Khảo sát khả năng ức chế nấm aspergillus flavus sinh độc tố aflatoxin của các chủng lactobacillus sp ứng dụng trong chăn nuôi

BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP.HCM TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO BÁO CÁO NGHIỆM THU KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ NẤM Aspergillus flavus SINH ĐỘC TỐ AFLATOXINCỦA CÁC CHỦNG Lactobacillus sp ỨNG DỤNG TRONG CHĂN NUÔI CHỦ NHIỆM NDNC Cn Nguyễn Văn Lượng CƠ QUAN QUẢN LÝ CƠ QUAN CHỦ TRÌ THÀ NH PHỚ HỜ CHÍ MINH THÁ NG 12/2015 TÓM TẮT ĐỀ TÀI Từ chủng Lactobacillus sp có khả ức chế nấm Aspergillus flavus sinh độc tố aflatoxin 19 chủng ban đầu sử dụng để khảo sát Kết chủng Lactobacillus LTD20 cho kết ức chế nấm tốt nhất, hàm lượng aflatoxin sinh thấp khác biệt ý nghĩa thống kê với chủng lại Chủng Lactobacillus LTD20 sử dụng để khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ, thời gian ủ mật số vi khuẩn đến khả ức chế nấm Aspergillus flavus Kết cho thấy chủng LTD20 ức chế nấm tốt 35 0C 40 0C sau ngày với mật số 109 cfu/ml, đồng thời lượng aflatoxin sinh thấp Thí nghiệm tạo chất mạng bột đậu nành với chủng Lactobacillus LTD20 cho kết tối ưu nhiệt độ sấy khô 40 0C sau 16 với độ ẩm phù hợp 12%, mật độ vi khuẩn trì mức cao 109 CFU/ml Thí nghiệm khảo sát thức ăn cho gà cho thấy tỷ lệ phối trộn CML:CMA 10g:1g 100g thức ăn cho kết kháng nấm Aspergillus flavus sinh độc tố aflatoxin hiệu Từ khóa: Aspergillus flavus; aflatoxin; chất mang; Lactobacillus ABSTRACT Seven antifungal strains of Lactobacillus seclected from 19 original strains could inhibited aflatoxin-producing Aspergillus flavus Lactobacillus strain LTD20 inhibited most effectively with the lowest aflatoxin-producing and statistically significant differences with other strains Lactobacillus strain LTD20 was continued using to investigate the affect of temperature, time for incubation and density of bacteria to the antifungal activity in inhibition of Aspergillus flavus The result showed that Lactobacillus strain LTD20 inhibited Aspergillus flavus most effectively at incubation temperature 35 0C and 40 0C after days with density of bacteria 109 CFU/ml and aflatoxin-producing was lowest In experiment of creating soy bean flour carrier contain Lactobacillus strain LTD20, the optimal result was dried at 40 0C after 16 hours with suitable humidity 12% and remained high level of II density of bacteria Applying in chicken feed with the ratio of CML:CMA in 100 g mixture was 10 g:1 g was most effective in inhibition aflatoxin-producing Aspergillus flavus Keywords: Aspergillus flavus; aflatoxin; carrier; Lactobacillus III MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa i Tóm tắt đề tài ii Mục lục iv Danh mục chữ viết tắt vii Danh mục bảng viii Danh mục hình x THƠNG TIN ĐỀ TÀI MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược Lactobacillus 1.2 Sơ lược nấm Aspergillus flavus độc tố aflatoxin lương thực, thực phẩm 1.2.1 Nấm Aspergillus flavus 1.2.2 Aflatoxin 1.2.3 Con đường sinh tổng hợp aflatoxin 1.3 Tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực nội dung nghiên cứu 1.3.1 Nghiên cứu nước 1.3.2 Nghiên cứu nước 10 Chương NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 11 2.2 Phương tiện thí nghiệm 11 2.2.1 Vật liệu thí nghiệm 11 2.2.2 Hóa chất, mơi trường ni cấy 11 2.2.3 Thí bị thí nghiệm 12 2.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm 13 IV 2.3.1 Nội dung 1: Sàng lọc chủng vi khuẩn Lactobacillus sp có khả ức chế nấm Aspergillus flavus sinh độc tố aflatoxin 2.3.1.1 Định tính khả sinh độc tố nấm Aspergillus flavus môi trường thạch nước cốt dừa (CND) 2.3.1.2 Đánh giá khả ức chế nấm Aspergillus flavus sinh aflatoxin chủng Lactobacillus sp in vitro 2.3.1.3 Chỉ tiêu theo dõi 13 13 14 16 2.3.2 Nội dung 2: Khảo sát điều kiện chủng vi khuẩn Lactobacillus sp ức chế nấm Aspergillus flavus in vitro 2.3.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ ủ vi khuẩn Lactobacillus sp đến khả ức chế nấm Aspergillus flavus 2.3.