Báo cáo thí nghiệm vi sinh vật

PHƯƠNG PHÁP CẤY TRUYỀN VÀ PHÂN LẬP VI SINH Cấy chuyền giống giúp giữ giống và nhân giống vi sinh vật, không bị mất đi trongquá trình nghiên cứu.. Phân lập vi sinh vật nhằm tách từng dòng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TPHCM

KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÁO CÁO THÍ NGHI Ệ M VI SINH V Ậ T

MỤC LỤC

BÀI 1: PHA MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠ NG  4 

1 Mục đích  4  

2 Nguyên tắc của việc pha môi trườ ng  4 

3 Hóa chất  4  

4 Các bước pha môi trườ ng  4 

5 Thự c hiện thí nghiệm  5 

6 Những điều cần lưu ý khi đưa môi trườ ng vào dụng cụ  6 

BÀI 2 PHƯƠNG PHÁP CẤY TRUYỀN VÀ PHÂN LẬP VI SINH  7 

1 Mục đích  7  

2 Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất  7 

3 Phương pháp cấy truyền  7 

4 Kết quả và nhận xét 10 

BÀI 3 NHUỘM MÀU VI SINH VẬT 12 

1 Mục đích 12  

2 Nguyên tắc 12  

3 Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất 12 

4 Tiến hành thí nghiệm  13 

5 Kết quả và bàn luận  14 

BÀI 4 ĐỊNH LƯỢ NG TRỰ C TIẾP NẤM MEN  16 

1 Mục đích 16  

2 Phương pháp định lượ ng trự c tiếp  16 

3 Quy tắc 16  

4 Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất 16 

5 Tiến hành thí nghiệm  17 

6 Kết quả  17 

BÀI 5 ĐỊNH LƯỢNG GIÁN TIẾP NẤM MEN 19 

1 Dụng cụ 19  

2 Trình tự thí nghiệm 19 

3 Kết quả  21 

BÀI 1: PHA MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠ NG

của vi sinh vật

Dùng trong các nghiên cứu và sản suất vi sinh vật

2 Nguyên tắc của việc pha môi trườ ng

Điều chỉnh tỷ lệ và nồng độ một cách chính xác Tùy theo loại môi trườ ng mà ta sẽ 

chọn hóa chất khác nhau Xác định thể tích của môi trườ ng dự định pha cần chọn lượ nghóa chất phù hợ p

3 Hóa chất

Agar

NB thêm agar (NA)

rồi cho hóa chất NB vàođể cân

khác, rồi cho lượng nướ c thích hợ p vào

 Bướ c 5: Chuyển bình chứa môi trườ ng vào thiết bị tiệt trùng Canh nhiệt độ và thờ igian.

Có sự tham gia của arga Cân agar rồi ngâm vào nướ c

5 Thự c hiện thí nghiệm

a Thạch nghiêng (có sự  tham gia của agar)

Để nghiêngống nghiệm K hông để môi trường dính vào đầuống nghiệm Thực

hiện thao tác nhanh

K ết thúc thí nghiệm, đậyống nghiệm bằng nút bông

b Thạch đứ ng (không có sự  tham gia của agar)

Đặtống nghiệm đã cho môi trường vào giá đỡ  

K ết thúc thí nghiệm, đậyống nghiệm bằng nút bông

c Đỗ đĩa

ngoài.Các bướ c thực hiện đỗ đĩa như sau:

Khử trùng tay bằng cách xịt cồn trướ c khi cho tay vào thực hiện trong tủ cấy

nhiễm

cho môi trường vào đĩa

Sau khi đỗ vào đĩa petri xong thì viết tên môi trườ ng, ngày thực hiện và nhóm. Theo dõi 1-2 ngày kiểm tra xem môi trườ ng có bị nhiễm hay không rồi mớ i sử 

dụng tiếp để cấy

 Hìnhảnh minh họa

6 Những điều cần lưu ý khi đưa môi trườ ng vào dụng cụ 

Đỗ cẩn thận và khéo léo vàoống nghiệm và đĩa cần sử dụng

BÀI 2 PHƯƠNG PHÁP CẤY TRUYỀN VÀ PHÂN LẬP VI SINH 

Cấy chuyền giống giúp giữ giống và nhân giống vi sinh vật, không bị mất đi trongquá trình nghiên cứu

Phân lập vi sinh vật nhằm tách từng dòng tế bào riêng lẻ trong quần thể sinh vật

Đĩa petri, ống thạch nghiêng, ống môi trường lỏng đã được đổ môi trường nuôi cấy

đáy ống chứa mẫu giống khuẩn lấy một lượng vừa đủ vi sinh vật; chú ý khi mở nắp ống

chứa giống khuẩn, hơ miệng và nắp ống giống trên ngọn lửa tránh việc ống giống bị

