Khảo Sát Khả Năng Ức Chế Enzyme Α-Amylase Của Cao Chiết Thực Vật.pdf

Từ ống 1 đến ống 5, khi nồng độ cao chiết tăng dần, màu của dung dịch từ không màu chuyển dần sang xanh tím, chứng tỏ lượng tinh bột còn thừa sau phản ứng tăng dần do tinh b t k t hộ ế ợ

Giảng viên hướng dẫn: PGS.TS Đái Thị Xuân Trang

1

BÀI 1 KHẢO SÁ T KH Ả NĂNG ỨC CHẾ ENZYME

I THỰC HÀNH

1. Chuẩn bị

a) Pha dung dịch đệm phosphate natri, pH 7

− Lần lượt pha hai dung dịch (a) và (b) theo công thức sau:

+ Dung dịch mononatri orthophosphate 0,2M (a): 27,8 g NaH2PO4hòa tan và định mức đến 1000 mL

+ Dung dịch dinatri hydrophosphate 0,2M (b): 53,05 g Na2HPO4.7H2O hoặc 71,7g

Na HPO2 4.12H2O hòa tan và định mức đến 1000 mL

− Lấy 39 mL dung dịch (a) cho vào bình định mức 100 mL, thêm dung dịch (b) cho đến vạch Thu được dung dịch đệm phosphate natri pH 7

b) Chuẩn bị cao chiết

− Cân chính xác 10 mg cao chiết cho vào eppendorf tube 1 mL rồi thêm 1mL DMSO

− Lắc đều cho tan hoàn toàn thu được dung dịch cao chiết có nồng độ 10.000 μg/mL (xem như dung dịch gốc)

− Tiến hành pha loãng dung dịch gốc thành dãy nồng độ 400; 800; 1600 và

Thể tích DMSO 10% (µL)

c) Pha dung dịch tinh bột

− Cân chính xác 20 mg tinh bột cho vào cốc thủy tinh, thêm 10 mL nước cất, khuấy đều

− Đun bằng lò vi sóng cho đến khi tinh bột tan hoàn toàn

− Dung dịch tinh bột thu được có nồng độ 2 mg/mL, dung dịch này cần được để nguội hoàn toàn trước khi sử dụng

2

d) Pha enzyme α – amylase

− Cân chính xác 2 mg enzyme α-amylase cho vào eppendorf và thêm vào 2 mL dung dịch đệm phosphate natri pH 7

− Dung dịch enzyme thu được có nồng độ 1 mg/mL tương đương 30 U/mL (U) Sau

đó rút rút 100 µL enzyme α – amylase 30 U vào eppendorf tube 1 mL và rút thêm

900 µL dung dịch đệm phosphate pH = 7 vào đánh đều lên thu được dung dịch enzyme α – amylase nồng độ 3 U dùng cho thí nghiệm

2. Xác định kh ả năng ức ch ế enzyme α-amylase c a cao chi t ủ ế thực v t: ậ

100 µL,

nồng độ

800 µg/mL

100 µL,

nồng độ

1600 µg/mL

100 µL,

nồng độ

3200 µg/mL

Hốn h p ph n ng ti p tợ ả ứ ế ục được ủ ở 37oC trong 15 phút

HCl đậm

đặc 200 µL 200 µL 200 µL 200 µL 200 µL 200 µL 200 µL Thuốc thử

iod 300 µL 300 µL 300 µL 300 µL 300 µL 300 µL 300 µL

Đo OD ở bước sóng 660 nm

3

Ghi chú: “-“ là không thêm vào

❖ Thêm ống 2’, 3’, 4’, 5’ cho cao chiết gi ng ố ống 2, 3, 4, 5 tương ứng, tất cả các dung

100 µL,

nồng độ 800 µg/mL

❖ Khả năng ức chế enzyme α-amylase của cao chi t ế thực v t nậ ở ồng độ xác định được

bi u diể ễn thông qua hiệu suất ph n ng thả ứ ủy phân tinh bột dựa vào lượng tinh bột còn thừa sau khi đã ngừng phản ứng thủy phân Lượng tinh bột thừa được kiểm tra thông qua phản ứng màu với iod Hiệu suất ph n ả ứng được tính theo công thức:

Hiệu su t ph n ng (%) = ấ ả ứ 𝐴𝑐−𝐴𝑠

𝐴𝑐 x 100 Trong đó:

− Aclà m t đậ ộ quang c a dung dủ ịch đối chứng ( ng 7) ố

− Aslà m t đậ ộ quang c a dung d ch sau ph n ủ ị ả ứng

4

Đồ th ị

Đồ ị th biểu diễn ph ần trăm enzyme α-amylase bị ức chế theo n ồng độ cao chiết

Từ phương trình đường chuẩn: y = 0.0 x + 35.182 22

Lượng tinh bột còn lại sau phản ứng càng nhiều thì khả năng ức ch ế α-amylase của cao chiết càng cao Từ ống 1 đến ống 5, khi nồng độ cao chiết tăng dần, màu của dung dịch từ không màu chuyển dần sang xanh tím, chứng tỏ lượng tinh bột còn thừa sau phản ứng tăng dần (do tinh b t k t hộ ế ợp v i iod tớ ạo thành phức h p iod-tinh bợ ột có màu xanh tím)

- Cao chiết có khả năng ức ch ế enzyme α amylase, làm cho enzyme α- -amylase không có khả năng thủy phân tinh bột nên lượng tinh bột còn thừa từ ống 1

đến ống 5 tăng dần → màu dung dịch t ống 1 đếừ n ống 5 đậm dần → giá trịAbs tăng dần

- → Phần trăm ức chế tăng dần khi nồng độ cao chiết tăng dần suy ra hiệu quả

ức chế -amylase tăng khi nồng độ cao chiα ết tăng Do đó cao chiết có khảnăng ức chế enzyme α-amylase

6

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG VI KHUẨN BẰNG PHƯƠNG

PHÁP KHUẾCH TÁN TRÊN ĐĨA THẠCH

I CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

1. Pha chế môi trường

− Môi trường LB Broth powder (có sẵn): cân 25 g môi trường LB, sau đó thêm vào

1000 mL nước cất và điều chỉnh pH 7,2

− Môi trường được pha từ các hóa chất:

Thành phần môi trường (chuẩn bị 1000 mL môi trường) gồm:

− Điều chỉnh pH môi trường pH 7,2

2. Khử trùng môi trường và chuẩn bị môi trường đặc trên đĩa petri

− Môi trường sau khi pha xong được chuyển vào chai chịu nhiệt, đĩa petri được cho vào túi nylon kiếng (hoặc gói trong giấy dầu)

− Môi trường và đĩa petri được cho vào nồi khử trùng nhiệt ướt và khử trùng ở nhiệt

độ 121°C trong 30 phút

− Sau khi khử trùng xong, chai chứa môi trường và đĩa petri được cho vào tủ cấy vô trùng

− Các đĩa được đặt chồng lên nhau (khoảng 4 5 đĩa) -

− Môi trường được chia vào các đĩa petri, thao tác được thực hiện như sau:

• Tay phải cầm chai chứa môi trường đã khử trùng và hơ nhẹ miệng chai trên đèn cồn, tay trái mở nắp chai và hơ miệng chai trên ngọn lửa đèn cồn lần thứ 2

• Tay trái cầm và mở nắp đĩa petri cuối cùng, tay phải nghiêng chai môi trường và rót môi trường vào đĩa petri (lớp môi trường dày khoảng 2 – 3 mm), đậy nắp đĩa lại và mở nắp đĩa petri thứ 2 và thực hiện tương tự cho đĩa thứ 3 và 4

3. Chuẩn bị môi trường đặc trên đĩa petri trong thử hoạt tính kháng khuẩn

− Khi khử hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán trên thạch, độ dày môi trường trên các đĩa petri cần đồng đều, nên việc chuẩn bị môi trường cũng được tiến hành tương tự như trên nhưng cần chia môi trường vào các ống nghiệm trước khi khử trùng

− Chia 10 mL (hoặc 15 mL tùy theo kích thước đĩa) môi trường sau khi phối trộn vào

− Thao tác rót môi trường phải nhanh và nhẹ để hạn chế bọt khí và sự nhiễm khuẩn

− Mặt agar phải phẳng, không gợn sóng

− Sau 1-2 ngày cần kiểm tra lại xem môi trường có bị nhiễm khuẩn không rồi mới sử dụng

để cấy hay phân lập

4 B áo cáo kết quả

Chuẩn bị được các đĩa môi trường đúng cách không bị nhiễm

8

5 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG VI KHUẨN BẰNG PHƯƠNG PHÁP

KHUẾCH TÁN TRÊN ĐĨA THẠCH

1. Chuẩn bị kháng sinh hoặc cao chiết của một loài thực vật.

a. Chuẩn bị kháng sinh hoặc cao chiết thực vật nồng độ 1280 ng/mL

− Cân chính xác 0,0128 g kháng sinh hoặc cao chiết cho vào eppendorf

− Dùng micropipet lấy 1 mL DMSO 10% (*) cho vào eppendorf

− Vortex cho mẫu hòa tan hoàn toàn được kháng sinh gốc, nồng độ 1280 µg/mL

b. Chuẩn bị cao chiết hoặc kháng sinh thử nghiệm (Euvioxcin)