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng thời gian ủ vi khuẩn Lactobacillus sp đến khả ức chế nấm Aspergillus flavus 2.3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng mật độ vi khuẩn Lactobacillus sp có khả ức chế nấm Aspergillus flavus 2.3.2.4 Chỉ tiêu đánh giá 16 16 17 17 18 2.3.3 Nội dung 3: Tạo chất mang chứa Lactobacillus sp đánh giá hoạt tính chất mang Lactobacillus sp (CML) 18 2.3.3.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 18 2.3.3.2 Chỉ tiêu đánh giá 19 2.3.4 Nội dung 4: Đánh giá khả ức chế nấm Aspergillus flavus sinh độc tố aflatoxin từ chủng Lactobacillus sp thức ăn gà 19 in vitro 2.3.4.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 19 2.3.4.2 Chỉ tiêu đánh giá 20 2.3.5 Phương pháp phân tích xử lý số liệu 20 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21 3.1 Nội dung 1: Sàng lọc chủng vi khuẩn Lactobacillus sp có khả ức chế nấm Aspergillus flavus sinh độc tố aflatoxin V 21 3.1.1 Định tính khả sinh độc tố Aspergillus flavus môi trường thạch nước cốt dừa (NCD)s 3.1.2 Đánh giá khả ức chế nấm Aspergillus flavus sinh độc tố aflatoxin chủng Lactobacillus sp 3.2 Nội dung 2: Khảo sát điều kiện chủng vi khuẩn Lactobacillus sp ức chế nấm Aspergillus flavus in vitro 3.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ ủ vi khuẩn Lactobacillus sp.đến khả ức chế nấm Aspergillus flavus 3.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng thời gian ủ vi khuẩn Lactobacillus sp đến khả ức chế nấm Aspergillus flavus 3.2.3 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng mật độ vi khuẩn Lactobacillus sp đến khả ức chế nấm Aspergillus flavus 3.3 Nội dung 3: Tạo chất mang chứa Lactobacillus sp đánh giá hoạt tính chất mang Lactobacillus sp (CML) 21 22 25 25 28 30 33 Nội dung 4: Đánh giá khả ức chế nấm Aspergillus flavus sinh độc tố aflatoxin từ chủng Lactobacillus sp thức ăn gà 36 in vitro Chương IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 40 4.1 Kết luận 40 4.2 Kiến nghị 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 PHỤ LỤC 44 VI DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VIẾT TẮT THUẬT NGỮ TIẾNG VIỆT Aspergillus flavus A flavus CFU Colony-forming unit- Số đơn vị khuẩn lạc CMA Chất mang Aspergillus flavus CML Chất mang Lactobacillus HPLC High Performance Liquid Chromatography MEA Malt Extract Agar MRS De man, Rogosa, Sharpe MRSA De man, Rogosa, Sharpe Agar MRSB De man, Rogosa, Sharpe Broth NCD Nước cốt dừa PDA Potatoe Dextrose Agar UV Ultra Violet VII DANH MỤC CÁC BẢNG Số 1.1 1.3 2.1 2.2 2.3 Tên bảng số liệu Mức giới hạn lượng aflatoxin thực phẩm thức ăn chăn nuôi Giới hạn tối đa lượng aflatoxin cho phép thực phẩm theo Bộ Y tế Việt Nam Danh sách chủng Lactobacillus sp cung cấp PTN VSCN Dược Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ ủ đến khả ức chế nấm Aspergillus flavus vi khuẩn Lactobacillus sp Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng thời gian ủ đến khả ức chế nấm Aspergillus flavus vi khuẩn Lactobacillus sp Trang 15 17 17 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng mật độ vi khuẩn đến khả 2.4 ức chế nấm Aspergillus flavus vi khuẩn 18 Lactobacillus sp 2.5 Thời gian nhiệt độ sấy CML CMA 19 2.6 Tỷ lệ phối trộn CML 100g cám viên 20 3.1 Hàm lượng aflatoxin B1 môi trường NCD cấy nấm Aspergillus flavus sau ngày ủ 30 0C 22 Kích thước vịng kháng nấm Aspergillus flavus chủng 3.2 Lactobacillus sp sau ngày ủ 35 0C hàm lượng aflatoxin 22 sinh nghiệm thức Ảnh hưởng nhiệt độ ủ đến khả ức chế nấm 3.3 Aspergillus flavus hàm lượng aflatoxin chủng 25 Lactobacillus LTD20 Ảnh hưởng thời gian đế khả ức chế nấm Aspergillus 3.4 flavus hàm lượng aflatoxin chủng Lactobacillus LTD20 VIII 28 Ảnh hưởng mật độ vi khuẩn đến khả ức chế nấm 3.5 Aspergillus flavus hàm lượng aflatoxin chủng 31 Lactobacillus LTD20 Ảnh hưởng nhiệt độ thời gian sấy đến độ ẩm, mật độ vi 3.6 khuẩn khả ức chế nấm Aspergillus flavus chủng 34 Lactobacillus LTD20 CML 3.7 Hàm lượng aflatoxin có nghiệm thức phối trộn chất mang CML với thức ăn cho gà sau ngày ủ 350C IX 38 