Nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học phòng trừ tuyến trùng meloidogyne spp trên cây hồ tiêu

SỞ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN TP.HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO NGHIỆM THU NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM SINH HỌC PHỊNG TRỪ TÚN TRÙNG Meloidogyne spp TRÊN CÂY HỜ TIÊU Mã số: VS02/13 – 15 Chủ nhiệm đề tài: ThS Lê Thị Mai Châm Cán thực hiện: ThS Lê Thị Mai Châm KS Lê Thị Thùy Nhi KS Vũ Thùy Dương TP Hồ Chí Minh, tháng 10 năm 2015 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii DANH SÁCH BẢNG .iv DANH SÁCH BIỂU ĐỒ v DANH SÁCH HÌNH vi TÓM TẮT viii I THÔNG TIN CHUNG VỀ ĐỀ TÀI II ĐẶT VẤN ĐỀ III TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3.1 Tổng quan về tuyến trùng Meloidogyne spp .4 3.1.1 Loài tuyến trùng gây hại hồ tiêu 3.1.2 Đặc điểm của Meloidogyne spp 3.1.3 Vòng đời của Meloidogyne spp 3.1.4 Cấu tạo thể tuyến trùng Meloidogyne spp 3.1.5 Cấu tạo của vỏ trứng tuyến trùng Meloidogyne spp 3.2 Tác nhân sinh học kiểm soát tuyến trùng Meloidogyne spp 10 3.3 Tổng quan về nấm Purpureocillium lilacinum .12 3.3.1 Phân loại và đặc điểm nấm Purpureocillium lilacinum 12 3.3.2 Cơ chế ký sinh tuyến trùng Meloidogyne của Purpureocillium lilacinum 14 3.4 Những nghiên cứu đã thực hiện nấm P lilacinum 15 3.4.1 Những nghiên cứu ở nước ngoài về nấm P lilacinum 15 3.4.2 Những nghiên cứu ở nước về nấm P lilacinum 16 IV VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .16 4.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 16 4.2 Nội dung nghiên cứu 18 4.3 Phương pháp nghiên cứu 19 4.3.1 Phân lập chủng nấm nghi ngờ thuộc là P lilacinum ở Việt Nam 19 4.3.2 Tách, nhân nuôi và thu nhận tuyến trùng Meloidogyne spp gây hại cho 22 4.3.3 Định tính hệ enzyme ngoại bào có khả phân hủy vỏ trứng và biểu bì tuyến trùng của chủng nấm .23 4.3.4 Sàng lọc chủng nấm có khả kí sinh trứng và tuyến trùng Meloidogyne spp đĩa Petri .23 4.3.5 Kiểm tra độc tính của chủng nấm chọn tiêu 23 4.3.6 Sàng lọc chủng nấm có khả tiêu diệt hiệu tuyến trùng Meloidogyne spp nhà kính 24 i 4.3.7 Định danh chủng nấm chọn kĩ thuật sinh học phân tử 25 4.3.8 Đánh giá tính đối kháng của chủng nấm chọn và với Trichoderma hay Bacillus 25 4.3.9 Nghiên cứu quy trình sản xuất chế phẩm nấm kí sinh trứng tuyến trùng 26 4.3.10 Phương pháp xử lý số liệu 27 V KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 5.1 Kết phân lập chủng nấm nghi ngờ thuộc là P lilacinum ở vùng Đông Nam Bộ Việt Nam 27 5.2 Kết tách, nhân nuôi và thu nhận tuyến trùng Meloidogyne spp gây hại 32 5.3 Kết định tính hệ enzyme ngoại bào có khả phân hủy vỏ trứng và biểu bì tuyến trùng của chủng nấm .34 5.4 Kết sàng lọc chủng nấm có khả kí sinh trứng và Meloidogyne sp đĩa Petri .41 5.5 Kết kiểm tra độc tính của chủng nấm chọn tiêu trờng nhà kính 46 5.6 Kết sàng lọc chủng nấm có khả tiêu diệt hiệu tuyến trùng Meloidogyne spp nhà kính 48 5.7 Kết định danh chủng nấm chọn kĩ thuật sinh học phân tử 54 5.8 Kết đánh giá tính đối kháng của chủng nấm chọn và với Trichoderma 55 5.9 Quy trình nhân và xử lý sinh khối nấm P lilacinum .58 5.9.1 Kết nhân sinh khối lỏng nấm P lilacinum 58 5.9.2 Kết nhân sinh khối bán rắn nấm P lilacinum .59 5.9.1 Kết bảo quản sinh khối nấm P lilacinum sau thu hoạch 60 VI KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .62 6.1 Kết luận 62 6.2 Đề nghị 62 VIII TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DK KL Đường kính khuẩn lạc DK VPG Đường kính vịng phân giải DC Đới chứng CFU Clony forming unit WA Water agar PDA Potato dextrose agar CV Coefficient of variation P Probability value iii DANH SÁCH BẢNG Bảng Mật độ xuất hiện của chủng nấm Purpureocillium spp và pH của đất ở vùng lấy mẫu khác 29 Bảng Mật độ tuyến trùng có mẫu đất và rễ thu thập .32 Bảng Trung bình đường kính vịng phân giải (DK VPG, D), đường kính khuẩn lạc (DK KL, d) và tỉ lệ D/d của chủng nấm chọn lọc và chủng đối chứng P lilacinum NBRC 5350 (PL), Pochonia chlamydosporia NBRC 103141 (PC) mọc môi trường có chitin sau ni cấy .35 Bảng Trung bình đường kính vòng phân giải (DK VPG, D), đường kính khuẩn lạc (DK KL, d) và tỉ lệ D/d của chủng nấm chọn lọc và chủng đối chứng P lilacinum NBRC 5350 (PL), Pochonia chlamydosporia NBRC 103141 (PC) mọc mơi trường có tributyrin sau nuôi cấy .37 Bảng Trung bình đường kính vịng phân giải (DK VPG, D), đường kính khuẩn lạc (DK KL, d) và tỉ lệ D/d của chủng nấm chọn lọc và chủng đối chứng P lilacinum NBRC 5350 (PL), Pochonia chlamydosporia NBRC 103141 (PC) mọc mơi trường có casein sau nuôi cấy 39 Bảng Trung bình đường kính khuẩn lạc của chủng nấm Purpureocillium spp chọn lọc và chủng đối chứng PL, PC đĩa WA khảo sát khả ký sinh Meloidogyne spp 42 Bảng Trung bình đường kính khuẩn lạc của chủng nấm Purpureocillium spp chọn lọc và chủng đối chứng PL, PC đĩa WA khảo sát khả ký sinh túi trứng Meloidogyne spp .44 Bảng Tốc độ phát triển của tiêu sau 30, 60 và 90 ngày thí nghiệm 47 Bảng Tỉ lệ cái, khối trứng Meloidogyne spp rễ và tỉ lệ tuyến trùng di động đất bị chết sau 30 ngày thí nghiệm 49 Bảng 10 Tỉ lệ cái, khối trứng Meloidogyne spp rễ và tỉ lệ tuyến trùng di động đất bị chết sau 60 ngày thí nghiệm 50 Bảng 11 Tỉ lệ cái, khối trứng Meloidogyne spp rễ và tỉ lệ tuyến trùng di động đất bị chết sau 90 ngày thí nghiệm 51 Bảng 12 Khả đối kháng của chủng Trichoderma TN1 với chủng nấm CM3.4 và XL1.2 sau 2, 4, 6, 8, 10 ngày thí nghiệm .55 Bảng 13 Khả đối kháng của Bacillus với chủng nấm CM3.4 