim Tuyến trongthời gian ngắn mà vẫn đảm bảo chất lượng cây giống Nhiều đề tài đã nghiên cứu và xâydựng thành công quy trình nhân giống in vitro cây lan Kim Tuyến Tuy nhiên, việcnghiên cứu để liên tục cải thiện về môi trường và nâng cao chất lượng cây giống là vấn

đề luôn được quan tâm Vì vậy, trong nghiên cứu này một số chất hữu cơ đã được bồ sungvào môi trường nuôi cấy để xác định ảnh hưởng của chúng lên sự sinh trưởng và pháttriển của lan Kim Tuyến nhằm tìm ra chất hữu cơ bố sung phù hợp để nhân giống loại lan

dược liệu quý này.

Việc bồ sung các chất hữu cơ vào môi trường nuôi cấy của các loại lan đã có nhiềutác giả quan tâm nghiên cứu như là Nguyễn Thị Cúc (2014) nghiên cứu trên cây lan Hai

Hồng, Vũ Quốc Luận (2014) nghiên cứu trên cây lan Vân Hài Nhờ một lượng nhỏ của

các chât hữu cơ này mà sự sinh trưởng và phát triên của nhiêu loại cây trong điêu kiện

in vitro đã được cải thiện Các chất hữu cơ là nguồn bổ sung carbohydrate, amino acid,peptide, vitamin và chất tăng trưởng thực vật không thể thể thiếu trong nuôi cấy nhiềuloài thực vật (Thorpe và ctv, 2008) Ngoài các chất hữu cơ được sử dụng trong nghiêncứu này như dịch nghiền chuối, khoai tây, cà rốt, nước dừa thì còn có một số hợp chấthữu cơ khác được phát hiện và bổ sung vào môi trường nuôi cấy như casein, nấm men,pepton, các loại mầm đậu nành, dịch chiết ca chua dé nâng cao hiệu quả nhân giống.

Xuất phát từ những giá trị thực tiễn trên, đề tài “ Khảo sát ảnh hưởng của một sốhop chất hữu cơ lên quá trình sinh trưởng và phát triển lan Kim Tuyến (Anoectochilussetaceus Blume) in vitro” được thực hiện nhằm góp phần hoàn thiện quy trình nhângiống lan Kim Tuyến in vitro

1.3 Nội dung thực hiện:

Nội dung 1: Khảo sát ảnh hưởng riêng lẻ và kết hợp của chuối, khoai tây, cà rốt,nước dừa lên quá trình sinh trưởng và phát triển chồi lan Kim Tuyến in vitro

Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của tảo Spirulina lên quá trình sinh trưởng và

phát triển chồi lan Kim Tuyến in vitro

CHUONG 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Tổng quan về cây lan Kim Tuyến

Tông : Cranichideae fia * seh as

= ———E Hinh 2.1 Cay lan Kim Tuyén

Loai : Anoectochilus setaceus Nguôn: https://ifrad.vn

Lan Kim Tuyén có tên khoa hoc là Anoectochilus setaceus Blume Ngoài ra, con

có các tên gọi khác như Lan Gam, Lan Kim Tuyến tơ

2.1.2 Nguồn gốc và phân bố

Lan Kim Tuyến có nguồn gốc từ Hy Lạp, sau đó được du nhập và phô biến ở cácnước như Việt Nam, Thái Lan, Trung Quốc Lan Kim Tuyến là cây được liệu quý hiếmgiúp bồi bổ, tăng cường sức khỏe Chúng thường mọc ở vách núi, ven sông nơi có nhiệt

độ thấp, độ âm cao Lan Kim Tuyến sinh trưởng rất chậm dưới tán rừng, trên sườn núi

đá granit, riolit, phiến sét, ở độ cao 500 — 1600 m, rải rác thành từng nhóm vài ba câytrên đất 4m, rất giàu mun và lá cây rụng Lan Kim Tuyến là một loài quý hiếm có têntrong Sách Đỏ Việt Nam và Phụ lục IA của Nghị định số 32/2006/CP thuộc nhóm thựcvật nghiêm cắm khai thác, sử dụng vì mục đích thương mai và nhóm thực vật rừng đangnguy cap EN Ala,c,đ, trong sách đỏ Việt Nam (Bộ Khoa học va Công nghệ, 2007).2.1.3 Thành phần hóa học cây lan Kim Tuyến

Trong cây lan Kim Tuyến có nhiều hợp chất như nhóm flavonoids (quercetin,

isorhamnetin), nhóm steroids, polysaccharides, oligosacharides và đường don, alkaloid

va nhiều nguyên tố vi lượng và các khoáng chất Ngoài ra, trong lan Kim Tuyến còn cócác chất khác với khối lượng rất nhỏ như sterols và một số kim loại như: Canxi, Magie,Sat, Crom, Mangan, Đồng, Strontium

2.1.4 Đặc điểm hình thái

Cơ quan sinh dưỡng: khi trưởng thành, các cá thể thuộc loài lan Kim Tuyến mọctrong tự nhiên có dạng thân thảo, mọc trên đất mùn với đặc điểm hình thái như sau: thânlan Kim Tuyến gồm hai phần: thân rễ và thân khí sinh

