Ứng dụng công nghệ bức xạ chế tạo chế phẩm bạc nano chitosan để phòng trị bệnh cho cây hồ tiêu

SỞ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM CƠNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO NGHIỆM THU ĐỀ TÀI CƠ SỞ CẤP TRUNG TÂM ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ BỨC XẠ CHẾ TẠO CHẾ PHẨM BẠC NANO/CHITOSAN PHÒNG TRỊ BỆNH CHO CÂY HỒ TIÊU Đơn vị chủ trì nhiệm vụ: phịng CNSH Vật liệu Nano Chủ nhiệm nhiệm vụ: PGS.TS Lê Quang Luân Cán tham gia: ThS Nguyễn Xuân Tuấn ThS Đặng Hoàng Việt ThS Nguyễn Thanh Vũ CN Nguyễn Thị Ngọc Anh CN Huỳnh Gia Hòa CN Phạm Trần Hải Thương Thành phố Hồ Chí Minh, tháng năm 2018 MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC HÌNH iv DANH MỤC BẢNG BIỂU vi TÓM TẮT vii PHẦN THÔNG TIN CHUNG PHẦN NỘI DUNG KHOA HỌC Tính cấp thiết đề tài Ý nghĩa tính khoa học thực tiễn .5 Tổng quan tài liệu 3.1 Bạc nano 3.1.1 Tính chất hạt bạc nano 3.1.2 Khả kháng vi sinh vật AgNPs 3.1.3 Các phương pháp chế tạo AgNPs 3.2 Chitosan 10 3.2.1 Giới thiệu chitosan 10 3.2.2 Hiệu ứng sinh học chitosan phân tử thấp 10 3.3 Cây hồ tiêu bệnh chết nhanh hồ tiêu 12 3.4 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 15 3.4.1 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 15 3.4.2 Tình hình nghiên cứu nước 16 II VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 Vật liệu 17 Phương pháp nghiên cứu 17 2.1 Chế tạo dung dịch AgNPs/CTS phương pháp chiếu xạ 17 2.2 Xác định đặc trưng quang học mẫu AgNPs phổ UV-vis 17 2.3 Xác định kích thước hạt mẫu AgNPs ảnh TEM 18 2.4 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ Ag+ đến liều xạ chuyển hóa bão hịa (Ag+  Ag0), kích thước phân bố AgNPs 18 2.5 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất ổn định chitosan đến kích thước AgNPs 19 2.6 Khảo sát độ ổn định AgNPs/CTS theo thời gian lưu giữ 19 2.7 Khảo sát hoạt tính kháng nấm in vitro chế phẩm AgNPs/CTS 19 2.7.1 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ AgNPs/CTS đến khả kháng nấm 19 i 2.7.2 Khảo sát ảnh hưởng kích thước hạt nano đến khả kháng nấm chế phẩm 20 2.8 Khảo sát khả phòng trị bệnh chết nhanh P capsici hồ tiêu chế phẩm AgNPs/CTS điều kiện in vivo 21 2.8.1 Khảo sát khả phòng bệnh chết nhanh P capsici đối tượng hồ tiêu tháng tuổi chế phẩm AgNPs/CTS nhà kính 21 2.8.2 Khảo sát khả trị bệnh chết nhanh P capsici hồ tiêu tháng tuổi chế phẩm AgNPs/CTS nhà kính 21 III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 Chế tạo dung dịch AgNPs/CTS phương pháp chiếu xạ 22 1.1 Ảnh hưởng nồng độ Ag+ đến liều xạ chuyển hóa bão hịa (Ag+  Ag0), kích thước phân bố AgNPs 22 1.2 Ảnh hưởng nồng độ chất ổn định chitosan đến kích thước AgNPs 26 1.3 Chế tạo dung dịch keo AgNPs với nồng độ Ag+ chitosan tối ưu 27 1.4 Độ ổn định AgNPs/CTS theo thời gian lưu giữ 28 Hoạt tính kháng nấm in vitro chế phẩm AgNPs/CTS 29 