và XL1.2 sau 2, 4, 6, 8, 10 ngày thí nghiệm 56 Bảng 14 Khả đối kháng của chủng XL1.2 với chủng CM3.4 sau 2, 4, 6, 8, 10 ngày thí nghiệm .57 Bảng 15 Mật độ bào tử nấm P lilacinum sau bảo quản ở khoảng thời gian khác .60 iv DANH SÁCH BIỂU ĐỜ Biểu đồ Biểu đờ so sánh mật độ của nấm Purpureocillium spp pH trung bình giữa đất rừng và đất trờng tiêu .31 Biểu đồ Biểu đồ so sánh mật độ của nấm Purpureocillium spp pH trung bình giữa địa điểm phân lập khác .32 Biểu đồ Biểu đồ so sánh tỷ lệ bị ký sinh bởi chủng nấm Purpureocillium spp chọn lọc và chủng đối chứng P lilacinum NBRC 5350 (PAE), Pochonia Chlamydosporium NBRC 103141 (POC) sau 14 ngày 43 Biểu đồ Biểu đồ so sánh tỷ lệ khối trứng bị ký sinh bởi chủng nấm Purpureocillium spp và chủng đối chứng P lilacinum NBRC 5350 (PAE), Pochonia Chlamydosporium NBRC 103141 (POC) sau 14 ngày thí nghiệm 45 Biểu đồ Biểu đồ thể hiện biến thiên mật độ nấm P lilacinum theo thời gian môi trường khảo sát 59 Biểu đồ Biểu đồ thể hiện biến thiên mật độ nấm P lilacinum theo thời gian nhân nuôi chất tấm ở độ ẩm khác 60 Biểu đồ Biểu đồ thể hiện giảm mật độ nấm P lilacinum so với ban đầu theo thời gian bảo quản 61 v DANH SÁCH HÌNH Hình Cây tiêu bị vàng tuyến trùng xâm nhiễm .5 Hình Nớt sần rễ tiêu Meloidogyne incognita gây Hình Tuyến trùng Meloidogyne incognita .7 Hình Vịng đời của Meloidogyne incognita Hình Mơ hình biểu bì (cuticle) ấu trùng cảm nhiễm điển hình .9 Hình Vòng đời của vi khuẩn Pasteuria penetrans 10 Hình Đặc điểm sinh học của nấm kí sinh tuyến trùng 11 Hình Hình thái tản nấm mơi trường MEA và hình thái khuẩn ty, quan mang bào tử quan sát dưới kính hiển vi của P lilacinum 13 Hình 10 Sơ đờ lấy mẫu Vườn Q́c gia Nam Cát Tiên 20 Hình 11 Sơ đờ vị trí lấy mẫu vườn tiêu ở Đồng Nai 20 Hình 12 Sơ đờ vị trí lấy mẫu vườn tiêu ở Bình Phước .21 Hình 13 Khuẩn lạc chủng BS3.3 và chủng đới chứng P liacinum NBRC 5350 sau ngày mọc môi trường PDA .28 Hình 14 Hình thái vi thể chủng BS3.3 và chủng đối chứng P liacinum NBRC 5350 chụp dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 400 lần 29 Hình 15 Các mẫu đất thu thập ở rừng và vườn tiêu 31 Hình 16 Tuyến trùng M incognita chụp dưới kính soi ở vật kính 10X 34 Hình 17 Đường kính vòng phân giải chitin của chủng BN5, BGG7, XL1.2, BL10, HQ3.1, BGM6.1 và và chủng đối chứng PL, PC sau 96 nuôi cấy môi trường chitin .36 Hình 18 Đường kính vòng phân giải tributyrin của chủng LN6.1, BN5, CM4.1, XL1.2, LN1.3, CM1.3, LN1.2 và BL16 sau 96 mọc mơi trường cảm ứng 38 Hình 19 Đường kính vòng phân giải casein của chủng BN5, BGM6.1, CM6.3, CM3.4, BS3.3 và chủng đối chứng P lilacinum NBRC 5350 (PL), Pochonia chlamydosporia NBRC 103141 (PC) sau 96 mọc mơi trường cảm ứng 41 Hình 20 Tuyến trùng Meloidogyne sp bị xâm nhập và phá hủy bởi khuẩn ty nấm Purpureocillium sp chụp dưới kính hiển vi huỳnh quang có độ phóng đại 100 lần 43 Hình 21 Tuyến trùng Meloidogyne sp bị nấm Purpureocillium sp ký sinh chụp dưới kính soi ở vật kính 10X .43 Hình 22 Khới trứng Meloidogyne spp bị nấm Purpureocillium spp ký sinh chụp dưới kính soi ở vật kính 10X 45 Hình 23 Khới trứng Meloidogyne spp và ấu trùng J2 bị nấm Purpureocillium spp ký sinh 46 Hình 24 Cây tiêu ở nghiệm thức có chủng nấm BL10, CM3.4, XL1.2 và BGM6.1 và đối chứng sau tháng thí nghiệm 47 Hình 25 Cây tiêu sau tháng thử nghiệm nhà kínt .49 Hình 26 Rễ tiêu sau tháng thí nghiệm nhà kính 52 Hình 27 Rễ tiêu lây nhiễm tuyến trùng Meloidogyne spp và chủng nấm XL1.2 sau tháng thí nghiệm 53 Hình 28 Cây phát sinh loài của chủng CM3.4 và XL1.2 .54 vi Hình 29 Khả đới kháng của chủng Trichoderma TN1 với chủng P lilacinum CM3.4 và XL1.2 sau 4, 6, và 10 ngày thí nghiệm 56 Hình 30 Khả đối kháng của chủng Bacillus BA98 với chủng P lilacinum CM3.4 và XL1.2 sau 4, 6, và 10 ngày thí nghiệm 57 Hình 31 Khả đới kháng của chủng P lilacinum CM3.4 với chủng P lilacinum XL1.2 sau 4, 6, và 10 ngày thí nghiệm 58 Hình 32 Khả phát triển của khuẩn lạc chủng P lilacinum CM3.4 XL1.2 sau 2, 4, và 10 ngày thí nghiệm .58 vii TÓM TẮT Trong những năm gần đây, bệnh tuyến trùng Meloidogyne spp trực tiếp hay gián tiếp gây đã gây thiệt hại rất nặng nề cho việc canh tác những công nghiệp dài ngày nước ta, đặc biệt tiêu Piper nigrum L Thực tế này đã đưa vấn đề bức thiết phải tìm phương pháp phịng trừ chúng hiệu nhất mà không ảnh hưởng đến môi trường sinh thái, chất lượng nông sản và sức khỏe người Trên sở đó, đề tài “Nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne spp hồ tiêu” tiến hành Bộ sưu tập chủng nấm Purpureocillium phân lập từ mẫu đất tự nhiên (đất rừng Nam Cát Tiên và Bù Gia Mập) và đất đã qua cải tạo (đất trồng tiêu thuộc tỉnh Đờng Nai và Bình Phước) Từ 213 mẫu đất thu thập ở vườn Quốc gia Cát Tiên (43 mẫu), vườn Quốc gia Bù Gia Mập (32 mẫu), vườn tiêu ở Đồng Nai (54 mẫu) và vườn tiêu ở Bình Phước (84 mẫu), chúng tơi đã phân lập 95 chủng nấm nghi ngờ Purpureocillium lilacinum Mật độ xuất hiện của nấm Purpureocillium spp mẫu đất rừng cao so với mẫu đất trồng tiêu (trong mẫu đất rừng là 3,66 x 104 CFU/g, mẫu đất trồng tiêu là 2,38 x 104 CFU/g) Mật độ bào tử của nấm Purpureocillium spp tập trung nhiều nhất ở vườn Quốc gia Bù Gia Mập (5,07 x 104 CFU/g đất), tiếp đến là vườn tiêu ở Đồng Nai (3,35 x 104 CFU/g đất), vườn tiêu ở Bình Phước (2,04 x 104 CFU/g đất) và cuối là ở vườn Quốc gia Cát Tiên (1,49 x 104 CFU/g đất) Bào tử nấm Purpureocillium spp tồn đất tự nhiên và đất đã qua cải tạo ở độ pH từ đến 7, nhiên tập trung nhiều nhất ở khoảng pH từ 5,87 đến 