Thân rễ: nằm ngang sát mặt đất, đôi khi hơi nghiêng, bò dài Chiều dai từ 5-12 cm,đường kính thân rễ từ 2,5 - 3,5 mm có màu nâu đỏ hoặc xanh trắng, nhẫn, không phủ

có từ 2 - 9 rễ Lá: Số lượng lá trên một cây có từ 2 - 6 chiếc, thường gặp là 4 Lá có bẹnhẫn, hình máng ôm lay thân Lá mọc cách, xoắn quanh thân, xoé trên mặt đất Phién láhình trứng, mép nguyên, chóp lá tù, gốc lá hình tim; màu nâu đỏ hoặc xanh thẫm ở mặttrên; mặt trên phủ lông nhung mềm óng ánh, mặt dưới nhăn, màu xanh nhạt Hệ gânlông chim thường có 5 gân gốc nổi rõ các gân phụ, màu đỏ tia ánh kim, mặt đưới lá gânmàu xanh Kích thước của lá thay đổi, dài 3 - 5 cm, rộng 2 - 4 cm Các lá trên một cây

thường có kích thước khác nhau rõ rệt.

Cơ quan sinh sản: cụm hoa mọc ở đầu ngọn thân, dai từ 5 - 20 cm, thường phủlông màu nâu đỏ, mang từ 4 - 10 hoa Hoa màu trang, có cánh môi lớn Hai bên ria mang

từ 6 - 8 râu mỗi bên Hoa nở vào thang 9 đến tháng 12 Phùng Văn Phê va ctv (2010) đãnghiên cứu đặc điểm hình thái lan Kim Tuyến thu hái tại Vườn Quốc Gia Tam Đảo, tỉnhVĩnh Phúc và Trần Huy Thái cũng mô tả đặc điểm sinh thái, hình thái lan Kim tuyến tạikhu bảo tồn thiên nhiên Xuân Nha, Tinh Sơn La (Lò Thị Mai Thu, 2021)

2.1.5 Giá trị kinh tế và ý nghĩa dược học cây Lan Kim Tuyến

Theo y học cô truyền, Lan Kim Tuyến là nguồn dược thảo quý, có giá kinh tế cao,trong đó loài Anoectochilus setaceus Blume thường gặp nhất và có giá trị thương mạicao nhất, gấp hàng chục lần các loài khác (Trần Thị Hồng Thúy và ctv, 2015) Cây đượcứng dụng nhiều trong việc chữa bệnh, có tác dụng tăng cường sức khỏe, khí huyết lưuthông, có tính kháng khuẩn, chữa các bệnh viêm khí quan, tiêu đường, suy nhược than

kinh, lao phôi, phong thấp, giúp bổ máu Chính vi giá trị dược liệu cũng như giá trị kinh

tế rất cao (2.500.000 — 3.000.000 đồng/kg tươi) mà loại được liệu này bị khai thác quámức dẫn đến suy thoái

Đỗ Thị Gam (2017), chiết xuất và định lượng flavonoid tổng số từ 3 loài Lan KimTuyến của Việt Nam, kết quả cho thấy hợp chất Flavonoid được tích lũy chủ yếu ở lácây lan Kim Tuyến Đặc biệt, quercetin và isorhamnetin thuộc nhóm flavonoid có giátrị dược tính cao Quercetin đóng vai trò như một chất giúp ngăn ngừa và điều trị ungthư một cách hiệu quả; chất này có chức năng cải thiện sức khỏe tim mạch, làm giảmlượng cholesterol giúp ngăn ngừa sơ vữa động mạch, ngăn ngừa đột quy và một số bệnhliên quan về tim mach Thanh phan hóa học và vai trò của quercetin, isorhamnetin vaferulic acid trong hỗ trợ nâng cao sức khỏe con người trong lan Kim Tuyến tại Việt Namthì trong nhóm flavonoid hợp chất isorhamnetin lại có kha năng ngăn ngừa tôn thương

các tế bào trong cơ thể, hoạt động như một chất chống oxi hóa mạnh mẽ Isorhamnetin

được coi như một hợp chất chống ung thư nhờ vào khả năng ức chế sự tăng trưởng của tếbao ung thư Ngoài ra, quercetin cũng là một hợp chất rất tốt dành cho bệnh nhân bị tiêuđường và cao huyết áp Với khả năng chống viêm của mình cũng như khả năng làm bềnthành mạch chống tai biến mạch máu não Đây cũng là một hợp chất quý đóng vai trò quantrọng trong việc phòng ngừa và điều trị bệnh tiểu đường và các biến chứng của bệnhtiêu đường (Lê Đình Chắc, 2019)