2.1 Ảnh hưởng nồng độ AgNPs/CTS đến khả kháng nấm chế phẩm 29 2.2 Ảnh hưởng kích thước hạt nano đến hoạt tính kháng nấm chế phẩm 31 Kết khảo sát khả trị phòng trị bệnh chết nhanh P capsici hồ tiêu chế phẩm AgNPs/CTS điều kiện in vivo 32 3.1 Kết khảo khát khả phòng bệnh chết nhanh P capsici hồ tiêu non (1 tháng tuổi) hồ tiêu tháng tuổi chế phẩm AgNPs/CTS điều kiện in vivo 32 3.1.1 Kết khảo sát hiệu phòng bệnh hồ tiêu non (1 tháng tuổi) 32 3.1.2 Kết khảo sát hiệu phòng bệnh hồ tiêu tháng tuổi 35 3.2 Kết khảo sát hiệu trị bệnh hồ tiêu tháng tuổi 37 III KẾT LUẬN 40 Nhận xét đánh giá kết đạt so với yêu cầu 40 Các nội dung cơng việc chưa hồn thành lý (nếu có) 41 IV KIẾN NGHỊ (Đề xuất phát triển kết nghiên cứu đề tài) 41 PHẦN SẢN PHẨM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 42 Sản phẩm KH&CN nhiệm vụ dạng II 42 Sản phẩm KH&CN nhiệm vụ dạng III 42 PHẦN TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT  Gamma Ag+ Bạc ion Ag0 Bạc nguyên tử AgNPs Bạc nano AgNPs/CTS Bạc nano sử dụng chitosan làm chất ổn định Co-60 Đồng vị cobalt 60 CR Carrot CRA Carrot agar Cs Cộng CTS Chitosan ĐHH Độ hữu hiệu Gy Gray TEM Kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission Electron Microscope) UV-vis Quang phổ tử ngoại - khả kiến (Ultraviolet–Visible spectroscopy) VSV Vi sinh vật iii DANH MỤC HÌNH Hình Cơ chế tiêu diệt vi khuẩn AgNPs thông qua tương tác với protein nucleic acid Hình Cơ chế tiêu diệt vi sinh vật AgNPs thông qua tác động gốc oxi hóa tự (ROS) đến ty thể DNA Hình Cấu trúc phân tử chitosan 10 Hình Nấm Phytophthora capsici 13 Hình Bệnh chết nhanh hồ tiêu 14 Hình Khoanh nấm P capsici sau chuyển lên môi trường CRA 20 Hình Dung dịch Ag+ ổn định CTS trước chiếu xạ 22 Hình Dung dịch AgNPs/CTS 1% sau chiếu xạ điều kiện khác .22 Hình Phổ UV-vis mẫu AgNPs (1 mM Ag+ ổn định CTS 1%) sau chiếu xạ liều xạ khác 23 Hình 10 Phổ UV-vis mẫu AgNPs (2,5 mM Ag+ ổn định CTS 1%) sau chiếu xạ liều xạ khác 23 Hình 11 Phổ UV-vis mẫu AgNPs (5 mM Ag+ ổn định CTS 1%) sau chiếu xạ liều xạ khác 24 Hình 12 Phổ UV-vis mẫu AgNPs (10 mM Ag+ ổn định CTS 1%) sau chiếu xạ liều xạ khác 24 Hình 13 Ảnh TEM phân bố kích thước hạt mẫu AgNPs có nồng độ Ag+ khác sau chiếu xạ .25 Hình 14 Ảnh TEM phân bố kích thước hạt bạc ổn định chitosan có nồng độ khác 26 Hình 15 Sơ đồ khối quy trình chế tạo keo AgNPs/CTS phương pháp chiếu xạ .27 Hình 16 Phổ UV-vis chế phẩm AgNPs/CTS theo thời gian lưu giữ 29 Hình 17 Màu sắc chế phẩm AgNPs/CTS theo thời gian lưu giữ 29 Hình 18 Khả ức chế chế phẩm AgNPs/CTS nồng độ khác lên phát triển nấm P capsici mơi trường CRA 29 Hình 19 Khả ức chế phát triển nấm P capsici AgNPs nồng độ khác sau 54 nuôi cấy môi trường CRA 30 Hình 20 Hoạt tính kháng nấm P capsici AgNPs nồng độ khác sau 54 nuôi cấy môi trường CRA 30 Hình 21 Sự phát triển nấm P capsici mơi trường có bổ sung