Bước đầu nghiên cứu chuyển gen kháng tuyến trùng sưng rễ trên cây đậu nành

ỦY BAN NHÂN DÂN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRƯỜNG ĐH NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU CHUYỂN GENE KHÁNG TUYẾN TRÙNG SƯNG RỄ TRÊN CÂY ĐẬU NÀNH Cơ quan chủ trì TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Chủ nhiệm nhiệm vụ TS Nguyễn Vũ Phong Thành phố Hồ Chí Minh tháng năm 2020 i ỦY BAN NHÂN DÂN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRƯỜNG ĐH NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU CHUYỂN GENE KHÁNG TUYẾN TRÙNG SƯNG RỄ TRÊN CÂY ĐẬU NÀNH Xác nhận Cơ quan chủ trì: Chủ nhiệm nhiệm vụ: Nguyễn Vũ Phong Thành phố Hồ Chí Minh tháng năm 2020 ii MỤC LỤC MỤC LỤC ii DANH SÁCH HÌNH vi DANH SÁCH BẢNG vii PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu 1.1.1 Tuyến trùng ký sinh thực vật 1.1.1.1 Tuyến trùng Meloidogyne incognita (Mi) 10 1.1.1.2 Phân loại tuyến trùng 11 1.1.2 Effector 13 1.1.2.1 Khái niệm effector 13 1.1.2.2 Chức effector 14 1.1.3 Câm lặng gene (gene silencing) 17 1.1.3.1 Xác định mục tiêu vật chủ 18 1.1.3.2 Ở Meloidogyne spp 19 1.1.4 Tác động nông nghiệp chiến lược quản lý tuyến trùng 21 1.1.5 Kỹ thuật RNAi 23 1.1.5.1 Sự ức chế gene sau phiên mã thông qua siRNA 24 1.1.5.2 Sự ức chế RNA thông qua miRNA 25 1.1.5.3 Quá trình tạo amiRNA 26 1.1.6 RNA can thiệp ứng dụng quản lý tuyến trùng ký sinh thực vật 27 1.1.6.1 Phương pháp siRNA 28 1.1.6.2 Phương pháp sử dụng microRNA 30 1.1.7 Nghiên cứu RNAi thực vật Việt Nam 31 1.1.8 Chuyển gene đậu nành 32 1.1.8.1 Các nghiên cứu nước 32 1.1.8.2 Các nghiên cứu nước 36 1.2 Tính cấp thiết nghiên cứu 37 1.3 Mục tiêu 39 1.4 Cách tiếp cận 39 iii 1.5 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 40 PHẦN NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41 2.2 Phương pháp nghiên cứu 43 2.2.1 Định danh dòng tuyến trùng Mi ký sinh đậu nành 43 2.2.2 Sự đa dạng hình thái khả ký sinh đậu nành tuyến trùng 45 2.2.2.1 Đặc điểm hình thái dịng tuyến trùng M incognita 45 2.2.2.2 Khả ký sinh đậu nành dòng M incognita 45 2.2.3 Tạo dịng gene mã hóa effector 47 2.2.4 Thiết kế vector mang cấu trúc RNAi 48 2.2.4.1 Chọn lựa amiRNA 48 2.2.4.2 Tổng hợp amiRNA 48 2.2.4.3 Tạo dòng cấu trúc amiRNA 50 2.2.5 Xây dựng hệ thống tái sinh in vitro đậu nành 52 2.2.5.1 Khử trùng đậu nành 52 2.2.5.2 Đánh giá khả tạo chồi mẫu cấy 53 2.2.5.3 Khảo sát khả vươn chồi mẫu cấy 53 2.2.5.4 Khảo sát khả tạo rễ chồi đậu nành 53 2.2.5.5 Xác định nồng độ chất hygromycin sử dụng chọn chuyển gene 53 2.2.6 Chuyển gene vào đậu nành thông qua vi khuẩn A tumefaciens 53 2.2.6.1 Chuẩn bị vi khuẩn 53 2.2.6.2 Chuẩn bị mẫu mầm đậu nành 54 2.2.6.3 Lây nhiễm đồng nuôi cấy 54 2.2.6.4 Sàng lọc tái sinh 54 2.2.6.5 Kiểm tra số cấu trúc amiRNA chồi giả định chuyển gene 55 2.2.7 Đánh giá mức độ biểu miRNA đậu nành T1 57 2.2.8 Đánh giá mức độ kháng đậu nành chuyển gene với tuyến trùng 58 2.2.9 Phân tích số liệu 58 Phần KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC 59 3.1 Sự đa dạng tuyến trùng M incognita ký sinh đậu nành 59 3.1.1 Định danh tuyến trùng M incognita 59 iv 3.1.1.1 Đặc điểm vân sinh môn trưởng thành 59 3.1.1.2 Định danh tuyến trùng thị phân tử 60 3.1.2 Hình thái khả ký sinh đậu nành dòng tuyến trùng 61 3.1.2.1 Hình thái ấu trùng (J2) dòng tuyến trùng phân lập 61 3.1.2.2 Khả ký sinh đậu nành dòng M incognita phân lập 62 3.1.2.3 Chu kỳ ký sinh tuyến trùng đậu nành 66 3.2 Phân tích trình tự số gene mã hóa effector tuyến trùng Mi 67 3.2.1 Tạo dịng gene mã hóa effector 67 3.2.2 Phân tích trình tự gene 68 3.3 Tạo vector mang cấu trúc RNAi 68 3.3.1 Tổng hợp miRNA 68 3.3.2 Tạo vector biểu cấu trúc amiRNA 70 3.4 Tạo đậu nành biến đổi di truyền mang cấu trúc RNAi 72 3.4.1 Xây dựng hệ thống tái sinh in vitro đậu nành 72 3.4.1.1 Khả tạo chồi từ nốt mầm giống đậu nành in vitro 72 3.4.1.2 Khả kéo dài chồi giống đậu nành 73 3.4.1.3 Khả tạo rễ đậu nành 74 3.4.1.4 Xác định nồng độ hygromycin dùng chọn lọc chuyển gene 75 3.4.2 Chuyển gene vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 78 3.4.2.1 Ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy đến khả tái sinh