i ĐẠI HỌC HUẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ĐOÀN MẠNH DŨNG NGHIÊN CỨU TÁCH, ĐIỀU CHẾ CHẤT CHUẨN VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH MỘT SỐ HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Huế[.]
ĐẠI HỌC HUẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ĐOÀN MẠNH DŨNG NGHIÊN CỨU TÁCH, ĐIỀU CHẾ CHẤT CHUẨN VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH MỘT SỐ HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Huế - Năm 2020 i ĐẠI HỌC HUẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ĐOÀN MẠNH DŨNG NGHIÊN CỨU TÁCH, ĐIỀU CHẾ CHẤT CHUẨN VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH MỘT SỐ HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC Ngành: Hóa Phân tích Mã số: 44 01 18 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Đình Luyện PGS TS Nguyễn Hữu Tùng Huế - Năm 2020 ii LỜI CAM ĐOAN Luận án đƣợc hoàn thành Trƣờng Đại học Khoa học, Đại học Huế, dƣới hƣớng dẫn PGS.TS Nguyễn Đình Luyện PGS.TS Nguyễn Hữu Tùng Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu Các kết luận án trung thực, đƣợc đồng tác giả cho phép sử dụng chƣa đƣợc cơng bố trƣớc Tác giả Đoàn Mạnh Dũng i LỜI CẢM ƠN Luận án đƣợc hoàn thành dƣới hƣớng dẫn tận tình đầy tâm huyết Thầy Nguyễn Đình Luyện Thầy Nguyễn Hữu Tùng Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến PGS TS Nguyễn Đình Luyện - Trƣờng Đại học Sƣ phạm – Đại học Huế, PGS.TS Nguyễn Hữu Tùng Trƣờng Đại học Quốc gia Hà Nội ngƣời giao đề tài, tận tình hƣớng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi suốt thời gian học tập nghiên cứu Đặc biệt tơi xin tỏ lịng kính trọng với GS TS Trần Đình Thắng – Trƣờng Đại học Vinh, ngƣời Thầy dìu dắt, hỗ trợ điều kiện tốt cho đƣờng nghiên cứu khoa học Nhân dịp này, tác giả xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu Trƣờng Đại học Khoa học, Đại học Huế, Phịng Sau đại học, Khoa Hóa học q thầy cô giáo giảng dạy lớp nghiên cứu sinh tận tình giúp đỡ tơi hồn thành luận án Tác giả xin chân thành cảm ơn bạn đồng nghiệp gần xa giúp đỡ, động viên, khích lệ tác giả suốt trình làm luận án Cuối cùng, tác giả xin dành tình cảm đặc biệt đến gia đình, ngƣời thân ngƣời bạn tác giả, ngƣời mong mỏi, động viên tiếp sức cho tác giả để hoàn thành luận án Tác giả Đoàn Mạnh Dũng ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN I LỜI CẢM ƠN II MỤC LỤC III KÝ HIỆU VIẾT TẮT V DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU VII DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ IX MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học số thuốc 1.1.1 Giới thiệu chung 1.1.2 Các nghiên cứu tách chiết số hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học .5 1.1.3 Một số loài thuốc chứa hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học 1.2 Các phƣơng pháp phân tích hợp chất thiên nhiên 11 1.2.1 Phƣơng pháp sắc ký khí 11 1.2.2 Phƣơng pháp sắc ký lỏng 12 1.3 Một số nghiên cứu liên quan đến luận án 16 Chƣơng NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu 22 2.2 Nội dung nghiên cứu 23 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 25 2.3.1 Thông tin mẫu 25 2.3.2 Phƣơng pháp chiết tách/phân lập 27 2.3.3 Phƣơng pháp xác định cấu trúc đặc trƣng hóa - lý HCTN 29 2.3.4 Phƣơng pháp tinh chế hctn để tạo chất chuẩn 