2.1.6 Các dịch nghiền hữu cơ

Một số lượng lớn các chất hữu cơ tự nhiên như: nước dừa, dịch nghiền khoai tây,dịch nghiền chuối, dịch nghiền ca rốt thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy

có tác dụng rat tốt trong việc phát triển cây giông đã được báo cáo ở nhiều loài lan Sựtăng trưởng và tái sinh của thực vật từ nuôi cấy mô trong ống nghiệm có thể được cảithiện bằng một lượng nhỏ một số chất dinh dưỡng hữu cơ cung cấp axit amin, peptit,acid béo, carbohydrate, vitamin và các chất tăng trưởng thực vật ở các nồng độ khácnhau (George và ctv, 2008) Các dich nghiền hữu cơ có nguồn gốc tự nhiên chứa mộtlượng đáng ké vitamin, axit amin và các hợp chất hữu cơ có thé hoạt động như chat điều

hòa sinh trưởng (Islam và ctv, 2003)

Nước dừa: Nước dừa được sử dụng rộng rãi như một thành phần thúc đây tăngtrưởng trong môi trường nuôi cay mô và thường được sử dụng ở nồng độ từ 5% đến20% (Lê Văn Hoàng, 2008) Một số thành phần quan trọng có trong nước dừa là tập hợp

5

của phytohormone, trong đó, quan trọng và hữu ích nhất là cytokinin (Jean Yong, 2009).Theo George, nước dita bao gồm nhiều axit amin, hợp chất đạm, hợp chất vô cơ, cácaxit hữu cơ, nguồn carbon, vitamin và có khả năng điều chỉnh sự phát triển như cytokinin

và auxin Nước dừa đã được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất khoáng vàchất kích thích sinh trưởng ( Yong va ctv, 2009) Thông thường nước dừa được xử lý déloại trừ các protein, sau đó được lọc qua màng lọc dé khử trùng trước khi bao quản lạnh,tồn dư protein trong nước dừa không gây ảnh hưởng đến sinh trưởng của mô hoặc tếbảo nuôi cấy nhưng khi bảo quản lạnh dung dịch có thể sẽ kết tủa

Dịch nghiền chuối: Chuối được sử dụng trong nuôi cay mô đề bé sung dinh dưỡngcho môi trường nuôi cấy, được ghi nhận có khả năng tốt đối với việc kích thích chéi vàphát triển rễ, lá Dịch nghiền chuối thường được thêm vào môi trường nuôi cấy lan vàđược cho là có vai trò đây mạnh sự sinh trưởng (Thorpe va ctv, 2008) Trong 100 g chuối

có 75% nước, 1,1 g protein, 12,2 g đường Ngoài ra, chuối có chứa một hàm lượng lớnnhư sắt, kali, vitamin B6, B12 va trytophan thúc đây PLBs tăng trưởng (Pierik, 1988).Tác dụng của chuối hiệu quả do khả năng ổn định pH của môi trường nuôi cấy

(Pavallekoodi và ctv, 2010).

Dịch nghiền khoai tây: có chứa carbonhydrat dưới dạng saccarose, glucose vàfructose, amino axit, các muối khoáng (K, Fe, Mg ) và các vitamin (BI, Bó, C) Dichnghiền khoai tây cũng là chất hữu cơ thường được sử dụng Nhiều nghiên cứu cho thấydịch nghiền khoai tay được bé sung riêng lẻ hoặc kết hợp với các thành phần của môitrường nuôi cấy thông thường tạo nên môi trường hữu ích cho việc nuôi cay bao phanlúa mì, một số loại ngũ cốc và lan (Molnar va ctv, 2011) Trong 100 g khoai tây có 15,44

g tinh bột, 2,2 g chất xơ, 2 g chất béo, 75 g nước, vitamin và chất khoáng Đối với nuôicay mô, dịch nghiền khoai tây thường được bổ sung vào môi trường dé làm tăng hàmlượng dinh dưỡng, ngoài ra các hợp chất hữu cơ có trong khoai tây giúp thúc đây qúatrình phát triển của tế bào thực vật Năm 2010, Mohamed đã sử dụng khoai tây như mộtchất làm đông tự nhiên thay thế cho agar, khi bổ sung vào môi trường, khoai tây có tácdụng làm giảm pH môi trường đồng thời giúp cây tăng trọng lượng khô và kích thíchtạo chôi

Dịch nghiền cà rốt: có chứa cytokinin, giàu chất khoáng (kali, sắt, magie) và đặcbiệt là các vitamin (A, BI, B2,C và E) và glutamin Trong 100 g cà rốt có 6 g carbohydrate,1,5 g chất xơ, 42 mg kali, 0,5 g chat đạm và vitamin Trong nuôi cây mô dịch nghiền ca

6

rốt được bồ sung vào môi trường dé kích thích sự phân chia tế bào của thực vật, pháttriển cây.