DANH MỤC CÁC HÌNH Số 1.1 1.2 1.3 3.1 Tên hình Vi khuẩn Lactobacillus quan sát kính hiển vi với độ phóng đại 1000x Hình thái Aspergillus flavus thạch mơi trường PDA (A) kính hiển vi (B) Cơng thức cấu tạo hóa học aflatoxin B1, B2, G1, G2, M1 M2 Nấm Aspergillus flavus sinh độc tố aflatoxin môi trường NCD sau ngày ủ 300C quan sát tia UV Trang 21 Đồ thị thể kích thước bán kính vịng kháng nấm 3.2 Aspergillus flavus hàm lượng Aflatoxin B1 sinh 23 chủng Lactobacillus sp 3.3 Vòng kháng Aspergillus flavus chủng Lactobacillus sp sau ngày ủ 350C 24 Đồ thị thể ảnh hưởng nhiệt độ đến kích thước bán 3.4 kính vịng kháng nấm Aspergillus flavus hàm lượng 26 Aflatoxin B1 sinh chủng Lactobacillus LTD20 3.5 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả ức chế nấm Aspergillus flavus chủng Lactobacillus LTD20 27 Đồ thị thể ảnh hưởng thời gian ủ đến kích thước 3.6 bán kính vịng kháng nấm Aspergillus flavus hàm lượng 29 Aflatoxin B1 sinh chủng Lactobacillus LTD20 3.7 Ảnh hưởng thời gian đến khả ức chế nấm Aspergillus flavus chủng Lactobacillus LTD20 X 30 aflatoxigenic fungi on maize kernels Quality Assurance and Safety of Crops & Foods, 2(1), 22-27 [11] FDA Mycotoxin Regulatory Guidance 8/2011(http://www.ngfa.org/wpcontent/uploads/NGFAComplianceGuideFDARegulatoryGuidanceforMycotoxins8-2011.pdf) [12] Fiore A.D., Riverberi M., Rossi P.D., Tolaini V., Fabbri A.A., Fanelli C (2009) Polymerase chain reaction-based assay for the early detection of aflatoxigenic fungi on maize kernels Quality Assurance and Safety of Crops and Foods, 10, 22-27 [13] Fuller R (1989), Probiotics in man and animals Journal of Applied Microbiology, 66, pp 65–78 [14] Gerbaldo, G A., Barberis, C., Pascual, L., Dalcero, A., & Barberis, L (2012) Antifungal activity of two Lactobacillus strains with potential probiotic properties FEMS microbiology letters, 332(1), 27-33 [15] Magnusson, Jesper, & Johan Schnürer.(2001) Lactobacillus coryniformis subsp coryniformis strain Si3 produces a broad-spectrum proteinaceous antifungal compound Applied and Environmental Microbiology 67.1, 1-5 [16] Magnusson, J (2003) Antifungal activity of lactic acid bacteria (Vol 397) [17] Muñoz, R., Arena, M E., Silva, J., & González, S N (2010) Inhibition of mycotoxin-producing Aspergillus nomius VSC 23 by lactic acid bacteria and Saccharomyces cerevisiae Brazilian Journal of Microbiology, 41(4), 10191026 [18] Onilude, A A., Fagade, O E., Bello, M M., & Fadahunsi, I F (2005) Inhibition of aflatoxin-producing Aspergilli by lactic acid bacteria isolates from indigenously fermented cereal gruels African Journal of Biotechnology, 4(12) [19] Saito, T (2004) Selection of useful probiotic lactic acid bacteria from the Lactobacillus acidophilus group and their applications to functional foods Animal Science Journal, 75(1), 1-13 42 [20] Soccol, C R., Vandenberghe, L P D S., Spier, M R., Medeiros, A B P., Yamaguishi, C T., Lindner, J D D., & Thomaz-Soccol, V (2010) The potential of probiotics: a review Food Technology and Biotechnology, 48(4), 413-434 [21] Tnou, C H A R L E S., & Mycologist, B (1916) Effect of pasteurization on mold spores Journal of Agricultural Research, 6(1-13), 153 [22] Yu, J., Chang, P K., Ehrlich, K C., Cary, J W., Bhatnagar, D., Cleveland, T E., & Bennett, J W (2004) Clustered pathway genes in aflatoxin biosynthesis Applied and environmental microbiology, 70(3), 1253-1262 [23] Zinedine, A., Faid, M., & Benlemlih, M O H A M E D (2005) In vitro reduction of aflatoxin B1 by strains of lactic acid bacteria isolated from Moroccan sourdough bread International Journal of Agriculture and Biology, 7(1), 67-70 [24] Zuo, R., Chang, J., Yin, Q., Wang, P., Cheng, W., Wang, X., & Zheng, Q (2012) Inhibiting Aspergillus flavus growth and degrading aflatoxin B1 by combined beneficial microbes African Journal of Biotechnology, 11(65), 12903-12909 43 PHỤ LỤC Phụ lục Kết phân tích ANOVA Phụ lục 1.1 Sàng lọc chủng Lactobacillus có khả ức chế nấm A flavus ANOVA Table for VK by Col_1 Source Sum