29 2.3.5 Phƣơng pháp đánh giá độ tinh khiết chất chuẩn liệu chất chuẩn 30 2.3.6 Phƣơng pháp phân tích HCTN 30 2.3.7 Phƣơng pháp đánh giá độ tin cậy phƣơng pháp phân tích 32 iii 2.3.8 Phƣơng pháp xử lý số liệu 34 2.4 Thiết bị, dụng cụ hóa chất 24 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Chiết tách xác định cấu trúc hợp chất thiên nhiên 35 3.1.1 Chiết tách HCTN từ Diệp hạ châu đặc trƣng cấu trúc 35 3.1.2 Chiết tách HCTN từ Đan sâm đặc trƣng cấu trúc 42 3.1.3 Chiết tách HCTN từ Mật nhân đặc trƣng cấu trúc 49 3.2 Tinh chế hợp chất thiên nhiên để tạo chất chuẩn 53 3.2.1 Chất chuẩn hypophyllanthin phyllanthin 54 3.2.2 Chất chuẩn tanshinone I, cryptotanshinone, tanshinone IIA 55 3.2.3 Chất chuẩn eurycomanone 57 3.3 Quy trình phân tích hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học 58 3.4.1 Tính ổn định hệ thống thiết bị 65 3.4.2 Độ đặc hiệu phƣơng pháp phân tích 69 3.4.3 Khoảng tuyến tính 72 3.5 Áp dụng thực tế 79 3.5.1 Kiểm soát chất lƣợng phƣơng pháp phân tích 79 3.5.2 Hàm lƣợng hctn mẫu thực tế 86 3.6 Các hợp chất acetogenin chiết tách từ Mãng cầu xiêm 92 3.6.1 Xác định phân đoạn giàu hoạt chất acetogenin 94 3.6.2 Định tính acetogenin phân đoạn AMF-3 95 3.6.3 Định lƣợng acetogenin phân đoạn AMF-3 97 3.7 Hàm lƣợng tinh dầu chiết tách từ Riềng đuôi nhọn 98 KẾT LUẬN .105 TÀI LIỆU THAM KHẢO 109 Danh mục cơng trình cơng bố kết nghiên cứu luận án 107 PHỤ LỤC 122 iv KÝ HIỆU VIẾT TẮT Viết tắt Tiếng Việt ACN ACRS Acetonitril Chất chuẩn đối chiếu hóa Asean học ASEAN AOAC Reference Substance Analytical Chemists Hiệp hội nƣớc Đông Association of Southeast Nam Á CCĐC Chemical Hiệp hội nhà khoa Association of Official học Phân tích Hoa Kỳ ASEAN Tiếng Anh Asian Nations Chất chuẩn đối chiếu CE Điện di mao quản Capillary Electrophoresis DAD Detector chuỗi diot Diot Array Detector ESI-MS Khối phổ - ion hóa phun Electron Spray Ionisation – Mass Spectrometry mù electron EtOAc Ethyl acetat EtOH Ethanol FLD Detector huỳnh quang Fluorescence Detector GC Sắc kí khí Gas Chromatography GC-MS Sắc ký lỏng ghép nối Gas Chromatography – khối phổ Mass Spectrometry HCTN Hợp chất thiên nhiên HPLC Sắc kí lỏng hiệu cao High Performance Liquid Chromatography HPLC-MS Sắc kí lỏng - khối phổ High Performance Liquid Chromatography– Spectrometry HTSH Hoạt tính sinh học Bioactive HCTN Hợp chất thiên nhiên Natural compounds v Mass Viết tắt LC-MS/MS Tiếng Việt Tiếng Anh Sắc ký lỏng ghép lần Liquid khối phổ Chromatograph Tandem Mass Spectrometer LOD Giới hạn phát Limit of detection LOQ Giới hạn định lƣợng Limit of quantity MeOH NMR Methanol Cộng hƣởng từ hạt nhân Nuclear Magnetic Resonance NPLC Sắc ký lỏng pha thuận Normal Phase Liquid Chromatography PPPT Phƣơng pháp phân tích Analysis method PTN Phịng thí nghiệm Laboratory Sắc ký lỏng pha đảo Reversed Phase Liquid RPLC Chromatography RSD Độ lệch chuẩn tƣơng đối Relative Standard Deviation SKĐ Sắc kí đồ SPE Chiết pha rắn TCCL TLC Solid Phase Extraction Tiêu chuẩn chất lƣợng Sắc kí lớp mỏng Thin Layer Chromatography UV-Vis VQG Tử ngoại – khả kiến Vƣờn quốc gia vi Ultraviolet – Visible DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Một số cơng trình nghiên cứu liên quan đến đề tài nghiên cứu 17 Bảng 3.1 Dữ liệu phổ NMR PU-1 so sánh với công bố tài liệu 39 Bảng 