6,29 Kết thử nghiệm định tính hệ enzyme ngoại bào (chitinase, protease và lipase), nhóm nghiên cứu chọn 10 chủng nấm tới ưu là BS3.3, BL10, BL16, XL1.2, CM3.4, CM6.3, BN5, BGM6.1, LN1.2 và HQ5.1 Thí nghiệm sàng lọc chủng nấm có khả kí sinh trứng và Meloidogyne spp đĩa Petri từ 10 chủng cho thấy chủng nấm BL10, XL1.2, CM3.4, BGM6.1 có khả ký sinh kí chủ cao nhất Kết cho thấy chủng nấm có khả ký sinh nhanh so với ký sinh khối trứng, khả ký sinh tuyến trùng của chủng nấm tương quan với khả tiết enzyme ngoại bào Các thử nghiệm cho thấy chủng nấm BL10, XL1.2, CM3.4, BGM6.1 khơng gây bệnh cho tiêu, đó, chủng XL1.2, CM3.4 có khả làm giảm 70% và trứng Meloidogyne spp rễ tiêu trồng nhà kính chủng nấm này xác định là Purpureocillium lilacinum kỹ thuật sinh học phân tử Trước năm 2011, Purpureocillium lilacinum có tên Paecilomyces lilacinus và chính là chủng nấm mục tiêu nghiên cứu này Chủng XL1.2 chọn làm đại diện để nghiên cứu quy trình sản xuất chế phẩm nấm phịng trừ tuyến trùng Quy trình sản x́t gờm giai đoạn chính: nhân sinh khối lỏng, nhân sinh khối bán rắn và bảo quản sinh khối sau thu hoạch Kết quả, nấm P lilacinum phát triển và tạo bào tử nhiều nhất sau ngày nuôi cấy CDB, lắc 200250 v/p Sinh khới sau lên men chìm chủng vào chất bán rắn tấm ở độ ẩm 40% nấm tạo bào tử nhiều nhất sau 7-8 ngày Sinh khối nấm phơi khô, nghiền mịn và phới trộn với zeolit mật độ bào tử sau tháng bảo quản là 2,7.106 CFU/g (mật độ ban đầu là 5,2.108 CFU/g) Thử nghiệm in vitro cho thấy sử dụng kết hợp chế phẩm chứa chủng nấm này với chế phẩm BIMA (chứa bào tử chủng Trichoderma TN1) để tăng tính hiệu việc phịng trừ dịch bệnh tổng hợp viii I THƠNG TIN CHUNG VỀ ĐỀ TÀI Tên đề tài: Nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne spp hồ tiêu (Mã số: VS02/13-15) Cơ quan quản lý: Trung tâm Công nghệ Sinh học TP.HCM Địa chỉ: 176 Hai Bà Trưng, Phường Đakao, Quận 1, TP.HCM Điện thoại: 08 38 22 52 02 Đơn vị chủ trì: Phịng CN Vi sinh - Trung tâm Công nghệ Sinh học TP.HCM Địa chỉ: Km 1900 Quốc lộ 1A – Phường Trung Mỹ Tây – Quận 12 - TP.HCM Điện thoại: 08 37 15 96 82 Cơ quan phối hợp chính: Viện Sinh Học Nhiệt Đới TP.HCM Chủ nhiệm đề tài: ThS Lê Thị Mai Châm Cán bộ/Nhóm thực hiện: ThS Lê Thị Mai Châm, KS Lê Thị Thùy Nhi, KS Vũ Thùy Dương Thời gian thực hiện: 30 tháng (Từ 1/2013 đến 6/2015) Kinh phí duyệt: 380.000.000 VNĐ Kinh phí đã xử dụng: 380.000.000 VNĐ 10 Các nội dung nghiên cứu đã thực hiện so với đề cương đăng ký STT Nội dung Thời gian (bắt đầu – kết thúc) Kết thực hiện tháng (1/2013 – 7/2013) Phân lập 95 chủng nấm nghi ngờ Purpureocillium lilacinum tháng (8/2013 – 10/2013) - Đã tách tuyến trùng (con di động, cái, Đánh giá (đạt/không đạt) Nội dung 1: Phân lập chủng nấm thuộc chi Purpureocillium ở vùng Đông Nam Bộ Việt Nam Đạt Nội dung 2: Tách, nhân nuôi thu nhận tuyến trùng Đạt trồng khỏi Fusarium oxysporum gây bệnh thối rễ (Suseela Brai, 2009), đối kháng với nấm Aspergillus flavus Rhizoctonia sp (Subhash, 1993),…Do đó, tạm kết luận nấm Trichoderma TN1 khơng đối kháng với Purpureocillium spp mà cạnh tranh không gian và dinh dưỡng môi trường CM3.4 NGÀY NGÀY NGÀY 10 NGÀY XL1.2 Hình 28 Khả đối kháng của chủng Trichoderma TN1 với chủng P lilacinum CM3.4 và XL1.2 sau 4, 6, và 10 ngày thí nghiệm Bảng 13 Khả đối kháng của Bacillus với chủng nấm CM3.4 và XL1.2 sau 2, 4, 6, 8, 10 ngày thí nghiệm Thời gian Tỉ lệ ức chế Trichoderma với chủng TBB CM3.4 XL1.2 A1 A2 e 3,59 0,00e 1,795C B1 13,11d 35,76b 19,92B B2 27,89c 11,96d 24,43B B3 a a 44,83 44,25 44,54A B4 49,92a 47,29a 48,61A B5 27,869 27,849 TBA ** ns ** FTN 72,87 ; F(A) 0,00 ; F(B) 144 ; F(A.B) 19,4** ; CV 13,99 % Ghi chú: - Yếu tố A1, A2 giống CM3.4, XL1.2 Yếu tố B1, B2, B3, B4, B5 thời gian 2, 4, 6, 8, 10 ngày thí nghiệm - Phân hạng theo LSD0,05, ns: P > 0,05, *: 0,01 < P < 0,05 **: P < 0,01 - Trong cột, giá trị trung bình có mẫu tự khơng có khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê - Phân hạng mức yếu tố (chữ in hoa) phân hạng nghiệm thức (chữ thường) Khi đồng nuôi cấy Purpureocillium spp với chủng Bacillus BA98 đĩa Petri chứa môi trường PDA thấy Bacillus ức chế dưới 50% phát triển của chúng sau 10 ngày Thời gian đầu, phát triển của Bacillus không ảnh hưởng nhiều đến phát triển 56 của nấm Purpureocillium spp Thời gian nuôi cấy tăng dần, Bacillus tiết chất có hoạt tính kháng nấm nhiều làm ức chế phát triển của sợi nấm Purpureocillium spp làm cho khuẩn lạc nấm phát triển không đều, bị lệch tâm (hình 29) Tuy nhiên, chất kháng nấm này không gây nên hiện tượng tiêu hủy sợi nấm thí nghiệm trước Khi đồng nuôi cấy chủng Bacillus BA98 và nấm Phomosis vexan Fusarium solani đĩa Petri, thời gian nuôi cấy càng kéo dài sợi nấm bị phân hủy (Lê, 2013) CM3.4 NGÀY NGÀY NGÀY 10 NGÀY XL1.2 Hình 29 Khả đới kháng của chủng Bacillus BA98 với chủng P lilacinum CM3.4 và XL1.2 sau 4, 6, và 10 ngày thí nghiệm Các chủng Purpureocillium spp không đối kháng lẫn nuôi cấy chung Do đó, sau 2, 4, ngày đờng nuôi cấy chủng CM3.4 và XL1.2 đĩa Petri chứa môi trường PDA, khuẩn lạc chủng nấm này phát triển bình tường tạo thành dạng trịn đều Sau 8, 10 ngày ni cấy tỉ lệ ức chế phát triển lẫn của chúng là 16,38 và 22,39; nhiên, ức chế lẫn này hoạt động của hợp chất kháng nấm tiết và hoạt động thủy phân sợi nấm của enzyme ngoại bào Sự ức chế phát triển này là không gian chật hẹp, sợi nấm phát triển đến hết khơng gian dừng lại giống sợi nấm phát triển đến mép đĩa Petri thi dừng lại Do đó, kết luận chủng nấm CM3.4 không ức