đáy ống chứa mẫu giống khuẩn lấy một lượng vừa đủ vi sinh vật; chú ý khi mở nắp ốngchứa giống khuẩn, hơ miệng và nắp ống giống trên ngọn lửa tránh việc ống giống bị

nghiêng, không được đặt nút bông xuống mặt bàn tủ cấy, đưa que cấy đã lấy giống mẫucấy sâu vào trong ống nghiệm ria hình ziczac từ hướng đáy ống ra ngoài miệng ống, đến

cái để mở nắp; hướng mở đĩa quay về phía ngọn lửa đèn cồn; sử dụng que cấy lướt nhẹtrên mặt thạch, tránh làm bể thạch Kỹ thuật ria có thể làm như sau, chia mặt đĩa petrithành 4 phần, phần 1 ria theo đường ziczac, kéo ngang từng đường có dính vi sinh vật từ phần 1 sang phần 2, kéo dọc từng đường có dính vi sinh vật từ

 phần 2 sang phần 3, tiếp tục kéo ngang từng đường dính vi sinh

vật từ phần 3 sang phần 4 như hình dưới đây Sau mỗi đường

ria liên tục, đốt khử trùng que cấy và làm nguội trước khi thực

 Bước 3: Lật ngược đĩa và ủ ở nhiệt độ thích hợp để vi sinh vật phát triển Việc úpngược đĩa Petri nhằm tránh hiện tượng hơi nước đọng từ nắp rơi xuống môi trường gâytạp nhiễm Đồng thời việc úp ngược đĩa Petri cũng làm tránh nguy cơ VSV từ nắp đĩa rơi

que trang Sau đó, đợt que trang nguội hẳn, có thể để que trang ngược trên nắp lớn của đĩa

dịch khuẩn khô dần trên bề mặt thạch đĩa Thao tác nhẹ nhàng tránh làm rách thạch trên

Chú ý:

Quá trình lấy mẫu và phân lập giống VSV phải thực hiện trong vùng không gian

Khi cầm ống giống và ống nghiệm chứa môi trường phải cầm nghiêng một để

nhóm 5)

Hình: Đĩa cấy trang sau một tuần nuôi cấy 

Ở đĩa cấy trang, do quá trình trang đĩa không đều tay, và thao tác chưa đến khi dịchkhuẩn khô nên không xuất hiện nhiều khuẩn lạc, chỉ xuất hiện khuẩn lạc màu trắng ở phía

Ở đĩa cấy ria, nhóm có đĩa không xuất hiện khuẩn lạc ở vùng III và IV, do lượnglấy giống bạn đầu thấp, hoặc trong quá trình ria đã không lấy được dịch khuẩn từ vùng IIria qua vùng III và IV Ngoài ra, nhóm có xuất hiện những đĩa petri đã bị nhiễm vi khuẩnkhác vì quan sát được trên đĩa xuất hiện những khuẩn lạc màu vàng và màu xám đen sovới khuẩn lạc màu trắng của vi giống Lý do có thể là trong quá trình thao tác thực hiệnviệc nuôi cấy đã vô tình làm rơi vi khuẩn từ tay người cấy hoặc từ không khí trong tủ cấy,hoặc đã không khử trùng hoàn toàn que cấy ria, làm cho mẫu bị tạp nhiễm các loại vi

Ở ống thạch nghiêng thì không xuất hiện ống nghiệm nào bị đấy thạch lên miệngống Khuẩn lạc được mọc đều lên trên bề mặt thạch nghiêng, không xuất hiện ống nghiệm

BÀI 3 NHUỘM MÀU VI SINH VẬT 

Giúp việc quan sát tế bào, các thành phần cấu trúc tế bào và cách sắp xếp của visinh vật được dễ dàng Giúp phân biệt các chủng vi sinh vật với nhau đối với các loạithuốc nhuộm tạo điều kiện cho cho việc phân loại, định dạng vi sinh vật (nhuộm màu

Gram)

 Nhuộm màu là quá trình làm cho tế bào hoặc các thành phần của tế bào vi sinh vật

Tùy theo từng loại vi sinh vật, tùy theo từng cấu trúc tế bào muốn nhuộm, ta cónhiều phương pháp nhuộm màu khác nhau Mỗi phương pháp nhuộm cũng có nguyên tắc

-Cồn 90 độ 

Quy trình nhuộm đơn cần chuẩn bị một số dụng cụ sau: đèn cồn, que cấy, kính

 Nhuộm đơn là dùng 1 loại thuốc nhuộm để nhuộm Các loại thuốc nhuộm thường

Trong bài thí nghiệm này, thuốc nhuộm được sử dụng trong phương pháp nhuộm

Phương pháp nhuộm đơn: đặt tiêu bản đã cố định lên giá rồi nhỏ vài giọt thuốc

nhẹ bằng nước sạch tới khi nào thấy nước rửa chảy qua vết bôi không còn màu nữa làđược Để tiêu bản khô dần hoặc thấm khô bằng giấy thấm Khi tiêu bản khô hẳn đem quan

Quy trình nhuộm Gram cần chuẩn bị một số dụng cụ sau: đèn cồn, que cấy, kính

 Bước 1: Tạo vết bôi. 