of Squares Between groups 557.445 Within groups 7.3 Total (Corr.) 564.745 Df 14 20 Mean Square 92.9074 0.521429 F-Ratio 178.18 P-Value 0.0000 Multiple Range Tests for VK by Col_1 Method: 95.0 percent Tukey HSD Col_1 Count Mean Homogeneous Groups X LTD01 5.81667 X LTD03 8.53333 X LTD05 10.5167 X LTD06 15.1 X LTD11 15.4167 X LTD19 16.8167 X LTD20 22.2167 Contrast LTD01 - LTD03 LTD01 - LTD05 LTD01 - LTD06 LTD01 - LTD11 LTD01 - LTD19 LTD01 - LTD20 LTD03 - LTD05 LTD03 - LTD06 LTD03 - LTD11 LTD03 - LTD19 LTD03 - LTD20 LTD05 - LTD06 LTD05 - LTD11 LTD05 - LTD19 LTD05 - LTD20 LTD06 - LTD11 LTD06 - LTD19 LTD06 - LTD20 LTD11 - LTD19 LTD11 - LTD20 LTD19 - LTD20 Sig * * * * * * * * * * * * * * * * * Difference -2.71667 -4.7 -9.28333 -9.6 -11.0 -16.4 -1.98333 -6.56667 -6.88333 -8.28333 -13.6833 -4.58333 -4.9 -6.3 -11.7 -0.316667 -1.71667 -7.11667 -1.4 -6.8 -5.4 +/- Limits 2.01434 2.01434 2.01434 2.01434 2.01434 2.01434 2.01434 2.01434 2.01434 2.01434 2.01434 2.01434 2.01434 2.01434 2.01434 2.01434 2.01434 2.01434 2.01434 2.01434 2.01434 * denotes a statistically significant difference Summary Statistics for Aflatoxin NT Count Average Standard deviation DC 420.333 12.5033 LTD01 417.0 5.56776 LTD03 413.333 4.72582 LTD05 407.667 4.16333 LTD06 396.333 8.5049 Coeff of variation 2.97462% 1.3352% 1.14334% 1.02126% 2.1459% 44 Range 25.0 11.0 9.0 8.0 16.0 LTD11 LTD19 LTD20 Total 3 24 391.0 386.0 367.333 399.875 3.60555 5.56776 10.0167 18.3879 ANOVA Table for Aflatoxin by NT Source Sum of Squares Between groups 6889.29 Within groups 887.333 Total (Corr.) 7776.62 0.922136% 1.44243% 2.72686% 4.59841% Df 16 23 Mean Square 984.185 55.4583 7.0 11.0 20.0 76.0 F-Ratio 17.75 Table of Means for Aflatoxin by NT with 95.0 percent Tukey HSD intervals Stnd error NT Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit DC 420.333 4.29955 409.793 430.873 LTD01 417.0 4.29955 406.46 427.54 LTD03 413.333 4.29955 402.793 423.873 LTD05 407.667 4.29955 397.127 418.207 LTD06 396.333 4.29955 385.793 406.873 LTD11 391.0 4.29955 380.46 401.54 LTD19 386.0 4.29955 375.46 396.54 LTD20 367.333 4.29955 356.793 377.873 Total 24 399.875 Multiple Range Tests for Aflatoxin by NT Method: 95.0 percent Tukey HSD NT Count Mean Homogeneous Groups X LTD20 367.333 XX LTD19 386.0 XX LTD11 391.0 XXX LTD06 396.333 XXX LTD05 407.667 XX LTD03 413.333 XX LTD01 417.0 X DC 420.333 Contrast DC - LTD01 DC - LTD03 DC - LTD05 DC - LTD06 DC - LTD11 DC - LTD19 DC - LTD20 LTD01 - LTD03 LTD01 - LTD05 LTD01 - LTD06 LTD01 - LTD11 LTD01 - LTD19 LTD01 - LTD20 LTD03 - LTD05 LTD03 - LTD06 LTD03 - LTD11 LTD03 - LTD19 LTD03 - LTD20 Sig * * * * * * * * * * Difference 3.33333 7.0 12.6667 24.0 29.3333 34.3333 53.0 3.66667 9.33333 20.6667 26.0 31.0 49.6667 5.66667 17.0 22.3333 27.3333 46.0 +/- Limits 21.0803 21.0803 21.0803 21.0803 21.0803 21.0803 21.0803 21.0803 21.0803 21.0803 21.0803 21.0803 21.0803 21.0803 21.0803 21.0803 21.0803 21.0803 45 P-Value 0.0000 LTD05 - LTD06 11.3333 21.0803 LTD05 - LTD11 16.6667 21.0803 LTD05 - LTD19 * 21.6667 21.0803 LTD05 - LTD20 * 40.3333 21.0803 LTD06 - LTD11 5.33333 21.0803 LTD06 - LTD19 10.3333 21.0803 LTD06 - LTD20 * 29.0 21.0803 LTD11 - LTD19 5.0 21.0803 LTD11 - LTD20 * 23.6667 21.0803 LTD19 - LTD20 18.6667 21.0803 * denotes a statistically significant difference Phụ lục 1.2 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến khả ức chế nấm A flavus chủng Lactobacillus ANOVA Table for VK by NT Source Sum of Squares Between groups 93.7218 Within groups 13.0547 Total (Corr.) 106.776 Df 11 Mean Square 31.2406 1.63184 F-Ratio 19.14 P-Value 0.0005 Table of Means for VK by NT with 95.0 percent Tukey HSD intervals Stnd error NT Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit T25 19.35 0.737528 17.6805 21.0195 T30 20.49 0.737528 18.8205 22.1595 T35 24.5533 0.737528 22.8839 26.2228 T40 26.1233 0.737528 24.4539 27.7928 Total 12 22.6292 Multiple Range Tests for VK by NT Method: 95.0 percent Tukey HSD NT Count Mean Homogeneous Groups X T25 19.35 X T30 20.49 X T35 