chế phát triển của chủng XL1.2 Bảng 14 Khả đối kháng của chủng XL1.2 với chủng CM3.4 sau 2, 4, 6, 8, 10 ngày thí nghiệm Thời gian (ngày) ngày ngày 10 ngày Khả đối kháng CM3.4 với XL1.2 0,00C 0,00C 0,00C 16,38B 22,39A FTN 5958** CV 3,133 % 57 Phân hạng theo LSD0,05, ns: P > 0,05, *: 0,01 < P < 0,05 **: P < 0,01 Hình 30 Khả đới kháng của chủng P lilacinum CM3.4 với chủng P lilacinum XL1.2 sau 4, 6, và 10 ngày thí nghiệm Hình 31 Khả phát triển của khuẩn lạc chủng P lilacinum CM3.4 XL1.2 sau 2, 4, và 10 ngày thí nghiệm Tóm lại, kết hợp chủng P lilacinum CM3.4 XL1.2 chế phẩm và sử dụng chế phẩm nấm phòng trừ tuyến trùng với chế phẩm BIMA chứa chủng Trichoderma TN1 để phòng trừ bệnh tuyến trùng, cụ thể là tuyến trùng Meloidogyne spp gây trồng nói chung và tiêu nói riêng Sự kết hợp P lilacinum với Trichoderma để phòng trừ phức hợp tuyến trùng Meloidogyne incognita Fusarium solani gây trồng Khan và cộng thực hiện năm 1997 5.9 Quy trình nhân xử lý sinh khối nấm P lilacinum 5.9.1 Kết nhân sinh khối lỏng nấm P lilacinum Chế phẩm nấm phòng trừ tuyến trùng chứa bào từ chủng nấm CM3.4 và XL1.2 Vì chủng nấm CM3.4 và XL1.2 khơng ức chế phát triển của nuôi cấy chung và phát triển của chủng nấm này mơi trường thạch khơng có khác biệt nhiều, đờng thời có nhiều khó khăn việc phân biệt khuẩn lạc chủng nấm này nên chọn chủng đại diện (chủng XL1.2) để thử nghiệm nhân sinh khối bảo quản 58 Log10(mật độ) Sự biến thiên mật độ P lilacinum nhân nuôi môi trường lỏng khác 14 12 10 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Thời gian (giờ) Môi trường SDAY3 Môi trường CAM Môi trường CDB Môi trường PDB Biểu đồ Biểu đồ thể hiện biến thiên mật độ nấm P lilacinum theo thời gian môi trường khảo sát Kết thử nghiệm nhân sinh khối lỏng cho thấy nấm P lilacinum tạo bào tử nhiều nhất môi trường CDB và nhất môi trường SDAY3 Ở 24 và 48 đầu, mật độ bào tử nấm đạt môi trường SDAY3 là cao nhất, tiếp đến là CAM và nhất là môi trường CDB Ở 72 đến 96 giờ, có thay đổi đáng kể mật độ bào tử nấm môi trường PDB đạt cao nhất và nhất môi trường SDAY3 Ở 120 giờ, mật độ nấm P lillacinum tiếp tục tăng dần nhân nuôi tất loại môi trường khảo sát, đạt cao nhất môi trường CDB và thấp nhất môi trường SDAY3 Khi thời gian nuôi cấy tăng lên 144 mật độ giảm dần ở tất loại môi trường khảo sát (biểu đồ ) Vậy, nuôi cấy nấm P lilacinum môi trường lỏng điều kiện lăc 200 v/p mật độ nấm đạt cao nhất 5,35.1011 CFU/g ở 120 đối với môi trường CDB (phụ lục) 5.9.2 Kết nhân sinh khối bán rắn nấm P lilacinum Có nhiều chất dùng trình lên men ban rắn vi nấm Daisy Leena cộng (2003) đã sử dụng bánh dầu từ đậu nành, dừa, để lên men bán rắn P lilacinum Sau lên men, mật độ nấm đều đạt 1010 CFU/g Bánh dầu dừa Sahayaraj và cộng (2008) chứng minh phù hợp cho trình nhân sinh khối nấm kí sinh côn trùng Ngoài ra, nhóm của ơng xác định hạt bo bo, bột hạt mít, bột cà rốt thích hợp cho phát triển và tạo bào tử của nhóm nấm này Thet và cộng (2012) đã sử dụng gạo, lúa mì, lúa mì đen, bắp, bo bo để nhân sinh khới bán rắn nấm P lilacinum và thấy mật độ nấm đạt cao nhất chất bo bo (5,3.1011 CFU/g), là gạo (3,99 1011 CFU/g) Tuy nhiên, tiến hành thử nghiệm sơ thấy nhân nuôi bánh dầu rất dễ bị nhiễm Và hạt bo bo có giá đắt, khó tìm ng̀n cung ứng Do đó, để đảm bảo khơng bị tạp nhiễm q trình nhân ni chúng tơi chọn chất tấm cho thử nghiệm này Việc xác định độ ẩm phù hợp cho q trình nhân ni rất cần thiết Khi nhân nuôi bán rắn chất tấm, mật độ nấm P lilacinum đạt 59 cao Sau ngày, nấm đạt mật độ 108 CFU/g ở tất độ ẩm chất khảo sát Khi thời gian ni cấy tăng dần mật độ nấm tăng dần tương ứng với tất độ ẩm của tấm Mật độ nấm đạt sau ngày chất tấm cao so với nhóm Thet và cộng Và nấm đạt mật độ cực đại ở mốc thời gian ngày (1014 CFU/g), sau giảm dần Có thể thấy nấm P lilacinum phát triển và tạo bào tử ở độ ẩm chất từ 30-50% Tuy nhiên, độ ẩm chất thích hợp nhất là 40% Khi nấm P lilacinum nhân ni điều kiện này bào tử đạt cực đại sau 7-8 ngày (7,03.1014 - 7,24.1014 CFU/g) (phụ lục) Log10(mật độ) Sự biến thiên mật độ P lilacinum nhân nuôi tấm ở độ ẩm khác 16 15 14 13 12 11 10 Độ ẩm 30% Độ ẩm 40% Thời gian (ngày) 10 Độ ẩm 50% Biểu đồ Biểu đồ thể hiện biến thiên mật độ nấm P lilacinum theo thời gian nhân nuôi chất tấm ở độ ẩm khác 5.9.1 Kết bảo quản sinh khối nấm P lilacinum sau thu hoạch Bảng 151 Mật độ bào tử nấm P lilacinum sau bảo quản ở khoảng thời gian khác Mật độ bào tử sau bảo quản (tháng) (CFU/g) Chất mang DC 2,2.1011 1,8.1010 6,0.109 4,8.109 5,2.108 5,2.108 TB 4,2.1010 Diatomide 1,9.108 4,6.107 3,5.107 1,1.107 7,4.106 2,9.106 8,4.102 4,2.107 Zeolite 5,2.108 1,3.108 6,9.107 6,5.107 5,3.107 2,5.107 2,7.106 1,2.108 7,4.1010 6,1.109 2,1.109 1,6.109 1,9.108 1,8.108 9,1.105 TB FTN 70.76**; F(A) 386.13**; F(B) 69.28**; F(A.B) 8.58** ; CV 4.94% Phân hạng theo LSD0,05, ns: P > 0,05, *: 0,01 < P < 0,05 **: P < 0,01 Sau nhân nuôi P lilacinum bán rắn, sinh khối nấm thu phơi khô, nghiền mịn rồi phối trộn với chất mang Yêu cầu của chất mang dùng để bảo quản vi 60 sinh vật là chất trơ, giữ mật độ bào tử (tế bào) vi sinh vật, rẻ tiền, dễ tìm ng̀n cung cấp,…Một số chất mang thường sử dụng bảo quản sinh khới nấm là: bột mì, bột cám, mùn cưa, diatomide, zeolit, than bùn,…Tuy nhiên, sớ lí khách quan, chọn diatomide và zeolite để bảo quản sinh khối nấm Sau – tháng bảo quản, tỉ lệ nảy mầm của sinh khối nấm giữ diatomide là cao nhất Tuy nhiên, từ tháng thứ đến tháng thứ 6, tỉ lệ nảy mầm của bào tử nấm giữ zeolit là cao hơn, đặc biệt ở