Nghiên cứu chế tạo phức zn2 oligochitosan và khảo sát khả năng kiểm soát bệnh thán thư do nấm collectotrichum truncatum trên cây đậu nành

BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP HCM TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO BÁO CÁO NGHIỆM THU NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO PHỨC ZN2+-OLIGOCHITOSAN VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KIỂM SOÁT BỆNH THÁN THƯ DO NẤM Collectotrichum truncatum TRÊN CÂY ĐẬU NÀNH KS Lê Thành Hưng ThS Đặng Văn Phú Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 01/2018 BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP HCM TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý Hội đồng nghiệm thu) NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO PHỨC ZN2+-OLIGOCHITOSAN VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KIỂM SOÁT BỆNH THÁN THƯ DO NẤM Collectotrichum truncatum TRÊN CÂY ĐẬU NÀNH CƠ QUAN CHỦ TRÌ (Ký tên, đóng dấu xác nhận) CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI (Ký tên) Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 01/2018 TÓM T T tài Nghiên c u ch t o ph c Zn2+-oligchitosan kh o sát kh m Collectotrichum truncatum ki m soát b u nành c ti n hành t i Trung tâm Nghiên c u Phát tri n Nông nghi p Công ngh cao t c th c hi n v i m c tiêu ch t o oligochitosan t chitosan b u x k t h p x peroxit s d ng oligochitosan có kh ng th ch t o ph c Zn2+- ng phân t th u qu lý hydrogen c ch n m Collectotrichum truncatum u ki n in vitro kh o sát hi u ng kích kháng b u nành nh m phát tri n ng d ng hi u qu ch ph m vi c phòng tr b nh h i n m Collectotrichum truncatum gây K t qu nghiên c u tr c qua q trình c trình bày tóm t t c oligochitosan có kh ng phân t Mw ~ kDa b pháp chi u x dung d ch 5% chitosan 2,5% acid lactic có b sung 0,5% H2O2 t i li u x 20 kGy, su t li u 1,27 kGy/gi Oligochitosan thu nh c có c ba m u dung d ch ph c Zn2+-oligochitosan v i t l ph n mol t khác l cm ts u trúc ph GPC, ph UV-Vis, ph FT-IR ph XLD cho th y oligochitosan thu c có c u trúc g u Ph c Zn2+- i so v liên k t gi a Zn2+ oligochitosan có xu t hi n m t vài c oligochitosan ng k m dung d ch ZnCOS-1 cho th y giá tr g i so v i lý thuy t ZnCOS-1 d ng b ng k c m u ng 89,2% so v i giá tr lý thuy t Ho t tính c ch n m c a ph i ch s oligochitosan có Mw ~ 5kDa C th ng PDA, ho t l c c ch n m C truncatum c a oligochitosan có Mw ~ kDa cao nh t n 1000 mg/l 11,7% Ho t l c c ch n m C truncatum c a ph c ZnCOS-0,25 cao nh t 1000 mg/l d ng t n ng t 75,14% Ho t l c c ch n m C truncatum c a ph c ZnCOS-0,5 i cao nh t n 1000 mg/l ph c ZnCOS-1 cao nh t Ph c ZnCOS có kh n t 91,71% Ho t l c c ch n m C truncatum c a 750 mg/l t 100% m soát t t b truncatum gây làm gi m t l b nh ch 15,6 