3.2 Dữ liệu phổ NMR PU-2 so sánh với công bố tài liệu 41 Bảng 3.3 Dữ liệu phổ NMR SM-1 so sánh với công bố tài liệu 46 Bảng Dữ liệu phổ NMR SM-2 so sánh với công bố tài liệu .47 Bảng 3.5 Dữ liệu phổ NMR SM-3 so sánh với công bố tài liệu .48 Bảng 3.6 Dữ liệu phổ NMR EL-1 so sánh với công bố tài liệu 52 Bảng 3.7 Dữ liệu đánh giá độ tinh khiết chất chuẩn hypophyllanthin phyllanthin .54 Bảng 3.8 Dữ liệu đánh giá độ tinh khiết chất chuẩn tanshinone I, cryptotashinone tanshinone IIA 56 Bảng 3.9 Dữ liệu đánh giá độ tinh khiết chất chuẩn eurycomanone 57 Bảng 3.10 Kết khảo sát tính ổn định hệ thống thiết bị LC-MS/MS phân tích đồng thời hypophyllanthin phyllanthin .67 Bảng 3.11 Kết khảo sát độ ổn định hệ thống thiết bị LC-MS/MS phân tích đồng thời tanshinone I, cryptotanshinone tanshinone IIA .68 Bảng 3.12 Kết khảo sát độ ổn định hệ thống thiết bị LC-MS/MS phân tích Eurycomanone 69 Bảng 3.13 Kiểm tra độ lặp lại phƣơng pháp LC-MS/MS UPLC-DAD phân tích đồng thời hypophyllanthin phyllanthin, phân tích Eurycomanone 80 Bảng 3.14 Kết đánh giá độ lặp lại PP LC-MS/MS UPLC-DAD .81 Bảng 3.15 Kết kiểm tra độ phƣơng pháp LC-MS/MS hypophyllanthin phyllanthin 83 Bảng 3.16 Kết kiểm tra độ phƣơng pháp LC-MS/MS tanshinone I, cryptotanshinone tanshinone IIA 84 Bảng 3.17 Dữ liệu xác định giá trị LOD hợp chất hypophyllanthin, phyllanthin eurycomanone 86 Bảng 3.18 Dữ liệu xác định giá trị LOD hợp chất tanshinone I, cryptotanshinone tanshinone IIA 86 vii Bảng 3.19 Hàm lƣợng (mg/g) hypophyllanthin phyllanthin mẫu thực phẩm chức bào chế từ Diệp hạ châu 88 Bảng 3.20 Hàm lƣợng (mg/g) tanshinone I, tanshinone IIA cryptotanshinone mẫu Đan sâm 90 Bảng 3.21 Hàm lƣợng (mg/g) eurycomanone Mật nhân địa phƣơng khác 91 Bảng 3.22 Phƣơng trình đƣờng thêm chuẩn LOD, LOQ phƣơng pháp phân tích .98 Bảng 3.23 Hàm lƣợng (%) cấu tử nhóm hợp chất có mặt tinh dầu chiết tách từ phận Riềng đuôi nhọn 102 viii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 3.1 Cơng thức cấu tạo hypophyllanthin 38 Hình 3.2 Cơng thức cấu tạo phyllanthin 40 Hình 3.3 Cơng thức cấu tạo cryptotanshinone 45 Hình 3.4 Cơng thức cấu tạo tanshinon IIA 47 Hình 3.5 Công thức cấu tạo Tanshinon I 48 Hình 3.6 Cơng thức cấu tạo Eurycomanone .52 Hình 3.7 Sắc đồ xác định độ tinh khiết hypophyllanthin: 55 Hình 3.8 Sắc đồ xác định độ tinh khiết phyllanthin: 55 Hình 3.9 Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh tanshinone I: 56 Hình 3.10 Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh cryptotanshinone: 56 Hình 3.11 Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh tanshinone IIA .57 Hình 3.12 Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết hợp chất eurycomanone: 58 Hình 3.13 Phổ ESI-MS hợp chất hypophyllanthin 59 Hình 3.14 Phổ ESI-MS hợp chất phyllanthin 59 Hình 3.15 Quy trình phân tích đồng thời hypophyllanthin phyllanthin phƣơng pháp LC-MS/MS, UPLC-DAD 60 Hình 3.16 Phổ ESI-MS hợp chất tanshinone I 62 Hình 3.17 Phổ ESI-MS hợp chất cryptotanshinone 62 Hình 3.18 Phổ ESI-MS hợp chất tanshinone IIA 62 Hình 3.19 Quy trình phân tích đồng thời tanshinone I, cryptotanshinone tanshinone IIA phƣơng pháp LC-MS/MS, UPLC-DAD 63 Hình 3.20 Quy trình phân tích eurycomanone phƣơng pháp LC-MS/MS 64 Hình 3.21 Phổ ESI-MS hợp chất eurycomanone 65 Hình 3.22 Sắc đồ LC-MS/MS