tháng thứ 6, mật độ nấm hỗn hợp này là 2,7.106 CFU/g, cao rất nhiều so với chất mang diatomide (8,4.102 CFU/g) Trong đó, đối với đối chứng (không sử dụng chất mang q trình bảo quản) mật độ bào tử có tốc độ giảm rất nhanh Tỷ lệ Sự biến thiên mật độ P lilacinum theo thời gian bảo quản 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 DC Diatomide Thời gian (tháng) Zeolite Biểu đồ Biểu đồ thể hiện giảm mật độ nấm P lilacinum so với ban đầu theo thời gian bảo quản Như vậy, quy trình sản xuất chế phẩm nấm phịng trừ tuyến trùng sau: Giớng P lilacinum giữ ở 4-50C Cấy truyền lần qua môi trường PDA Nhân sinh khối môi trường CDB 25±30C Chuẩn bị môi trường CDB Lắc 200-250 v/p Nhân sinh khối bán rắn tấm Phơi, nghiền Phối trộn với zeolit 61 Hấp 1210C, 15 phút Tấm VI KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 6.1 Kết luận - - - - - - Đã phân lập 95 chủng nấm nghi ngờ thuộc chi Purpureocillium từ 213 mẫu đất thu thập được, có 11 chủng có ng̀n gớc từ VQG Cát Tiên, 17 chủng từ VQG Bù Gia Mập, 18 chủng từ vườn tiêu thuộc tỉnh Đồng Nai chủng cịn lại có ng̀n gớc từ vườn tiêu tỉnh Bình Phước Sau thí nghiệm định tính hệ enzyme ngoại bào (chitinase, protease lipase), chọn lọc 10 chủng nấm BS3.3, BL10, BL16, XL1.2, CM3.4, CM6.3, BN5, BGM6.1, LN1.2 HQ5.1 Chọn lọc chủng nấm BL10, XL1.2, CM3.4, BGM6.1 có khả kí sinh trứng Meloidogyne spp hiệu đĩa Petri Các chủng nấm BL10, XL1.2, CM3.4, BGM6.1 không gây bệnh cho tiêu Trong đó, chủng CM3.4 XL1.2 có khả làm giảm 70% trứng tuyến trùng Meloidogyne spp rễ tiêu trồng nhà kính Và chủng nấm vào đất trờng tiêu trước ngày lây nhiễm tuyến trùng cho hiệu phịng trừ tớt nhất Kết định danh sinh học phân tử cho thấy chủng nấm CM3.4 XL1.2 Purpureocillium lilacinum (Paecilomyces lilacinus), chủng nấm mục tiêu để chọn nghiên cứu Chủng Trichoderma TN1 đối kháng với nấm P lilacinum CM3.4 XL1.2 chế cạnh tranh không gian, chủng CM3.4 XL1.2 không ức chế phát triển của điều kiện phịng thí nghiệm, đó, kết hợp chủng nấm CM3.4 XL1.2 chung chế phẩm nấm Và sử dụng kết hợp chế phẩm chứa bào tử chủng nấm với chế phẩm BIMA để việc phòng trừ dịch bệnh tớt Quy trình sản x́t chế phẩm nấm P lilacinum thực hiện qua giai đoạn: nhân sinh khối lỏng môi trường CDB ngày (bổ sung 10% giống đầu vào với mật độ 107 CFU/ml), canh trường nuôi cấy chứa 5,35.1011 CFU/ml bổ sung vào chất bán rắn tấm để nhân sinh khối bán rắn 7-8 ngày (mật độ bào tử đạt 7,03.1014 - 7,24.1014 CFU/g Sinh khối thu sau lên men bán rắn phơi khô, nghiền phới trộn với zeolit tỷ lệ nảy mầm của bào tử đảm bảo (2,7.106 CFU/g sau tháng bảo quản) 6.2 Đề nghị - - Số liệu thí nghiệm khảo sát hoạt lực của nấm tuyến trùng Meloidogyne spp hại tiêu nhà kính hầu hết khơng có khác biệt về mặt thớng kê chúng tơi khơng kiểm sốt độ đờng đều của tiêu thí nghiệm Do đó, cần phải thực hiện lại thí nghiệm này để xác định hiệu của nấm việc phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne spp hại tiêu Trong quy trình nhân sinh khới nấm P lilacinum, đối với giai đoạn nhân sinh khối bán rắn, mật độ nấm đạt cao sau 7-8 ngày nhân nuôi Tuy nhiên, tỷ lệ nảy mầm của bào tử thu giảm nhanh trình bảo quản, cần phải xác định thời gian thu sinh khới thích hợp để bào tử giữ hoạt tính sinh học tớt Đờng thời, cần phải nghiên cứu hỗn hợp dinh dưỡng bổ sung vào 62 - q trình nhân sinh khới bán rắn nấm chất tấm để tăng cường khả nảy mầm hoạt tính sinh học của nấm sau nảy mầm Nghiên cứu quy trình sản xuất chế phẩm nấm phòng trừ bệnh tổng hợp chứa bào tử Trichoderma P lilacinum Thực hiện thí nghiệm kiểm tra kết hợp của Trichoderma với nấm P lilacinum việc kiểm soát bệnh tuyến trùng Meloidogyne spp gây hai tiêu nhà kính để xác định tương hỗ lẫn của loại nấm việc phòng trừ bệnh VIII TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Đỗ Trung Bình, 2013 Sản x́t hờ tiêu hữu Hội nghị khách hàng ngành Hồ tiêu TP HCM Viện KHKT Nông nghiệp miền Nam, 14 trang Lê Thị Mai Châm, Phạm Hữu Nhượng, 2013 Phân lập tác nhân gây bệnh chọn lọc chủng Bacillus spp có khả đối kháng tốt với tác nhân gây bệnh lở cổ rễ cà tím thành phố Hồ Chí Minh Luận văn thạc sỹ, trường khoa học tự nhiên TP HCM Nguyễn Ngọc Châu, Nguyễn Vũ Thanh, 1991 Kết bước đầu nghiên cứu phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne ở hồ tiêu Những thành tựu KHKT đưa vào sản xuất 1, TT KHTN&CNQG, Hà Nội, 11-16 Trần Thị Thu Hà và Nguyễn Tăng Tôn, 2011 Nghiên cứu thành phần và mật số tuyến trùng gây hại hồ tiêu Cam Lộ, Quảng Trị Tạp chí khoa học Đại học Huế, 67: 5-12 Dương Đức Hiếu, Phan Thị Hồng Thủy, Nguyễn Vũ Thanh, 2010 Phòng trừ tuyến trùng gây bướu rễ (Meloidogyne sp.) hồ tiêu chế phẩm từ phân ủ bánh dầu Neem (Azadirachta indica A.Juss) Tạp chí Bảo vệ thực vật Dương Đức Hiếu, Bùi Thị Thu Nga, Trần Thị Diễm Thúy, Nguyễn Thị Minh Phương, Ngô Thị Xuyên, 2012 Bước đầu nghiên cứu sử dụng tuyến trùng đánh giá chất lượng đất vùng trồng tiêu xã Lộc Hưng, hụn Lộc Ninh, tỉnh Bình Phước Tạp chí Khoa học Phát triển, 10 (6): 653-661 Lê Tấn Hưng, Võ Thị Hạnh, Lê Thị Bích Phượng, Trần Thạnh Phong, Trương Thị Hồng Vân và Somsak Sivichai, 2010 Nấm côn trùng vườn quốc gia Cát Tiên: Nguồn tài nguyên quý cho ứng dụng sinh học Hội nghị Khoa học kỷ niệm 35 năm Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam - Hà Nội, 10 trang Lê Hữu Phước, 2009 Phân lập chọn môi trường nhân sinh khối ba lồi nấm ký sinh trùng Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok, Beauveria bassiana (Bals.) Vuill Purpureocillium lilacinum nhóm rau ăn