AgNPs có kích thước khác .31 iv Hình 22 Hoạt tính kháng nấm P capsici chế phẩm AgNPs/CTS kích thước hạt nano khác 32 Hình 23 Biểu bệnh nấm P capsici gây rễ hồ tiêu Bên phải: biểu bệnh Bên trái: không biểu bệnh 35 Hình 24 Các nghiệm thức sau xử lý AgNPs 35 ngày 37 Hình 25 So sánh nghiệm thức đối chứng với nghiệm thức nồng độ 50 ppm sau xử lý AgNPs 35 ngày .38 Hình 26 Cây hồ tiêu sau 35 ngày trồng nhà kính 39 Hình 27 Cây hồ tiêu thí nghiệm phòng trị bệnh .40 v DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng Nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng nồng độ Ag+ đến liều xạ chuyển hóa bão hịa kích thước hạt 19 Bảng Nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng nồng độ chitosan 19 Bảng Nghiệm thức nồng độ AgNPs khảo sát kháng nấm P capsici 20 Bảng Nghiệm thức kích thước AgNPs khảo sát kháng nấm P capsici 20 Bảng Nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng nồng độ chế phẩm AgNPs/CTS đến khả phòng bệnh chết nhanh tiêu 21 Bảng Nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng nồng độ chế phẩm AgNPs/CTS đến khả trị bệnh chết nhanh tiêu 21 Bảng Ảnh hưởng nồng độ bạc nitrat đến kích thước AgNPs tạo thành 24 Bảng Hiệu phòng bệnh sau ngày gây bệnh 33 Bảng Hiệu phòng bện%h sau 14 ngày gây bệnh 34 Bảng 10 Hiệu lực phòng bệnh chết nhanh nấm P capsici hồ tiêu xử lý AgNPs sau chủng bệnh 36 Bảng 11 Hiệu lực hạn chế bệnh chết nhanh nấm P capsici hồ tiêu xử lý AgNPs sau có mầm bệnh 37 Bảng 12 So sánh hiệu lực xử lý AgNPs trước sau có mầm bệnh 39 vi TÓM TẮT Chế tạo dung dịch keo AgNPs phương pháp chiếu xạ sử dụng chitosan làm chất ổn định phương pháp an toàn, hiệu cao nhằm tạo chế phẩm có nguồn gốc tự nhiên vừa có khả tiêu diệt vi sinh vật, vừa có khả bảo vệ trồng trước xâm nhiễm vi sinh vật gây bệnh đồng thời thúc đẩy tăng trưởng trồng Bên cạnh đó, chế tạo AgNPs phương pháp chiếu xạ giảm thiểu lượng chất khử sử dụng chế tạo AgNPs so với phương pháp hóa học rút ngắn thời gian, hiệu suất chế tạo so với phương pháp sinh học Mục tiêu nghiên cứu chế tạo chế phẩm AgNPs/CTS kỹ thuật xạ nghiên cứu đặc trưng chế phẩm, khảo sát khả ức chế, hiệu diệt nấm P capsici gây bệnh chết nhanh tiêu chế phẩm điều kiện in vitro in vivo Kết nghiên cứu cho thấy, chế tạo thành công chế phẩm AgNPs/CTS, tùy vào điều kiện chế tạo mà chế phẩm AgNPs/CTS có đặc trưng khác Cụ thể, bước sóng hấp thụ cực đại (từ 404 đến khoảng 415 nm) kích thước AgNPs tăng dần (từ khoảng đến 15 nm) tăng nồng độ Ag+ (1 đến 10 mM) giảm nồng độ chitosan (từ 1%) tăng liều xạ từ - 28 kGy Chế phẩm AgNPs/CTS chế tạo từ điều kiện như: nồng độ Ag+ 10 mM, nồng độ chất ổn định chitosan 1% liều xạ 28 kGy cho thấy khả ổn định tốt lưu trữ điều kiện bình thường 12 tháng Hiệu kháng nấm P capsici (tác nhân gây bệnh chết nhanh tiêu) chế phẩm AgNPs/CTS in vitro tăng dần theo nồng độ chế phẩm sử