dung dịch chuẩn chứa: (a) hypophyllanthin, ứng với nồng độ khác (b) phyllanthin, ứng với nồng độ khác (c) hypophyllanthin phyllanthin 70 Hình 3.23 Sắc đồ LC-MS/MS dung dịch chuẩn chứa: (a) tanshinone I, ứng với nồng độ khác nhau; (b) cryptotanshinone, ứng với nồng độ khác nhau; (c) tanshinone IIA, ứng với nồng độ khác nhau; (d) tanshinone I, cryptotanshinone tanshinone IIA 71 Hình 3.24 Sắc đồ LC-MS/MS đối vơi dung dịch chuẩn chứa: eurycomanone, ứng ix với nồng độ khác 72 Hình 3.25 Đƣờng hồi quy tuyến tính hypophyllanthin phƣơng pháp LC-MS/MS 74 Hình 3.26 Đƣờng hồi quy tuyến tính phyllanthin phƣơng pháp LCMS/MS 74 Hình 3.27 Đƣờng hồi quy tuyến tính (a) hypophyllanthin (b) phyllanthin phƣơng pháp UPLC-DAD .74 Hình 3.28 Đƣờng hồi quy tuyến tính tanshinone I phƣơng pháp LCMS/MS 76 Hình 3.29 Đƣờng hồi quy tuyến tính cryptotanshinone phƣơng pháp LC-MS/MS 77 Hình 3.30 Đƣờng hồi quy tuyến tính tanshinone IIA phƣơng pháp LC-MS/MS 77 Hình 3.31 Đƣờng hồi quy tuyến tính (a) tanshinone I (b) cryptotanshinone (c) tanshinone IIA phƣơng pháp UPLC-DAD 78 Hình 3.32 Đƣờng hồi quy tuyến tính eurycomanone phƣơng pháp LC-MS/MS 78 Hình 3.33 Sắc đồ mẫu DHC-VX .87 Hình 3.34 Sắc đồ mẫu Diệp hạ châu .89 Hình 3.35 Sắc đồ mẫu Đan sâm Sapa 89 Hình 3.36 Sắc đồ (a) mẫu Mật nhân Hà Giang; (b) mẫu Mật nhân Bắc Giang 91 Hình 3.37 Quy trình phân tích định tính, định lƣợng hợp chất acetogenin từ dịch chiết Mãng cầu xiêm 93 Hình 3.38 Phổ 1H-NMR phân đoạn AMF-3 dung môi CDCl3 95 Hình 3.39 Sắc đồ HPLC-PDA phân đoạn AMF-3 96 Hình 3.40 Phổ MALDI-TOF-HRMS hợp chất acetogenin phân đoạn AMF-3 .97 Hình 3.41 Quy trình phân tích định tính, bán định lƣợng hợp chất tinh dầu chiết tách từ phận Riềng đuôi nhọn 100 x MỞ ĐẦU Việt Nam nằm khu hệ thực vật phong phú giới, khu vực rừng nhiệt đới Đông Nam Á Với bờ biển dài 3200 km đƣờng biên giới đất liền dài tới 4630 km, rừng núi chiếm 3/4 diện tích nƣớc, đất nƣớc ta sở hữu nguồn tài nguyên động thực vật vô phong phú Theo tài liệu cơng bố, có khoảng 12000 loài thực vật hữu Việt Nam [6], [7], [10], [20], [24] Theo thống kê Phan Kế Lộc có 10386 lồi thực vật bậc cao có mạch thuộc 2257 chi 305 họ (trong có 733 lồi gặp trồng trọt) [26] Những nghiên cứu phát thuốc từ nguồn thảo dƣợc Việt Nam nhằm giúp chủ động nguồn nguyên liệu sẵn có đƣợc ý thực Một phần thuốc đại hợp chất thiên nhiên dẫn xuất chúng đƣợc sử dụng trực tiếp công nghiệp dƣợc chúng đƣợc phát triển ứng dụng nhanh châu Âu Bắc Mỹ Các chƣơng trình sử dụng thuốc cổ truyền nƣớc phát triển nhƣ Mexico, Trung Quốc Nigeria đƣợc xúc tiến mạnh mẽ đặc biệt sử dụng chúng để hỗ trợ điều trị bệnh thực phẩm chức [8], [10], [21] Các nội dung nghiên cứu HCTN có hoạt tính sinh học (i) Xây dựng quy trình tách chiết thích hợp để thu đƣợc hợp chất có HTSH có giá trị cho ngành dƣợc, cơng nghệ sinh học, y sinh ; (ii) Tách chiết tinh chế để thu đƣợc HCTN có HTSH làm chất chuẩn để định lƣợng chúng loài thuốc (thực vật nói chung) khác nhau; (iii) Xây dựng quy trình phân tích (định tính định lƣợng) HCTN có HTSH đối tƣợng mẫu khác nhau; (iv) Phân tích cấu trúc xác định HTSH hợp chất mới; (v) Nghiên cứu xác định HTSH hợp chất thiên nhiên ứng dụng chúng vào lĩnh vực khác Nhiều nghiên cứu giới Việt Nam tách HCTN có HTSH từ Diệp hạ châu, Đan sâm, Mật nhân sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột phân tích hàm lƣợng HPLC [18], [27], [31] Một số nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích HCTN có HTSH nhƣ acetogenin [46], [51], [90], tinh dầu phƣơng pháp GC-MS, LC-MS/MS [33] Mặt khác, gần đây, số nghiên cứu loài annona, bao gồm Mãng cầu xiêm (A muricata) cho thấy chúng có chứa nguồn phong phú hợp chất acetogenin annonaceous (AGEs) [98] Các nghiên cứu thuộc chi Riềng cho thấy loài chứa nhiều hợp chất có HTSH có giá trị nhƣ camphor, camphen, borneol bornyl acetat,… đƣợc sử dụng rộng rãi làm hƣơng liệu mĩ phẩm, thực phẩm làm gia vị ăn [33] Cho đến nay, có vài nghiên cứu tập trung phân tích nhóm chất có HTSH acetogenin Mãng cầu xiêm phân tích hợp chất tồn Riềng nhọn [46], [51], [70], [89], [90] Song, chƣa có nghiên cứu xác định đƣợc hàm lƣợng chất có HTSH phân cây, để định hƣớng cho nghiên cứu tách chiết hợp chất có giá trị từ phận riêng biệt - Về hƣớng (ii) – tinh chế để thu đƣợc chất tinh khiết đƣợc nhiều nghiên cứu quan tâm, song chủ yếu PTN/các hãng dƣợc chuyên ngành nghiên cứu giá thành chất chuẩn có HTSH đắt Trong đó, VN, nay, nghiên cứu theo hƣớng hạn chế Xuất phát từ vấn đề trên, luận án đƣợc thực nhằm mục đích đóng góp tích cực vào hƣớng nghiên cứu (i), (ii) (iii) Mục đích nghiên cứu luận án: Luận án đƣợc thực nhằm xây dựng đƣợc quy trình tách chiết, điều chế chất chuẩn phân tích số HCTN có HTSH từ số thuốc phân bố địa phƣơng nƣớc ta: Diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L.), Đan sâm (Salvia miltiorrhiza B.), Mật nhân (Eurycoma longifolia J.), Mãng cầu xiêm (Annona muricata (Soursop)), Riềng đuôi nhọn (Alpinia macroura K Schum.) - loài phát Các nội dung nghiên cứu luận án: Để đạt đƣợc mục đích trên, nội dung nghiên cứu bao gồm: - Nghiên cứu xây dựng quy trình tách chiết hợp chất phyllanthin, hypophyllanthin từ Diệp hạ châu; hợp chất tanshinone I, cryptotanshinone, tanshinone IIA từ Đan sâm hợp chất eurycomanone từ Mật nhân phƣơng pháp sắc ký; - Tinh chế hợp chất thu đƣợc (phyllanthin, hypophyllanthin, tanshinone I, cryptotanshinone, tanshinone IIA, eurycomanone) để tạo chất chuẩn cho phân tích định tính định lƣợng chúng dƣợc liệu khác nhau; - Xây dựng quy trình phân tích hợp chất phyllanthin, hypophyllanthin, tanshinone I, cryptotanshinone, tanshinone IIA eurycomanone phƣơng pháp sắc ký lỏng đại LC-MS/MS, UPLC-DAD để áp dụng cho PTN phân tích nƣớc ta; - Nghiên cứu xác định hàm lƣợng hợp chất có HTSH dịch chiết Mãng cầu xiêm phƣơng pháp sắc ký đại: sắc ký lỏng ghép nối với detector khác (qNMR, HPLC-PDA, MALDI-TOP HRMS) hợp chất có tinh dầu phận (lá, thân, rễ ) Riềng nhọn phƣơng pháp sắc ký khí ghép nối với detector khối phổ (GC-MS) Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÁC HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC VÀ MỘT SỐ CÂY THUỐC 1.1.1 Giới thiệu chung Hợp chất thiên nhiên hay hợp chất tự nhiên chất hóa học có nguồn gốc từ thiên nhiên đƣợc ngƣời tách từ loại động vật, thực vật tự nhiên có hoạt tính sinh học có tác dụng dƣợc học dùng để làm thuốc Trong phát triển lồi ngƣời, thiên nhiên có vai trị vơ quan trọng, khơng cho nơi cƣ ngụ mà cung cấp cho vật chất thiết yếu cho sống Hóa học hợp chất thiên nhiên hóa học hợp chất hữu đƣợc tạo từ tổ chức sống (vi sinh vật, nấm, động thực vật ) tìm