đồng bằng sông Cửu Long Đề tài cấp trường Đại học An Giang Trần Duy Thảo, 2009 Beauveriolide I, Cyclopeptide từ nấm ký sinh côn trùng (Paecilomyces lilacinus (Thom) Samson) Nghệ An Luận văn thạc sĩ hóa học Trường đại học Vinh 63 10 Nguyễn Tăng Tôn 2005 Nghiên cứu giải pháp khoa học công nghệ thị trường để phát triển vùng hồ tiêu nguyên liệu phục vụ chế biến xuất Đề tài cấp nhà nước, 103 - 111 11 Nguyễn Vĩnh Trường, Trần Thị Thu Hà, Trần Thị Nga, Trường Thị Diệu Hanh, 2013 Xây dựng chuyển giao quy trình quản lý tổng hợp bệnh chết nhanh hồ tiêu ở Quảng Trị Trường Đại học Nông Lâm Huế Sở Khoa học Công nghệ tỉnh Quảng Trị, trang 21 12 Trịnh Thị Thu Thuỷ, Lê Tường Tề, De Waele và Nguyễn Thị Yến, 2007 Nghiên cứu biến động số lượng quần thể tuyến trùng nốt sưng Meloidogyne spp hại hồ tiêu ở miền Trung và Tây Nguyên Tạp chí Bảo vệ Thực vật, trang 13 Ngô Thị Xuyên, 2000 Nghiên cứu đặc điểm sinh học khả phòng chống tuyến trùng nốt sưng Meloidogyne incognita (Kofoid et white, 1919/Chitwood, 1949) số trồng vùng Hà Nội phụ cận Luận án tiến sĩ Trường đại học Nông nghiệp I Hà Nội 14 VPA., 2015 Hiệp hội Hồ tiêu Việt Nam. Tài liệu tiếng Anh 15 Abad P et al., 2008 Genome sequence of the metazoan plant-parasitic nematode Meloidogyne incognita Nature Biotechnology, 26 (8): 909-915 16 Abbott W S., 1925 A method of computing the effectiveness of an insecticide J Econ Entomol., 18: 265-267 17 Amala U., Jiji T and Naseema A., 2010 Laboratory evaluation of local isolate of entomopathogenic fungus, Paecilomyces lilacinus Thom Samson (ITCC 6064) against adults of melon fruit fly, Bactrocera cucurbitae Coquillett (Diptera; Tephritidae) Journal of Tropical Agriculture, 51 (1-2): 132-134 18 Angelo C.I et al., 2012 Virulence of Isaria sp and Purpureocillium lilacinum to Rhipicephalus microplus tick under laboratory conditions Parasitol Res., 111: 1473-1480 19 Araújo M.J., Braga R.F., Araújo V.J., Soares E.F.F and Geniêr L.A.H., 2010 Biological control of Taenia saginata eggs Helminthologia, 47 (3): 189-192 20 Agrawal P.K., Lal B., Wahab S., Srivastava O.P and Misra S.C., 1979 Orbital paecilomycosis due to Paecilomyces lilacinus (Thom) Samson Sabouraudia, 17: 363-370 21 Basualdo A.J., Ciarmela L.M., Sarmiento L.P and Minvielle C.M., 2000 Biological activity of Paecilomyces lilacinus genus againt Toxocara canis eggs Parasitol Res., 86: 854-859 22 Bird A.R., 1971 The Structure of Nematodes Academic Press, 323 pages 23 Bird A.R., 1991 The Structure of Nematodes Academic Press, Inc., pp 7-292 24 Bonants J.M.P., Fitters F.L.P., Thijs H., Belder D.E., Waalwijk C and Henflin J.W.D.M., 1995 A basic serine protease from Paecilomyces lilacinus with biological activity against Meloidogyne hapla eggs Microbiology, 141: 775-784 64 25 Bhai S.R., Remya B., Danesh J and Eapen J.S., 2009 In vitro and in planta assays for biological control of Fusarium root rot disease of vanilla BioI Control, 23 (1): 83-86 26 Burgess L.W., Knight T.E., Tesoriero L and Phan H.T., 2008 Diagnosticmanual for plant diseases in Vietnam ACIAR Monograph, pp 188 27 Cartwright K.D and Benson M.D., 1995 Optimization of Biological Control of Rhizoctonia Stem Rot of Poinsettia by Paecilomyces lilacinus and Pseudomonas cepacia Plant Disease The American Phytopathological Society, 79 (3): 301308 28 Chen G P., Chan T S L., Sing K W., lily E., Make J., Franklin R K., Zakry F AB A., Osumanu H A and Nik M M, 2012 Isolation of Indigenous Strains of Paecilomyces lilacinus with Antagonistic Activity against Meloidogyne incognita International journal of agriculture & Biology: 1560–8530 29 Ciancio A., Mukerji K.G., 2008 Integrated Management and Biocontrol of Vegetable and Grain Crops Nematodes 30 Curtis H.C.R., Jones T.J., Davies D.K., Sharon E and Spiegel Y., 2009 Chapter Plant Nematode Surfaces In Biological Control of Plant-Parasitic Nematodes:Building Coherence between Microbial Ecology and Molecular Mechanisms Davies K and Spiegel Y Progress in Biological Control 11 Springer Science, pp 115-144 31 Daisy Leena S M Easwaramoorthy, 2003 In vitro production of entomopathogenic fungi Paecilomyces farinosus (hotmskiold) and Paecilomyces lilacinus (Thom.) Samson using byproducts of sugar industry and other agro-industrial byproducts and wastes Sugar Tech, (4): 231-236 32 Davies K.G., 2009 Understanding the interaction between an obligate hyperparasitic bacterium, Pasteuria penetrans, and its obligate plant parasitic host, Meloidogyne spp., Advances in Parasitology, 211-245 33 Demirci F and Denizhan E., 2010 Paecilomyces lilacinus, a potential biocontrol agent on apple rust mite Aculus schlechtendali and interactions with some fungicides in vitro Phytoparasitica, 38: 125-132 34 Dong L.Q., Yang J.K and Zhang K.Q., 2007 Cloning and phylogenetic analysis of the chitinase gene from the facultative pathogen Paecilomyces lilacinus Microbiology, 103: 2476-2488 35 Eisenback J.D., 1985 Chapter Detailed Morphology And Anatomy Of SecondStage Juveniles, Males, And Females Of The Genus Meloidogyne (Root-Knot Nematodes) In An Advanced treatise on Meloidogyne Vol I Biology and Control Sasser J.N and Carter C.C North Carolina State University Graphics, Raleigh, NC., pp 47-78 65 36 Eisenback J.D and Hunt J.D., 2009 General Morphology In Root-knot Nematodes Perry N R., Moens M and Starr L.J CAB International, pp 18-23 37 EFSA, 2007 Conclusion regarding the peer review of the pesticide risk assessment of the active substance Paecilomyces lilacinus strain 251 Scientific Report, 103: 1-35 38 Elbandy M., 2009 α-Pyrones and Yellow Pigments from the Sponge-Derived Fungus Paecilomyces lilacinus Bull Korean Chem Soc 30(1): 188-192 39 Fiedler Z and Sosnowska D., 2010 Nematophagous fungus Paecilomyces lilacinus (Thom) Samson is also a biological agent for control of greenhouse insects and mite pests BioControl, 52: 547-558 40 Gams W and Zare R., 2003 A Taxonomic Review of the Clavicipitaceous Anamorphs Parasitizing Nematodesand Other Microinvertebrates In Clavicipitalean Fungi volutionary biology, chemistry, biocontrol and cultural impacts White J.F.J., Bacon C.W., Hywel-Jones N.L and Spatafora J W Marcel Dekker, Inc., New York, pp 17-73 41 Gaspard J.T., Jaffee A., and Ferris H., 1990 Association of Verticillium chlamydosporium and Paecilomyces lilacinus with Root-knot Nematode Infested Soil Journal of Nematology, 22 (2): 207-213 42 Gupta C.S., Leathers D.T and Wicklow T.D., 1993 Hydrolytic enzymes secreted by Paecilomyces lilacinus cultured on sclerotia of Aspergillus flavus Appl Microbiol Biotechnol, 39: 99-103 43 Hallmann J., Davies G.K and Sikora R., 2009 Biological Control Using Microbial Pathogens, Endophytes and Antagonists In Root-knot Nematodes Perry N R., Moens M and Starr L.J CAB International, pp 380-401 44 Holland R.J., Williams, K.L and Nevalainen K.M.H., 2003 Paecilomyces lilacinus strain Bioact 251 is not plant endophyte Australasian Plant Patholog 37:473-478 45 Hunt D.J., Handoo Z.A., 2009 Taxonomy, identification and principal species In: Perry R.N., Moens M., Starr J.L (Eds.) Root-knot Nematodes CABI International, Cambridge, MA 46 Izumitsu K., Hatoh K., Sumita T., Kitade Y., Morita A., Gafur A., Ohta A., Kawai M., Yamanaka T., Neda H., Ota Y., Tanaka C., 2012 Rapid and simple preparation of mushroom DNA directly from colonies and fruiting bodies for PCR Mycoscience, 53 (5), p396 47 Jatala P., Tenbach K.R., and Bocangel M., 1979 Biological control of Meloidogyne incognitaacrita and Globodera pallida on potatoes Journal Of Nematology, 11: 303 48 Jennifer L., Jos H., Tineke V D., Seung B H., Andrew M B., Nigel L H.-J and Robert A.S., 2011 Purpureocillium, a new genus for themedically important Paecilomyces lilacinus, Research letter, 321: 141 - 149 66 49 Jersys A., Leopoldo H – D., Irene M., Janaína F S., José M C C., Regina M D.G C, Myrian S T., 2009 Cultural and morphological characterization of Pochonia chlamydosporia NBRC 103141and Lecanicillium psalliotae isolated from Meloidogyne mayaguensis eggs in Brazil, Tropical Plant Pathology 34, 158-163 50 Khalil S.M., Kenawy A., Gohrab A.M and Mohammed E.E., 2012 Impact of microbial agents on Meloidogyne incognita management andmorphogenesis of tomato JBiopest., (1): 28-35 51 Khan A., Williams L.K and Nevalainen K.M.H., 2003 Testing the nematophagous biological control strain Paecilomyces lilacinus 251 for paecilotoxin production FEMS Microbiology Letters, 227: 107-111 52 Khan A., Williams L.K and Nevalainen K.M.H., 2004 Effects of Paecilomyces lilacinus protease and chitinase on the eggshell structures and hatching of Meloidogyne javanica juveniles Biological Control, 31: 346-352 53 Khan A., Williams L.K and Nevalainen K.M.H., 2006 Infection of plantparasitic nematodes by Paecilomyces lilacinus and Monacrosporium lysipagum BioControl, 51: 659-678 54 Kiewnick S., Sikora R.A., 2006 Biological control of the root-knot nematode Meloidogyne incognita by Paecilomyces lilacinus strain 251 Biological Control, 38: 179–187 55 Kumar A.G and Ramya V., 2014 Compatibility Of Rochemical With Entomopathogenic Fungi (Paecilomyces lilacinus) - A Biological Nematicide Global Biosciences, (2): 406-410 56 Luangsa-ard J., Houbraken J., Doorn V.T., Hong S.B., Borman M.A., HywelJones L.N and Samson A.R., 2013 Purpureocillium, a new genus for the medically important Paecilomyces lilacinus Federation of European Microbiological Societies Microbiol Lett., 321: 141-149 57 Mankau R and Sitanath D., 1969 The influence of chitin amendments on Meloidogyne incognita Nematology (Abstr.), (1): 15-16 58 Marti A.G., Lopez Lastra C.C., Pelizza A.S and Garcıa J.J., 2006 Isolation of Paecilomyces lilacinus (Thom) Samson (Ascomycota: Hypocreales) from the Chagas disease vector, Triatoma infestans Klug (Hemiptera: Reduviidae) in an endemic area in Argentina Mycopathologia, 162: 369-372 59 Mitchell D.J., Kannwischer-Mitchell M.E and Dickson D.W., 1987 A Semiselective Medium for the Isolation of Paecilomyces lilacinus from Soil Journal of Nematology, 19 (2): 255-256 60 Moens M., Perry N.R., and Starr L.J., 2009 Meloidogyne species - a diverse group of novel and important plant parasites In Root-knot Nematodes Perry N R., Moens M and Starr L.J CAB International, pp 3-6 67 61 Moosavi M.R and Zare R., 2012 Chapter Fungi as Biological Control Agents of Plant-Parasitic Nematodes In Plant Defence: Biological Control Vol Mérillon J.M và Ramawat K.G Progress in Biological Control Springer Science, pp 67-107 62 Monfort E.l., Lopez-Llorca V.L., Jansson B.H and Salinas J., 2006 In vitro soil receptivity assays to egg-parasitic nematophagous fungi Mycol Progress, 5: 1823 63 Morgan-Jones G., White J F and Rodriguez-Kabana R., 1984 Phytonematode pathology: ultrastructural studies I Parasitism of Meloidogyne arenaria eggs by Paecilomyces lilacinus Nematropica, 14 (1): 57-71 64 Mukhtar T., Hussain M.A and Kayani M.Z., 2013 