24.5533 X T40 26.1233 Contrast Sig Difference +/- Limits T25 - T30 -1.14 3.33893 T25 - T35 * -5.20333 3.33893 T25 - T40 * -6.77333 3.33893 T30 - T35 * -4.06333 3.33893 T30 - T40 * -5.63333 3.33893 T35 - T40 -1.57 3.33893 * denotes a statistically significant difference Summary Statistics for Temp NT Count Average Standard deviation DC 414.0 8.544 ND1 380.667 4.04145 ND2 373.333 4.04145 ND3 359.0 4.0 ND4 358.333 3.78594 Total 15 377.067 21.509 Coeff of variation 2.06377% 1.06168% 1.08253% 1.11421% 1.05654% 5.7043% 46 Range 17.0 8.0 8.0 8.0 7.0 68.0 ANOVA Table for Temp by NT Source Sum of Squares Between groups 6204.93 Within groups 272.0 Total (Corr.) 6476.93 Df 10 14 Mean Square 1551.23 27.2 F-Ratio 57.03 P-Value 0.0000 Table of Means for Temp by NT with 95.0 percent Tukey HSD intervals Stnd error NT Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit DC 414.0 3.01109 406.992 421.008 ND1 380.667 3.01109 373.659 387.675 ND2 373.333 3.01109 366.325 380.341 ND3 359.0 3.01109 351.992 366.008 ND4 358.333 3.01109 351.325 365.341 Total 15 377.067 Multiple Range Tests for Temp by NT Method: 95.0 percent Tukey HSD NT Count Mean Homogeneous Groups X ND4 358.333 X ND3 359.0 X ND2 373.333 X ND1 380.667 X DC 414.0 Contrast Sig Difference +/- Limits DC - ND1 * 33.3333 14.0157 DC - ND2 * 40.6667 14.0157 DC - ND3 * 55.0 14.0157 DC - ND4 * 55.6667 14.0157 ND1 - ND2 7.33333 14.0157 ND1 - ND3 * 21.6667 14.0157 ND1 - ND4 * 22.3333 14.0157 ND2 - ND3 * 14.3333 14.0157 ND2 - ND4 * 15.0 14.0157 ND3 - ND4 0.666667 14.0157 * denotes a statistically significant difference Phụ lục 1.3 Khảo sát ảnh hưởng thời gian đến khả ức chế nấm A flavus chủng Lactobacillus ANOVA Table for VK by NT Source Sum of Squares Between groups 87.2023 Within groups 2.48833 Total (Corr.) 89.6906 Df 11 Mean Square 29.0674 0.311042 F-Ratio 93.45 Table of Means for VK by NT with 95.0 percent Tukey HSD intervals Stnd error NT Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit TG3 20.65 0.321995 19.9211 21.3789 TG5 19.25 0.321995 18.5211 19.9789 TG7 18.0833 0.321995 17.3545 18.8122 TG9 13.4667 0.321995 12.7378 14.1955 47 P-Value 0.0000 Total 12 17.8625 Multiple Range Tests for VK by NT Method: 95.0 percent Tukey HSD NT Count Mean Homogeneous Groups X TG9 13.4667 X TG7 18.0833 XX TG5 19.25 X TG3 20.65 Contrast TG3 - TG5 TG3 - TG7 TG3 - TG9 TG5 - TG7 TG5 - TG9 TG7 - TG9 Sig * * * * Difference 1.4 2.56667 7.18333 1.16667 5.78333 4.61667 +/- Limits 1.45773 1.45773 1.45773 1.45773 1.45773 1.45773 * denotes a statistically significant difference Summary Statistics for Time NT Count Average Standard deviation DC 407.667 4.72582 TG1 282.333 6.80686 TG2 371.667 5.50757 TG3 381.667 5.68624 TG4 393.0 4.0 Total 15 367.267 45.9028 ANOVA Table for Time by NT Source Sum of Squares Between groups 29204.3 Within groups 294.667 Total (Corr.) 29498.9 Df 10 14 Coeff of variation 1.15924% 2.41093% 1.48186% 1.48984% 1.01781% 12.4985% Mean Square 7301.07 29.4667 F-Ratio 247.77 Table of Means for Time by NT with 95.0 percent Tukey HSD intervals Stnd error NT Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit DC 407.667 3.13404 400.373 414.961 TG1 282.333 3.13404 275.039 289.627 TG2 371.667 3.13404 364.373 378.961 TG3 381.667 3.13404 374.373 388.961 TG4 393.0 3.13404 385.706 400.294 Total 15 367.267 Multiple Range Tests for Time by NT Method: 95.0 percent Tukey HSD NT Count Mean Homogeneous Groups X TG1 282.333 X TG2 371.667 XX TG3 381.667 X TG4 393.0 X DC 407.667 48 Range 9.0 13.0 11.0 11.0 8.0 136.0 P-Value 0.0000 Contrast Sig Difference +/- Limits DC - TG1 * 125.333 14.588 DC - TG2 * 36.0 14.588 DC - TG3 * 26.0 14.588 DC - TG4 * 14.6667 14.588 TG1 - TG2 * -89.3333 14.588 TG1 - TG3 * -99.3333 14.588 TG1 - TG4 * -110.667 14.588 TG2 - TG3 -10.0 14.588 TG2 - TG4 * -21.3333 14.588 TG3 - TG4 -11.3333 14.588 * denotes a statistically significant difference Phụ lục 1.4 Khảo sát ảnh hưởng mật độ vi khuẩn đến khả ức chế nấm A flavus chủng Lactobacillus ANOVA Table for VK by NT Source Sum