thấy tự nhiên, thƣờng có hoạt tính sinh dƣợc học đƣợc sử dụng để phát phát triển thuốc chữa bệnh [108] Ngƣời ta cần dựa vào khái niệm tính chất chất (alkaloit có tính kiềm yếu chứa nitơ), đơn vị hợp thành phân tử (terpenoit tạo thành từ đơn vị isopren) hay sở mối liên kết (các glycosit có liên kết glycosit) để phân chia lớp chất tự nhiên Nhƣ vậy, hợp chất thiên nhiên phân chia thành lớp chất sau: hợp chất terpenoit, hợp chất steroit, hợp chất alkaloit, hợp chất flavonoit, hợp chất phenolic, hợp chất lipit, hợp chất cacbohydrat, hợp chất axit amin, peptit protein, vitamin [21], [29], [108] Các lồi thực vật có chứa khoảng triệu hợp chất hóa học Cho tới nay, có 0,5 %, nghĩa 1.300 đƣợc nghiên cứu cách có hệ thống thành phần hóa học giá trị chữa bệnh [15] Thuốc từ dƣợc liệu đƣợc sử dụng khơng nƣớc Á Đơng mà cịn đƣợc tiêu thụ lƣợng lớn nƣớc phƣơng Tây Ở nƣớc có cơng nghiệp phát triển phần tƣ số thuốc kê đơn có chứa hoạt chất từ dƣợc liệu…[32] Các hợp chất thiên nhiên nguồn cung cấp phân tử có đa dạng lớn cấu trúc hoạt tính sinh học Sự đa dạng cấu trúc hố học hợp chất thiên nhiên có liên quan đến đa dạng sinh học nguồn thiên nhiên sinh tổng hợp hợp chất Hơn nữa, hợp chất có hoạt tính sinh học đƣợc tìm thấy từ thiên nhiên dùng trực tiếp y học, nhiều hợp chất khác đƣợc dùng nhƣ chất dẫn đƣờng phân tử đại cho tổng hợp bán tổng hợp thuốc Việc sử dụng sản phẩm thiên nhiên đóng vai trị nguồn hợp chất dẫn đƣờng làm phong phú đa dạng cấu trúc hợp chất tổng hợp bán tổng hợp thuốc [21] 1.1.2 Các nghiên cứu tách chiết số hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học Cho đến Việt Nam tồn giới có nhiều cơng trình nghiên cứu chiết tách HCTN có HTSH Một nghiên cứu tách chiết thành công artermisin từ Thanh hao hoa vàng (Artemisia annua L.) chuyển hóa thành thành dẫn xuất có hoạt tính cao (artermether, artesunat…) làm thuốc chống sốt rét Nghiên cứu phân lập taxol từ thông đỏ (Taxus baccata L); Chiết l-tetrahydropalmatin từ rễ củ số loại Bình vơi (Stephania spp.) làm thuốc an thần; Tách chiết berberin từ loài Vàng đắng (Coscinium fenestratum); Tách curcumin từ Nghệ (Curcuma longa L.), rutin từ nụ Hoa hòe (Styphnolobium japonicum L.); Tách vinblastin, vincristin từ Dừa cạn (Catharanthus roseus L.)… [20], [35] Hàng ngàn năm nay, tự nhiên nguồn cung cấp tác nhân điều trị bệnh, với số ấn tƣợng lƣợng thuốc đại có nguồn gốc tự nhiên dựa sở sử dụng làm thuốc truyền thống chúng Một số lƣợng lớn thuốc bán chạy kỷ 20 đƣợc tách chiết từ thảo dƣợc khác nhƣ: vincristin từ Dừa cạn - Vinca rosea, morphin từ Anh túc - Papaver somniferum, Taxol từ Thông đỏ - Taxus brevifolia Riêng năm 2001, có tới hợp chất (simvastatin, pravastatin, amoxycillin, axit clavulanic, azithromycin, ceftriaxone, cyclosporin paclitaxel) có mặt số 30 thuốc bán chạy giới với tổng kinh phí khoảng 16 tỷ đô la Mỹ [29], [108] Trong năm gần đây, nhiều nghiên cứu tập trung vào tách chiết HCTN có hoạt tính sinh học từ số lồi thảo dƣợc có sẵn nhiều địa phƣơng nƣớc ta nhƣ Diệp hạ châu, Đan sâm, Mật nhân, Mãng cầu xiêm Riềng nhọn 1.1.3 Một số lồi thuốc chứa hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học 1.1.3.1 Cây Diệp hạ châu Cây Diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L.) cịn có tên gọi khác Chó đẻ cƣa, thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae), loại thảo mộc đƣợc sử dụng nhiều thuốc cổ truyền chữa đau viêm họng, đinh râu, mụn nhọt, viêm da, lở ngứa, bệnh gan, sốt, đái tháo đƣờng Hiện sản phẩm thuốc có nguồn gốc từ Diệp hạ châu nhiều Thành phần hóa học bao gồm lignan, tannin, flavonoid, axit phenolic, terpenoid loại hợp chất khác Đến nay, 93 hợp chất đƣợc xác định cấu trúc đƣợc làm sáng tỏ từ chất chiết xuất từ Diệp hạ châu bao gồm 22 lignan, 16 tannin, 12 flavonoid, 21 phenolic, 13 terpenoid chất chuyển hóa thứ cấp khác Thành phần có hoạt tính quan trọng đƣợc tập trung nghiên cứu chủ yếu phyllanthin, hypophyllanthin, corilagin, geraniin, brevifolin, dẫn xuất rutin Các hợp chất chiết từ lồi Chó đẻ thân xanh (P amarus), Diệp hạ châu (P urinaria) có hoạt tính kháng virus, kháng khuẩn, đặc biệt ức chế hoạt động virus viêm gan B Lignan hợp chất đóng vai trị quan trọng hệ thống phịng thủ thực vật Lignan có hoạt tính sinh học nhƣ chất chống oxy hóa, chống ung thƣ, estrogen, kháng virus hạ huyết áp Các ngành công nghiệp dƣợc phẩm sử dụng chúng làm tiền chất cho tổng hợp thuốc chống ung thƣ Phyllanthin lignan có hoạt tính chống oxy hóa, chống viêm, miễn dịch bảo vệ gan đƣợc sử dụng điều trị nhiều bệnh gan [7], [10], [62] Ngồi ra, phyllanthin có hoạt tính chống oxy hóa bao gồm ức chế superoxide enzyme dismutase (SOD) glutathione reductase làm giảm tổn thƣơng oxy hóa ethanol gây tế bào gan chuột Nó có tác dụng làm gia tăng lƣợng glutathione có vai trị bảo vệ phục hồi tế bào gan, làm giảm men gan ức chế men ADN polymerase virus viêm gan B Các nghiên cứu hypophyllanthin lignan lập từ P urinaria có tiềm hoạt tính sinh học bao gồm hoạt tính chống oxy hóa, chống viêm, miễn dịch kháng virut, chống ung thƣ, chống virut viêm gan B tác dụng bảo vệ gan Nó có tác dụng làm gia tăng lƣợng glutathione có vai trị bảo vệ phục hồi tế bào gan, làm giảm men gan ức chế men ADN polymerase virus viêm gan B [50], [64], [87] 1.1.3.2 Cây Đan sâm Cây Đan sâm (Salvia miltiorrhiza B.) thuộc chi Salvia, họ Hoa mơi (Lamiaceae) cịn gọi đơn sâm, huyết sâm, xích sâm Thành phần hóa học Đan sâm acid phenolic, diterpenoid, flavonoid số thành phần khác Các thành phần hoạt chất rễ Đan sâm đƣợc chia thành hai nhóm tanshinontan lipid acid phenolic tan nƣớc [6], [7], [10] Đến nay, 20 acid phenolic phân lập từ rễ Đan sâm đƣợc nghiên cứu Các chất có hoạt tính thân dầu tanshinon diterpenoid, bao gồm tanshinon I, tanshinon IIA, cryptotanshinon Hơn 30 tanshinon quinon diterpenoid đƣợc phân lập sinh tổng hợp [55], [103] Hiện có nhiều nghiên cứu tác dụng dƣợc lý Đan sâm Các tác dụng đƣợc chứng minh bao gồm: làm giãn mạch vành, chống huyết khối, chống thiếu máu cục [57], [85] Ngồi ra, Đan sâm cịn đƣợc chứng minh có tác dụng chống đau thắt ngực [44], [54] Tác dụng làm hạ đƣờng huyết, hạ lipid máu, ức chế sinh tổng hợp cholesterol tế bào [49], [54] Tác dụng an thần, chống vi khuẩn, chống nấm, tốt cho trƣờng hợp nấm da, mụn trứng cá, rụng tóc, ngứa mề đay [60], [103], [118] Hoạt tính chống viêm [35], hoạt tính chống oxy hóa mạnh [7], [54], có tác dụng chống ung thƣ [2], [85] Cryptotanshinon thành phần đƣợc phân lập từ rễ Đan sâm, có hoạt tính kháng khuẩn mạnh, chống dermatophytic, chất chống oxy hóa, chống viêm chống ung thƣ, hoạt động cryptotanshinon ức chế tế