mầm 78 3.4.2.2 Chọn lọc chồi đậu nành chuyển gene 79 3.4.3 Xác định chồi chuyển gene 80 3.5 Xác định chuyển gene hệ T1 81 3.6 Xác định biểu amiRNA đậu nành T1 83 3.7 Mức độ kháng tuyến trùng đậu nành chuyển gene 84 Phần KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 87 4.1 Kết luận 87 4.2 Đề nghị 87 TÀI LIỆU THAM KHẢO 88 v DANH SÁCH HÌNH Hình 1.1 Sơ đồ trình tạo amiRNA (http://wmd3.weigelworld.org) 27 Hình 2.1 Plasmid pRS300 chứa trình tự miR319a (Schawb, 2005) 49 Hình 2.2 Phương pháp tổng hợp cấu trúc amiRNA (Schawb, 2005) 49 Hình 2.3 Plasmid pSM103 (Melito cs, 2010) 51 Hình 3.1 Hình dạng vân sinh mơn dịng tuyến trùng phân lập 60 Hình 3.2 Kết điện di sản phẩm PCR-SCAR 60 Hình 3.4 Sự biến đổi hình thái tuyến trùng Mi-PN-02 rễ đậu nành 66 Hình 3.5 Kết PCR tổng hợp gene 67 Hình 3.6 Kết điện di sản phẩm phản ứng PCR tổng hợp amiR-16281.1 69 Hình 3.7 PCR sàng lọc dòng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp 70 Hình 3.8 Trình tự 21 nu thay vào trình tự precursor ath-mR319a 70 Hình 3.9 Kết cắt vector (a) pSM103 (b) pJET1.2-amiR16281.1 71 Hình 3.10 Kết cắt vector pSM103-amiR16281.1 71 Hình 3.11 Cụm chồi tạo thành từ đốt mầm sau 28 ngày nuôi cấy 73 Hình 3.12 Cụm chồi giống đậu nành sau tuần nuôi cấy 74 Hình 3.13 Chồi đậu nành tạo rễ sau 28 ngày nuôi cấy (a) 75 đậu nành hóa (b) 75 Hình 3.14 Chồi đậu nành môi trường bổ sung hygromycin sau tuần 76 Hình 3.15 Chồi đậu nành hình thành sau 14 ngày mơi trường lọc 79 Hình 3.16 Chồi đậu nành mơi trường bổ sung 10 mg/L hygromycin 80 Hình 3.17 Kết PCR gene golgin 84 (trên) hptII (dưới) 81 Hình 3.19 Kết điện di PCR gene hptII hệ T1 82 Hình 3.20 Kết điện di sản phẩm RT-PCT gene actin đậu nành 83 Hình 3.21 Kết semi RT-PCT đoạn amiR-16281 T1 83 Hình 3.22 Cây đậu nành 30 ngày sau lây nhiễm tuyến trùng 85 Hình 3.23 Rễ đậu nành chuyển gene sau 30 ngày lây nhiễm tuyến trùng 85 vi DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1 Trình tự hai microRNA nhân tạo lựa chọn cho gene Minc16281 48 Bảng 2.2 Trình tự primer tổng hợp amiR-16281.1 amiR-16281.2 50 Bảng 2.3 Thứ tự phản ứng PCR tổng hợp amiRNA 50 Bảng 3.2 Khả ký sinh tuyến trùng Mi-PN02 giống Nam Vang 62 Bảng 3.3 Mức độ ký sinh dòng tuyến trùng giống Nam Vang 64 Bảng 3.4 Khả ký sinh dòng tuyến trùng Mi-PN02 giống đậu nành sau 56 ngày lây nhiễm với 1000 J2s 65 Bảng 3.5 Khả tạo chồi từ nốt mầm sau 28 ngày nuôi cấy 72 Bảng 3.6 Sự phát triển cụm chồi sau 28 ngày theo dõi 73 Bảng 3.7 Khả tạo rễ chồi đậu nành môi trường RM 75 Bảng 3.8 Kết tái sinh chồi đồng nuôi cấy ngày 78 Bảng 3.9 Kết chọn lọc chồi giả định chuyển gene đậu nành ĐT22 79 Bảng 3.10 Số copy gene hptII đậu nành T0 81 Bảng 3.11 Mức độ biểu miRNA ba đậu nành chuyển gene 84 Bảng 3.12 Mức độ kháng tuyến trùng Mi đậu nành chuyển gene 84 vii DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT A tumefaciens Agrobacterium tumefaciens amiRNA Artificial microRNA - microRNA nhân tạo B5 Môi trường nuôi cấy theo Gamborg cộng BA - Benzylaminopurine (Benzyladenine) bp base pair cs Cộng ĐC Đối chứng DNA Deoxyribonucleic Acid E coli Escherichia coli EDTA Ethylenediamine Tetraacetic Acid FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations kb kilo base LB Luria – Bertani miRNA micro RNA MS Murashige and Skoog, 1962 nu Nucleotide OD Optical Density PCR Polymerase Chain Reaction PEG Polyethylene glycol RISC RNA Inducing Silencing Complex RNA Ribonucleic Acid RNAi RNA interfering siRNA small interfering RNA TBE Tris Borate EDTA TP HCM Thành phố Hồ Chí Minh viii PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu 1.1.1 Tuyến trùng ký sinh thực vật Đậu nành có giá trị cao dinh dưỡng công dụng y học, đặc biệt chất isoflavones nhiều cơng trình khoa học chứng minh tốt việc trị ngừa số bệnh Mặt khác, đậu nành trồng góp phần đảm bảo an ninh lương thực quan trọng gia tăng dân số giới ngày Hiện nay, đậu nành trồng bị tuyến trùng gây hại nghiêm trọng, đặc biệt tuyến trùng sưng rễ Meloidogyne Tuyến trùng ký sinh thực vật (plant-parasitic nematode) tìm thấy khắp nơi giới, đặc biệt vùng có khí hậu nóng ẩm Cây bị bệnh tuyến trùng gây nên có tượng vàng lá, thối rễ Loại bệnh nguy hiểm, gây chết trồng hàng loạt Nguyên nhân tuyến trùng ký sinh rễ chúng tiết protein (cịn gọi effector) làm thay đổi q trình sinh lý, sinh hóa mơ rễ, hình thành tế bào khổng lồ (ở tuyến trùng sưng rễ) làm rối loạn trình vận chuyển trao đổi chất rễ Đồng thời, vết thương tạo điều kiện cho loại nấm, vi khuẩn xâm nhập gây hại gây tượng thối rễ, vàng Tuyến trùng sưng rễ Meloidogyne gồm 80 loài (Karssen, 2002) phân bố toàn giới Loài M incognita, M javanica, M arenaria, M chitwoodi, M fallax M hapla chiếm 95% tần suất xuất chi loài phân bố rộng rãi Tuyến trùng Meloidogyne tuyến trùng đa thực, có số lượng ký chủ rộng lớn Những loài phổ biến có số lượng ký chủ ước tính nhiều 5500 loài thực vật (Trudgill & Blok, 2001) Trong phân họ Meloidogyne, loài Meloidogyne incognita xem loài ký sinh thực vật nguy hiểm nhất, chúng chiếm tới 72% số lượng ký chủ phân bố khu vực nhiệt đới cận nhiệt đới toàn cầu Ở Việt Nam Meloidogyne incognita ký sinh 100 loài 72 họ thực vật (Nguyễn Vũ Thanh, 2002), gây hại nghiêm trọng đến hồ tiêu, cà phê, rau màu, đậu nành bơng vải Các lồi tuyến trùng chi Meloidogyne có hình thái đặc tính ký sinh giống nên khó phân biệt Việc định danh loài tuyến trùng sở quan trọng nhằm từ đưa biện pháp quản lý canh tác nhằm giảm thiểu tác động tuyến trùng sưng rễ đến trồng 1.1.1.1 Tuyến trùng Meloidogyne incognita (Mi) Tuyến trùng sưng rễ Meloidogyne incognita loại nội ký sinh trồng Đặc điểm triệu chứng biểu bệnh dễ nhầm lẫn với triệu chứng bệnh số tác nhân gây bệnh khác nấm, vi khuẩn virus gây bệnh Mức độ nhiễm bệnh thành phần tuyến trùng sưng rễ họ thực vật, loại đất khác (Ngơ Thị Xun, 2000) Về mặt hình thái, Meloidogyne incognita khơng có vùng bên vùng bên khơng rõ ràng, lổ tiết nằm ngang với kim hút Con có dạng lê hay hình cầu khơng cân phần cổ ngắn Mấu đuôi nhỏ, khơng thấy Kim hút có núm gốc trịn phần chóp kim hút cong phía lưng Vị trí lỗ tiết nằm sau gốc kim hút chút Vùng mơ rõ ràng Diều có kích thước 30-32 x 23-27 µm thay đổi Vân sinh mơn có dạng thay đổi, vulva có hình oval, kéo dài hướng lưng bụng, ln có vịm lưng cao khơng bị bóp lại từ hai phía bên, đường vân khơng liên tục; trường hợp đường vân phía bụng khơng bị cắt gần phía vulva vân ln gấp khúc mạnh Vùng bên khơng có biểu dạng chĩa chỗ nối vân vùng lưng bụng Mút đuôi thường dễ quan sát (Nguyễn Vũ Thanh, 2002) Con đực có thể dạng chỉ, đầu cao hình chóp tù khơng tách biệt với thể, với vòng; kim hút thường dài 25 - 26 µm với gốc kim hút tròn cao – 3,5 µm rộng 5,5 – 6,6 µm Phần chóp kim hút dài phần trụ Lỗ tiết nằm phía trước đoạn thắt thực quản Vùng bên với bốn đường chúng bị vng hóa phần Đi trịn mập, mút đuôi phân đốt không rõ 10 development in Pakistan, held in Islamabad on May 7-9, 29-37 Cheng M., Chang Y.F., Olhoft P.M., Cardoza V., Lai F.M., Jones T.D., Wenck A.R 2011 Cells/Tissues conditioning for facilitating T-DNA delivery In: Dan Y.H., David W.O (ed.): Plant Transformation Technology Revolution in Last Three Decades, Volume, Historical Technology Development in Plant transformation Bentham Science Publishers, USA 77-107 Christianson M.L., Warnick D.A., Carlson P.S 1983 A morphogenetically competent soybean suspension culture Science 222: 632-634 Claverie M, Dirlewanger E, Bosselut N, Van Ghelder C, Voisin R, Kleinhentz M, Lafargue B, Abad P, Rosso M, N, Chalhoub B, Esmenjaud D 2011 The Ma Gene for Complete-Spectrum Resistance to Meloidogyne Species in Prunus Is a TNL with a Huge Repeated C-Terminal Post-LRR Region Plant Physiol 156(2):779-792 Collier, R., Dasgupta, K., Xing, Y.