6,7 20,2% ii u nành n m C 42,2%, ch s b nh gi m M CL C TÓM T i M CL iii M CL CB v M CL vi vii M NG QUAN TÀI LI U 1.1 T NG QUAN V CHITIN, CHITOSAN, OLIGOCHITOSAN 1.1.1 Ngu n g c t o oligochitosan 1.2 N M Colletotrichum truncatum 1.2.1 Nghiên c u v n m Colletotrichum truncatum m Colletotrichum truncatum h 1.2.2 B 1.3 T NG QUAN V u nành U NÀNH 1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN C U V OLIGOCHITOSAN VÀ PH C OLIGOCHITOSAN-Zn++ T LI U 12 2.1 N I DUNG NGHIÊN C U 12 2.1.1.Th 12 2.1.1.1 Th 12 12 2.1.2 N i dung nghiên c 12 2.2 NGUYÊN LI U, HÓA CH T VÀ D NG C THI T B NGHIÊN C U 12 2.2.1 Nguyên li u, hóa ch ng, d ng c thi t b 12 13 13 2.3.1 N i dung 1: Nghiên c u ch t o ch t o ph c Zn2+-oligchitosan 13 2.3.1.1 Thí nghi m 1: Nghiên c ch t nh n H2O2 thích h p 13 iii 2.3.1.2 Thí nghi m 2: Nghiên c u t l thích h ph c Zn2+- ch t o 15 2.3.2 N i dung 2: Nghiên c u kh c ch n m Collectotrichum truncatum kích kháng b u nành c a ph c ZnCOS 17 2.3.2.1 Thí nghi ng c a oligochitosan lên s phát tri n c ah s in ng th ch 17 2.3.2.2 Thí nghi m 2: Nghiên c u hi u ng kích kháng b u nành c a ph c ZnCOS 18 K T QU VÀ TH O LU N 21 3.1 NGHIÊN C U CH T O CH T O PH C Zn2+-OLIGCHITOSAN 3.1.1 Thí nghi m 1: Nghiên c ch t o oligochitosan 21 nh n H2O2 thích h p 21 3.1.1.1 Oxi hóa c t m ch chitosan 21 nh n H2O2 t o oligochitosan b chi u x 22 3.1.2 Thí nghi m 2: Nghiên c u t l thích h ph c Zn2+-oligchitosan ch t o 26 nhi u x tia X (XRD) c a ph c Zn2+-oligochitosan ch t c 29 ng k m ph c Zn2+-oligochitosan 32 3.2 N I DUNG 2: NGHIÊN C U KH C CH N M Collectotrichum truncatum VÀ KÍCH KHÁNG B U NÀNH C A PH C ZnCOS 33 3.2.1 Thí nghi ng c a oligochitosan lên s phát tri n c ah s in ng th ch 33 3.2.1 Thí nghi m 2: Nghiên c u hi u ng kích kháng b u nành c a ph c ZnCOS 37 K T LU N VÀ KI N NGH 40 4.1 K t lu 4.2 Ki n ngh TÀI LI U THAM KH O 40 41 42 iv PH L 46 M C L C B NG B a dung d ch 4% chitosan ch a H2O2 v in B c chi u x c t m ch theo li u x 21 ng k m m u ph c ch t B ng 3.3 nuôi c B ng 3.4 Kh c 30 ng kính t n n m C truncatum sau ngày ng PDA lo i ph c n khác 32 c ch s phát tri n (%) c a C truncatum c a lo i ph c khác 34 v M C L C HÌNH Hình 1.1 C u t o chitin, chitosan oligochitosan Hình 2.1 Mơ hình tr u nành nhà màng s d ng thí nghi 17 Hình 3.1 Chitosan s d ng nghiên c u 19 Hình 3.2 Ph GPC c u chitosan oxi hóa d th 20 Hình 3.3 Ph UV-Vis c a dung d ch chitosan 21 Hình 3.4 Ph GPC c a chitosan oligochitosan s d ng nghiên c u 22 Hình 3.5 Ph FTIR c a chitosan oligochitosan ch t c 23 Hình 3.6 Màu s c c a dung d ch 4% oligochitosan lo i ph c Zn2+ oligochitosan ch t c 25 Hình 3.7 Ph UV-Vis c a oligochitosan kDa dung d ch ph c Zn2+ oligochitosan v i t l ph n mol khác 25 Hình 3.8 Ph FTIR c a ph c Zn2+ oligochitosan