bào sản xuất endothelia endothelin-1 tạo khác biệt số tế bào nhƣ tế bào gốc trung mô tủy xƣơng Các kết nghiên cứu in vivo cho thấy tanshinon IIA có tác dụng giảm đáng kể kích thƣớc vùng nhồi máu Cơ chế khả dọn gốc tự màng ty thể tim [57], [103] Tanshinon IIA ức chế q trình oxi hóa LDL hoạt động angiotensin II, từ làm giảm phì đại tế bào tim [118] Các kết nghiên cứu in vivo cho thấy tanshinon I có tác dụng giảm đáng kể kích thƣớc vùng nhồi máu Cơ chế khả dọn gốc tự màng ty thể tim Tanshinon I ức chế trình oxi hóa LDL hoạt động angiotensin II, từ làm giảm phì đại tế bào tim [49], [118] 1.1.3.3 Cây Mãng cầu xiêm Cây Mãng cầu xiêm (Annona muricata (Soursop)) có tên gọi khác Na xiêm hay mãng cầu gai thuộc chi Annona, họ Na [94] Nghiên cứu thành phần hóa học Mãng cầu xiêm cho thấy đa dạng cấu trúc hợp chất có nhiều lớp chất đƣợc phân lập xác định cấu trúc Khái quát từ công trình nghiên cứu cho biết lớp chất bao gồm: cacbohydrat, lipit, amino axit, phenolic axit, proanthocyanidin, tannin, flavonoit, monotecpen, sesquitecpen, ditecpen, tritecpen, ancaloit, polyprenol, hợp chất thơm, cyclopeptit, acetogenin, [22], [59] Trong số đó, hợp chất acetogenin có cấu trúc đặc biệt đƣợc tìm thấy Mãng cầu xiêm nhƣ loài thuộc họ na, độc đáo không dừng lại cấu trúc hóa học mà hoạt tính sinh học chúng bật nhờ khả gây độc dòng tế bào ung thƣ thể ngƣời, đồng thời cấu trúc hợp chất đa dạng [95], [100] Mãng cầu xiêm (lá, rễ hạt) đƣợc dùng làm thuốc nhiều nơi giới, quốc gia Nam Mỹ [8], [9] Phần lớn nghiên cứu ung thƣ chi Annona tập trung vào lớp chất có nguồn gốc từ thiên nhiên đƣợc gọi annonaceous acetogenin Ba nhóm nghiên cứu độc lập phân lập hợp chất acetogenin từ chi Annona cho thấy khả chống khối u, chống ung thƣ chống lại độc tính có chọn lọc với loại tế bào ung thƣ khác (mà không làm hại tế bào khỏe mạnh), có tám nghiên cứu lâm sàng đƣợc công bố dựa phát Nhiều hợp chất acetogenin chứng minh tính gây độc chọn lọc tác dụng gây độc tế bào ung thƣ với liều lƣợng thấp khoảng 1/106 Cụ thể dòng tế bào bào ung thƣ biểu mơ phổi, dịng khối u ngực ngƣời, ung thƣ tuyến tiền liệt, dòng tế bào ung thƣ biểu mơ tuyến tụy, dịng tế bào ung thƣ tuyến đại tràng, dòng tế bào ung thƣ gan dòng tế bào ung thƣ hệ bạch huyết ngƣời nhiều loại thuốc kháng ung thƣ ác tính ngực ngƣời [59], [95] Xem xét hoạt động kháng u gây độc tế bào, annonacin đƣợc sử dụng nhƣ chất dẫn đƣờng để phát triển tiềm tác nhân chống ung thƣ Tuy nhiên, ý quan trọng annonacin ức chế phát triển bình thƣờng khối u phổi thời gian kéo dài hai tuần, khơng tiêu diệt khối u không làm ngừng tăng trƣởng chúng cách hoàn toàn [22] ... HỌC HUẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ĐOÀN MẠNH DŨNG NGHIÊN CỨU TÁCH, ĐIỀU CHẾ CHẤT CHUẨN VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH MỘT SỐ HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC Ngành: Hóa Phân tích Mã số: ... Giới thiệu hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học số thuốc 1.1.1 Giới thiệu chung 1.1.2 Các nghiên cứu tách chiết số hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học ... sinh học nguồn thiên nhiên sinh tổng hợp hợp chất Hơn nữa, hợp chất có hoạt tính sinh học đƣợc tìm thấy từ thiên nhiên dùng trực tiếp y học, nhiều hợp chất khác đƣợc dùng nhƣ chất dẫn đƣờng phân