dụng giảm dần kích thước AgNPs chế phẩm tăng Độ hữu hiệu chế phẩm đạt 92,1% nồng độ 100 ppm (kích thước AgNPs 10 nm) đạt 100% nồng độ 60 ppm (kích thước AgNPs nm) điều kiện in vitro Ngoài ra, kết in vivo cho thấy chế phẩm có tác dụng phịng trị bệnh chết nhanh hồ tiêu tháng tuổi tháng tuổi nấm P capsici gây Hiệu phòng bệnh đạt từ 40 80% nồng độ ppm hồ tiêu non sau 14 ngày gây nhiễm 96,4% hồ tiêu tháng tuổi sau 35 ngày gây nhiễm Hiệu lực trị bệnh chế phẩm khảo sát hồ tiêu tháng tuổi, kết nhận cho hiệu lực trị bệnh chế phẩm đạt 94% sau 35 ngày xử lý chế phẩm Như chế phẩm AgNPs/CTS có nguồn gốc tự nhiên hứa hẹn sản phẩm sử dụng an toàn hiệu quả, đáp ứng mục tiêu phòng trị bệnh chết nhanh P capsici gây hồ tiêu đáp ứng nhu cầu sản xuất nông phẩm theo hướng công nghệ cao tương lai vii PHẦN THÔNG TIN CHUNG Tên đề tài: “Ứng dụng công nghệ xạ chế tạo chế phẩm bạc nano/chitosan để phòng trị bệnh cho hồ tiêu” Mã số: NN01/16-17 Đơn vị chủ trì: Phòng CNSH Vật liệu Nano Đơn vị phối hợp Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS Lê Quang Luân Cán tham gia thực hiện: Từ 06/2016 đến 07/2017: ThS Đặng Hồng Việt (thành viên chính), CN Nguyễn Thanh Vũ (thành viên) CN Phạm Trần Hải Thương (thành viên) Từ 07/2017 đến 11/2017: ThS Nguyễn Xuân Tuấn (thành viên chính), CN Nguyễn Thị Ngọc Anh (thành viên) CN Huỳnh Gia Hòa (thành viên) Thời gian thực hiện: 18 tháng (từ 06/2016 đến 11/2017) Kinh phí: - Tổng dự tốn: 300 triệu đồng - Kinh phí sử dụng: 300 triệu đồng Mục tiêu nhiệm vụ: Mục tiêu tổng quát Sản xuất chế phẩm AgNPs xạ gamma Co-60 sử dụng chitosan (CTS) làm chất ổn định có khả kháng nấm cao, ứng dụng phòng trị bệnh chết nhanh hồ tiêu Mục tiêu cụ thể - Xây dựng quy trình chế tạo chế phẩm AgNPs/CTS có quy mơ phịng thí nghiệm quy mơ lớn (100 L/mẻ) phương pháp chiếu xạ tia gamma Co-60 - Khảo sát đặc trưng cấu trúc hoạt tính kháng nấm P capsici chế phẩm AgNPs/CTS in vitro - Khảo sát hoạt tính diệt khuẩn chế phẩm việc phòng trị bệnh chết nhanh nấm P capsici gây hồ tiêu - Xây dựng tiêu chuẩn sở cho sản phẩm Các nội dung công việc thực so với đăng ký (Ghi rõ nội dung triển khai từ bắt đầu thực đề tài thời điểm báo cáo) STT Nội dung đăng ký Xây dựng đề cương Thời gian (bắt đầu – kết thúc) tháng (5/2016) tháng (6/2016-12/2016) Nội dung 1: Chế tạo dung dịch keo AgNPs/CTS phương pháp chiếu xạ Nội dung thực Đánh giá Đã hoàn thiện đề cương Đúng chi tiết phê tiến độ duyệt - Đã chế tạo chế phẩm AgNPs/CTS với AgNPs có kích thước khác phương pháp chiếu xạ liều xạ từ - 28 kGy, nồng độ Ag+ sử dụng từ - 10 mM nồng độ chất ổn địch (chitosan) từ 5% - Đã xác định kích thước AgNPs Đúng mẫu AgNPs/CTS chế tạo tiến độ - Đã chế tạo chế phẩm AgNPs/CTS liều chiếu xạ, nồng độ Ag+ chitosan tối ưu - Đã khảo sát thời gian ổn định chế phẩm AgNPs/CTS chế tạo liều xạ, nồng độ Ag+ chitosan tối ưu sau - 12 