of Squares Between groups 75.7775 Within groups 8.36167 Total (Corr.) 84.1392 Df 11 Mean Square 25.2592 1.04521 F-Ratio 24.17 P-Value 0.0002 Table of Means for VK by NT with 95.0 percent Tukey HSD intervals Stnd error NT Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit TL1 10.55 0.590257 9.2139 11.8861 TL2 11.6667 0.590257 10.3306 13.0028 TL3 14.3 0.590257 12.9639 15.6361 TL4 17.05 0.590257 15.7139 18.3861 Total 12 13.3917 Multiple Range Tests for VK by NT Method: 95.0 percent Tukey HSD NT Count Mean Homogeneous Groups X TL1 10.55 XX TL2 11.6667 X TL3 14.3 X TL4 17.05 Contrast Sig Difference +/- Limits TL1 - TL2 -1.11667 2.67221 TL1 - TL3 * -3.75 2.67221 TL1 - TL4 * -6.5 2.67221 TL2 - TL3 -2.63333 2.67221 TL2 - TL4 * -5.38333 2.67221 TL3 - TL4 * -2.75 2.67221 * denotes a statistically significant difference Summary Statistics for Mat so NT Count Average Standard deviation DC 377.333 7.02377 TL1 323.667 6.65833 TL2 315.667 4.50925 TL3 302.0 4.0 TL4 283.0 3.60555 Coeff of variation 1.86142% 2.05716% 1.42848% 1.3245% 1.27405% 49 Range 14.0 13.0 9.0 8.0 7.0 Total 15 320.333 33.0814 ANOVA Table for Mat so by NT Source Sum of Squares Between groups 15035.3 Within groups 286.0 Total (Corr.) 15321.3 10.3272% Df 10 14 Mean Square 3758.83 28.6 104.0 F-Ratio 131.43 P-Value 0.0000 Table of Means for Mat so by NT with 95.0 percent Tukey HSD intervals Stnd error NT Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit DC 377.333 3.08761 370.147 384.519 TL1 323.667 3.08761 316.481 330.853 TL2 315.667 3.08761 308.481 322.853 TL3 302.0 3.08761 294.814 309.186 TL4 283.0 3.08761 275.814 290.186 Total 15 320.333 Multiple Range Tests for Mat so by NT Method: 95.0 percent Tukey HSD NT Count Mean Homogeneous Groups X TL4 283.0 X TL3 302.0 XX TL2 315.667 X TL1 323.667 X DC 377.333 Contrast Sig Difference +/- Limits DC - TL1 * 53.6667 14.3719 DC - TL2 * 61.6667 14.3719 DC - TL3 * 75.3333 14.3719 DC - TL4 * 94.3333 14.3719 TL1 - TL2 8.0 14.3719 TL1 - TL3 * 21.6667 14.3719 TL1 - TL4 * 40.6667 14.3719 TL2 - TL3 13.6667 14.3719 TL2 - TL4 * 32.6667 14.3719 TL3 - TL4 * 19.0 14.3719 * denotes a statistically significant difference Phụ lục 1.5 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ thời gian sấy đến độ ẩm CML Summary Statistics for độ ẩm nt Count Average Variance 40_16 12.2867 0.0202333 40_24 8.17 0.0441 40_8 21.8867 0.0201333 45_16 10.5367 0.0366333 45_24 7.53 0.1521 45_8 18.3633 0.105733 50_16 9.42667 0.00543333 50_24 7.15 0.0687 50_8 17.2467 0.0597333 Total 27 12.5107 26.6282 Standard deviation 0.142244 0.21 0.141892 0.191398 0.39 0.325167 0.0737111 0.262107 0.244404 5.16025 50 Coeff of variation 1.15771% 2.57038% 0.648303% 1.8165% 5.17928% 1.77074% 0.781943% 3.66583% 1.41711% 41.2466% Range 0.26 0.42 0.28 0.38 0.78 0.64 0.14 0.51 0.48 15.11 ANOVA Table for độ ẩm by nt Source Sum of Squares Between groups 691.308 Within groups 1.0256 Total (Corr.) 692.333 Df 18 26 Mean Square 86.4134 0.0569778 F-Ratio 1516.62 Table of Means for đọ ẩm by nt with 95.0 percent Tukey HSD intervals Stnd error nt Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit 40_16 12.2867 0.137814 11.9444 12.6289 40_24 8.17 0.137814 7.82772 8.51228 40_8 21.8867 0.137814 21.5444 22.2289 45_16 10.5367 0.137814 10.1944 10.8789 45_24 7.53 0.137814 7.18772 7.87228 45_8 18.3633 0.137814 18.0211 18.7056 50_16 9.42667 0.137814 9.08438 9.76895 50_24 7.15 0.137814 6.80772 7.49228 50_8 17.2467 0.137814 16.9044 17.5889 Total 27 12.5107 Multiple Range Tests for độ ẩm by nt Method: 95.0 percent Tukey HSD nt Count Mean Homogeneous Groups X 50_24 7.15 XX 45_24 7.53 X 40_24 8.17 X 50_16 9.42667 X 45_16 10.5367 X 40_16 12.2867 X 50_8 17.2467 X 45_8 18.3633 X 40_8 21.8867 Contrast 40_16 - 40_24 40_16 - 40_8 40_16 - 45_16 40_16 - 45_24 40_16 - 45_8 40_16 - 50_16 40_16 - 50_24 40_16 - 50_8 40_24 - 40_8 40_24 - 45_16 40_24 - 45_24 40_24 - 45_8 40_24 - 50_16 40_24 - 50_24 40_24 - 50_8 40_8 - 45_16 40_8 - 45_24 40_8 - 45_8 Sig * * * * * * * * * * * * * * * * * Difference 