− Đánh số các ống nghiệm từ 1 đến 5 tương ứng với các nồng độ 8 (µg/mL), 16 (µg/mL), 32 ( g/mL), 64 (µ µg/mL) và 128 (µg/mL)

− Dùng micropipet hoặc pipet lấy 1800 µL DMSO 1% cho vào ống nghiệm 5 và 1000

µL và các ống nghiệm 1, 2, 3, 4

− Lấy 200 µL kháng sinh gốc cho vào ống nghiệm 5, sau đó vortex để trộn mẫu

− Tiếp tục lấy 1000 µL dung dịch từ ống nghiệm 5 chuyển sang ống nghiệm 4, vortex trộn mẫu được nồng độ 128 (µg/mL)

− Lấy 1000 µL dung dịch trong ống nghiệm 4 cho vào ống nghiệm 3, vortex trộn mẫu được nồng độ 64 (µg/mL)

− Tiến hành tương tự đối với các ống nghiệm còn lại

2. Chuẩn bị vi khuẩn thử nghiệm

− Vi khuẩn được nuôi và nhân một số trong môi trường LB lỏng (được lắc trên máy lắc ngang trong 24 giờ)

− Dịch vi khuẩn được pha loãng 10 với nước cất (vô trùng) hoặc dung dịch NaCl60,9% (vô trùng)

3. Tiến hành thí nghiệm

− Chuẩn bị 6 đĩa môi trường LB đặc và ghi số thứ tự từ 1 – 6 (2 nồng độ kháng sinh

và 3 cao chiết),

− 100 µL dung dịch vi khuẩn được nhỏ trên bề mặt đĩa petri chứa môi trường LB đặc

và được trãi trên bề mặt môi trường, để khoảng 5 – 10 phút cho bề mặt môi trường khô

− Dùng cây đục lỗ có đường kính 10 mm, đã được khử trùng ấn mạnh lên bề mặt môi trường đã trãi vi khuẩn Staphylococcus aureus Đĩa petri cho cao chiết đục 5 lỗ, đĩa cho kháng sinh đục 3 lỗ

− Cho kháng sinh hoặc cao chiết ở từng nồng độ khảo sát vào

− Sau đó chờ cho kháng sinh hoặc chất thử nghiệm (cao chiết) khuếch tán hoàn toàn trong agar, đậy nắp đĩa petri ghi nhận ngày, tháng, năm thực hiện thí nghiệm và nồng độ kháng sinh đã thực hiện

− Các đĩa petri đã thực hiện được đặt trong tủ ủ ở 32°C trong 24 giờ Quan sát và ghi nhận kết quả thí nghiệm bằng cách là đo đường kính vùng ức chế (dùng thước đo với đơn vị mm) bao gồm đường kính khoanh giấy và vùng vi khuẩn không phát triển

độ vi khuẩn giảm hẳn chỉ còn 1 3 khuẩn lạc mọc Ở nồng độ thấp nhất, không có -

vị khuẩn mọc thì kết quả được ghi nhận là: nhỏ hơn hoặc bằng nồng độ đó Trong trường hợp đến nồng độ cao nhất mà vẫn thấy vi khuẩn mọc thì kết quả được ghi nhận là lớn hơn nồng độ đó

4. Báo cáo kết quả

1 Thử nghi m hoạt tính kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus c a kh ệ ủ áng sinh Vancomycin ở các

2 Thử nghi m hoệ ạt tính kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus c a cao chi c ủ ế ở các nồng độ 8 (µg/mL), 16 (µg/mL), 32 (µg/mL), 64 (µg/mL) và 128 (µg/mL)

10

1 V ẽ đường bi u diể ễn đường kính trung bình vòng kháng khuẩn theo dãy nồng độ

Vị trí Đường k nh kháng sinh í Đường k nh cao chií ếc

11

- Đố ới kháng sinh vòng kháng khuẩn có đường kính tăng dầi v n khi nồng độ tăng dần, đối

v i cao chiớ ết không nhìn thấy vòng kháng khuẩ ở ồng độ ừn n t 8 64 – μg/ml và đố ới i vDMSO 10%, đến nồng độ 128 μg/ml mới xuất hiện vòng kháng khuẩn

- Khả năng kháng khuẩn của kháng sinh Vancomycin thì luôn cao hơn cao chiết ở ấ ả t t c

nồng độ khả sáto

- Nồng độ ức chế ố t i thiểu MIC có khả năng kháng khuẩn của cao chiếc là 128(μg/ml) Vì

tại đó là nồng độ thấp nhấ ểt đ cao chiếc xuất hi n ệ ức chế ự tăng trưở s ng c a vi khu n ủ ẩ

➢ Cao chiếc có kh ả năng ức chế vi khuẩn ở ồng độ thích ợ n h p

I PHƯƠNG PHÁP GIẢI PHẪU CHU T NH T TR Ộ Ắ ẮNG

1. Quan sát hình dạng bên ngoài

Loài: Mus musculus Linnaeus

Chuột nhắt có cơ thể nhỏ, lông trắng chia thành 4 thành phần chính: đầu, mình, đuôi

và tứ chi Tai rộng, thân được bao ph bủ ởi lông mao màu trắng (tr ừ phần mõm), tai và đuôi

ít lông Chuột có 4 cái răng: 2 răng trên và 2 răng dưới, nhọn và bén Mắt chuột màu hồng Chuột đực và chuột cái có thể phân biệt khi chuột trưởng thành dựa vào bộ phận sinh

dục

2. Phương pháp cân và lấy máu tĩnh mạch đuôi chuột nhắt trắng

− Chuột nhắt trắng được cân bằng cách cho chuột vào ống falcon 15 mL (đã trừ trọng lượng c a ống falcon) và cân bằng cân phân tích ủ

− Máu tĩnh mạch đuôi được lấy bằng cách dùng lưỡi lam rạch một vết ở đuôi chuột kho ng 0,2 mm, vu t nhả ố ẹ đuôi để máu chảy ra Giọt máu này có thể được cho vào eppendorf cho các thí nghiệm khác, hoặc có thể cho lên que thử để đo glucose huyết của chu t Chuộ ột được cầm máu bằng cách giữchặ ị trí cắt bằng bông gòn tầm cồn t v khoảng 1 phút

3. Phương pháp giải ph u chu t nhẫ ộ ắt trắng

Quy trình giải phẩu chuột gốm các bước:

− Bước 1: Gây mê

Dùng bông gòn thấm diethyl ether cho vào lọ thuỷ tinh có nắp đậy Sau đó, cho chuột vào

và đậy nắp lại khoảng 3 phút Quan sát cho đến khi chuột không còn thở nữa

− Bước 2: Giải ph u chu t ẫ ộ

Cố định chu tộ : đặt chuột nằm ngửa, dùng kim ghim cố định 2 chi trên và 2 chi dưới vào khay m ổ (kim ghim nghiêng về phía ngoài một góc 450)

13

C t daắ : Dùng kéo cắt từ vị trí cách hậu môn khoảng 0,5 cm, sau đó cắt thằng rồi cắt về phía 2 chi trên của chu t, tiộ ếp t c c t v ụ ắ ề phí chi dưới Sau đó, kéo da về 2 phía và dùng kim ghim c ố định vào khay mổ

Cắt cơ: Dùng kẹp nâng cơ bụng lên, cắt một đường dọc cho đến mấu hình kiếm của xương

ức

Lưu ý: khi cắt cơ, mũi kéo hướng chếch lên để tránh đ ứt các nội quan

− Bước 3: Mở l ộ tim và lấy máu tim

Dùng kéo cắt bỏ phần xương sườn mở ộ l tim và tiến hành lấy máu tim

Dùng kim tiêm (đã bơm bỏ khí trong ống) đâm nhẹ vào đỉnh tâm thất trái, kéo nhẹkim tiêm để máu được đẩy vào ống tiêm và lấy thể tích máu từ khoảng khoảng 0,7 - 1 mL Sau đó máu được đưa vào ống có chứa sẵn chất chống đông và lắc đều nhẹ

− Bước 4: Giải ph u lấy gan và th n ẫ ậ

Tách gan: Gan là nội tạng lớn nhất trong cơ thể ằm sát khoang ngực, gan có 4 thùy Cắ n t rời gan khỏi cơ thể tĩnh mạ ở ch cửa và động mạch gan