‐P., Hernandez, B.T., Shao, M., Rohozinski, D., Kovak, E., Lin, J., de Oliveira, M.L.P., Stover, E., McCue, K.F., Harmon, F.G., Blechl, A., Thomson, J.G and Thilmony, R (2017) Accurate measurement of transgene copy number in crop plants using droplet digital PCR The Plant Journal, 90, 1014–1025 Cuc NTT, Prot JC 1992 Root-parasitic nematodes of deep-water rice in the Mekong-delta of Vietnam Fundamental and Applied Nematology 15:575-577 Dalzell JJ, McVeigh P, Warnock ND, Mitreva M, Bird DM, Abad P, FleMing CC, Day TA, Mousley A, Marks NJ, Maule AG 2011 RNAi effector diversity in nematodes PLoS Negl Trop Dis 5(6):e1176 doi: 10.1371/journal.pntd.0001176 Dan Y and Reichert N.A 1998 Organogenic regeneration of soybean from hypocotyl explants In Vitro Cellular and Developmental Biology–Plant 34: 1421 Dan Y.H., Armstrong C.L., Jimmy D., Feng X.R., Joyce E.F., Keithly G.E 2009 Lipoic acid – a unique plant transformation enhancer In Vitro Cell Dev Biol Plant 45: 630-638 Dang W., Wei Z.M 2007 An optimized Agrobacterium mediated transformation for soybean for expression of binary insect resistance genes Plant Sci 173: 381389 Davis E.L., Hussey R.S., Baum T.J 2004 Getting to the roots of parasitism by nematodes Trends Parasitol 20: 134-141 De Waele D and Elsen A 2007 Challenges in tropical plant nematology Annual Review of Phytopathology 45:457-485 Đinh Thị Phòng 2007 Chuyển gene gus vào đỉnh phơi hạt chín giống đậu nành ĐT12 thơng qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Tạp chí Cơng nghệ sinh học 5: 471-478 Dinkins R.D., Collins G.D 2008 Agrobacterium mediated genetic transformation of soybean In: Kirti PD (ed.) Handbook of new technologies for genetic improvement of legumes CRC Press, Florida, 89-102 Droste A., Bodanese-Zanettini M.M., Hu C.Y 1993 Meristem culture of Brazilian soybean cultivars Rev Bras Genet 16: 135-144 89 Duan CG, Wang CH, Fang RX, Guo HS 2008 Artificial miRNA highly accessible to targets confer efficient virus resistance in plants J Virol 82(22):1108411095 Gamborg O.L., Miller R.A., Ojima K 1968 Nutrient requirements of suspension cultures of soybean cells Experimental Cell Research 50: 151-158 Gheysen G, Vanholme B 2007 RNAi from plants to nematodes Trends Biotechnol 25:89–92 Hammond SM, Bernstein E, Beach D, Hannon GJ 2000 An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells Nature 404(6775): 293-296 Hu T, Fu Q, Chen P, Ma L, Sin O, Guo D 2009 Construction of an artificial miRNA expression vector for simultaneous inhibition of multiple genes in mammalian cells Int J Mol Sci 10(5):2158-2168 Huang G, Allen R, Davis EL, Baum TJ, Hussey RS 2006 Engineering broad rootknot resistance in transgenic plants by RNAi silencing of a conserved and essential root-knot nematode parasitism gene Proc Natl Acad Sci U.S.A 103, 14302–14306 Huang Q-X, Cheng X-Y, Mao Z-C, Wang Y-S, Zhao L-L, et al 2010 miRNA Discovery and Analysis of Pinewood Nematode Bursaphelenchus xylophilus by Deep Sequencing PLoS ONE 5(10): e13271 doi:10.1371/journal.pone.0013271 Jaouannet M, Magliano M, Arguel MJ, Gourgues M, Evangelisti E, et al 2013 The root-knot nematode calreticulin Mi-CRT is a key effector in plant defense suppression Mol Plant Microbe Interact 26: 97-105 Ketting RF, Fischer SE, Bernstein E, Sijen T, Hannon GJ, Plasterk RH 2001 Dicer functions in RNA interference and in synthesis of small RNA involved in developmental timing in C elegans Genes Dev 15(20):2654-2659 Khan A.Z, Shah P., Lhalil S.K and Ahmad B 2004 Yield of soybean cultivars as affected by planting date under Peshawar valley conditions The Nucleus 41: 9395 Khraiwesh B, Ossowski S, Weigel D, Reski R, Frank W 2008 Specific gene silencing by artificial miRNAs in Physcomitrella patens: an alternative to targeted gene knockouts Plant Physiol 148(2):684-693 Kim J., LaMotte C.E., and Hack E 1990 Plant Regeneration In Vitro from Primary Leaf Nodes of Soybean (Glycine max) Seedlings Journal of Plant Physiology 136: 664-669 Klink VP, Kim KH, Martins V, Macdonald MH, Beard HS, Alkharouf NW, Lee SK, Park SC, Matthews BF 2009 A correlation between host-mediated expression of parasite genes as tandem inverted repeats and abrogation of development of female Heterodera glycines cyst formation during infection of Glycine max Planta, 230, 53–71 Ko T.S., Korban S.S 2004 Enhancing the frequency of somatic embryogenesis following Agrobacterium mediated transformation of immature cotyledons of soybean [Glycine max (L.) Merrill] In Vitro Cell Dev Biol Plant 40: 552-558 90 Komari T., Hiei Y., Saito Y., Murai N., and Kumashiro T 1996 Vectors carrying two separate T - DNAs for co-transformation of higher plants mediated by Agrobacterium tumefaciens and segregation of transformants free from selection markers Plant J 10: 165-174 Lafitte HR, Li ZK, Vijayakumar CHM, Gao YM, Shi Y, Xu JL, Fu BY, Yu SB, Ali AJ, Domingo J, Maghirang R, Torres R, Mackill D 2006 Improvement of rice drought tolerance through backcross breeding: Evaluation of donors and selection in drought nurseries Field Crops Research 97:77-86 Li B.J., Langridge W.H.R., Szalay A.A 1985 Somatic embryogenesis and plantlet regeneration in the soybean Glycine max Plant Cell Rep 4: 344-347 Li J, Todd TC, Lee J, Trick HN 2011 Biotechnological application of functional genomics towards plant-parasitic nematode control Plant Biotechnol J 9(9):936944 doi: 10.1111/j.1467-7652.2011.00601.x Li J, Todd TC, Oakley TR, Lee J, Trick HN 2010 Host-derived suppression of nematode reproductive and fitness genes decreases fecundity of Heterodera glycines Ichinohe Planta, 232, 775–785 Li X, Wang X, Zhang S, Liu D, Duan Y, et al 2012 Identification of Soybean miRNA Involved in Soybean Cyst Nematode Infection by Deep Sequencing PLoS ONE 7(6): e39650 doi:10.1371/journal.pone.0039650 Libault M, Thibivilliers S, Bilgin DD, Radwan O, Benitez M, et al (2008) Identification of four soybean reference genes for gene expression normalization The Plant Genome 1: 44–54 Lippmann B., Lippmann G 1984 Induction of somatic embryos in cotyledons tissue of soybean Glycine max (L.) Merrill Plant Cell Rep 3: 215-218 Liu J.H., Wang P.W., Wu L.M., Yu Y.C., Zhan J., Hao W.Y., Yao D 2003 Effects of proline and AgNO3 on Agrobacterium-mediated transformation of soybean Soybean Sci 22: 36-39 Liu X.J., Yin H.X., Wang Y.Z., and Xu J 2008 Efficient Agrobacterium tumefaciens mediated transformation of Maluszumi (Matsumura) using leaf explant regeneration system Electronic Journal of Biotechnology ISSN: 0717 – 3458 12: 1-8 Livak K J., Schmittgen T D 2001 Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods., 25, pp 402 – 408 M B T O Committee 2010 Report of the Methyl Bromide Technical Options Committee 2010 Assessment Nairobi, United Nations Environment Programme (UNEP) Ma H., and Wu L 2008 Rapid and efficient regeneration in soybean [Glycine max (L.) Merrill] from whole cotyledonary node explants Acta Physiologiae Plantarum 30: 209-216 Mante S., Scorza R., and Cordts J 1989 A simple, rapid protocol for adventitious shoot development from mature cotyledons of Glycine max cv bragg In Vitro Cellular & Developmental Biology 25: 385-388 McManus MT, Petersen CP, Haines BB, Chen J, Sharp PA 2002 Gene silencing 91 using micro-RNA designed hairpins RNA 8(6):842-850 Melito S, Heuberger AL, Cook D, Diers BW, MacGuidwin AE, Bent AF 2010 A nematode demographics assay in transgenic roots reveals no significant impacts of the Rhg1 locus LRR-Kinase on soybean cyst nematode resistance BMC Plant Biol 10:104 doi: 10.1186/1471-2229-10-104 Meng QP, Long H, Xu JH 2004 PCR assays for rapid and sensitive identification of three major root-knot nematodes, Meloidogyne incognita, M javanica and M arenaria Acta Phytopathologica Sinica 34:204–210 Milligan SB, Bodeau J, Yaghoobi J, Kaloshian I, Zabel P, Williamson VM 1998 The root knot nematode resistance gene Mi from tomato is a member of the leucine zipper, nucleotide binding, leucine-rich repeat family of plant genes Plant Cell 10(8): 1307–1319 Nguyễn Thị Thúy Hường, Trần Thị Ngọc Diệp, Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn Chu Hoàng Hà 2009 Phát triển hệ thống tái sinh in vitro đậu tương (Glycine max L Merrill) phục vụ chuyển gen Tạp chí khoa học cơng nghệ Đại học Thái Ngun 52: 82-88 Nguyễn Thúy Điệp, Kiều Thị Dung, Đặng Minh Trang, Lê Việt Trung, Đặng Trọng Lương, Trương Thị Thanh Mai 2005 Kết nghiên cứu ban đầu khả tái sinh số giống đậu nành phục vụ cho cơng tác chuyển gene Tạp chí Nơng nghiệp PTNT 20: 35-38 Nguyễn Tiến Dũng, Ngơ Xn Bình, Hà Văn Chiến, Nguyễn Văn Đồng 2010 Nghiên cứu khả tiếp nhận gene số giống đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) Việt Nam thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Tạp chí NN PTNT 11: 69-74 Nguyễn Văn Đồng, Phạm Thị Lý Thu, Lê Thị Mai Hương, Lê Thị Lan, Nguyễn Chiến Hữu, Lê Huy Hàm 2012 Nghiên cứu tạo giống ngô chịu hạn công nghệ gen Hội thảo Quốc gia Khoa học Cây trồng 1: 405-411 Olhoft P.M., Flagel L.E., Donovan C.M., Somers D.A 2003 Efficient soybean transformation using hygromycin B selection in the cotyledonary node method Planta 216: 723-735 Olhoft P.M., Somers D.A 2001 L - Cysteine increases Agrobacterium mediated T DNA delivery into soybean cotyledonary node cells Plant Cell Rep 20: 706711 Parrish S, Fire A 2001 Distinct roles for RDE-1 and RDE-4 during RNA interference in Caenorhabditis elegans RNA 7(10):1397-1402 Parrott W.A., Dryden G., Vogt S., Hildebrand D.F., Collins G.B., Williams E.G 1988 Optimization of somatic embryogenesis and embryo germination in soybean Vitro Cell Dev Biol 4: 817-820 Paz M.M., Martinez J.C., Kalving A.B., Fonger T.M., Wang K 2006 Improved cotyledonary node method using an alternative explants derived from mature seed for efficient Agrobacterium mediated soybean transformation Plant Cell Rep 25: 206-213 Perl A., Lotan O., Abu-Abied M., Holland D 1996 Establishment of an Agrobacterium mediated transformation system for grape (Vitis vinifera L.): the 92 role of antioxidants during grape Agrobacterium interactions Nat Biotechnol 14: 624-628 Qu J, Ye J, Fang R 2007 Artificial miRNA-mediated virus resistance in plants J Virol 81(12):6690-6699 Radhakrishnan R., Ramachandran A., and Kumari B.D.R 2009 Rooting and shooting: dual function of thidiazuron in in vitro regeneration of soybean (Glycine max L) Acta Physiologiae Plantarum 31: 1213-1217 Rajasekaran K., Pellow J.W 1997 Somatic embryogenesis from cultured epicotyls and primary leaves of soybean [Glycine max L Merrill] In Vitro Cell Dev Biol Plant 33: 88-91 Reichert N.A., Young M.M., Woods A.L 2003 Adventitious organogenesis regeneration from soybean genotypes representing nine maturity groups Plant Cell Tiss Org Cult 75: 273-277 Rosso MN, Dubrana MP, Cimbolini N, Jaubert S, Abad P 2005 Application of RNA interference to root-knot nematode genes encoding esophageal gland proteins Mol Plant Microbe Interact 18(7):615-620 Rosso MN, Jones JT, Abad P 2009 RNAi and functional genomics in plant parasitic nematodes Annu Rev Phytopathol 47:207-232 Sairam R.V., Franklin G., Hassel R 2003 A study on the effect of genotypes, plant growth regulators and sugars in promoting plant regeneration via organogenesis from soybean cotyledonary nodal callus Plant Cell, Tissue and Organ Culture 75: 79-85 Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T 1989 Molecular cloning: A laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY Santarem E.R., Pelissier B., Finer J.J 1997 Effect of explant orientation, pH, solidifying agent and wounding on initiation of soybean somatic embryos Vitro Cell Dev Biol Plant 33: 13-19 Sato S., Xing A., Ye X., Schweiger B., Kinney A., Graef G., Clemente T 2004 Production of γ - Linolenic Acid and Stearidonic Acid in Seeds of Marker - Free Transgenic Soybean Crop Sci 44: 646-652 Schmutz J., Cannon S.B., Schlueter J 2010 Genome sequence of the paleopolyploid soybean Nature 463: 178-183 Schwab R, Ossowski S, Riester M, Warthmann N, Weigel D 2006 Highly specific gene silencing by artificial miRNA in Arabidopsis Plant Cell 18(5):1121-1133 Shan Z., Raemakers K., Tzitzikas E.N., Ma Z., and Visser R G F 2005 Development of a highly efficient, repetitive system of organogenesis in soybean (Glycine max (L.) Merr) Plant Cell Reports 24: 507-512 Sindhu AS, Maier TR, Mitchum MG, Hussey RS, Davis EL, Baum TJ 2009 Effective and specific in planta RNAi in cyst nematodes: expression interference of four parasitism genes reduces parasitic success J Exp Bot 60, 315–324 Stachel S.E., and Zambryski P.C 1986 VirA and VirG control the plant–induced activation of the T - DNA transfer process of A tumefaciens Cell 46: 325-333 Stanton B Gelvin 2000 Agrobacterium and plant genes involved in T - DNA transfer and integration Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular 93 Biology 51: 223-256 Stanton B Gelvin 2003 Agrobacterium mediated plant transformation: the biology behind the Gene–Jockeying tool Microbiology and Molecular Biology Review 67: 16-37 Steeves RM, Todd TC, Essig JS, Trick HN 2006 Transgenic soybeans expressing siRNAs specific to a major sperm protein gene suppress Heterodera glycines reproduction Funct Plant Biol 33, 991–999 Sukno SA, McCuiston J, Wong MY, Wang X, Thon MR, Hussey R, Baum T, Davis E 2007 Quantitative Detection of Double-Stranded RNA-Mediated Gene Silencing of Parasitism Genes in Heterodera glycines J Nematol 39(2):145-152 Tabara H, Yigit E, Siomi H, Mello CC 2002 The dsRNA binding protein RDE-4 interacts with RDE-1, DCR-1, and a DExH-box helicase to direct RNAi in C elegans Cell 109(7):861-871 Tiwari M.T 2003 Epigenesis and High Frequency Plant Regeneration from Soybean (Glycine max (L.) Merr.) Hypocotyls Plant Tissue Culture 13: 61-73 Trần Thị Cúc Hoà 2007 Nghiên cứu khả đáp ứng chuyển nạp gene giống đậu nành trồng Việt Nam Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển nông thôn 18: 9-14 Trick H.N., and Finer J.J 1998 Sonication assisted Agrobacterium mediated transformation of soybean Glycine max (L.) Merrill embryogenic suspension culture tissue Plant Cell Reports 17: 482-488 Trick H.N., Dinkins R.D., Santarem E.R., Di R., Samoylov V., Meurer C.A., Walker D.R., Parrott W.A., Finer J.J., Collins G.B 1997 Recent advance in soybean transformation Plant Tissue Cult Biotechnol 3: 6-26 Trinh PQ, de la Pena E, Nguyen CN, Nguyen HX, Moens, M 2009 Plant-parasitic nematodes associated with coffee in Vietnam Russian journal of nematology 17(1): 73-82 Trudgill D.L, Blok V.C 2001 Apomictic, polyphagous root-knot nematodes: exceptionally successful and damaging biotrophic root pathogens Annual review of Phytopathology 39: 53-77 Trudgill DL 1997 Parthenogenetic root-knot nematodes (Meloidogyne spp.); how can these biotrophic endoparasites have such an enormous host range? Plant Pathology 46:26-32 Tsuda N, Ishiyama S, Li Y, Ioannides CG, Abbruzzese JL, Chang DZ 2006 Synthetic microRNA designed to target glioma-associated antigen transcription factor inhibits division and induces late apoptosis in pancreatic tumor cells Clin Cancer Res 12(21):6557-6564 Urwin PE, Lilley CJ, Atkinson HJ 2002 Ingestion of double-stranded RNA by preparasitic juvenile cyst nematodes leads to RNA interference Mol Plant microbe Interact 15(8):747-752 Williamson VM, Kumar A 2006 Nematode resistance in plants: the battle underground Trends Genet 22(7): 396–403 Wright M.S., Korhler S.M., Hinchee M.A., Carnes M.G 1986 Plant regeneration by organogenesis in Glycine max Plant Cell Rep 5: 150-154 94 Wright M.S., Ward D.V., Hinchee M.A., Carnes M.G., and Kaufman R.J 1987 Regeneration of soybean (Glycine max L Merr.) from cultured primary leaf tissue Plant Cell Reports 6: 83-89 Wright M.S., Williams M.H., Pierson P.E., and Carnes M.G 1987 Initiation and propagation of Glycine max L Merr plants from tissue–cultured epicotyls Plant Cell, Tissue and Organ Culture 8: 83-90 Xue B, Hamamouch N, Li C, Huang G, Hussey RS, et al 2013 The 8D05 parasitism gene of Meloidogyne incognita is required for successful infection of host roots Phytopathology 103: 175-181 Yadav BC, Veluthambi K., Subramaniam K 2006 Host-generated double stranded RNA induces RNAi in plant-parasitic nematodes and protects the host from infection Mol Biochem Parasitol 148, 219–222 Yadava P, Mukherjee SK 2012 Artificial microRNA and Its Applications Pages 505-521 In: Regulatory RNAs: Basics, Methods and Applications Bibekanand, M and Zhumur, G eds Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Germany Yamada T., Satoshi W., Maiko A., Kyuya H., Keisuke K 2010 Cotyledonary node pre-wounding with a micro-brush increased frequency of Agrobacteriummediated transformation in soybean Plant Biotechnology 27: 217 Yang X., Yu X., Zhou Z., Ma W.J., Tang G 2016 A high - efficiency Agrobacterium tumefaciens mediated transformation system using cotyledonary node as explants in soybean (Glycine max L.) Acta Physiol Plant 38: 60-70 Yoshida T 2002 Adventitious shoot formation from hypocotyl sections of mature soybean seeds Breeding Science 52: 1-8 Zamore PD, Tuschl T, Sharp PA, Bartel DP 