4.11667 -9.6 1.75 4.75667 -6.07667 2.86 5.13667 -4.96 -13.7167 -2.36667 0.64 -10.1933 -1.25667 1.02 -9.07667 11.35 14.3567 3.52333 +/- Limits 0.684565 0.684565 0.684565 0.684565 0.684565 0.684565 0.684565 0.684565 0.684565 0.684565 0.684565 0.684565 0.684565 0.684565 0.684565 0.684565 0.684565 0.684565 51 P-Value 0.0000 40_8 - 50_16 * 12.46 0.684565 40_8 - 50_24 * 14.7367 0.684565 40_8 - 50_8 * 4.64 0.684565 45_16 - 45_24 * 3.00667 0.684565 45_16 - 45_8 * -7.82667 0.684565 45_16 - 50_16 * 1.11 0.684565 45_16 - 50_24 * 3.38667 0.684565 45_16 - 50_8 * -6.71 0.684565 45_24 - 45_8 * -10.8333 0.684565 45_24 - 50_16 * -1.89667 0.684565 45_24 - 50_24 0.38 0.684565 45_24 - 50_8 * -9.71667 0.684565 45_8 - 50_16 * 8.93667 0.684565 45_8 - 50_24 * 11.2133 0.684565 45_8 - 50_8 * 1.11667 0.684565 50_16 - 50_24 * 2.27667 0.684565 50_16 - 50_8 * -7.82 0.684565 50_24 - 50_8 * -10.0967 0.684565 * denotes a statistically significant difference Phụ lục 1.6 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ thời gian sấy đến mật số CML Summary Statistics for Mat so NT Count Average Variance 40_16 9.53 0.0012 40_24 9.38 0.0028 40_8 9.58333 0.000933333 45_16 8.95 0.0049 45_24 8.75 0.0175 45_8 9.53 0.0003 50_16 8.74333 0.0196333 50_24 8.39 0.0012 50_8 8.94 0.0028 DC 10.52 0.0048 Total 30 9.23167 0.348014 ANOVA Table for Mat so by NT Source Sum of Squares Between groups 9.98028 Within groups 0.112133 Total (Corr.) 10.0924 Df 20 29 Standard deviation 0.034641 0.052915 0.0305505 0.07 0.132288 0.0173205 0.140119 0.034641 0.052915 0.069282 0.589927 Mean Square 1.10892 0.00560667 Coeff of variation 0.363494% 0.564126% 0.318788% 0.782123% 1.51186% 0.181747% 1.60258% 0.412885% 0.591891% 0.658574% 6.39026% F-Ratio 197.79 Table of Means for Mat so by NT with 95.0 percent Tukey HSD intervals Stnd error NT Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit 40_16 9.53 0.0432306 9.42172 9.63828 40_24 9.38 0.0432306 9.27172 9.48828 40_8 9.58333 0.0432306 9.47506 9.69161 45_16 8.95 0.0432306 8.84172 9.05828 45_24 8.75 0.0432306 8.64172 8.85828 45_8 9.53 0.0432306 9.42172 9.63828 50_16 8.74333 0.0432306 8.63506 8.85161 50_24 8.39 0.0432306 8.28172 8.49828 50_8 8.94 0.0432306 8.83172 9.04828 DC 10.52 0.0432306 10.4117 10.6283 52 P-Value 0.0000 Range 0.06 0.1 0.06 0.13 0.25 0.03 0.28 0.06 0.1 0.12 2.23 Total 30 9.23167 Multiple Range Tests for Mat so by NT Method: 95.0 percent Tukey HSD NT Count Mean Homogeneous Groups X 50_24 8.39 X 50_16 8.74333 X 45_24 8.75 X 50_8 8.94 X 45_16 8.95 X 40_24 9.38 X 45_8 9.53 X 40_16 9.53 X 40_8 9.58333 X DC 10.52 Contrast 40_16 - 40_24 40_16 - 40_8 40_16 - 45_16 40_16 - 45_24 40_16 - 45_8 40_16 - 50_16 40_16 - 50_24 40_16 - 50_8 40_16 - DC 40_24 - 40_8 40_24 - 45_16 40_24 - 45_24 40_24 - 45_8 40_24 - 50_16 40_24 - 50_24 40_24 - 50_8 40_24 - DC 40_8 - 45_16 40_8 - 45_24 40_8 - 45_8 40_8 - 50_16 40_8 - 50_24 40_8 - 50_8 40_8 - DC 45_16 - 45_24 45_16 - 45_8 45_16 - 50_16 45_16 - 50_24 45_16 - 50_8 45_16 - DC 45_24 - 45_8 45_24 - 50_16 45_24 - 50_24 45_24 - 50_8 45_24 - DC 45_8 - 50_16 45_8 - 50_24 45_8 - 50_8 45_8 - DC Sig * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * Difference 0.15 -0.0533333 0.58 0.78 0.0 0.786667 1.14 0.59 -0.99 -0.203333 0.43 0.63 -0.15 0.636667 0.99 0.44 -1.14 0.633333 0.833333 0.0533333 0.84 1.19333 0.643333 -0.936667 0.2 -0.58 0.206667 0.56 0.01 -1.57 -0.78 0.00666667 0.36 -0.19 -1.77 0.786667 1.14 0.59 -0.99 +/- Limits 0.216553 0.216553 0.216553 0.216553 0.216553 0.216553 0.216553 0.216553 0.216553 0.216553 0.216553 0.216553 0.216553 0.216553 0.216553 0.216553 0.216553 0.216553 0.216553 0.216553 0.216553 0.216553 0.216553 0.216553 0.216553 0.216553 0.216553 0.216553 0.216553 0.216553 0.216553 0.216553 0.216553 0.216553 0.216553 0.216553 0.216553 0.216553 0.216553 53 50_16 - 50_24 * 0.353333 0.216553 50_16 - 50_8 -0.196667 0.216553 50_16 - DC * -1.77667 0.216553 50_24 - 50_8 * -0.55 0.216553 50_24 - DC * -2.13 0.216553 50_8 - DC * -1.58 0.216553 * denotes a statistically significant