ch t c 26 Hình 3.9 Ph nhi u x tia X c a ph c Zn2+ oligochitosan ch t c 27 Hình 3.10 C u trúc c a ph c Zn2+ oligochitosan Hình 3.11 Kh n (%) c a n lo i ph c n ng PDA khác 32 ng kính t n n m C truncatum n 1000 mg/l 33 Hình 3.13 Bi u hi n b u nành tr Hình 3.14 nơng h 35 ng c a lo i ph c Zn2+ oligochitosan n ch tiêu u nành sau 21 ngày phun nhi m b nh 36 vi TÀI tài/d án Nghiên c u ch t o ph c Zn2+-oligochitosan kh o sát kh m Collectotrichum truncatum m soát b u nành Ch nhi tài/d trì: Trung tâm Nghiên c u Phát tri n Nông nghi p Công ngh cao Th i gian th c hi n: 01/2017 - 12/2017 c ng M c tiêu: Nghiên c u ch ph c Zn2+-oligchitosan có hi u ng c ch b nh (b nh thán u qu u nành c ch n m Collectotrichum truncatum c a ph c Zn2+- Nghiên c u kh oligchitosan u ki n in vitro c m Collectotrichum truncatum m soát b u nành N i tài: N i dung 1: Nghiên c u ch t o oligochitosan có kh ng phân t (KLPT) u x tia gamma Co-60 ch t o ph c Zn2+- ~5000 Da b oligchitosan N i dung 2: Nghiên c u kh c ch n m Collectotrichum truncatum u nành c a ph c Zn2+-oligchitosan kích kháng b N i dung 3: Nghiên c u hi u ng kích kháng b c a ph c Zn2+-oligochitosan S n ph m c tài /d án: Báo cáo khoa h c Bài báo khoa h i t p chí khoa h c vii u nành M U u nành (Glycine max) m t nh c vô quan tr ng th gi i Các s n ph m t c ng d ng r ng rãi nhu c u s d p s n xu t th c ph m, th nuôi, nuôi tr ng th y s gs ng hi n t n m Colletotrichum truncatum ng B i gây b nh ph bi n cho h u h t vùng tr u tìm ki m gi i pháp ki m soát b nh u nành m t cách hi u qu , gi ng c m b o an tồn mơi c hi n c chi t xu t t ngu n polysacarit t nhiên (v tôm, cua, v côn trùng thành t bào c a m t s loài n tính sinh h c thích h c minh ch ng có nhi u ho t khai thác ng d ng làm ch ng b o v cho tr ng Ho t tính sinh h c c a chitin/chitosan ph thu c ch y u vào kh i ng phân t n hi tm oligochitosan b ng enzym b ng b c x ion hóa (tia gamma-Co60 t o n t gia t Hi u ng kích kháng b nh c t ob t m ch b ng b c x h i tr c minh ch ng ghi nh n a, m t s nghiên c u g sinh h c c c ch y ho t tính t h p v i ion kim lo i chuy n ti Cu++, Zn++, M c dù v kích kháng b nh c a chitosan-M++ v c ti p t c nghiên c n b i nhi u nhóm nghiên c u toàn th gi i c, hi u qu v tc ng hi u ng kích kháng b nh th c c ch t o b t m ch chitosan b i tia b c x gamma Co-60 s tài nghiên c u khoa h c t i m t nghiên c u M c dù v tài nghiên c u hi u ng kích kháng b nh c a h n h p oligochitosan ion k m tr th c hi ti p t c phát tri n v ng nghiên c u nh kích kháng b nh c a oligochitosan d ng v t li u lai h u u ng Zn2+- 4.2 KI N NGH Ti p t c nghiên c u hi u ng kích kháng b ng c a ph c ZnCOS u ki n in vivo th nghi m di n u nành lo h p 41 TÀI LI U THAM KH O TÀI LI U TI NG VI T c Hi ng H 2015 Kh o sát hi u ng