Báo cáo thí nghiệm chuyên Đề tổng hợp hữu cơ mã môn học 605027 bài hợp chất thiên nhiên

3-Công dụng : Chống khối u: các hợp chất polyphenol, flavonoid, quinone trong cây xạđen có tác dụng ức chế tế bào ung thư phát triển, hóa lỏng tế bào ung thư để chúng dễ dàng bị tiêu hủy

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CHUYÊN ĐỀ TỔNG HỢP HỮU CƠ

1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về lá xạ đen 3

1.2 Các phương pháp trích ly 5

1.2.1 Ngâm dầm 5

1.2.2 Chiết bằng Soxhlet 5

1.2.3 Chiết bằng phương pháp ngấm kiệt 6

1.2.4 Chiết bằng phương pháp ngấm kiệt ngược dòng 6

1.2.5 Chiết với sự hỗ trợ của siêu âm 7

1.2.6 Chiết với sự hỗ trợ của vi sóng 7

1.2.7 Chiết dưới áp suất cao 7

1.2.8 Các công trình nghiên cứu về trích ly và cô lập hợp chất có trong lá xạ đen 8 1.3 Tổng quan về các hợp chất có hoạt tính sinh học 8

1.3.1 Alkaloids 8

1.3.2 Flavonoids 10

1.3.3 Saponin 11

1.3.4 Steroids 11

2 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 12

2.1 Đo độ ẩm của nguyên liệu 12

2.2 Phương pháp chiết 4 cao 14

2.3 Phân tích sơ bộ hóa thực vật cao chiết 14

2.3.1 Cách pha thuốc thử 14

2.4 Cô lập hợp chất 19

2.4.1 Tiến trình sắc ký cột 19

2.4.2 Sơ đồ sắc ký cột 21

2.4.3 Kết quả 22

2.5 Kết luận báo cáo 24

1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về lá xạ đen

Tên khoa học:  Celastrus hindsii Benth

Tên gọi khác: Cây xạ đen hay còn gọi là cây ung thư

(theo dân tộc Mường ở tỉnh Hòa Bình), bạch vạn

hoa, cây bách giải, cây dây gối,

Đặc điểm thực vật: cây quả nâu, bách giải, bạch vạn hoa, thanh giang đằng,

dây gối, thuộc họ dây gối (Celastraceae) Ở nước ta, cây xạ đen mọc nhiều ở khuvực rừng núi, đặc biệt là tỉnh Hòa Bình, Thanh Hóa và Ninh Bình

Cây xạ đen là một loại thực vật dây leo và thân gỗ, dài khoảng 3 đến 10m Xạđen mọc thành bụi, nhưng cây non thường có màu xám nhạt và không có lông, còncây trưởng thành thì có màu xanh nâu và nhiều lông

Thành phần hóa học : Cây xạ đen có thành phần hóa học gồm những

polyphenol (axit lithospermic và axit lithospermic B, axit rosmarinic, kaempferol rutinoside, rutin); sesquiterpene và triterpene; các nhóm hợp chất khác như axit amin,quinone, flavonoid, tanin,

3-Công dụng :

Chống khối u: các hợp chất polyphenol, flavonoid, quinone trong cây xạđen có tác dụng ức chế tế bào ung thư phát triển, hóa lỏng tế bào ung thư để chúng

dễ dàng bị tiêu hủy, từ đó chống hình thành khối u và di căn

Chống oxy hóa: các chất hóa học có trong cây xạ đen có khả năng chống lạicác gốc tự do và làm suy giảm những tác hại của gốc tự do đối với tế bào

Chống nhiễm khuẩn: một số chất trong cây xạ đen, đặc biệt là hợp chấtsaponin triterpenoid có khả năng bảo vệ cơ thể trước tác nhân vi khuẩn xâm nhập

Cải thiện chức năng và giải độc cho gan: hoạt chất có trong cây xạ đen cóthể hỗ trợ điều trị xơ gan, viêm gan, men gan cao, chống lại các bệnh gan thứ phát

Cải thiện giấc ngủ và cảm giác ngon miệng: xạ đen tương đối tốt với người

bị suy nhược cơ thể, mất ngủ thường xuyên, bị thiếu máu Loại cây này còn có khảnăng cải thiện tuần hoàn máu, giúp hỗ trợ chữa trị chứng chóng mặt hoa mắt

1.2 Các phương pháp trích ly

1.2.1 Ngâm dầm

Ngâm bột đã trong bình chứa bằng thủy tinh hoặc thép không rỉ có nắp đậy Rótdung môi phủ lớp bột cây, để yên ở nhiệt độ phòng, dung môi sẽ ngấm dần vào nguyênliệu và hòa tan các chất tự nhiên Có thể gia tăng hiệu quả chiết xuất bằng cách khuấy bộtcây hoặc dùng máy lắc nhẹ Sau 24 giờ, dung môi trong bình được rót ra và đổ dung môimới vào

Ưu điểm: Quy trình đơn giản.

Nhược điểm:

 Sử dụng nhiều dung môi

 Chi phí cho dung môi lớn và chi phí cho cô quay loại dung môi lớn

 Không thể tách được tất cả các chất

1.2.2 Chiết bằng Soxhlet

Bộ dụng cụ Soxhlet được bán sẵn với nhiều kích cỡ

Muốn biết quá trình chiết đã cạn kiệt chưa, tháo phần ống ngưng hơi, dùng pipethút lấy vài giọt dung dịch trong bình chứa mẫu cây, nhỏ lên mặt kính hoặc giấylọc, để dung môi bay hơi hết để lại vết cắt trên bề mặt kính Nếu không thấy vết thì đãchiết kiệt, nếu thấy vết thì phải chiết thêm một thời gian nữa

Ưu điểm:

 Chỉ sử dụng một lượng ít dung môi mà vẫn có thể chiết kiệt được hoạt chất

 Sự ly trích tự động, liên tục nên nhanh chóng

Nhược điểm:

 Không chiết được một lượng lớn mẫu cây, nên chỉ thích hợp cho các nghiên

cứu trong phòng thí nghiệm

 Trong suốt quá trình chiết, mẫu cây luôn có nhiệt độ bằng nhiệt độ sôi của

dung môi nên những hợp chất kém bền nhiệt như carotenoid có thể bị thủy giải, phân giảihoặc tạo các hợp chất artefact

1.2.3 Chiết bằng phương pháp ngấm kiệt

Phương pháp ngấm kiệt là một trong những phương pháp trích ly được sử dụngphổ biến nhất vì không đòi hỏi nhiều thao tác cũng như thời gian

Dụng cụ gồm một bình ngấm kiệt, hình trụ đứng, bằng thủy tinh, ở dưới đáy bình

có van khóa để điều khiển tốc độ dung môi chảy ra Khi đã ngâm mẫu cây trongdung môi sau một thời gian nhất định, dung dịch chảy ra được hứng trong một erlen bêndưới, ở trên có một bình lóng chứa dung môi chảy vào bình ngấm kiệt này

Đây là quá trình chiết liên tục, dung môi sau khi đã bão hòa hoạt chất sẽ đượcliên tục thay thế bằng dung môi mới Tuy vậy người ta không thực hiện liên tục

mà mẫu cây được ngâm trong dung môi khoảng 1 - 2 ngày, cho dung môi bão hòa chảy rarồi mới cho dung môi mới vào tiếp tục thực hiện quá trình trích ly Để khảo sát sự chiếtxuất hoàn toàn chưa, người ta thường theo dõi bằng cách lấy dịch trích ly thử với thuốcthử đặc trưng với chất cần trích

1.2.4 Chiết bằng phương pháp ngấm kiệt ngược dòng

Là sự kết hợp giữa phương pháp ngấm kiệt và phương pháp ngâm dầm Bột câyđược cho vào nhiều bình chiết khác nhau, ví dụ có 3 bình A, B, C Cho dung môivào bình A, ngâm và lấy ra dung dịch A1, lấy dung dịch A1 để riêng Cho dung môi mớivào bình A, ngâm và lấy ra được dung dịch A2 Lấy dung dịch A2 làm dung môi đầu chobình B, tương tự như trên có được dung dịch B1 và dung dịch B2 Dung dịch B2 làm

dung môi đầu cho vào bình C, quá trình diễn ra tương tự như trên Như vậy, dung dịchđược chiết ra từ bình trước được dùng làm môi để ngâm bột cây của bình sau.

Đây là phương pháp được ứng dụng nhiều trong sản xuất lớn Phương pháp nàykhác với phương pháp ngấm kiệt là dịch chiết sau khi lấy ra không theo phươngpháp nhỏ giọt mà mở khóa cho chạy thẳng dòng sau khi ngâm một thời gian

1.2.5 Chiết với sự hỗ trợ của siêu âm

Sóng siêu âm với tần số trên 20Hz có tác dụng làm tăng sự hòa tan của chất tanvào dung môi và tăng quá trình khuếch tán chất tan Sóng siêu âm cường độ caocũng có thể phá vỡ cấu trúc tế bào, thúc đẩy quá trình chiết

Thường được sử dụng trong chuẩn bị mẫu phân tích thay cho phương pháp ngâmlạnh hay chiết Soxhlet cổ điển Trong chiết siêu âm, hỗn hợp chiết với dung môi phân cực

sẽ nóng lên Tuy nhiên, người ta cũng có thể gia nhiệt để quá trình chiết được nhanh hơn

Trong chiết xuất ở quy mô lớn, đầu phát siêu âm thường được nhúng trực tiếp vàobình chiết chứa dược liệu Do khả năng xuyên sâu kém nên sử dụng thường ở quy môphòng thí nghiệm

1.2.6 Chiết với sự hỗ trợ của vi sóng

Trong chiết xuất, chiếu xạ vi sóng (bức xạ điện từ ở tần số 2450 MHz) vào môitrường có chứa các tiểu phân dược liệu và dung môi phân cực, các phân tử này sẽ chịuđồng thời 2 tác động: sự dẫn truyền ion và sự quay lưỡng cực dưới tác dụng của điệntrường → làm sinh ra nhiệt trong lòng khối vật chất, làm tăng khả năng hòa tan các chấtvào dung môi

Vi sóng cũng phá hủy cấu trúc vách tế bào thực vật làm các chất tan giải phóngtrực tiếp vào dung môi chiết → quá trình chiết chuyển thành hòa tan đơn giản → chiếtnhanh hơn nhưng cũng làm dịch chiết nhiều tạp chất hơn

1.2.7 Chiết dưới áp suất cao

Khi nhiệt độ tăng, khả năng hòa tan các chất tăng → giảm lượng dung môi sửdụng và giảm thời gian chiết Tuy nhiên, trong điều kiện bình thường, việc tăng nhiệt độ

để chiết có giới hạn của nó là nhiệt độ sôi của dung môi Khi hóa hơi, dung môi không cókhả năng hòa tan các chất nữa Để khắc phục điều này, người ta tiến hành chiết các chấtdưới áp suất cao dựa vào nguyên tắc: nhiệt độ sôi của chất lỏng tăng khi áp suất tăng

Khi nhiệt độ tăng lên 10 , khả năng hòa tan của dung môi tăng lên gấp rưỡi.℃Trong chiết dưới áp suất, dung môi chiết được đưa tới nhiệt độ và áp suất gần với vùngtới hạn Nhiệt độ và áp suất cao làm tăng khả năng hòa tan và khuếch tán của dung môi

để cho việc chiết xuất hiệu quả hơn

1.2.8 Các công trình nghiên cứu về trích ly và cô lập hợp chất có trong lá xạ đen

Đái Thị Xuân Trang và cộng sự, Tối ưu hoá quy trình trích ly cao chiết lá

xạ đen (Celastrus hindsii) giàu polyphenol, flavonoid có hoạt tính kháng oxy hoá và kháng đái tháo đường in vitro, Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, năm

2022

Vũ Lệ Quyên và cộng sự, Ảnh hưởng của điều kiện tách chiết đến hoạt tính

chống oxy hoá của cây xạ đen (Celastrus hindsu benth) trồng tại Khánh Hoà, Tạp chí

Công thương, năm 2020

Phạm Đình Chương và cộng sự, Optimization of Ultrasound-Assisted

Extraction of Flavonoids from Celastrus hindsii Leaves Using Response Surface Methodology and Evaluation of Their Antioxidant and Antitumor Activities, Hindawi

BioMed Research International, 2020

1.3 Tổng quan về các hợp chất có hoạt tính sinh học

1.3.1 Alkaloids

Khái niệm: Alkaloids là hợp chất hữu cơ, có chứa Nito, có phản ứng kiềm, được

tổng hợp từ thực vật

Phân loại:

Theo tác dụng dược lý: trị sốt rét, an thần, tạo ảo giác,

Theo taxon thực vật: họ Fabaceae, chi Atropa, Datura,

Theo nguồn sinh vật: động vật, thực vật, rêu, nấm,

Theo nguồn acid amin: từ tyr, tryp, orn, lys, his,

Theo bậc Nito: N bậc I, II, III, IV, N-oxyd,

Theo đường sinh tổng hợp: pseudo-, proto-, alk.thực

Theo cấu trúc hóa học: purin, tropan, quinolin, indol,

Hoạt tính sinh học:

Đối với sinh vật:

Là những chất chuyển hóa thứ cấp, chất bài tiết hoặc là sản phẩm cuối trong quátrình chuyển hóa của thực vật

Là những chất dự trữ Nitơ, tham gia vào chu trình Nitơ trong thực vật

Đôi khi là những chất tích lũy dần từ thức ăn

Là những chất bảo vệ, chống các sinh vật ăn thực vật

Là vũ khí hóa học trong tự vệ, cần trong quá trình sinh tồn nhất là ở động vật

Đối với con người: 

Alkaloid thường có hoạt tính sinh học mạnh đến rất mạnh Khá nhiều chất được sử dụngtrong y học

Một số chất dùng làm chất độc dùng trong săn bắn

Một số chất quá độc, không dùng trong y học

Nhiều chất có thêm tác động nguy hại đến xã hội

Đối với y học: 

Khi thực vật có nhóm alkaloid, thì tác dụng của dược liệu thường do nhóm

alkaloids (trong đó thường do 1 alkaloids chủ yếu).

Trên hệ thần kinh:

Kích thích, ức chế thần kinh trung ương;

Kích thích trực giao cảm;

Liệt trực giao cảm;

Kích thích đối giao cảm; Liệt đối giao cảm

 Trên các cơ quan khác: Gây tê; Giảm đau; Giảm ho; Giảm co thắt; Trị sốt rét; Diệt

giun sán; Diệt khuẩn;Hạ huyết áp; Trị ung thư.     

1.3.2 Flavonoids

Khái niệm: Flavonoids là nhóm hợp chất lớn, gặp nhiều trong thực vật Là nhóm

hợp chất tự nhiên thường gặp trong dược liệu nguồn gốc thực vật Phần lớn các chấtflavonoids có màu vàng Tuy nhiên, một số có màu xanh, tím, đỏ, một số khác không cómàu

Cấu trúc: Flavonoids có khung cơ bản gồm vòng benzen A và B nối với nhau quamột mạch 3 carbon

Phân loại: sự phân loại flavonoid dựa vào vị trí gốc aryl (vòng B) và các mức độ

oxy hóa của mạch 3C

Eu-Flavonoid: Flavon, Flavonol, Flavanon, Flavanonol;

Iso-Flavonoid: isoflavon, isoflavanon, isoflavan;

Neo- Flavonoid;

Bi- Flavonoid; Cấu trúc khác

Hoạt tính sinh học:

Đối với thực vật:

Dẫn dụ côn trùng, giúp cho sự thụ phấn;

Bảo vệ cây: khỏi tia UV từ mặt trời, côn trùng, nấm mốc, vi sinh vật;

Ức chế enzym, điều hòa sinh trưởng

Đối với con người:

Khả năng dập tắt các gốc tự do, chống oxy hóa;

Tác dụng làm bền thành mạch, tăng tuần hoàn máu;

Giảm tổn thương, bảo vệ chức năng gan;

Chống co thắt, chống loét;

Kháng viêm, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng ung thư, kháng virus;

Thuốc dùng cho những người não suy: rối loạn trí nhớ, mất tập trung, có tác dụng

an thần.     

1.3.3 Saponin

Khái niệm: là một nhóm hợp chất tự nhiên thường gặp trong thực vật Chữ “sapo”

có nghĩa là xà phòng Người ta biết khoảng 500 loài thuộc 80 họ thực vật có saponin

Phân loại: người ta chia làm 2 loại dựa theo cấu trúc hóa học: Saponin

triterpenoid; Saponin steroid

Hoạt tính sinh học:

Long đờm, chữa ho;

Thuốc bổ, tăng cường sinh lực;

Giảm đau nhức xương;

Hạ cholesterol máu;

Lợi tiểu;

Chống viêm, kháng khuẩn, kháng nấm, ức chế virus;

Chống ung thư

1.3.4 Steroids

Khái niệm: là một loại hợp chất hữu cơ có chứa một sự sắp xếp đặc trưng của bốn

vòng cycloalkane được nối với nhau

Các steroid trong tự nhiên: Sterol: Cholesterol, ergosterol; Acid mật; Các

hormone; Glycosid tim; Saponin; Steroid alkaloid.     

2 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

2.1 Đo độ ẩm của nguyên liệu

Độ ẩm được đo bằng máy

Đem đi ngâm nóng ở 50°C trong 4h Sau đó lấy ra đem đi

lọc rồi thêm ethyl acetate, chloroform tiếp tục ngâm trong 4h ở

50°C

 

  

Đem hỗn hợp đó đi cô quay, thu được cao tổng. 

Bỏ n-hexan vào rồi lắc với dung môi, tiếp tục đem đi cô

quay sẽ thu được cao  n-hexan

Cô quay hỗn hợp

       

2.2     Phương pháp chiết 4 cao

Chiết

cao tổng

Lấy cao tổng cho vào bình chiết Để yên chiết

trong 20 phút, sau đó đem ra lắc 5 phút Sau khi

chiết thu được cao

 Cho cao vào bình chiết vàtiến hành chiết

Làm tương tự như trên với cao n - hexan (n - hexan còn lại bỏ vào bình), cao ethylacetate

2.3 Phân tích sơ bộ hóa thực vật cao chiết

2.3.1 Cách pha thuốc thử

2.3.1.1 Thuốc thử Wagner:

Cân 5g KI cho vào bencher hòa tan với 10 mL H2O, song song với đó, cân1.35g HgCl2 vào becher hòa tan với 60 mL H2O Sau đó, trộn hai hỗn hợp trên lại vớinhau, cho vào bình định mức 100 mL, tráng sạch cả hai bencher, nước tráng cho vàobình, cuối cùng định mức bình 100 mL bằng nước cất

2.3.1.2 Thuốc thử Mayer

Cân 2g I2 cho vào bencher, giữ becher, tiếp tục cân thêm 6g KI Cuối cùng, lấyống đong, đong 100 mL H2O cho vào becher chứa hỗn hợp 2 chất trên, khuấy đều để hòatan hỗn hợp

Không hiện tượng Không hiện tượng Không hiện tượng

Kết luận: Trong cao ethyl acetate không có thành phần alkaloid

2.3.2.2 Định tính phytosterol

Cho khoảng 1mL acid acetic vào ống nghiệm, dùng đũa lấy một lượng nhỏ caotrích ethylacetate cho vào, lắc đều, sau đó cho thêm 3 mL anhydrid acetic Cuối cùng, đểnghiêng ống nghiệm, cho một giọt H2SO4 đđ lên thành ống, dựng đứng ống nghiệm đểdung dịch từ từ đi xuống, không lắc ống nghiệm, để yên, quan sát

3mL  1 giọt Không có hiện tượng

Kết luận: hợp chất phytosterol có nhiều trong dung môi kém phân cực 

2.3.2.3 Định tính Flavanoid

Cho 1 mL ethanol vào ống nghiệm, dùng đũa lấy một lượng nhỏ cao trích ethylacetatecho vào, sau đó cho thêm một ít bột Mg, lắc đều Cuối cùng, để nghiêng ống nghiệm, chomột giọt HCl đđ lên thành ống, dựng đứng ống nghiệm để dung dịch từ từ đi xuống,không lắc ống nghiệm, để yên, quan sát

Ethanol Bột

Mg

HClđđ

n-Cao ethyl acetate

Cao tổng

Cao nước 

Kết tủa vàng đục

ống thủy tinh đường kính

khoảng 50mm trở lên, chiều cao từ 50cm – 1m

phía dưới có vòi

-Cột được rửa sạch rồi tráng bằng ethanol và sấy

khô, gắn lên giá đỡ

-Chuẩn bị một becher đã có chứa sẵn 7,5g silicagel

cho vào tủ sấy trong vòng 15p

 -Cho 25mL hỗn hợp dung môi n-hexan : etyl

axetat tỷ lệ 9:1 vào silicagel đã sấy khô rồi khuất

cột, ngâm bông gòn trước

trong cột với dung môi hexan etylacetat, sau đó xảcột và đồng thời cho chất hấp phụ là silicagel dạngsệt cho vào cột vừa mở nhẹ khóa bên dưới cột đểcho dung môi chảy ra hứng vào 1 becher trống đểkiểm tra silicagel có bị tuột trôi qua lớp bông gòn,nếu không có thì sử dụng lại dung môi này rót lạiđầu vào cột

-Bên cạnh đó dùng đũa khuấy nhẹ lên thành cột đểhạn chế tối đa sự hình thành bọt khí, giúp nén đềutrong cột và chất hấp thụ không bị bám dính trênthành cột

-Đổ một lần, nhẹ nhàng để

tránh làm nứt cột, tuyệt đối

không được để cột khô nên

phải liên tục đổ dung môi

vừa hứng được ở đầu ra, rót

lại đầu vào của cột

Nạp

mẫu

-Cao thìa canh lá to được

hòa tan hoàn toàn, sấy khô,

sau đó cho vào cột nhẹ nhàng để lớp cao thìa canh

lá to nằm trên lớp silicagel

-Nạp mẫu xong mở khóa cột

chậm để toàn bộ dung dịch mẫu thấm đều vàosilicagel,

tuyệt đối không được để khô