Đánh dấu lam kính bằng bút lông Nhỏ 1 giọt nước cất lên lam kính Lấy vi khuẩn

định tiêu bản: để giết chết vi khuẩn, giúp vi khuẩn gắn chặt vào lam kính và bắt màu

Phủ kín vùng có vi khuẩn trên lam kính bằng thuốc nhuộm tím kết tinh trong thời

nhuộm Sau đó, phủ thuốc nhuộm lugol trong 1 phút và rửa lại bằng bình tia Mục đích:

giây cho tới khi vừa mất màu và rửa lại nước bằng bình tia Mục đích: đây là bước tẩy

 bị cồn tẩy dễ dàng nên nó không giữ được màu tím của thuốc nhuộm mà sẽ bắt màu thuốcnhuộm sau là dung dịch Safranin màu hồng nhạt Cần tẩy màu kỹ để vi khuẩn bắt đúng

Cuối cùng phủ thuốc nhuộm Safranin lên lam và giữ 1 phút sau đó rửa lại bằng bình tia Mục đích: giúp các vi khuẩn không bắt màu tím và sẽ bám màu hồng nhạt của

Hình 3.1. Nhuộm đơn 

Hình 3.2.  Nhuộm Gram âm 

Hình 3.3.  Nhuộm Gram dương 

BÀI 4 ĐỊNH LƯỢ NG TRỰ C TIẾP NẤM MEN

nằm giữa phiến kính và đượ c bao quanh bở i một rãnh Đĩa đếm thấp hơn bề mặt củaphiến kính khoảng 1/10 mm, có hình tròn vì thế khi đượ c phủ lên bằng mộto lá kính thì

độ sâu của đĩa đếm sẽ đồng đều nhau Vùng đĩa đếm có diện tích 1mm2 và đượ c chiathành 25 ô vuông lớ n có diện tích mỗi ô là 1/25 mm2 và 400 ô vuông nhỏ hơn, mỗi ô có

diện tích 1/400 mm2

dễ nhầm lẫn tế bào vi sinh vật vớ i các hạt vật thể khác trong mẫu,khó đạt được độ chínhxác cao, không thích hợ p cho huyền phù vi sinh vật có mậtđộ thấp

3 Quy tắc

Pha loãng mẫu cần đếm sao cho trong mỗi ô

có từ 10-50 tế bào

Đếm những tế bào tính từ hàng trên và trái vào

nhau)

4 Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất

Sinh khối nấm men có nồng độ cao, nướ c cất vô trùng

Ống nghiệm và giáống nghiệm

5 Tiến hành thí nghiệm

Bướ c 1: Tiến hành pha loãng sinh khối nấm men để có các giá trị OD trong khoảng

Bướ c 2: Dùng micropipette lấy vừa đủ lượ ng dung dịch nấm men cho lên buồng

BÀI 5 ĐỊNH LƯỢNG GIÁN TIẾP NẤM MEN 

Phương pháp này cho phép xác định mật độ tế bào còn sống hiện diện trong mẫu

Tế bào còn sống là tế bào có khả năng phân chia tạo thành khuẩn lạc trên môi trườngchọn lọc Trong phương pháp này cần thực hiện pha loãng mẫu thành nhiều độ pha loãng

Ưu điểm: chỉ giúp ta định lượng được tế bào sống, sai số thấp, định lượng được phần lớn vi sinh vật hiếu khí mọc trên môi trường nhân tạo tạo khuẩn lạc, không quan tâmkích thước, quan sát được hình dáng khuẩn lạc, làm thuần dễ dàng, định lượng cho một số

Lấy 1ml ống mẫu pha vào 9ml nước trộn đều ta được nồng độ của ống thứ nhất là

10-1. 

Tiếp tục lấy 1ml dung dịch của ống thứ 1 cho vào 9ml của ống số 2 ta được dung

Thực hiện tương tự đến ống thứ 5, ta sẽ có các dung dịch với độ pha loãng tăng

Hút 0,1ml mẫu có độ pha loãng 10-4 vào đĩa petri (chú ý không được chạm đầu pipet vào trong đĩa), nhúng cồn, hơ lửa que cấy trang và để nguội (việc sử dụng que cấytrang quá nóng có thể làm hỏng bề mặt thạch do đó cần phải để nguội trước khi tiến hành

thao tác),đợi đến khi que nguội thì trải đều trên bề mặt đĩa thạch đến khi bề mặt khô, ghi

Sau khi hoàn thành xong, ta lấy mẫu đem ra nhiệt độ phòng, sau 24h rồi đếm

Trong quá trình làm thí nghiệm, ta cấy ít nhất 2 nồng độ pha loãng liên tục, mỗinồng độ làm ít nhất 2 đĩa Càng nhiều nồng độ pha loãng và càng nhiều đĩa petri cho mỗi

Không nên mở nắp hộp petri quá lớn và các thao tác nên thực hiện gần đèn cồn để

3.Kết quả 

Với: N: số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn trong 1g hay 1ml mẫu 

Cần kiểm soát chất lượng mẫu và phương pháp đo: Kết quả định lượng gián tiếp visinh vật phụ thuộc vào chất lượng mẫu và phương pháp đo Để đảm bảo độ chính xác của