kích kháng b nh t (Capsicum frutescents L.) c a ch ph m nano silica s d ng oligochitosan làm ch t nh tài nghiên c u khoa h c C , Trung tâm Nghiên c u Phát tri n Nông nghi p Công ngh cao, Tp.HCM i B Nông Mai Quang Vinh 2012 K thu t gieo tr ng gi nghi p Phát tri n Nông thôn Trung tâm Khuy n nông Qu c gia, 126 trang, Hà N i Nguy n Qu c Hi n Th Kim Lan, Nguy n Ng c Duy, Nguy n Th Ái Trinh, Bùi Duy Du 2011 Nghiên c u hi u ng v n c t m ch chitosan b ng b c x gamma Co-60 k t h p v i hydroperoxit T p chí Hóa h c 49:122-124 Nhà xu t b n Th ng T ng c c Th ng kê 2006 Niên giám th kê Lê Nguy n Th Kim Tuy n, Công Hà 2014 Nghiên c u ng d Lan Nguy n c ch n m Colletotrichum gloeosporioides phân l p t xồi cát hịa l c b b ih cC T p chí Khoa h c 4): 154-161 TÀI LI U TI NG ANH Aam B.B, Heggset E.B., Norberg A.L., Sorlie M., Varum K.M and Vincent G.H Eijsink 2010 Production of chitooligosaccharides and their potential applications in medicine Mar Drugs 2010, 8: 1482-1517 Athow K L 1987 Fungal diseases In: Wilcox J R, ed., Soybeans: Improvement, Production, and Uses ASA, CSSA, and SSSA, Madison, WI pp 687-727 Ben-Shalom N and Fallik E 2003 Further suppression of Botrytis cinerea disease in cucumber seedlings by chitosan-copper complex as compared with chitosan alone Phytoparasitica 31 (1):99-102 42 Cabrera J.C., Cutsem P.V 2005 Preparation of chitooligosaccharides with degree of polymerization higher than by acid of enzymatic degradation of chitosan Biochemical Engineering Journal 25: 165-172 Chmielewski A.G., H i-Saeid M., 2004 Radiation technologies: past, present and future Radiation Physics and Chemistry 71: 17-27 Denis P 1993 Disease of fruit crops Queensland, Australia Haji-Saeid M., Safrany A., Sampa M.H.O., Ramamoothy N 2010 Radiation processing of natural polymers: the IAEA contribution Radiation Physics and Chemistry 79:255-260 Hien N.Q., Phu D.V., Duy N.N., Lan N.T.K 2012 Degradation of chitosan in solution by gamma irradiation in the presence of hydro peroxide Carbohydr Polym 87: 935-938 Ibrahim E.A and Ramadan W.A 2015 Effect of zinc foliar spray alone and combined with humic acid or/and chitosan on growth, nutrient elements content and yield of dry bean (Phaseolus vulgaris L.) plants sown at different dates Sci Horticul 184: 101-105 10 Inmaculada A., Marian M., Ruth H., Inés P., Beatriz M., Niuris A., Gemma Ga., Ángeles H 2009 Functional Characterization of Chitin and Chitosan Current Chemical Biology 3: 203-230 11 Isaac S 1992 Fungal Plant Interraction London: Chapman and Hall Press, p.115 12 Khare M.N., Chacko S 1983 Factors affecting seed infections and transmission of Collectotrichum dematiumsp Truncatum in soybean Seed Sci Technol., pp 853 -855 13 Kumar K., Singh J.L 