2000 RNAi: double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals Cell 101(1):25-33 Zeng P., Vadnais D A., Zhang Z., Polacco J C 2004 Refined glufosinate selection in Agrobacterium mediated transformation of soybean [Glycine max (L.) Merrill] Plant Cell Reports 22: 478-482 Zeng Y, Wagner EJ, Cullen BR 2002 Both natural and designed microRNAs can inhibit the expression of cognate mRNAs when expressed in human cells Mol Cell 9(6):1327-1333 Zhang F., Chen C., Ge H., Liu J., Luo Y., Liu K., Chen L., Xu K., Zhang Y., Tan G and Li C 2014) Efficient soybean regeneration and Agrobacterium-mediated transformation using a whole cotyledonary node as an explant Biotechnology and Applied Biochemistry 61: 620-625 95 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Thông tin gene Phụ lục 2: Các amiRNA primer tổng hợp Tên Trình tự Năng % lượng GC cặp (kcal/mol) Vị trí bắt với mRNA amiR17980.1 UUGAAGACAAAUUACGGCCAC -34,02 42 276-292 amiR17980.2 UAAUUACGGUCACACUGGCCG -37,03 52 268-283 amiR14137-1 UAACUAUAAUCUAGGGCACGU -34,07 42 286-302 amiR14137-2 UAACUGUAAUCUAGGGCACGU -37,12 53 268-283 amiRNA Primer Trình tự (5’ 3’) amiR17980.1 I miR gaTTGAAGACAAATTACGGCCACtctctcttttgtattcc II miR gaGTGGCCGTAATTTGTCTTCAAtcaaagagaatcaatga III miR*s gaGTAGCCGTAATTTCTCTTCATtcacaggtcgtgatatg IV miR*a gaATGAAGAGAAATTACGGCTACtctacatatatattcct I miR gaTAATTACGGTCACACTGGCCGtctctcttttgtattcc II miR gaCGGCCAGTGTGACCGTAATTAtcaaagagaatcaatga III miR*s gaCGACCAGTGTGACGGTAATTTtcacaggtcgtgatatg IV miR*a gaAAATTACCGTCACACTGGTCGtctacatatatattcct I miR gaTAACTATAATCTAGGGCACGTtctctcttttgtattcc II miR gaACGTGCCCTAGATTATAGTTAtcaaagagaatcaatga III miR*s gaACGTGCCCTAGATTATAGTTAtcaaagagaatcaatga IV miR*a gaAAACTATTATCTAGGGCATGTtctacatatatattcct I miR gaTAACTATAATCTAGGGCACGTtctctcttttgtattcc II miR gaACGTGCCCTAGATTATAGTTAtcaaagagaatcaatga III miR*s gaACGTGCCCTAGATTATAGTTAtcaaagagaatcaatga IV miR*a gaAAACTATTATCTAGGGCATGTtctacatatatattcct amiR17980.2 amiR14137-1 amiR14137-2 Phụ lục 3: Quantitative PCR Đường chuẩn gene htpII log DNA Số copy Ct 34 10 32.5 100 30.2 1000 27 10000 24 Đường chuẩn actin Log DNA Số copy 3.383815 2420 3.781037 6040 4.082785 12100 4.383815 24200 4.559907 36300 Ct 21.718 20.635 19.652 18.486 17.495 Đường chuẩn At319 Log DNA Số copy Ct 10 34 100 30.8 1000 26.8 10000 23 DANH MỤC SẢN PHẨM ĐỀ TÀI Dạng I: TT Tên sản Số Chỉ tiêu phẩm lượng kỹ thuật Cây đậu 02-03 Kết đạt Ghi Cây đậu Gene chuyển đậu nành nành nành khẳng định diện chuyển gene chuyển chuyển cây, mức độ biểu kháng tuyến gen gene gene xác trùng hệ T1 định, kháng tuyến trùng sưng rễ so với đối chứng Cấu trúc Trình tự amiRNA chứa cấu amiRNA chèn vào precursor trúc giải với thiết kế ban amiRNA trình tự đầu, đảm bảo bắt cặp Vector 02 02 miRNA bổ sung với mRNA effector, không bắt cặp bổ sung với gene đậu nành Dạng II: Tên sản phẩm TT Yêu cầu khoa học cần đạt Ghi Dạng III: Số Tên sản Yêu cầu khoa học cần TT phẩm đạt Bài báo Bài báo phản biện khoa học độc lập, đăng tạp chí Số lượng 02 Kết đạt 02 có uy tín Nguyễn Vũ Phong, Nguyễn Thị Ngọc Loan, Tôn Bảo Linh, Trần Thị Lệ Minh, 2019 Tạo đậu nành biểu microRNA nhân tạo tăng cường kháng tuyến trùng sưng rễ Tuyển tập báo cáo toàn văn Hội nghị Cơng nghệ sinh học tồn quốc năm 2019, tháng 11 năm 2019 Nhà xuất Đại học Quốc gia TP.HCM, trang 468-472 ISBN: 978-604-73-7266-9 Nguyễn Vũ Phong, Nguyễn Thị Ngọc Loan, Trần Bảo Thắng, Tôn Bảo Linh, 2019 Tổng hợp vector mang cấu trúc microRNA nhân tạo sử dụng ức chế biểu gene Minc16281 tuyến trùng sưng rễ Meloidogyne incognita Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển, 18 (4) trang 62-69 pISSN 2615 - 9503, eISSN 2615-949X Dạng IV: Tham gia đào tạo sau đại học Số TT Cấp đào tạo Thạc sĩ Số lượng 01 Chuyên ngành đào tạo Công nghệ sinh học/ Khoa học trồng/Di truyền Kết đạt 02 Hồng Thị Hường, 2020 Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh học tuyến trùng Meloidogyne incognita Chitwood ký sinh đậu nành (Glycine max L.) Luận văn Thạc sĩ Bảo vệ thực vật Trần Bảo Thắng, 2020 Tổng hợp vector mang cấu trúc microRNA ứng dụng bất hoạt gene tuyến trùng Meloidogyne incognita Luận văn Thạc sĩ Công nghệ Sinh học