2.1.7 Giới thiệu về tảo Spirulina

Bên cạnh những lợi ích từ các dịch nghiền hữu cơ Ngoài ra, vi tảo cũng là mộtchất hữu cơ được sử dụng trong nuôi cay mô tế bao thực vat Tao Spirulina (Arthrospiriaplatensis) rất giàu protein, có chứa hàm lượng lớn các acid amin, carbonhydrate,vitamin, khoáng chất, acid béo đặc biệt là y-Linolenic acid cũng như các hoạt chất sinhhọc khác (Vonshak, 2002) Spirulina không chỉ được sử dụng dé làm thực phẩm bồ sung

mà còn được sử dụng trong nhiều nghiên cứu nhằm cải thiện môi tường nuôi cấy mô tếbào thực vật Theo George va Ravishankar (1996), tảo Spirulina là nguồn nito và vitaminthay thé rất hiệu qua trong việc nâng cao chất lượng cây giống và giảm chi phí cho quátrình vi nhân giống trên các đối tượng Musa paradisiaca William cv silk, Gardennia

jasminoides Ellis và Menthec piperita.

2.1.8 Tình hình nghiên cứu về cây lan Kim Tuyến

Yih-juh Shiau va ctv (2001) đã nghiên cứu thành công loài lan Kim Tuyến(Anoectochilus formosanus Hayata) từ hạt cho kết quả với công thức môi trường vô mẫulà: 1⁄2 MS + 0,2% than hoạt tính + 8% dịch chiết chuối + 2 mg/l BAP + 0,5 mg/1NAA

Chi lan Kim Tuyến (Anoectochilus) đã được nghiên cứu ở một số quốc gia nhưThái Lan, Việt Nam, Trung Quốc Trong đó nghiên cứu của (Lai Wan Yu và Lai WanNian, 2005) đã nghiên cứu một cách toàn điện cả về đặc điểm hình thái, kỹ thuật nhângiống, khả năng trồng, thành phần hóa học và công dụng phòng, chữa bệnh

Nguyễn Quang Thạch và Phí Thị Câm Miện (2012) đã nghiên cứu kỹ thuật nhângiống loài lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) in vitro nhằm bảo tồn nguồn

được liệu quý.

Tran Thị Hồng Thúy và ctv (2015) nghiên cứu nhân nhanh in vitro loài lan KimTuyến (Anoectochilus setaceus Blume) thông qua cảm ứng tạo Protocorm Like Bodies

Nguyễn Thi Huyền Trang va ctv (2019) đã nghiên cứu ứng dụng các hợp chat hữu

cơ thay thế nguồn nitrate vô cơ trong môi trường nuôi cấy sinh khối và thử hoạt tínhsinh học của cây lan Kim Tuyến (Anoectochilus formosanus Hayata) in vitro Kết quảnghiên cứu cho thấy môi trường thích hợp cho sự nhân nhanh cây lan Kim Tuyến là môitrường Albert’s có thành phan muối nitrate giảm 50% và 7 g/l cao nắm men với chiềucao cây đạt 9,4 em; khối lượng tươi đạt 1,82 g/mau và khối lượng khô đạt 0,18 g/mau

7

Nguyễn Thanh Mai và Mai Trường (2019) đã nghiên cứu nuôi cấy lỏng lắc thusinh khối lan Kim Tuyến bản địa Anoectochilus roxburghii (Wall) và xây dựng thànhcông quy trình nhân nhanh lan Kim Tuyến bản địa Anoectochilus roxburghii (Wall) invitro từ nguồn mẫu chdi tạo được từ đốt thân.

Lò Thị Mai Thu (2021) đã nghiên cứu đặc điểm hình thái, giải phẫu của loài lanKim Tuyến (Anoetochilus setaceus Blume) ở khu bao tồn COPIA Sơn La

Đỗ Thị Ngọc (2020) đã nghiên cứu ảnh hưởng của chất hữu cơ đến khả năng sinhtrưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tia (Dendrobium officinale Kimura

et Migo)

Nguyễn Trần Phước Huy và Đỗ Thị Mai Trinh (2023) nghiên cứu nhân giống invitro lan Kim Tuyến (Anoectochilus sp.)

Trần Nguyên Chất và ctv (2023) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các dịch chiết hữu

cơ đến sự hình thành chồi và rễ in vitro của lan Kim Tuyến Kết quả nghiên cứu chothấy bé sung dịch trích hữu cơ vào môi trường đều có tác dụng làm tăng số chỗi và rễ.Môi trường MS có bé sung dich ca chua 200 ml/l cho sự nhân chéi tốt nhất (41,917chéi/mau) va lá (30,5 lá/cụm chéi) Môi trường MS có bồ sung dich khoai tây (250 ml/1)tốt nhất cho sự hình thành rễ (8,05 rễ/cây) và môi trường MS có bổ sung nước dừa (100ml/1) tốt nhất cho sự phát triển chiều dai rễ (1,306 cm)

2.1.9 Các nghiên cứu về dich nghiền hữu cơ

Nguyễn Thị Cúc và ctv (2014) đã nghiên cứu “Ảnh hưởng của một số hợp chấthữu cơ lên quá trình sinh trưởng và phát triển cây lan Hài hồng (Paphiopedilumdelenatii) in vitro” cho thay cả ba nhóm chất hữu cơ đều có tác dụng làm gia tăng sốlượng chéi, đặc biệt là tao Spirulina lên quá trình sinh trưởng và phát triển lan Hài Hồng

in vitro.

