Nghiên cứu này nhằm mục tiêu phân lập và chọn ra chủng xạ khuẩn tiềm năng kiểm soát nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) gây bệnh rụng lá corynespora (CLF) trên cây cao su. Thử nghiệm in vitro và ex vivo bước đầu đã chọn ra được 07 chủng xạ khuẩn TKH08, TKH11, TKH12, TKH14, TT37, TT54 và PT2.
Chuyên san Phát triển Khoa học Công nghệ số (1), 2018 PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ NẤM CORYNESPORA CASSIICOLA CỦA MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN Hoàng Trọng Minh Quân*, Trần Khắc Huy, Nguyễn Hữu Ngun, Trịnh Thanh Tâm, Nguyễn Hồng Dũng, Lê Văn Ngơ Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQG TP.HCM *Tác giả liên lạc: quanhoangtrong.hcmus@gmail.com (Ngày nhận bài: 10/2/2018; Ngày duyệt đăng: 22/3/2018) TÓM TẮT Nghiên cứu nhằm mục tiêu phân lập chọn chủng xạ khuẩn tiềm kiểm soát nấm Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) gây bệnh rụng corynespora (CLF) cao su Thử nghiệm in vitro ex vivo bước đầu chọn 07 chủng xạ khuẩn TKH08, TKH11, TKH12, TKH14, TT37, TT54 PT2 Các chủng có khả sản sinh hợp chất ức chế phát triển nấm Corynespora cassiicola nên định danh Sinh học phân tử khảo sát điều kiện nuôi cấy Trong đó, dịch chiết từ chủng Streptomyces misionensis PT2 ni cấy môi trường L4 thời điểm ngày cho hoạt tính mạnh nhất, ức chế hồn tồn phát triển nấm bệnh mơ hình cao su cắt rời 72 Phân tích sắc ký pha đảo dịch chiết chủng PT2 bước sóng 254 nm cho thấy đỉnh có thời gian lưu 5.45 phút có nồng độ cao cấu trúc tiềm với bước sóng hấp thu cực đại 288.5 nm 399.2 nm Từ khóa: C cassiicola, streptomyces, cao su, xạ khuẩn, biến dưỡng thứ cấp, HPLC ISOLATION AND INVESTIGATION FOR ANTIFUNGAL ACTIVITY TO CORYNESPORA CASSIICOLA OF SEVERAL ACTINOBACTERIA STRAINS Hoang Trong Minh Quan*, Tran Khac Huy, Nguyen Huu Nguyen, Trinh Thanh Tam, Nguyen Hoang Dung, Le Van Ngo University of Science – VNU Ho Chi Minh City *Corresponding Author: quanhoangtrong.hcmus@gmail.com ABSTRACT This research aims to isolate and screen for some Actinomyces showed significant antagonistic activity against the fungal pathogen Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) causing corynespora leaf fall (CLF) on rubber tree In vitro and ex vivo tests have selected out seven candidates, named TKH08, TKH11, TKH12, TKH14, TT37, TT54, and PT2 Since these strains could synthesize compounds that inhibited Corynespora cassiicola from spreading, they were molecular identified and investigated for cultivation conditions The result showed that when cultivated strain Streptomyces misionensis PT2 in L4 medium after days gave highest antifungal activity, completely inhibited Corynespora cassiicola from invading rubber leaf tissue within at least 72 hours Discovering PT2 extract by reverse-phase HPLC at 254 nm showed that 5.45min peak had noticeable high concentration and promising structure with maximum 42 Chuyên san Phát triển Khoa học Công nghệ số (1), 2018 absorbent wavelength at 288.5 nm 399.2 nm Keywords: C cassiicola, streptomyces, rubber tree, actinomycete, secondary metabolism, HPLC nhiên, khả tiêu diệt nấm xâm nhiễm vào mô chủng chưa công bố Trong nghiên cứu này, sử dụng xạ khuẩn làm đối tượng nghiên cứu ngành vi khuẩn khai thác phổ biến tìm kiếm sàng lọc kháng sinh ứng dụng nông dược y dược Bên cạnh đó, bước đầu đề tài tiến hành khảo sát môi trường nuôi cấy C cassiicola để giúp tăng cường sản sinh hợp chất thứ cấp Các phép phân tích thử nghiệm in vitro ex vivo mơ hình cao su cắt rời Sự xuất thay đổi hàm lượng hợp chất theo dõi RP-HPLC TỔNG QUAN Corynespora cassiicola nấm nội kí sinh gây bệnh phổ biến loại cơng nghiệp nơng nghiệp, điển hình cao su, cà chua, đậu nành đu đủ Nấm công lên tất loại giai đoạn sống cây, làm giảm sản lượng lên tới 30%, chí gây chết hàng loạt C cassiicola có khả tiết độc tố cassiicolin gây rụng nhanh, hay gọi bệnh rụng Corynespora (Corynespora Leaf Fall – CLF), gây thiệt hại đáng kể cho nhiều nước châu Á châu Phi Tại Việt Nam, thời gian 2009-2010, nấm gây dịch với quy mô 3.000 Quảng Nam Kom Tum, 300 Bình Dương Nấm tồn khắp nơi, đặc biệt nhiều phận có triệu chứng bệnh mơ phân hủy Chính vậy, khả gây bệnh ln tiềm tàng, bùng phát thành dịch điều kiện phù hợp Một số loại thuốc thương mại chứa carbendazim hexaconazole diệt nấm, nhiên phổ diệt rộng tác động xấu hệ sinh thái đất Ngồi ra, hai thuốc độc có độ bền cao, carbendazim thuộc nhóm C, gây vô sinh nên bị cấm sử dụng Chính vậy, việc nghiên cứu tìm chế phẩm có khả diệt trừ Corynespora cassiicola cách hiệu thân thiện môi trường cần thiết Tại nước ta, nghiên cứu phòng trị bệnh biện pháp sinh học quan tâm gần đây, tiến hành sơ Bacillus thuringiensis Trichoderma sp Tuy PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP Nguyên vật liệu Lá cao su: dùng để phân lập có triệu chứng bị C cassiicola xâm nhiễm thu thập Củ Chi, Thành phố Hồ Chí Minh Lá cao su 15 ngày tuổi thuộc giống IAN 873 dùng làm mơ hình gây nhiễm ex vivo Mẫu đất dùng phân lập xạ khuẩn: tất mẫu dất thu nhận nhiều địa điểm khác vườn Quốc gia Cát Tiên như: rễ cây, đồng cỏ, thảm mục, đất ven sông suối Đất sau thu nhận để khô tự nhiên tuần nghiền sàng thành bột mịn để lưu trữ -20oC Môi trường dùng cho phân lập C cassiicola: Môi trường PGA (0.4% cao khoai tây, 2% dextrose, 2% agar) Hấp khử trùng 121oC 15 phút, bổ sung gentamycin nồng độ of µg/ml 43 Chuyên san Phát triển Khoa học Công nghệ số (1), 2018 trước đổ đĩa để loại bỏ bớt phần vi khuẩn khơng mong muốn q trình phân lập Môi trường SD lỏng (2% dextrose, 1% peptone, pH 5.6 25oC) dùng để nuôi tăng sinh nấm Môi trường chọn lọc dùng cho phân lập xạ khuẩn: Môi trường Humic acid Vitamin agar hay A8 (0.1% humic acid, 0.005% cao nấm men, 0.002% nalidixic acid, khoáng I lượng vitamin, pH 7.2 25oC) Đây môi trường truyền thống, hiệu phân lập xạ khuẩn chứa lượng dinh dưỡng vừa đủ cho xạ khuẩn sử dụng Kháng sinh terbinafin cycloheximide bổ sung thêm tới nồng độ mg/L 50 mg/L để loại bỏ bớt vi khuẩn nấm mốc Môi trường làm xạ khuẩn: môi trường ISP2 (0.4% cao nấm men, 1% cao malt, 0.4% dextrose, pH 7.2 25oC) Mô trường giàu dinh dưỡng cho phép xạ khuẩn phát triển tạo khuẩn lạc sau vài ngày Môi trường nuôi cấy thu hợp chất thứ cấp: Mơi trường L4 (2% mannitol, 2% đậu nành, khống đa lượng vi lượng, pH 6.2 25oC Môi trường sử dụng mannitol đậu nành làm nguồn cung cấp dinh dưỡng chủ yếu giá rẻ mà đẩm bảo yêu cầu sản xuất Phương pháp nghiên cứu Phân lập Corynespora cassiicola Lá cao su có triệu chứng đặc trưng bị C cassiicola xâm nhiễm thu nhận rửa nhẹ nước cất vơ trùng Vị trí nhiễm bệnh cắt thành miếng diện tích cm2, rửa cồn 70o rửa lại nước cất cô trùng Đặt mảnh xử lý sơ lên đĩa PGA có gentamycin, ủ 35 ngày nhiệt độ phịng Khuẩn lạc có cấu trúc đại thể tương đồng với C cassiicola cấy sang đĩa PGA-gentamycin khác để làm Chủng nấm phân lập làm xác nhận băng phương pháp định danh sinh học phân tử Cụ thể, genome thu nhận tinh để làm khuôn cho phản ứng PCR, sử dụng cặp mồi ITS1 (5’TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’) ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’) Sản phẩm PCR tinh tiến hành giải trình tự với mồi ITS1 Trình tự DNA BLAST với sở liệu NCBI để xác nhận Phân lập xạ khuẩn Mẫu đất sau sơ chế xử lý nhiệt (120oC giờ/70oC giờ) SDS để loại bỏ bớt vi sinh không mong muốn Sau đó, mẫu đất hịa pha lỗng nước cất vô trùng trước tiến hành trải lên đĩa môi trường A8 Đĩa ủ nhiệt độ phòng theo dõi tuần để ghi nhận phát triển khuẩn lạc mang đặc trưng Khuẩn lạc làm đĩa môi trường giàu dinh dưỡng ISP2 Các chủng cho hoạt tính tiềm tiến hành định danh phương pháp Sinh học Phân tử dựa trình tự 16S rRNA Các chủng xạ khuẩn tách chiết genome phương pháp phenolchloroform tủa cồn lạnh Genome thu nhận làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi F1 (5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) 1500R (5’-GTTACCTTGTTACGACTT3’) Sản phẩm PCR tinh giải trình tự mồi F1 Kết giải trình tự BLAST với sở liệu NCBI để chọn chi lồi có độ tương đồng cao Sàng lọc sơ hoạt tính kháng in vitro 44 Chuyên san Phát triển Khoa học Công nghệ số (1), 2018 Đĩa đem ủ 30oC quan sát kết đối kháng sau 10 ngày Chủng xạ khuẩn nấm C cassiicola cấy hai phía đối diện đĩa thạch L4, cách mép đĩa 1.5 cm (Hình 1) Hình Phương pháp đối kháng điểm Các chủng cho hoạt tính kháng sơ nồng độ 50,000 ppm để chuẩn bị cho thu nhận bào tử xạ khuẩn nhân giống thử nghiệm môi trường ISP2, nuôi lắc 3-4 Dịch chiết kiểm tra hoạt tính kháng ngày để sinh khối đạt lượng định nấm C cassiicola phương pháp trước chuyển sang lên men lượng lớn khuếch tán đĩa giấy (2 mg cao/đĩa) môi trường ISP2 lỏng tới thạch PGA (Hình 2) Chứng âm dung tuần Dịch ni cấy trích xuất mơi MeOH:DMSO, chứng dương 40 µg dung mơi ethyl actate, quay hòa lại cycloheximide/đĩa Đĩa ủ nhiệt độ MeOH:DMSO (4:1) chuẩn hóa phịng quan sát kết sau 8-9 ngày Hình Phương pháp khuếch tán đĩa khoảng 1-2 cm x 104 CFU bào tử C Thử nghiệm ex vivo Lá cao su 15 ngày tuổi giống IAN 873 cassiicola 0.85% NaCl 0.05% thu nhận, rửa nhẹ Tween 80 nhỏ trực tiếp lên gân thứ ethanol 70o, 20% javel nước cất vơ cấp, tính thời điểm Dịch chiết xạ trùng Lá sau rửa đặt vào khuẩn nhỏ lên vết bệnh ngày thứ hộp riêng, cách lớp ẩm bên ngày thứ Hộp giữ nhiệt độ 45 Chuyên san Phát triển Khoa học Cơng nghệ số (1), 2018 phịng Kết ghi nhận đánh giá thời điểm giờ, 24 72 dựa thang đo Nguyễn Anh Nghĩa cộng Nghiệm thức lặp lại 15 lần, sử dụng ANOVA để so sánh khác biệt ba thời điểm ba thời điểm chứng âm Nếu bệnh không phát triển phát triển khơng đáng kể dịch chiết có khả ngăn ngừa phát triển lan rộng C cassiicola Khảo sát môi trường nuôi cấy tăng cường sản sinh hợp chất thứ cấp Khuẩn lạc xạ khuẩn nhân mầm vào 25 mL môi trường ISP2 lỏng, ni lắc 150 rpm, nhiệt độ phịng – ngày (tùy chủng) Sau đó, tiến hành hút mL dịch nhân mầm chuyển vào 150 mL môi trường ISP2 L4 để tiếp tục nuôi Thu mẫu sau ngày để so sánh thơng qua HPLC Phân tích dịch chiết RP-HPLC Dịch chiết tổng sau chuẩn hóa 50,000 ppm lọc qua màng µL, chuyển vào vial 1.5 mL để nạp mẫu vào cột CC 125x2 Kromasil 100-5 C18 với quy trình chạy HPLC sau: 0-100% AcN, 0.3 mL/phút, 15 phút; 100-100% AcN, 0.3 mL/phút, phút; 100-0% AcN, 0.3 mL/phút, phút; 0-0% AcN, 0.8 mL/phút, phút; Thời gian lưu: 25 phút Đỉnh tiềm đỉnh có thời gian lưu khoảng 6-12 phút (không phân cực), có nhiều đỉnh hấp thu UV (nhiều gốc chức) Đối chiếu tăng giảm cường độ đỉnh với khả kháng C cassiicola đĩa để bước đầu phán đoán hoạt tính kháng tương ứng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Phân lập C cassiicola xạ khuẩn Từ mẫu bệnh, phân lập chủng nấm có hình thái phù hợp với đặc trưng mơ tả khuẩn lạc C cassiicola: khuẩn ti khí sinh non có màu trắng, già có màu xám (Hình 3A), khuẩn ti chất tạo sắc tố đen (Hình 3B) Hình Chủng nấm phân lập có hình thái giống C cassiicola (A) mặt trên, (B) mặt (C) hình thái hiển vi 30X Sau tiến hành PCR với cặp mồi cho lập C cassiicola (kết khơng nấm giải trình tự mồi ITS1, chúng trình bày) Chủng nấm sử so sánh với sở liệu cơng bố dụng cho thí nghiệm NCBI để khẳng định chủng nấm phân 46 Chuyên san Phát triển Khoa học Công nghệ số (1), 2018 Hơn 100 chủng xạ khuẩn phân lập, mang số đặc điểm đặc trưng cho ngành xạ khuẩn như: khuẩn lạc khô, bề mặt nhăn, tạo bào tử, nhiều vòng đồng tâm, ăn sâu mặt thạch,… (Hình 4) Dưới thị trường kính hiển vi vật kính dài (long distance), khuẩn ti khí sinh có dạng sợi mảnh, cuối sợi phân đốt tạo thành chuỗi bào tử Ngồi ra, vị trí giao sợi tạo thành khoang tiếp hợp, nhìn thấy rõ chủng TKH17 (Hình 5) Các chủng tiến hành thử nghiệm hoạt tính sơ để sang lọc chủng có khả kháng C cassiicola Hình Hình thái số khuẩn lạc xạ khuẩn phân lập Hình Hình thái số chủng xạ khuẩn thị trường kính hiển vi vật kính dài (long distance) Các mũi tên hình chủng TKH17 khoang tiếp hợp 47 Chuyên san Phát triển Khoa học Công nghệ số (1), 2018 chủng tách chiết sử dụng phương pháp khuếch tán dĩa để xác nhận lại Đáng ý, bốn chủng TKH11, TT37, TT54 PT2 cho hoạt tính kháng rõ ràng (Hình 6) Thử nghiệm in vitro sàng lọc chủng xạ khuẩn có tiềm ức chế C cassiicola Từ 100 chủng phân lập được, chủng TKH08, TKH11, TKH12, TKH14, TT37, TT54 PT2 thể hoạt tính kháng sơ với C cassiicola Các dịch ni cấy Hình Dịch chiết chủng xạ khuẩn ức chế phát triển C cassiicola Thử nghiệm khả gây bệnh ex vivo triển Sau ngày, vết bệnh đạt cấp 4, xuất chủng C cassiicola cao su: nhiều tơ nấm Sau ngày, tơ nấm kết cho thấy chủng nấm thử nghiệm mọc nhanh, dày lan rộng phiến có khả gây bệnh dịng cao su làm cho cao su chuyển màu sắc mạnh IAN 873 Tình trạng nhiễm bệnh nghiêm từ vàng nhạt sang nâu (Hình 7) Trong trọng dần theo thời gian: sau 24 gây trình tiến triển bệnh, khu vực xung nhiễm có biểu bệnh cấp tức quanh vùng bệnh bị hư hại ảnh chưa bị bệnh Sau 48 bắt đầu xuất hưởng độc tố cassiicolin, chuyển dần đốm đen viền vàng nhỏ Sau 72 sang màu vàng chuyển sang nâu xuất vết bệnh liên tục phát Hình Triệu chứng cấp bệnh tính theo ngày mẫu cắt rời 48 Chuyên san Phát triển Khoa học Công nghệ số (1), 2018 tế bào liên kết Sợi nấm quan sát dễ dàng khu vực bị xâm nhiễm (Hình 8A) Vào ngày thứ 4, sợi nấm mọc dày đặc lớn nhiều đốm sẫm màu bắt đầu xuất hiện, chứng tỏ mô bắt đầu bị phân hủy (Hình 8B) Ngồi ra, cắt lát vùng bệnh mẫu vào ngày thứ 2, quan sát kính hiển vi, nhận thấy C cassiicola dần xuyên qua lớp cutin xâm nhập vào mô bên Các vết hoại tử xuất xuất sau ngày lây nhiễm khiến vách tế bào mỏng Hình Mơ nhiễm bệnh thị trường kính hiển vi (A) Sau ngày (B) sau ngày nhiễm bệnh Mũi tên sợi nấm C cassiicola xâm nhiễm TT54, PT2 có khả kháng mạnh làm Xử lý vết bệnh với dịch chiết xạ khuẩn Lô xử lý vết bệnh sau ngày (D3) cho cho nấm phát triển thấy: khả kiểm soát nấm gây bệnh ngày Điều nấm cao su C cassiicola vết bệnh hình thành vết bệnh với mật độ nấm hình thành bảy chủng xạ khuẩn chưa đủ dày mạnh độ đậm đặc tốt, đáng ý dịch chiết khiến cho nấm bị ức chế, không chủng xạ khuẩn TKH12, TKH14, TT37, thể mọc trở lại phát triển mạnh Hình So sánh độ tiến triển bệnh điều trị dịch chiết xạ khuẩn ngày thứ (D3) ngày thứ (D6) sau 0-24-72 49 Chuyên san Phát triển Khoa học Cơng nghệ số (1), 2018 có kết kháng nấm đĩa giấy tốt điều kiện ex vivo khả kháng khơng cao, sau 24 sau nhỏ dịch chiết vết bệnh lan ngày phát triển Ngược lại, chủng PT2 cho kết kháng nấm tốt, ức chế hồn tồn phát triển khơng để nấm mọc trở lại Lô xử lý vết bệnh sau ngày (D6) cho thấy: đa phần chủng xạ khuẩn làm chậm phát triển C cassiicola, nấm mọc lại sau 72 nên hiệu kiểm sốt nấm khơng cao Khi mà nấm bệnh đạt cấp độ với mật độ dày phát triển nhanh dịch chiết khó ức chế hoàn toàn nấm phát triển mọc trở lại Điều đáng ý chủng TKH08 18 D3 0h D3 72h ĐƯỜNG KÍNH VÙNG BỆNH (mm) 16 D3 24h D6 0h 14 12 10 TKH08 TKH11 TKH12 TKH14 TT37 TT54 PT2 Đối chứng CHỦNG THỬ NGHIỆM Hình 10 Hiệu điều trị CLF mơ hình ex vivo dịch chiết PT2 cao su lô gây nhiễm ngày Lô điều trị dịch chiết PT2 (lô A) sau 24 (A1) 72 (A2) so với đối chứng (lô B) thời điểm 24 (B1) 72 (B2) Những kết chứng tỏ rằng: chất Hầu hết chủng nuôi cấy môi kháng nấm tách chiết từ chủng PT2 trường L4 cho lượng chất thu có khả kiểm sốt nấm C cassiicola tăng so với ISP2 Việc liên quan tốt Các chất kháng nấm từ chủng tới thành phần môi trường Đối với ISP2, TKH12, TKH14, TT37 TT54 có khả có nhiều thành phần dễ chuyển hóa kháng nấm mạnh nấm cịn yếu, cao malt, cao nấm men, glucose, cộng với vết bệnh xuất hiện, khả kiểm việc không thay đổi mơi trường so với lúc sốt nấm giảm nấm mạnh, tốc độ nhân mầm nên xạ khuẩn biểu lan bệnh nhanh vết bệnh lớn Hai chủng gen cần thiết; ngược lại, mơi trường lại TKH08 TKH11 cho kết L4 có thành phần khó sử dụng kháng nấm yếu Maltose đậu nành khiến xạ khuẩn phải Khảo sát môi trường nuôi cấy tăng thay đổi để thích ứng với mơi trường mới, cường sản sinh hợp chất thứ cấp thông nhiều khả làm biến đổi q trình chuyển hóa Ngồi ra, tiền chất qua HPLC 50 Chuyên san Phát triển Khoa học Công nghệ số (1), 2018 đậu nành giúp kích thích tạo nhiều hợp chất thứ cấp Đơn cử trường hợp chủng PT2: đỉnh 5.45 phút tăng mạnh với hoạt tính kháng chuyển sang nuôi môi trường L4 đỉnh cao hẳn so với đỉnh khác (đỉnh lớn 2.20 môi trường) Khi quét phổ UV-Vis đỉnh 5.54 phút, có hai bước sóng hấp thu mạnh 288.5 nm 399.2 nm (Hình 11) Hình 11 Kết phân tích HPLC cao chiết tổng chủng PT2 nuôi L4 ISP2 (A) tín hiệu thu phân tích bước sóng 254 nm (B) phổ quét UV-Vis đỉnh 5.45 phút Định danh xạ khuẩn phương pháp loài (Bảng 1) Tuy nhiên, để khẳng định điều này, cần tiến hành sinh học phân tử Dựa vào kết giải trình tự đối chiếu tham chiếu thêm với số chủng lân cận với sở liệu NCBI, bảy chủng Nhìn chung, chủng phân lập tiềm định danh Trong thuộc chi Streptomyces Điều chủng TKH08, TKH11 TKH14 thuộc dự đoán trước quy trình, bao gồm lồi Streptomyces naganishii; Các chủng bước tiền xử lý, môi trường, thời gian ủ,… TKH12 PT2 thuộc loài phù hợp với chi Mặt khác, tỷ lệ Strep diastaticus Strep misionensis Streptomyces đất chiếm tỉ lệ cao, Riêng chủng TT54 tương đồng cao với sức sống mạnh so với loài khác nhiều loài nên khẳng định Chính vậy, chúng tơi thử nghiệm thuộc chi Streptomyces