Biocontrol potential of Pasteuria penetrans, Pochonia chlamydosporia, Paecilomyces lilacinus and Trichoderma harzianum against Meloidogyne incognita in okra Phytopathologia Mediterranea, 52 (1): 66-76 65 Mustafa, Uzma, Kaur and Gurvinder, 2010 Studies on extracellular enzyme production in Beauveria bassiana isolates International Journal of Biotechnology and Biochemistry, 12 pages 66 Ornat C and Sorribas F.J., 2008 Integrated Management Of Root-Knot Nematodes In Mediterranean Horticultural Crops In Integrated Management Biocontrol of Vegetable and Grain Crops Nematodes Ciancio A and Mukerji K.G Springer, pp 295-319 67 Orion D and Kritzman G., 1991 Antimicrobial activity of Meloidogyne javanica gelatinous matrix Nematologica, 14 (4): 481-483 68 Ottow J.C.G., 1972 Rose Bengal as a Selective Aid in the Isolation of Fungi and Actinomycetes from Natural Sources Mycologia, 64 (2): 304-315 69 Pau G.C et al., 2012 Isolation of Indigenous Strains of Paecilomyces lilacinus with Antagonistic Activity against Meloidogyne incognita International Journal Of Agriculture and Biology, 14: 197-203 70 Pendse M.A., Karwande P.P and Limaye M.N., 2013 Past, present and future of nematophagous fungi as bioagent to control plant parasitic nematodes The Journal of Plant Protection Sciences, (1): 1-9 71 Ramana K.V and Mohandas C., 1987 Plant parasitic nematodes associated with black pepper (Piper nigrum L.) in Kerala Indian Journal of Nematology, 17 (1): 62-67 72 Ramana K.V., Mohandas C and Balakrishnan R., 1987 Role of plant parasitic nematodes in the slow wilt disease complex of black pepper (Piper nigrum L.) in Kerala Indian Journal of Nematology, 17 (2): 225-230 73 Ranjitsingh K N and Sucheta K R., 2009 Effect of plant root extracts to control root-knot nematode (Meloidogyne spp.) of soybean (Glycine max) Biological Forum – An International Journal, 1(1): 65-68 68 74 Rao M.S., Sowmya D.S., Chaya M.K., Kumar M.R., Rathnamma K., Gavaskar J., Priti K and Ramachandran N., 2012 Management Of Nematode Induced Wilt Disease Complexin Capsicum Using Pseudomonas fluorescens And Paecilomyces lilacinus Nematol medit., 40: 101-105 75 Robinson A.F., 2008 Nematode management in cotton In Integrated Management Biocontrol of Vegetable and Grain CropsNematodes Ciancio A and Mukerji K.G Springer, pp 151-155 76 Rombach M.C., Aguda R.M., Shepard B.M and Roberts D.W., 1986 Infection of rice brown planthopper, Nilaparvata lugens (Homoptera: Delphacidae), by field applicationtion of entomopathogenic hyphomycetes (Deuteromycotina) Environ Entomol, 15: 1070-1073 77 Samson A.R., 1974 Paecilomyces lilacinus and some allied Hyphomycetes Studies in Mycology, 6: 38-40 78 Sarkar M.J., 1986 Optimization and characterization of an extracellular polysacckaride produced by Paecilomyces lilacinus Biotechnology Letters, (11): 769-770 79 Sahayaraj K and Karthick R N S., 2008 Mass production of entomopathogenic fungi using agricultural products and by products African Journal of Biotechnology (12): 1907-1910 80 Siddiqui Z.A and Mahmood I., 1996 Biological control of plant parasitic nematodes by fungi: A review Bioresource Technology, 58: 229-239 81 Subhash C G., Timothy D L., Donald T W., 1993 Hydrolytic enzymes secreted by Paecilomyces lilacinus cultured on sclerotia of Aspergillus flavus Appl Microbiol Biotechnol 39:99-103 82 Subasioglu T and Cansunar E., 2010 Optimization of Culture Conditions and Environmental Factors of Dextranase Enzyme Produced by Paecilomyces lilacinus Hacettepe J Biol & Chem., 38 (2): 159-164 83 Suseela Brai R., Remya B., Danesh J., Eapen S J.,2009 In vitro and in planta Assays for Biological Control of Fusarium Root Rot Disease of Vanilla Journal of Biological Control 23(1): 83-86 84 Tahía B., Ana M R., M C L., Antonio C C.,2004 Biocontrol mechanisms of Trichoderma strains, International microbiology 7:249-260 85 Thet Thet Mar and Saisamorn Lumyoung, 2012 Conidial production of entomopathogenic fungi in solid state fermentation KKU Res.J 17(5) 86 Thom C., 1910 Cultural studies of species of Penicilium Wasington: Government priting office, pp 73-75 87 Trinh Thi Thu Thuy, 2010 Incidence and effect of Meloidogyne incognita (Nematoda: Meloidogyninae) on black pepper plants in Vietnam Dissertation of Doctor of Bioscience Engineering Katholieke Universiteit Leuven, pp 121-124 69 88 Trivedi P C., 2012 Plant Parasitic Nematodes and their Management by Bioagents Part II: Section of plant sciences Proceedings of the ninety ninth session of the Indian science congress, pp 1-24 89 Westenfeld F., Alston K.W and Winn C.W., 1996 Complicated Soft Tissue Infection with Prepatellar Bursitis Caused by Paecilomyces lilacinus in an Immunocompetent Host: Case Report and Review Journal Of Clinical Microbiology, 34 (6): 1559-1562 90 Will M E., Wilson D M and Wicklow D T., 1994 Evaluation of Paecilomyces lilacinus, chitin, and cellulose amendments in the biological control of Aspergillus flavus fungi Biol Fertil Soils Springer-Verlag, 17: 281-284 91 Villanueva L M and Davide R G., 1983 Effects of fungicides, nematicides and herbicides on the growth of nematophagous fungi Paecilomyces lilacinus and Arthrobotrys cladodes Phil Phytopathol., 19: 24-27 TP Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2015 PHÓ GIÁM ĐỐC CHUYÊN MƠN PHỤ TRÁCH PHỊNG CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI TS Phạm Hữu Nhượng Phan Mỹ Hạnh Lê Thị Mai Châm GIÁM ĐỐC TS Dương Hoa Xô 70