Nguyễn Thi Sơn va ctv (2014) đã tiến hành nghiên cứu “Nhân giống in vitro lanThạch Hộc Thiết Bi (Dendrobium offcinalekimura et migo)” nhân giống bằng gieo hattrên môi trường VW + 10 g sucrose + 6g agar + 100 ml/l ND, nhân nhanh cụm chéi tốtnhất trên môi trường MS + 100 ml ND + 20g sucrose + 6g agar + 60 g/1 chuối chín

Nguyễn Văn Tiến và ctv (2020) đã hoàn thiện quy trình nhân giống lan KiếmThanh Ngọc (Cybidium sinense var alba) bằng phương pháp nuôi cay mô tế bao Môi

trường MS + 2,5 mg/l BAP + 0,3 g/l THT + 50 g/l KT + 100 m1/I ND + 10 g/l đường +

6 g/l agar là môi trường nhân nhanh tốt nhất cho hệ số nhân 5,03 lần

§

Ảnh hưởng của một số dịch nghiền hữu cơ đến sự kéo dai chồi in vitro cây lan

Hoàn Thảo Kèn ( Dendrobium Tituiflorum Lindl.) (Dang Thị Thanh Tâm va ctv, 2020)

Đinh Trường Sơn và ctv (2023) đã nghiên cứu đánh giá tác động của các chất hữu

cơ đến giai đoạn nhân nhanh in vitro chuối tiêu Nam Mỹ (Musa acuminata)

2.2 Tổng quan về nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.2.1 Khái niệm nuôi cấy mô

Nuôi cay mô tế bao thực vat là một ngành khoa học trẻ có nhiều triển vọng nằm

trong sinh lý thực vật Nguyên liệu là các thực vật hoàn toàn sạch bệnh trên môi trường

nhân tạo và trong điều kiện vô trùng (Haberlant, 1902)

Nuôi cay mô tế bào thực vật hay còn gọi là nuôi cấy thực vật in vitro (trong ốngnghiệm) dé phân biệt với các quá trình nuôi cấy cây trong điều kiện tự nhiên (Ngô XuânBình, 2010) là thuật ngữ miêu tả các phương thức nuôi cấy các bộ phận thực vật trongống nghiệm có chứa môi trường xác định ở điều kiện vô trùng Môi trường có các chấtdinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, các hormone tăng trưởng và đường

(Dương Công Kiên, 2002).

2.2.2 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật

Haberlant cho rằng mỗi tế bảo của bất kỳ sinh vật nào cũng đều có khả năng tiềmtang dé phát triển thành một cơ thê hoàn chỉnh Điều đó có nghĩa là mỗi tế bao của mộtsinh vật sẽ chưa toàn bộ thông tin di truyền cần thiết của một cơ thé hoàn chỉnh Khi gặpđiều kiện thuận lợi nhất định, những tế bào đó có thé sẽ phát triển thành một cơ thể hoànchỉnh (Nguyễn Văn Hồng, 2009) Đây là cơ sở khoa học cho nhân giống bằng phươngpháp nuôi cấy mô hay nhân giống in vitro

Trong nuôi cay in vitro, tế bào thực vật thé hiện tính toàn năng thông qua sự phânhóa và phản phân hóa Cơ thê sinh vật trưởng thành bao gồm nhiều cơ quan có chứcnăng khác nhau được hình thành từ nhiều loại tế bào Tất cả các tế bào đó đều bắt nguồn

từ một tế bào ban đầu (tế bào hợp tử) Ở giai đoạn đầu tế bào hợp tử phân chia thànhnhiều tế bào phân sinh chưa mang chức năng chuyên biệt Sau đó các tế bào phôi sinhnày tiếp tục được biến đổi thành tế bào chuyên hóa đặc biệt cho các mô cơ quan khácnhau Đó là sự phân hóa Tính phản phân hóa của tế bào là các tế bào đã được phân hóathành các mô riêng biệt với các chức năng chức năng khác nhau nhưng trong điều kiệnnhất định chúng có thé quay trở về trạng thái phôi sinh dé phân chia tế bảo

2.2.3 Lợi ích nuôi cấy mô

Theo Trần Văn Minh (2004), nhân giống bằng nuôi cấy mô tạo ra cây con đồngnhất và giống hệt cây mẹ Đối với các loài cây sinh ra từ hạt thì cây con không hoàntoàn đồng nhất và có thê không giống cây mẹ Điều này chứng tỏ nhân giống vô tính cólợi thế hơn nhân giống bằng hạt

So với các kiểu nhân giống vô tính thông thường (chiết, hom, giâm), nhân giốngbằng nuôi cay mô có ưu điểm nhân giống trong thời gian ngắn với số lượng lớn đáp ứngnhu cầu trồng trọt trên diện tích rộng (Tạp chí khoa học và công nghệ Việt Nam, 2022)tạo ra các cây con sạch bệnh nhờ áp dụng việc chon lọc chặt chẽ khâu vật liệu ban đầulàm cho vật liệu ban đầu trở nên sạch bệnh, không bị ảnh hưởng nhiều bởi thời tiết, dédang thích nghi với điều kiện ngoại cảnh