tháng 11 tháng (9/2016-7/2017) Nội dung 2: Khảo sát hoạt tính sinh học chế phẩm AgNPs/CTS - Đã thử nghiệm hiệu lực kháng nấm P capsici gây bệnh chết nhanh hồ tiêu chế phẩm AgNPs/CTS điều Đúng kiện in vitro thay đổi tiến độ nồng độ AgNPs (20 100 ppm) kích thước hạt bạc (5 - 15 nm) chế phẩm - Đã thử nghiệm hiệu bệnh thuốc tăng khi nồng độ AgNPs tăng đối tượng Phytophthora parasitica P capsici Tương tự kết ghi nhận sau ngày gây bệnh, kết ghi nhận sau 14 ngày cho thấy kích thước nồng độ thử nghiệm có khả phòng bệnh hồ tiêu Tuy nhiên tỉ lệ số khỏe mạnh giảm, số bị bệnh tăng lên nồng độ bạc bị giảm sút theo thời gian tồn mơi trường Hình 23 Biểu bệnh nấm P capsici gây rễ hồ tiêu Bên phải: biểu bệnh, bên trái: không biểu bệnh Ngày nay, trước gia tăng dòng vi sinh vật hay các loại vi nấm gây bệnh thực vật P cappsici thiếu thuốc đặc trị việc lựa chọn chế phấm chứa AgNPs quan tâm Xét hiệu lực phòng bệnh kháng nấm chế phẩm AgNPs/ chitosan kích thước hạt nm có hiệu lực cao chế phẩm kích thước hạt 10 nm Tuy nhiên q trình nghiên cứu chúng tơi nhận thấy nồng độ bạc mẫu AgNPs có kích thước 10 nm 10 mM cao gấp 10 lần so với nồng độ bạc mẫu AgNPs có kích thước nm (1 mM) nên pha loãng đến nồng độ định mẫu có kích thước 10 mM có hệ số pha lỗng cao gấp 10 lần so với mẫu AgNPs có kích thước nm Mặc khác sản xuất nông nghiệp hiệu kinh tế xem trọng nên khuyến cáo sử dụng chế phẩm AgNPs 10 nm chế phẩm phịng trừ bệnh cho nơng nghiệp Chế phẩm AgNPs nm có hiệu lực kháng khuẩn nấm cao nghiên cứu ứng dụng y tế cơng nghiệp 3.1.2 Kết quả khảo sát hiệu quả phịng bệnh hồ tiêu tháng tuổi Sau tiến hành thí nghiệm, nhìn tổng thể tồn thí nghiệm, cho kết có khác biệt đáng kể lơ thí nghiệm hồ tiêu nghiệm 35 thức Sự khác biệt nghiệm thức trì điều tra lần cuối vào thời gian 35 ngày sau chủng P capsici So sánh nghiệm thức với với đối chứng: sau ngày, đối chứng xuất tỷ lệ bệnh cao (39,33%), có khác biệt rõ rệt tỷ lệ bệnh (33 với 2,33%) nồng độ AgNPs thấp (1 ppm) với nồng độ AgNPs cao (10 ppm), nồng độ 10 ppm khơng có khác biệt tỷ lệ bệnh nồng độ 10 ppm vẫn thấp Tại nồng độ ppm tỷ lệ bệnh cao gần với đối chứng, nồng độ AgNPs thấp nên bệnh vẫn tiến triển mạnh Sau 28 ngày gây nhiễm bệnh phát triển mạnh (mẫu đối chứng: 55,66%) Kết theo dõi tỷ lệ bị bệnh sau 7, 14, 28 35 ngày gây nhiễm (Bảng 10) thể sau: Bảng 10 Hiệu lực phòng bệnh chết nhanh nấm P capsici hồ tiêu xử lý AgNPs sau chủng bệnh Nồng độ Tỷ lệ hồ tiêu bị bệnh theo thời gian sau gây nhiễm, % AgNPs, ppm NSCB 14 NSCB 28 NSCB 35 NSCB a a a (ĐC) 39,33 42,33 55,66 85,66a b b b 33,00 35,33 42,66 45,66b 15,66c 16,00c 17,00c 17,66c 7,33d 8,66d 9,00d 11,00d 10 2,33d 3,16e 3,46e 3,66e ĐC: đối chứng không xử lý AgNPs; NSCB: ngày sau chủng bệnh; Trong cột, giá trị trung bình có kí tự theo sau khác thể khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê (P