Bài báo cáo thực hành Đề tài môn thực hành tách chiết các hợp chất thiên nhiên

ĐỊNH TÍNH TINH DẦU BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG - Khảo sát hệ dung môi giải ly trong sắc ký lớp mỏng - Định tính mẫu tinh dầu bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng.. Bước 4: Chấm mẫu lên bản mỏng v

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM

KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ HỮU CƠ

2

Nguyễn Thị Hạnh Duyên

Trần Nguyễn Minh Tâm

Nguyễn Thị Thanh Ngân

BÀI 1 CHIẾT XUẤT TINH DẦU BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHƯNG CẤT LÔI CUỐN HƠI NƯỚC

I MỤC ĐÍCH VÀ PHẠM VI CỦA PHƯƠNG PHÁP

- Làm quen với phương pháp chưng cất tinh dầu ở qui mô phòng thí nghiệm;

- Chiết xuất tinh dầu từ các nguồn thực vật khác nhau bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước

II NỘI DUNG THÍ NGHIỆM

Bước 1: Chuẩn bị nguyên liệu

- Mẫu được rửa sạch, để ráo và cắt nhỏ (dạng sợi hay hạt nhỏ);

- Cân 150g mẫu đã cắt nhuyễn cho vào bình cầu 1000mL (đã có sẵn vài viên đá bọt);

- Cho 600mL nước cất vào bình cầu, thêm NaCl với nồng độ thích hợp (2-10%)

4

Bước 3: Tiến hành chưng cất lôi cuốn hơi nước

- Kiểm tra hệ thống nước vào và nước ra;

- Bật bếp đun và quan sát hệ thống;

- Nước trong bình cầu sôi sẽ bốc hơi bay lên mang theo tinh dầu qua hệ thống sinh hàn làm lạnh, sau đó ngưng tụ thành thể lỏng, rơi xuống bộ hứng tinh dầu Trong bộ hứng tinh dầu, dung dịch tách thành hai lớp gồm lớp nước và lớp tinh dầu

Bước 4: Thu nhận tinh dầu

- Quan sát bộ hứng tinh dầu, thấy lớp tinh dầu không tăng thêm thì tắt bếp (lúc này chưa tắt hệ thống nước);

5

- Ghi nhận thời gian đun (tính từ lúc hỗn hợp nguyên liệu bắt đầu sôi);

- Mở khóa bộ hứng tinh dầu để thu nhận tinh dầu thô (đựng trong lọ 10mL trong suốt);

- Thêm ít Na2SO4 khan vào lọ chứa tinh dầu thô, vừa thêm vừa khuấy đều cho đến khi thấy các tinh thể Na2SO4 bắt đầu rời ra Để lắng hỗn hợp trên Cho phần tinh dầu đã làm khan bên trên chảy vào lọ đựng tinh dầu (màu nâu) và bảo quản trong ngăn mát tủ lạnh;

- Hiệu suất chưng cất tinh dầu (H) được tính theo công thức:

Trong đó: mmẫu (g) là khối lượng nguyên liệu ban đầu; mtinh dầu (g) là khối lượng tinh dầu thu được; w (%) là độ ẩm của nguyên liệu

III BÁO CÁO KẾT QUẢ

IV TRẢ LỜI CÂU HỎI

1 Trình bày tính chất hóa lý, thành phần hóa học của tinh dầu trong thí nghiệm?

- Thể chất : Đa số là chất lỏng ở nhiệt độ thường, một số thành phần ở thể rắn:

- Menthol, borneol, camphor, vanilin, heliotropin

- Màu sắc : Không màu hoặc vàng nhạt Do hiện tượng oxy hóa màu có thể sẫm lại

- Một số có màu đặc biệt: Các hợp chất azulen có màu xanh mực

- Mùi : Đặc biệt, đa số có mùi thơm dễ chịu, một só có mùi hắc, khó chịu (tinh dầu giun)

- Vị : cay, một số có vị ngọt: Tinh dầu quế, hồi

- Bay hơi được ở nhiệt độ thường

- Tỷ trọng : Đa số nhỏ hơn 1 Một số lớn hơn 1: Quế, đinh hương, hương nhu

- Tỷ lệ thành phần chính (aldehyd cinnamic, eugenol) quyết định tỷ trọng tinh dầu

- Nếu hàm lượng các thành phần chính thấp, chúng sẽ trở thành nhẹ hơn nước

- Độ tan : Không tan, hay đúng hơn ít tan trong nước, tan trong alcol và các dung môi hữu

- cơ khác

- Độ sôi : Phụ thuộc vào thành phần cấu tạo, có thể dùng phương pháp cất phân đoạn

để

- tách riêng từng thành phần trong tinh dầu

- Năng suất quay cực cao, tả tuyền hoặc hữu tuyền

6

- Chỉ số khúc xạ : 1,4500 - 1,5600

- Rất dễ oxy hoá, sự oxy hoá thường xảy ra cùng với sự trùng hiệp hoá, tinh dầu sẽ

- chuyển thành chất nhựa

- Một số thành phần chính trong tinh dầu cho các phản ứng đặc hiệu của nhóm chức

- năng, tạo thành các sản phẩm kết tinh hay cho màu, dựa vào đặc tính này để định tính

- và định lượng các thành phần chính trong tinh dầu

2 Nêu nguyên tắc của quy trình tách tinh dầu (trường hợp tinh dầu nặng hơn nước và trường hợp tinh dầu nhẹ hơn nước) bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước?

Dựa trên nguyên tắc cất một hỗn hợp 2 chất lỏng bay hơi được không trộn lẫn vào nhau (nước và tinh dầu) Khi áp suất hơi bão hoà bằng áp suất khí quyển, hỗn hợp bắt đầu sôi và hơi nước kéo theo hơi tinh dầu

Hơi nước có thể đưa từ bên ngoài do các nồi hơi cung cấp hoặc tự tạo trong nồi cất

3 Trình bày sơ đồ khối phương pháp tách tinh dầu bằng chưng cất lôi cuốn hơi nước?

7

4 Nêu ưu và nhược điểm của phương pháp thí nghiệm?

Ưu điểm của phương pháp này là dễ thực hiện, thiết bị dễ chế tạo và vận hành đơn

giản; giá thành rẻ Có thể sử dụng nhiều loại nguồn nhiệt khác nhau như điện, đốt củi, than,

… Tiết kiệm nước hơn

Nhược điểm: Hiệu suất thấp, độ tinh khiết không cao, do xử dụng nhiệt nếu người

thực hành không có kinh nghiệm thì nguyên liệu dễ bị cháy khét, thời gian thực hiện khá lâu

5 Nêu các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chưng cất tinh dầu?

Khuếch tán

Ở nhiệt độ nước sôi, một phần tinh dầu hòa tan vào trong nước có sẵn trong tế bào thực vật Dung dịch này sẽ thẩm thấu dần ra bề mặt nguyên liệu và bị hơi nước cuốn đi Một phần hơi nước trong nồi đi vào thực vật và tinh dầu lại tiếp tục bị hòa tan vào lượng nước này Quy trình này lặp đi lặp lại cho đến khi tinh dầu trong các mô thoát ra ngoài hết

Thời gian chưng cất

Những cấu phần Ester trong tinh dầu thường dễ bị thủy giải cho ra Acid và Alcol khi đun nóng trong một thời gian dài với nước Do đó, để hạn chế hiện tượng này, thời gian chưng cất hơi nước phải được thực hiện trong một thời gian càng ngắn càng tốt

6 Trình bày các phương pháp đánh giá tinh dầu thu được?

- dựa vào tiêu chí cảm quan

- chỉ tiêu hóa lý

- chỉ tiêu vi sinh

- chỉ tiêu an toàn

9

BÀI 2 ĐỊNH TÍNH TINH DẦU BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG

- Khảo sát hệ dung môi giải ly trong sắc ký lớp mỏng

- Định tính mẫu tinh dầu bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng

II NỘI DUNG THÍ NGHIỆM

Bước 1: Chuẩn bị vi quản

- Vi quản được hơ trên ngọn lửa xanh của đèn cồn, đồng thời xoay tròn để vi quản nóng chảy đều Khi thấy vi quản vừa nóng chảy: vừa đem vi quản tránh khỏi ngọn lửa, vừa kéo hai đầu ống ra xa; rồi giữ yên cho đến khi thủy tinh nguội

+ Lọc lấy dịch chiết bằng giấy lọc Dịch chiết dùng để chấm mẫu sắc ký

10

- Chuẩn bị hệ dung môi giải ly

+ Hệ dung môi n-hexan : ethyl acetat (7:3, theo thể tích);

+ Hệ dung môi methanol : acetone (3:2, theo thể tích);

+ Hệ dung môi n-hexan : acetone (7:3, theo thể tích);

+ Hệ dung môi n-hexan : diethyl ether (3:2, theo thể tích)

Bước 4: Chấm mẫu lên bản mỏng và giải ly bản mỏng

- Rót hệ dung môi dùng chạy sắc ký vào bình giải ly, chiều cao khoảng 2-3mm để điểm chấm mẫu không bị chìm vào dung môi Điều này đảm bảo rằng mẫu không tan trong dung môi và sẽ chạy trên bản mỏng cùng dung môi Trước khi cho bản mỏng vào, bình giải ly cần được bão hòa dung môi bằng cách phủ bề mặt trong của bình bằng một tờ giấy lọc, nghiêng đảo nhẹ bình giải ly để dung môi thấm ướt tờ giấy lọc

11

- Sử dụng ống vi quản chấm một số mẫu lên bản mỏng (các điểm này phải đồng tâm và

có đường kính khoảng 1-2mm, lượng mẫu khoảng 10µL), chấm xong để khô trong không khí;

- Dùng kẹp đặt bản mỏng vào bình giải ly đã chứa sẵn dung môi và chờ và quan sát bản mỏng thường xuyên (Lưu ý: không dịch chuyển hay chạm vào bản mỏng cũng như bình đựng vì có thể làm dung môi bị xáo trộn và ảnh hưởng đến quá trình di chuyển của dung môi)

- Khi dung môi chạm mức tiền tuyến dung môi (cách mép trên 0,5cm), gắp bản mỏng ra khỏi bình giải ly một cách cẩn thận

12

Bước 5: Hiện màu các vết sau giải ly và đánh giá các hệ dung môi giải ly

- Để dung môi bay hơi, sau đó quan sát bản mỏng dưới đèn UV, đánh dấu vị trí các điểm hiện ra bằng bút chì

13

- Quan sát trên bản mỏng và chọn hệ dung môi giải ly cho vết hiện tốt nhất

- Tiến hành kẹp miếng bảng mỏng và nướng trên bếp điện

14

III BÁO CÁO KẾT QUẢ

IV TRẢ LỜI CÂU HỎI

1 Nêu nguyên tắc và các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình định tính dịch sắc tố bằng

kỹ thuật sắc ký lớp mỏng?

Cơ chế của sự chia tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha động

Ðại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyển Rf được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung môi

2 Vai trò và ứng dụng của kỹ thuật sắc ký lớp mỏng trong nghiên cứu hợp chất tự nhiên?

Phương pháp sắc ký lớp mỏng được dùng để định tính, thử tinh khiết và đôi khi để bán

định lượng hoặc định lượng hoạt chất thuốc, là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt hỗn hợp các chất cần tách

3 Phương pháp lựa chọn hệ dung môi giải ly trong kỹ thuật sắc ký lớp mỏng?

Thường sử dụng một dung môi hay hệ dung môi, thường dùng hỗn hợp 2-3 dung môi (phải hòa lẫn hoàn toàn vào nhau), xác định được thứ tự độ phân cực tăng dần của dung môi là cực kì quan trọng và thường dùng là n-hexan Cloroform, aceton, butanol,…

15

4 Trình bày các phương pháp hiện vết (màu) trên bản mỏng?

Ðặt bản mỏng gần như thẳng đứng với bình triển khai, các vết chấm phải ở trên bề mặt của lớp dung môi khai triển Ðậy kín bình và để yên ở nhiệt độ không đổi Khi dung môi đã triển khai trên bản mỏng được một đoạn theo quy định trong chuyên luận, lấy bản mỏng ra khỏi bình, đánh dấu mức dung môi, làm bay hơi dung môi còn đọng lại trên bản mỏng rồi

hiện vết theo chỉ dẫn trong chuyên luận riêng Sử dụng đèn UV để hiện các vết rõ hơn

5.Nêu các lưu ý khi tiến hành kỹ thuật sắc ký lớp mỏng

Khi phân tích bằng sắc ký lớp mỏng luôn phải chấm chất đối chiếu bên cạnh vết chất thử với lượng tương tự như dự đoán có trong vết chất thử để so sánh kết quả về màu sắc, kích thước và giá trị Rf hoặc Rr trong cùng điều kiện

16

BÀI 3 TÁCH CHIẾT ALKALOID BẰNG DUNG MÔI HỮU CƠ

- Tách chiết Alkaloid (caffein) trong bột cà phê rang xay bằng dung môi Cloroform CHCl3 trong môi trường kiềm

- Định tính Alkaloid (Caffein) bằng thuốc thử thích hợp

Chiết Caffein từ bột cà phê bằng chloroform

Bước 1: Chuẩn bị mẫu:

- Cân 4,5 g bột cà phê rang xay và cốc thủy tinh 250mL (cốc A) Sau đó thêm 10mL dung dịch nước cất sôi khoảng 100oC vào cốc A Thêm 3g Na2CO3 vào hỗn hợp trong cốc A, khuấy đều khoảng 5 phút

17

- Lọc hỗn hợp trong cốc A, thu được dịch cà phê

- Chuyển toàn bộ dịch chiết cà phê vào phiễu chiết quả lê

Bước 2: Chiết lỏng lỏng bằng dịch cà phê bằng Chloroform Thêm 10Ml Chloroform và

phiễu chiết và lắc đều hỗn hợp Để phiễu đứng yên trong vòng đỡ (để hỗn hợp tách lớp khoảng 10 phút), mở khóa phễu chiết thu nhận chloroform ở lớp dưới

18

Bước 3: Cô đuổi dung môi thu nhận caffein

Dịch chiết Chloroform được cô đuổi dung môi thu nhận bột caffein thô

Định tính bột caffein thu được bằng sắc ký lớp mỏng

Bước 1: Chuẩn bị vi quản

Bước 2: Chuẩn bị bản mỏng sắc ký

Bước 4: Chuẩn bị dung dịch mẫu và dung môi giải ly

- Mẫu: cân 0,01g bột caffein thu được hòa tan trong 0,5mL chloroform;

- Mẫu tham chiếu: cân 0,1g caffein chuẩn hòa tan trong 5mL chloroform;

- Dung môi giải ly: hệ dung môi chloroform : ethyl acetat (5:1, theo thể tích)

20

Dùng H2SO4 10% phun lên miếng bản mỏng để xác định được Alkaloid

1 Kể tên một số thực vật chứa caffein? Công dụng của caffeein?

- Cây cà phê: Được trồng nhiều ở các quốc gia vùng nhiệt đới Hạt cây cà phê rang tới khi nâu đậm sẽ cho một mùi rất thơm và tỷ lệ caffein là 1 - 2%

- Cây chè (trà): Được trồng nhiều ở vùng Đông Nam Á, có hàm lượng caffein nhiều hay ít tùy chủng loại và cũng tùy theo cách chế biến Trung bình tỷ lệ caffein vào khoảng 4%

- Cây cola: trồng ở miền tây Ấn Độ và nhiều quốc gia nhiệt đới khác Hạt cây này có chứa khoảng 3% caffein

- Cây cacao: được trồng nhiều nước vùng nhiệt đới, nhưng chủ yếu là miền tây châu Phi Hạt cacao chứa một lượng caffein nhỏ nhưng nhiều chất béo và có mùi thơm đặc trưng

- Cây Guarana: Là một loại dây leo ở Brazin, cho lượng caffein khoảng 3,5%

 Công dụng của Caffein

- Kích thích hệ thần kinh trung ương, từ đó giúp tỉnh táo hơn và cung cấp và tăng cường năng lượng

- Giúp cơ thể loại bỏ lượng muối và nước bằng cách đi tiểu nhiều hơn Hoạt động như một thuốc lợi tiểu

- Tăng giải phóng axit trong dạ dày, đôi khi dẫn đến đau dạ dày hoặc ợ nóng

- Làm tăng huyết áp

- Ngoài ra, có thể cản trở sự hấp thụ canxi trong cơ thể

21

2 Alkaloid: phân loại theo cấu trúc, tính chất hóa lý, phương pháp định tính?

 Phân loại theo cấu trúc

Dựa vào bản chất của các dị vòng chứa nitơ, vị trí của nitơ trong phân tử hay dựa vào số hóa trị của nitơ, các alkaloid thường được chia thành các nhóm chính như sau:

+ Các alkaloid chứa nitơ trong hệ thống dị vòng và có nguồn gốc từ các acid amine Ví dụ: atropine, nicotine và morphine

+ Các protoalkaloid được xem là những amine có hoạt tính sinh học, chúng là những amine đơn giản, được tổng hợp từ các amino acid, trong đó nguyên tử nitơ không ở trong hệ thống

dị vòng Ví dụ, capsaicin trong quả ớt và ephedrine trong cây ma hoàng

+ Các alkaloid polyamine, ví dụ, spermidine Spermidine ban đầu được phân lập từ tinh dịch, như tên gọi của nó Nó là một hợp chất polyamine chuỗi tuyến tính đơn giản và được tìm thấy trong ribosome và các mô sống Polyamine là các amine aliphatic polycationic và đóng vai trò quan trọng trong sự sống của tế bào Chức năng chính của chúng trong cơ thể

là đồng bộ hóa một số quá trình sinh học (như Ca2+, Na+ , K+ -ATPase) ảnh hưởng đến màng tế bào, kiểm soát pH và thể tích nội bào

+ Peptide và cyclopeptide alkaloid

+ Pseudoalkaloid, không có nguồn gốc từ các acid amine, các alkaloid terpene và alkaloid steroid Solanidine là một ví dụ về một loại alkaloid chứa steroid, là một chất khá độc hại,

có thể ức chế hệ thần kinh Các hợp chất hoặc glycoside của nó được tìm thấy trong các cây thuộc họ Solanaceae, chẳng hạn như khoai tây

+ Các alkaloid giống như purine, ví dụ caffeine, theobromine và theophylline

Alkaloid là những hợp chất có tính base yếu, do sự có mặt của nguyên tử nitơ Tính base của các alkaloid cũng khác nhau tùy theo sự hiện diện của các nhóm thế R (mang các nhóm chức khác nhau) gắn trên nguyên tử nitơ

Alkaloid thường ở dạng muối với các acid hữu cơ có trong cây như acid acetic, acid oxalic, acid citric, acid malic và acid tartaric Các muối của alkaloid thì tan trong nước, alcol và hầu như không tan trong dung môi hữu cơ như chloroform, diethyl ether, benzene

Các alkaloid không có nguồn gốc từ amino acid thường dễ tan trong nước Các alkaloid ở dạng base tự do hầu như không tan trong nước, nhưng thường tan tốt trong dung môi hữu cơ như chloroform, diethyl ether, alcol bậc thấp

a Thuốc thử Mayer: Hòa tan 1,36g HgCl2 trong 60mL nước cất và hòa tan 5g

KI 10mL nước cất Hỗn hợp hai dung dịch và thêm nước cho đủ 100mL Nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer vào dung dịch acid loãng có chứa alkaloid, nếu có alkaloid sẽ xuất hiện tủa màu trắng hoặc vàng nhạt Cần chú ý vì tủa tạo thành

sẽ có thể hòa tan trở lại trong lượng thừa thuốc thử hoặc hòa tan bởi AcOH, ethanol có sẵn trong dung dịch thử

b Thuốc thử Dragendorff: Dung dịch thuốc thử dùng để định tính sự hiện diện

của alkaloid bằng ống nghiệm hoặc làm dung dịch phun xịt lên bản mỏng + Định tính bằng ống nghiệm: dung dịch acid loãng có chứa alkaloid đựng trong ống nghiệm, nhỏ vài giọt thuốc thử Dragendorff vào ống nghiệm nếu có alkaloid

sẽ xuất hiện tủa màu cam nâu (tủa alkaloid có thể được thu hồi bằng cách xử lý với Na2CO3 và chiết với diethyl ether)

+ Phun xịt lên tấm bản mỏng: Pha dung dịch phun xịt: trong một bình xịt, cho vào lần lượt theo thứ tự: 20mL nước; 5mL HCl 6N; 2mL dung dịch thuốc thử Dragendorff ở trên và 5mL NaOH 6N Sử dụng dung dịch này phun xịt lên bản mỏng, nếu có alkaloid sẽ cho vết màu cam - đỏ

c Thuốc thử Wagner: Nhỏ vài giọt thuốc thử Wagner vào dung dịch acid loãng

có chứa alkaloid, nếu có alkaloid sẽ xuất hiện tủa màu nâu

3 Nguyên tắc của kỹ thuật chiết lỏng- lỏng?

Nguyên tắc: Nguyên tắc của kỹ thuật chiết này là dựa trên cơ sở sự phân bố của

chất phân tích vào hai pha lỏng (2 dung môi) không trộn lẫn được vào nhau (trong hai dung môi này, có thể một dung môi có chứa chất phân tích) được để trong một dụng cụ chiết, như phễu chiết, bình chiết Và thế hệ số phân bố nhiệt động Kb của cân bằng chiết là một yếu tố quyết định hiệu quả của sự chiếtvà tiếp đến là sự ảnh hưởng của nhiệt độ, môi trường axit Và Kpb là hằng số nhiệt động Chiết theo kiểu này có hai cách là chiết tĩnh và chiết theo dòng chảy liên tục Trong phân tích, kiểu

tĩnh được ứng dụng nhiều hơn, và sự đơn giản của nó

4 Nêu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết Alkaloid bằng dung môi hữu cơ?

Tạp chất có trong mẫu chiết

Thao tác không chính xác

Xử lí mẫu không kĩ

Dung môi không tinh khiết

5 Nguyên lý hoạt động của hệ thống Soxlet?

Quá trình chiết Soxhlet được thực hiện bên trong một bộ chiết gọi là "bộ chiết Soxhlet", mỗi bộ gồm 3 bộ phận:bình chứa dung môi (solvent flask), ống chiết (extraction chamber) và ống sinh hàn (condenser) Sau khi tiền xử lý, mẫu sẽ được

23

đặt vào trong một đầu lọc (thimble), đầu lọc này sẽ được đặt vào trong ống chiết Khi đun nóng bình chứa, dung môi sẽ bay hơi lên trên về phía ống sinh hàn, tại đây dung môi sẽ chuyển sang trạng thái lỏng và rơi xuống mẫu nằm trong đầu lọc Ống chiết chứa mẫu sẽ dần dần được làm đầy bằng dung môi còn ấm, cho đến khi đầy thì toàn bộ dung môi chứa chất béo sẽ được chuyển về lại bình chứa thông qua ống siphon

Khi chất béo xuống bình chứa dung môi, chúng sẽ nằm đó và không tham gia vào các chu kỳ phía sau Chỉ có dung môi sạch tiếp tục bay hơi và tham gia vào chu

kỳ tiếp theo, đây là lợi thế chính của phương pháp chiết Soxhlet Sau nhiều chu trình trong nhiều giờ liền (6 ~ 24 giờ), bộ chiết Soxhlet sẽ được tháo ra và phần dung môi chứa chất chiết (chất béo) sẽ được cô cạn, giữ lại phần chất chiết để phân tích

II NỘI DUNG THỰC HÀNH

Bước 1: Chuẩn bị mẫu

- Lá cây xanh được rửa sạch, để ráo nước và cắt sợi nhỏ; Cân khoảng 5g lá cây đã cắt sợi nhỏ cho vào bộ cối chày sứ, nghiền nát với hỗn hợp gồm 22mL acetone và 3mL n-hexan

- Lọc lấy dung dịch trích ly bằng giấy lọc và cho toàn bộ dịch lọc vào phễu chiết quả lê;

n Rót dung môi vào cột (khoảng 1/3 chiều dài cột);

- Mở khóa cột cho dung môi thoát ra (từng giọt); đồng thời rót hỗn hợp silicagel và dung môi trong cốc thủy tinh vào cột sắc ký Vừa rót vừa gõ nhẹ vào cột

Bước 3: Nạp dịch chiết lá cây vào cột sắc ký

- Sử dụng pipet nhỏ giọt thêm từ từ n-hexan vào cột, mở khóa và hứng phần dung môi chảy

ra từ cột (liên tục cho n-hexan vào cột sắc ký);

- Sau khi sắc tố màu vàng ra được một đoạn tiến hành thay dung môi n-hexan bằng hệ dung môi n-hexan : acetone (7:3, theo thể tích) Lúc này sắc tố chlorophyl màu xanh lục sẽ bắt đầu di chuyển xuống dưới cột tạo thành hai lớp màu (màu vàng và xanh) Tiếp tục cho dung môi vào để thu từng dịch màu vào lọ bi