2.2.4 Môi trường nuôi cấy mô thực vật

Một trong những yếu tố quan trọng của trong sự phát triển và tăng trưởng về hìnhthái của tế bào, mô, cơ quan thực vật đó là môi trường nuôi cấy Môi trường dinh dưỡngphải có đầy đủ các chất dinh dưỡng, các chất cần thiết cho sự phân chia, phân hóa tếbào Hiện nay tuy có nhiều môi trường nuôi cấy khác nhau như MS, LS, WP, nhưng

môi trường Murashige và Skoog (Murashige và Skoog, 1962) hoặc môi trường MS là

một trong những loại môi trường được sử dụng rộng rãi nhất trong nuôi cấy mô tế bàothực vật vì nó thích hợp cho nhiều loại cây Tuy nhiên môi trường nuôi cấy mô tế bào

thực vật đặc trưng đều chứa các thành phần sau:

Muối khoáng đa lượng và vi lượng gồm các yếu tổ thiết yếu trong môi trường nuôicấy mô tế bào thực vật bên cạnh C, H và O là các nguyên tố đa lượng như nitơ (N), kali(K), magie (Mg) và canxi (Ca) (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thi Thủy Tiên, 2002).Khoáng đa lượng đóng vai trò rất quan trọng cần cho cây và có ảnh hưởng rất tốt cho sựhấp thu mẫu cấy Các nguyên tổ vi lượng Fe, Cu, Zn, Mo Các nguyên tố này tuy cóhàm lượng thấp nhưng có vai trò quan trọng trong việc thúc đây sự phát triển của thựcvật ở giai đoạn phân hóa, ngoai ra chúng còn là thành phần của enzyme, xúc tác cho cácphản ứng sinh hóa trong cơ thé Vi dụ thiếu sắt tế bao mat kha năng phân chia, thiếu bogây thừa auxin làm mô nuôi cấy có biểu hiện mô seo hóa mạnh nhưng lại xốp và tái sinhkém, molipđen tác động trực tiếp lên quá trình trao đổi đạm trong tế bào thực vật(Nguyễn Minh Chơn, 2004)

Nguồn carbon: khi nuôi cấy in vitro thì các tế bao không có khả năng quang hợp

10

nên đòi hỏi phải cung cấp nguồn cacbon dé tạo năng lượng cho các quá trình sinh lí,sinh hóa diễn ra bình thường trong tế bào Nguồn carbon tốt nhất thường được sử dụng

là đường saccarose với nồng độ từ 2 đến 5% Trong môi trường nuôi cấy tế bảo thựcvat, ngoài saccarose, carbohydrate khác cũng được sử dụng, gồm lactose, galactose,

maltose và tinh bột Chúng được báo cáo là kém hiệu qua hon so với saccarose hoặc

glucose (Nguyễn Văn Hồng, 2009)

Các vitamin va acid amin: vitamin có chức năng xúc tác trong phản ứng enzyme.

Mô và các tế bảo nuôi cấy tuy có tổng hơp được vitamin nhưng không đủ nên thườngphải bổ sung vitamin vào môi trường nuôi cấy chủ yếu là : Thiamin (BI) đóng vai tròquan trọng trong quá trình biến đổi carbon và tham gia vào thành phần tô hợp enzyme

xúc tác quá trình oxi hóa khử dehydrogenase xúc tác việc tach hydro ra khỏi axit hữu

cơ, pyridoxin (B6) tham gia vào thành phần các enzyme khử carbon và thay đối vị trí

nhóm amin trong các amino axit, myo — insitol giúp cải thiện sự tăng trưởng của mô, có

vai trò trong sinh tổng hợp thành tế bao Vitamin rất nhạy cảm với sự tăng trưởng của

mô nuôi cấy, vitamin được sử dụng ở nồng độ thấp, nó có vai trò quan trọng trong sựtổng hợp tế bảo

lãi

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện nghiên cứu

Thời gian thực hiện từ tháng 8 năm 2023 đến tháng 3 năm 2024

Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Nuôi cay mô tế bao thực vat (BIO 203),Khoa Khoa học Sinh học, trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu đốt thân mang chéi ngủ của cây lan Kim Tuyến in vitro 8 tuần tuổi được nuôicấy tại phòng Nuôi cấy mô tế bào thực vật, khoa Khoa học Sinh học, trường Đại họcNông Lâm Thành phó Hồ Chí Minh

3.2.2 Trang thiết bị và dụng cụ

Trang thiết bị: tủ cấy vô trùng, nồi hấp khử trùng, cân điện tử, máy khuấy từ, máy

đo pH, máy nước cất, máy xay sinh tố

Dung cụ: Chai thủy tinh, đèn côn, dao cấy, kẹp, kéo, pipet, đũa thủy tinh, ống đong

(25 ml, 50 ml, 100 ml), bình định mức (50 ml, 100 ml), dia petri.