Tách thận: Thận màu nâu đỏ hình hạt đậu nằm sát cột sống, ở xoang b ng Tuyụ ến thượng thận thật tròn màu trắng nằm trên thận Thận được c t r i kh i cắ ờ ỏ ở thể ở ị trí độ v ng m ch ạ

thận, tĩnh mạch thận và cắt ngang niệu quản để ận rth ời bàng quang

Sau khi c t rắ ời cơ thể, gan và thận được làm sạch bằng dung dịch muối sinh lý và trữ

tạm thời vào khay có chứa nước đá

4. Báo cáo kết quả

a) Mẫu giải phẫu chu t.ộ

15

NT5

16

II KHẢO SÁT HOẠT TÍNH BẢO V GAN C A CAO CHI T THỆ Ủ Ế ỰC VẬT TRÊN CHUỘT TỔN THƯƠNG GAN DO CARBON TETRACHLORIDE

1. Chuẩn bị thí nghi m ệ

− Chia ngẫu nhiên 15 con chuột vào 5 chuồng và đánh dấu th t ứ ự các chuồng chuột

− Dùng viết đánh dấu chuột trong mỗi chuồng bằng cách ạch vào đuôi chuột 1, 2 và v

3 vạch

− Cân và ghi nhận trọng lượng từng con chuột

− Nồng độ CCl4được cho uống là 0,2 mL pha trong d u olive v i t l 1:4.ầ ớ ỉ ệ

− Nồng độ cao chiết được cho uống là 200 mg/kg trọng lượng chuột

− Nồng độ sylimarin được cho uống là 100 mg/kg trọng lượng chuột

2 B ố trí thí nghiệm

Dựa vào bảng b ố trí thí nghiệm như sau:

− Nghiệm thức 1: Chuột bình thường cho u ng 0,ố 2 mL nước cất

− Nghiệm th c 2: Chuứ ột bình thường cho u ng 0,2 ml d u olive, sau 1 gi uố ầ ờ ống thêm 0,2 mL DMSO 1%

− Nghiệm thức 3: Chuột bình thường cho u ng 0,2 mL CCl pha trong d u olive, sau ố 4 ầ

1 gi uờ ống thêm 0,2 mL DMSO 1%

− Nghiệm th c 4: Chuứ ột bình thường cho u ng 0,2 mL CCl pha trong d u olive, sau ố 4 ầ

1 gi cho u ng 0,2 mL silimarin (nờ ố ồng độ 100 mg/ kg trọng lượng chuột) pha trong DMSO 1%

− Nghiệm th c 5: Chuứ ột bình thường cho u ng 0,2 mL CCl pha trong d u olive, sau ố 4 ầ

1 gi cho uờ ống thêm 0,1 mL cao chiết thực vật (200 mg/ kg trọng lượng chuột) pha trong DMSO 1%

Chuột được thực hiện gây tổn thương gan và điều trị trong 14 ngày, mỗi ngày thí nghiệm được thực hiện vào 7 hoặc 8 giờ sáng

3. Giải phẫu chu t ộ

− Sau 14 ngày kết thúc thí nghiệm, chuột được gi i ph u lả ẫ ấy gan, tim và 2 quả thận (phương pháp giải phẫu như bài 4)

− Tách toàn bộ gan, tim, thận khỏi cơ thể chuột, quan sát, ghi nhận và chụp hình cấu trúc bên ngoài gan

− Cân và ghi nhận trọng lượng gan chuột ở các nghiệm thức

− C t l y 250 mg gan, tim, th n chu t r a s ch bắ ấ ậ ộ ử ạ ằng nước muối sinh lý, sau đó trữtrong ống eppendorf nhiở ệt độ 20 - oC cho thí nghiệ ở bài 6 m

17

III K T QU Ế Ả THÍ NGHI MỆ

1.Cơ chế gây độc của CCl 4

− CCl4 có sự hình thành các gốc t ự do gây stress oxy hóa và kích thích gây viêm CCl4 dưới chuyển hóa của cytochrom P450 2E1 (CYP2E1) biến đổi thành tricloromethyl CCl 3.

− CCl3. là một gốc tự do, tiếp tục kết hợp với oxy tạo gốc tricloromethyl peroxyl (CCl3OO. ) ho t t nh mạ í ạnh hơn Các gố ự do này gây bão hòa hệ thốc t ng chống oxy hóa phòng thủ của cơ thể, phản ứng với các protein, tấn công các acid béo chưa no, gây peroxyd hóa lipid, giảm lượng cytochrom P450 dẫn đến suy giảm chức năng do giảm protein và tích tụ triglycerid, thay đổi trạng thái cân bằng nước, điện giải đồng thời làm tăng các enzym gan trong huyết tương

− S ự peroxyd hóa lipid dẫn đến một loạt các phản ứng, như phá hủy lipid màng, tạo

ra các chất độc hại nội sinh, gây ra nhiều biến chứng về gan và bất thường chức năng