Đặc biệt, có số quy trình khác để phân lập chi khác trình tự tương đồng 100% đặc biệt xạ khuẩn với hy với chủng TT37 chưa đặt tên vọng tìm thêm nguồn hợp chất thức (Streptomyces VK), có khả 51 Chuyên san Phát triển Khoa học Công nghệ số (1), 2018 Bảng Kết định danh đối chiếu với sở liệu cơng bố NCBI Chủng xạ khuẩn Tên lồi tương đồng Độ tương đồng TKH08 TKH11 100% Streptomyces naganishii TKH14 100% 100% TKH12 Streptomyces distaticus 100% TT37 Streptomyces VK 100% TT54 Streptomyces sp 100% (trùng nhiều loài) PT2 Streptomyces misionensis 100% phát triển để thu nhận hợp chất phục vụ nghiên cứu sâu hơn, góp phần phát triển nơng dược có nguồn gốc sinh học, khơng phục vụ cho việc điều trị CLF mà cho loại nấm bệnh khác trồng Lời cảm ơn Đề tài thực nhờ kinh phí Sở Khoa học Cơng nghệ TP Hồ Chí Minh, Chương trình Vườn ươm Sáng tạo Khoa học công nghệ Trẻ 2016 – 2017 KẾT LUẬN Chúng phân lập thành công nấm C cassiicola từ cao su nhiễm bệnh Nấm phân lập có khả tái nhiễm lên cao su khỏe mạnh Bên cạnh đó, chủng xạ khuẩn tiềm chọn thông qua thử nghiệm kháng nấm in vitro Trong số này, có chủng PT2 cho hoạt tính kháng ex vivo hiệu mơ hình cao su cắt rời ngăn vết bệnh phát triển 72 Chủng PT2 tiếp tục TÀI LIỆU THAM KHẢO ĐỖ THỊ THANH DUNG, LÊ THANH BÌNH, PHAN THỊ PHƯỢNG TRANG, et al., (2015), Phân lập tuyển chọn số chủng vi nấm có khả đối kháng với nấm Corynespora cassiicola gây bệnh vàng lá, rụng cao su Tạp chí khoa học Trường Đại học Sư phạm TP.HCM 9(75): p 82-94 NGUYỄN ĐÔN HIỆU, NGUYỄN ANH NGHĨA VÀ PHANH THÀNH DŨNG, (2011), Xác định tính gây bệnh nấm Corynespora cassiicola phân lập từ cao su số ký chủ khác phương pháp lây bệnh nhân tạo cắt rời Tạp chí Nơng nghiệp & Phát triển Nơng thơn 22: p 46-50 NGUYỄN VĂN MINH, MAI HỮU PHÚC, VÕ NGỌC YẾN NHI, et al., (2014), Sàng lọc vi sinh vật nội sinh cao su có khả kiểm sốt sinh học vi nấm Corynespora cassiicola Tạp chí Sinh học 36(1se): p 173-179 PU JINJI, ZHANG XIN, QI YANGXIAN, et al., (2007), First record of Corynespora leaf fall disease of Hevea rubber tree in China Australasian Plant Disease Notes X WANG, M SONG, C GAO, et al., (2009), Carbendazim induces a temporary change in soil bacterial community structure J Environ Sci (China) 52 ... sang lọc chủng có khả kháng C cassiicola Hình Hình thái số khuẩn lạc xạ khuẩn phân lập Hình Hình thái số chủng xạ khuẩn thị trường kính hiển vi vật kính dài (long distance) Các mũi tên hình chủng. .. chủng xạ khuẩn ức chế phát triển C cassiicola Thử nghiệm khả gây bệnh ex vivo triển Sau ngày, vết bệnh đạt cấp 4, xuất chủng C cassiicola cao su: nhiều tơ nấm Sau ngày, tơ nấm kết cho thấy chủng nấm. .. Điều nấm cao su C cassiicola vết bệnh hình thành vết bệnh với mật độ nấm hình thành bảy chủng xạ khuẩn chưa đủ dày mạnh độ đậm đặc tốt, đáng ý dịch chiết khiến cho nấm bị ức chế, không chủng xạ khuẩn