3.2.3 Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu gồm: ethanol, chất khoáng đa lượng, chấtkhoáng vi lượng, vitamin, Fe EDTA, đường và các chất hữu cơ được bé sung bao gồmchuối, khoai tây, ca rốt, nước đừa và tảo Spirulina

3.2.4 Môi trường sử dung nghiên cứu

Môi trường nuôi cấy được sử dụng trong thí nghiệm là môi trường MS cơ bản có

bổ sung các chất hữu cơ Môi trường sau khi pha xong, điều chỉnh pH 5,8 bằng dungdịch NaOH IN, có bồ sung agar, sau đó được đồ vào chai thủy tinh có thé tích là 500

ml Cột kín bình trước khi hap khử trùng ở 121°C, 1 atm trong 20 phút

Các chất hữu cơ được cân đủ số lượng, sau đó được xay ra bằng máy xay sinh tố

và bổ sung vào môi trường rồi mang đi hap bằng nồi hap

3.2.4 Điều kiện nuôi cấy

Nuôi cấy trong điều kiện phòng kín, có chiếu sáng, thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ngày, nhiệt độ phòng nuôi cấy: 25 + 2°C, độ âm: 65 — 70 %

12

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Nội dung 1: Khảo sát ảnh hưởng riêng lẻ và kết hợp của chuối, khoai tây, càrốt, nước dừa lên quá trình sinh trưởng và phát triển chéi lan Kim Tuyến

(Anoectochilus setaceus Blume) in vitro

Vật liệu: Mẫu đốt thân mang chéi ngủ lan Kim Tuyến in vitro 8 tuần tuôi

3.3.1.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nước dừa đến quá trình sinh trưởng

và phát triển chéi lan Kim Tuyến in vitro

Cách tiến hành: Đốt thân lan Kim Tuyến cấy trên môi trường MS có chứa 30 g/Isaccharose, 8 g/l agar Thí nghiệm được bồ trí hoàn toàn ngẫu nhiên 1 yếu tố với nồng

độ nước dừa thay đổi (0; 100; 150; 200 m1/⁄)) Gồm 4 nghiệm thức với 3 lần lặp lại, mỗilần lặp lại 3 bình, mỗi bình 5 mẫu, tổng số mẫu là 180 mẫu Thí nghiệm được bố trí như

Bảng 3.1.

Bảng 3.1 Khảo sát ảnh hưởng của nước dừa lên quá trình sinh trưởng và phát triển chồi

lan Kim Tuyên in vitro

Nghiệm thức Nước dừa (ml/I) Số mẫu

ĐC 0 5

AI 100 bộ A2 150 5 A3 200 5

Các chỉ tiêu theo dõi và ghi nhận: sau 6 tuần nuôi cay

Tổng số chồi phát sinh

So chôi trung bình =————————

Tong số mau nuôi cay

Tổng số chiều cao của mẫu

Chiều cao trung bình = Tổng số mẫu nuôi cấy

3.3.1.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của dịch nghiền chuối lên quá trình sinhtrưởng và phát triển chồi lan Kim Tuyến in vitro

Cách tiến hành: Đốt thân lan Kim Tuyến cấy trên môi trường MS chứa 30 g/lsaccharose, 8 g/l agar Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 1 yếu tố với nồng

độ chuối thay đối (0; 10; 15; 20 g/l) Gồm 4 nghiệm thức, 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 3bình, mỗi bình 5 mẫu, tổng số mẫu là 180 mẫu Thí nghiệm được bố trí như Bảng 3.2

13

Bảng 3.2 Khảo sát ảnh hưởng của dịch nghiền chuối lên quá trình sinh trưởng và phát

triên choi lan Kim Tuyên in vitro

Nghiệm thức Chuối (g/l) Số mẫu

ĐC 0 5

BI 10 5 B2 15 5 B3 20 5 Cac chỉ tiêu theo d6i va ghi nhận: sau 6 tuân nuôi cay.

Tổng số chồi phát sinh

Sô chôi trung bình =—————————

Tong số mau nuôi cay Tổng số chiều cao của mẫu

Chiêu cao trung bình =————D

Tổng số mâu nuôi cấy

3.3.1.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của dịch nghiền cà rốt lên quá trìnhsinh trưởng và phát triển chồi lan Kim Tuyến in vitro

Cách tiến hành: Đốt thân lan Kim Tuyến cấy trên môi trường MS có chứa 30 g/Isaccharose, 8g/1 agar Thí nghiệm được bố trí hoàn toản ngẫu nhiên 1 yếu tố với nồng

độ cà rốt thay đổi (0; 10; 15; 20 g/l) Gém 4 nghiém thuc, 3 lan lặp lại, mỗi lần lặp lại 3

bình, mỗi bình 5 mẫu, tổng số mẫu là 180 mẫu Thí nghiệm được bố trí như Bảng 3.3.Bảng 3.3 Khảo sát ảnh hưởng của dịch nghiền cà rốt lên quá trình sinh trưởng và phát

triên chôi lan Kim Tuyên in vitro

Nghiệm thức Cà rốt (g/l) Số mẫu

ĐỀ 0 Š

Cl 10 5 C2 15 5 C3 20 5

Các chỉ tiêu theo dõi và ghi nhận: sau 6 tuân nuôi cay

kK 4 hs : Tổng số chồi phát sinh

Số chdi trung bình =——Š =

Tổng số mẫu nuôi cấy Tổng số chiều cao của mẫu

Chiêu cao trung bình =————D

Tổng số mâu nuôi cấy

3.3.1.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của dịch nghiền khoai tây lên quá trình

sinh trưởng và phát triển chéi lan Kim Tuyến in vitro

Cách tiến hành: Đốt thân lan Kim Tuyến cấy trên môi trường MS chứa 30 g/1saccharose, 8 g/l agar Thí nghiệm được bố trí hoàn toản ngẫu nhiên 1 yếu tố với nồng

14

độ khoai tây thay đổi (0; 10; 15; 20 g/l) Thí nghiệm được bồ trí hoàn toàn ngẫu nhiên 1yếu tố với nồng độ cà rốt khác nhau Gồm 4 nghiệm thức, 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 3bình, mỗi bình 5 mẫu, tổng số mẫu là 180 mẫu Thí nghiệm bố trí như Bảng 3.4.

Bang 3.4 Khao sát ảnh hưởng của dich nghiền khoai tây đến quá trình sinh trưởng vàphát triển chồi lan Kim Tuyến in vitro

Nghiệm thức Khoai tây (g/l) Số mẫu

ĐC 0 5

DI 10 5 D2 15 5 D3 20 5

Các chỉ tiêu theo dõi và ghi nhận: sau 6 tuần nuôi cấy

Tổng số chồi phát sinh

Sô chôi trung bình = ————————

Tổng số mau nuôi cay Tổng số chiều cao của mẫu

Chiều cao trung bình = Tng số trấn cutie

3.3.1.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng kết hợp của dịch nghiền chuối và khoaitây đến quá trình sinh trưởng va phát triển chéi lan Kim Tuyến

Cách tiến hành: Đốt thân lan Kim Tuyến cấy trên môi trường MS có chứa 30 g/1saccharose, 8 g/l agar Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 2 yếu tố ở nồng độchuối thay đổi (0; 10; 15; 20 g/l) kết hợp với nồng độ khoai tây thay đối (0; 10; 15; 20g/l) Gồm 10 nghiệm thức, 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 3 bình, mỗi bình 3 mẫu, tổng sốmẫu là 270 mẫu Thí nghiệm được bố trí như Bảng 3.5

Bảng 3.5 Khảo sát ảnh hưởng kết hợp của dịch nghiền chuối và khoai tây lên quá trìnhsinh trưởng và phát triển chồi lan Kim Tuyến in vitro

Nghiệm thức Chuỗi (g/1) Khoai tây (g/l)

ĐC 0 0

El 10 E2 10 15 E3 20 E4 10 E5 15 15 E6 20 E7 10 E8 20 15 E9 20

15

Các chỉ tiêu theo đõi và ghi nhận: sau 6 tuần nuôi cấy.

Tổng số chồi phát sinh

Sô chôi trung bình =————D

Tổng số mau nuôi cay

Tổng số chiều cao của mẫu

Chiều cao trung bình = a

3.3.1.6 Thí nghiệm 6: Khảo sat ảnh hưởng kết hợp của dịch nghiền chuối va cà rốtlên quá trình sinh trưởng và phát triển choi lan Kim Tuyến in vitro

Cách tiến hành: Đốt thân lan Kim Tuyến cấy trên môi trường MS có chứa 30 g/1saccharose, 8 g/l agar Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 2 yếu tố ở nồng độchuối thay đối (0; 10; 15; 20 g/l) kết hợp với nồng độ cà rốt thay đối (0; 10; 15; 20 g/l)

Gồm 10 nghiệm thức, 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 3 bình, mỗi bình 3 mẫu, tổng số mẫu

là 270 mẫu Thí nghiệm được bố trí như Bảng 3.6

Bảng 3.6 Khảo sát ảnh hưởng kết hợp của dịch nghiền chuối và cà rốt lên quá trình sinhtrưởng và phát triển chổi lan Kim Tuyến in vitro

Nghiệm thức Chuỗi (g/l) Cà rốt (g/l)

ĐC 0 0

GI 10 G2 10 15 G3 20 G4 10 G5 15 15 G6 20 G7 10 G8 20 15 G9 20 Cac chỉ tiêu theo d6i va ghi nhận: sau 6 tuân nuôi cay.

Tổng số chồi phát sinh

So choi trung bình =——”————D

Tổng số mau nuôi cay Tổng số chiều cao của mẫu

Chiêu cao trung bình =————D

Tổng số mâu nuôi cấy

3.3.2 Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của tảo Spirulina lên quá trình sinh trưởng

và phát triển chéi lan Kim Tuyến in vitro

Cách tiến hành: Đốt thân lan Kim Tuyến cấy trên môi trường MS có chứa 30 g/Lsaccharose, 8g/L agar Thí nghiệm được bố trí hoan toàn ngẫu nhiên 1 yếu tố với nồng

16