difference Phụ lục 1.7 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ thời gian sấy đến hoạt tính CML NT 40_16 40_24 40_8 45_16 45_24 45_8 50_16 50_24 50_8 Total Count 3 3 3 3 27 Average 19.0833 18.25 18.6333 17.8333 18.6 18.6167 18.5333 18.1833 17.6167 18.3722 Standard deviation 0.925113 1.26194 1.2413 1.25731 0.589491 0.85049 0.951753 1.02997 0.728583 0.943534 ANOVA Table for Vòng kháng by NT Source Sum of Squares Df Between groups 4.87 Within groups 18.2767 18 Total (Corr.) 23.1467 26 Coeff of variation 4.84775% 6.91476% 6.66173% 7.05035% 3.16931% 4.56843% 5.13536% 5.66435% 4.13576% 5.13566% Mean Square 0.60875 1.01537 F-Ratio 0.60 Range 1.85 2.5 2.4 2.35 1.15 1.7 1.9 2.05 1.4 3.6 P-Value 0.7663 Table of Means for Vòng kháng by NT with 95.0 percent Tukey HSD intervals Stnd error NT Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit 40_16 19.0833 0.58177 17.6384 20.5283 40_24 18.25 0.58177 16.8051 19.6949 40_8 18.6333 0.58177 17.1884 20.0783 45_16 17.8333 0.58177 16.3884 19.2783 45_24 18.6 0.58177 17.1551 20.0449 45_8 18.6167 0.58177 17.1717 20.0616 50_16 18.5333 0.58177 17.0884 19.9783 50_24 18.1833 0.58177 16.7384 19.6283 50_8 17.6167 0.58177 16.1717 19.0616 Total 27 18.3722 Multiple Range Tests for Vòng kháng by NT Method: 95.0 percent Tukey HSD NT Count Mean Homogeneous Groups X 50_8 17.6167 X 45_16 17.8333 X 50_24 18.1833 X 40_24 18.25 X 50_16 18.5333 X 45_24 18.6 X 45_8 18.6167 X 40_8 18.6333 X 40_16 19.0833 54 Contrast Sig Difference +/- Limits 40_16 - 40_24 0.833333 2.88984 40_16 - 40_8 0.45 2.88984 40_16 - 45_16 1.25 2.88984 40_16 - 45_24 0.483333 2.88984 40_16 - 45_8 0.466667 2.88984 40_16 - 50_16 0.55 2.88984 40_16 - 50_24 0.9 2.88984 40_16 - 50_8 1.46667 2.88984 40_24 - 40_8 -0.383333 2.88984 40_24 - 45_16 0.416667 2.88984 40_24 - 45_24 -0.35 2.88984 40_24 - 45_8 -0.366667 2.88984 40_24 - 50_16 -0.283333 2.88984 40_24 - 50_24 0.0666667 2.88984 40_24 - 50_8 0.633333 2.88984 40_8 - 45_16 0.8 2.88984 40_8 - 45_24 0.0333333 2.88984 40_8 - 45_8 0.0166667 2.88984 40_8 - 50_16 0.1 2.88984 40_8 - 50_24 0.45 2.88984 40_8 - 50_8 1.01667 2.88984 45_16 - 45_24 -0.766667 2.88984 45_16 - 45_8 -0.783333 2.88984 45_16 - 50_16 -0.7 2.88984 45_16 - 50_24 -0.35 2.88984 45_16 - 50_8 0.216667 2.88984 45_24 - 45_8 -0.0166667 2.88984 45_24 - 50_16 0.0666667 2.88984 45_24 - 50_24 0.416667 2.88984 45_24 - 50_8 0.983333 2.88984 45_8 - 50_16 0.0833333 2.88984 45_8 - 50_24 0.433333 2.88984 45_8 - 50_8 1.0 2.88984 50_16 - 50_24 0.35 2.88984 50_16 - 50_8 0.916667 2.88984 50_24 - 50_8 0.566667 2.88984 * denotes a statistically significant difference Phục lục 1.8: Hàm lượng aflatoxin có nghiệm thức với thức ăn cho gà Summary Statistics for Afla NT Count Average DC+ 136.967 DC3 20.0667 NT1 106.833 NT2 64.4667 NT3 4.0 Total 15 66.4667 Standard deviation 11.6105 2.05994 8.32006 9.41134 1.253 52.4902 ANOVA Table for Afla by NT Source Sum of Squares Between groups 37976.3 Within groups 596.827 Total (Corr.) 38573.1 Df 10 14 Coeff of variation 8.47687% 10.2655% 7.78788% 14.5988% 31.3249% 78.9722% Mean Square 9494.07 59.6827 F-Ratio 159.08 Table of Means for Afla by NT with 95.0 percent Tukey HSD intervals Stnd error NT Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit 55 Range 23.1 3.9 16.6 18.8 2.5 146.4 P-Value 0.0000 DC+ DCNT1 NT2 NT3 Total 3 3 15 136.967 20.0667 106.833 64.4667 4.0 66.4667 4.46029 4.46029 4.46029 4.46029 4.46029 126.586 9.686 96.4527 54.086 -6.38066 147.347 30.4473 117.214 74.8473 14.3807 Multiple Range Tests for Afla by NT Method: 95.0 percent Tukey HSD NT Count Mean Homogeneous Groups X NT3 4.0 X DC3 20.0667 X NT2 64.4667 X NT1 106.833 X DC+ 136.967 Contrast Sig Difference +/- Limits DC+ - DC* 116.9 20.7613 DC+ - NT1 * 30.1333 20.7613 DC+ - NT2 * 72.5 20.7613 DC+ - NT3 * 132.967 20.7613 DC- - NT1 * -86.7667 20.7613 DC- - NT2 * -44.4 20.7613 DC- - NT3 16.0667 20.7613 NT1 - NT2 * 42.3667 20.7613 NT1 - NT3 * 102.833 20.7613 NT2 - NT3 * 60.4667 20.7613 * denotes a statistically significant difference 56