2000 Suevival transimission and management of seed borne Macrophomina phasoelina Annals of protection Sciences Univercity, Agryculture an technology, India., pp 44 46 14 Lehman PS., Machado C.C., Tarrago M.T 199) Frequency and Severity of Soybean Diseases in the States of Rio Grande di Sul and Santa Cataria Brazil, pp 183 193 43 15 Lin H., Wang H., Xue C., Ye M 2002 Preparation of chitosan oligomers by immobilized papain Enzyme and Microbial Technology 31: 588-592 16 Luan L.Q., Nagasawa N., Tamada M., Nakanishi T.M (2006) Enhancement of plant growth activity of irradiated chitosan by fractionation Radio Isotops 55(1):21-27 17 Makuuchi K 2010 Critical review of radiation processing of hydrogel and polysaccharide Radiation Physics anh Chemistry 79:267-271 18 Mekahliaa S and Bouzidb B 2009 Chitosan-copper (II) complex as antibacterial agent: synthesis, characterization and coordinating bond- activity correlation study Physics Procedia 2: 1045 1053 19 Nghiep D.N., Kim M.M., Kim S.K 2012 Protective effects of aminoethylchitooligosaccharides against oxidative stress in mouse macrophage RAW 264.7 cells Int J Bio Macromol 50: 624-631 20 Prashanth K.V.H Tharanathan R.N 2007 Chitin/chitosan: modification and their unlimited application potential an overview Trend in Food Sci Technol 18: 117-131 21 Quin C., Du Y.M, Xiao L 2002 Effect of hydrogen peroxide treament on the molecular weight and structure of chitosan Polyme Degradation and Stability 76:211-218 22 Rahaman M.H., Agarwal V.K., Thapliyal P.N., Singh R.A 1993 Effect of weed control on soybean seeding emergence an disease development Bangladesh Journal of Plant Phatology, pp 17 -20 23 Verma ML, Upadhyay AR, 1973 Studies on incidence of anthoracnose of soybean in a fertility inoculum varietal trial Proc Indial Acad Sci B, pp 234 239 24 Verma M.L., Upadhyay A.R 1973 Studies on incidence of anthoracnose of soybean in a fertility inoculum Science (B):234 varietal trial Proceedings Indian Academy 239 44 25 Yu G , Meuhlbauer G 2001 Benzothiadiazole-induced gene expression in wheat spikes does not provides resistance to Fusarium head blight Physiological and Molecular Plant Pathology 59: 129 139 26 Yuliana, N D., Khatib, A., Choi, Y H and Verpoorte, R 2012 Comprehensive Extraction Method Integrated with NMR Metabolomics: A new bioactivity screening method for plants, adenosine A1 receptor binding compounds in Orthosiphon stamineus Benth Analytical Chemistry 83: 6902 6906 45 PH L C Quy trình s n xu t ch ph m ph c ZnCOS-1 quy mô 200 lit kg oligochitosan có Mw ~ kDa 3,1 lit acid acetic (lo i 88%) 2,4 lit H2O2 (lo i 30%) 12,94 kg mu i Zn(NO3)2.6H2O (tinh t) Khu y 60 phút 175 lit H2O DD 5% oligochitosan 20 lit H2O Dung d ch mu i k m Ph i tr n Khu y 60 phút Khu y 60 phút 200 lit ch ph m ph c ZnCOS v i t l ph n mol 1:1 Thuy t minh quy trình: Ch dung d ch 5% oligochitosan/2,5% acid acetic/0,5% H2O2 (Dung d ch A) - i 200 lit có ch a 175 lit c - B sung thêm 3,1 lit axít lactic (lo i 88%) 2,4 lit H2O2 (lo i 30%) vào thùng ch a - Khu y h n h p b ng máy khu y hoàn toàn (~8 gi khu u ki n oligochitosan tan n yên dung d Ch dung d ch mu i k m (Dung d ch B) - i Zn(NO3)2.6H2O (lo i tinh t) vào thùng ch a lo i 20 lit - B sung thê c - Khu y h n h p b ng máy khu y hoàn toàn t o dung d ch su t u ki n mu i k m tan h t Ch ph c ZnCOS-1 - Tr n hai dung d ch A B l i v i b ng cách cho t t dung d ch B vào dung d ch A Khu y liên t c b sung - sung h t Khu y h n h p b ng máy khu y gi t o ph c ZnCOS-1 Yêu c u k thu t - Dung d ch su - Khơng c n, khơng có k t t a - pH kho ng 5,0 5,5 Th ng kính t n n m (B ng 3.3) a) M u Oligochitosan có Mw ~ kDa 250mg/l 250mg/l 250mg/l 250mg/l 250mg/l 250mg/l 250mg/l 250mg/l 500mg/l 500mg/l 500mg/l 500mg/l 500mg/l 500mg/l 500mg/l 500mg/l 750mg/l 750mg/l 750mg/l 750mg/l 750mg/l 750mg/l 750mg/l 750mg/l 1000mg/l 1000mg/l 1000mg/l 1000mg/l 1000mg/l 1000mg/l 78.5 75.2 74.3 74.3 78.5 75.2 74.3 74.3 75.6 74.1 76.7 78.5 77.2 76.1 72.6 72 79.3 79.1 73.2 70.4 70.2 71.3 78.3 75.9 77.8 78.9 70.4 70 69.5 70.9 70.7 65.6 68.7 62.4 65.4 70.4 65.7 67.4 u ki ng 1000mg/l 1000mg/l 69.1 65 b) M u Ph c ZnCOS-0.25 250mg/l 250mg/l 250mg/l 250mg/l 250mg/l 250mg/l 250mg/l 250mg/l 500mg/l 500mg/l 500mg/l 500mg/l 500mg/l 500mg/l 500mg/l 500mg/l 750mg/l 750mg/l 750mg/l 750mg/l 750mg/l 750mg/l 750mg/l 750mg/l 1000mg/l 1000mg/l 1000mg/l 1000mg/l 1000mg/l 1000mg/l 1000mg/l 1000mg/l 78.5 75.2 74.3 74.3 78.5 75.2 74.3 74.3 57.8 68.9 60.4 70 49.5 60.9 60.7 65.6 58.7 52.4 55.4 60.4 55.7 57.4 59.1 55 35.6 34.1 36.7 38.5 37.2 36.1 32.6 32 18.9 22 15.2 20.4 17.4 18.8 18.8 18.8 c) M u ph c ZnCOS-0.5 250mg/l 250mg/l 250mg/l 250mg/l 250mg/l 250mg/l 250mg/l 250mg/l 500mg/l 500mg/l 500mg/l 500mg/l 500mg/l 500mg/l 500mg/l 500mg/l 750mg/l 750mg/l 750mg/l 750mg/l 750mg/l 750mg/l 750mg/l 750mg/l 1000mg/l 1000mg/l 1000mg/l 1000mg/l 1000mg/l 1000mg/l 1000mg/l 1000mg/l 78.5 75.2 74.3 74.3 78.5 75.2 74.3 74.3 56.9 69.1 59.3 64 50.1 59.9 61 64.9 59.3 59.1 53.2 50.4 50.2 51.3 58.3 55.9 34.3 16.9 35.6 16.1 35 27.5 27.5 27.5 8.7 2.4 5.4 6.4 5.7 7.4 9.1 d) M u ph c ZnCOS-1 78.5 75.2 74.3 250mg/l 250mg/l 250mg/l 250mg/l 250mg/l 250mg/l 250mg/l 250mg/l 500mg/l 500mg/l 500mg/l 500mg/l 500mg/l 500mg/l 500mg/l 500mg/l 750mg/l 750mg/l 750mg/l 750mg/l 750mg/l 750mg/l 750mg/l 750mg/l 1000mg/l 1000mg/l 1000mg/l 1000mg/l 1000mg/l 1000mg/l 1000mg/l 1000mg/l 74.3 78.5 75.2 74.3 74.3 62 36.3 54.5 36.3 60.4 49.5 55 64.4 8.3 10.6 8 8.3 13.5 0 0 0 0 0 0 0 0