báo cáo thí nghiệm thực hành giám định vi sinh vật

Đặc tính nuôi cấy: Staphylococci mọc dễ dàng trên hầu hết các loại môi trường nuôi cấy, trong điều kiện khuẩn có hình tròn, đường kính khoảng 2 - 4mm, lồi, biên đều, đục, có màu từ trắng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

- -BÁO CÁO THÍ NGHIỆM

THỰC HÀNH GIÁM ĐỊNH

VI SINH VẬT

GVHD: Dương Nhật Linh

SV : Hồ Sơn Hải 30700106

Văn Đặng Hồng Cẩm 30700035

Ngô Văn Quang 30700406

Nhóm: G1 Tổ: 10

TP.HCM ngày 8 tháng 11 năm 2010

Bài 1: NH DANH T C U KHU N STAPHYLOCOCI ĐỊNH DANH TỤ CẦU KHUẨN STAPHYLOCOCI Ụ CẦU KHUẨN STAPHYLOCOCI ẦU KHUẨN STAPHYLOCOCI ẨN STAPHYLOCOCI 3

1 Đặc điểm và tính gây bệnh: điểm và tính gây bệnh: ểm và tính gây bệnh: c i m và tính gây b nh: ệnh: 3

2 Đặc điểm và tính gây bệnh: c tính hình th và nhu m: ểm và tính gây bệnh: ộm: 3

3 Đặc điểm và tính gây bệnh: c tính nuôi c y: ấy: 3

4 nh danh: Định danh: 3

4.1 Kháng sinh điểm và tính gây bệnh:ồ: 3 :

4.2 Th nghi m Catalase: ử nghiệm Catalase: ệnh: 4

4.3 Th nghi m Coagulase: ử nghiệm Catalase: ệnh: 5

5.Quy trình nh danh: điểm và tính gây bệnh:ịnh danh: 6

Bài 2: NH DANH CHU I C U KHU N STREPTOCOCCI ĐỊNH DANH CHUỖI CẦU KHUẨN STREPTOCOCCI ỖI CẦU KHUẨN STREPTOCOCCI ẦU KHUẨN STREPTOCOCCI ẨN STREPTOCOCCI 7

1 N i c trú và tính gây b nh: ơi cư trú và tính gây bệnh: ư trú và tính gây bệnh: ệnh: 7

2 Đặc điểm và tính gây bệnh: c tính hình th và nhu m: ểm và tính gây bệnh: ộm: 7

3 Đặc điểm và tính gây bệnh: c tính nuôi c y: ấy: 7

4 nh danh: Định danh: 7

4.1 Th nghi m Catalase ử nghiệm Catalase: ệnh: 7

4.2 Ph n ng ti ản ứng ti ứng ti êu huy t ết 7

4.3 Th nghi m Taxo A (th nghi m nh y c m v i Bacitracin) ử nghiệm Catalase: ệnh: ử nghiệm Catalase: ệnh: ạy cảm với Bacitracin) ản ứng ti ới Bacitracin) 8

4.4 Th nghi m nh y c m Bactrim ử nghiệm Catalase: ệnh: ạy cảm với Bacitracin) ản ứng ti 8

4.5 Th nghi m Bile esculin ử nghiệm Catalase: ệnh: 8

4.6 Th nghi m dung n p NaCl 6.5% ử nghiệm Catalase: ệnh: ạy cảm với Bacitracin) 9

5 Quy trình nh danh: điểm và tính gây bệnh:ịnh danh: 9

Bài 3: NH DANH PH Y KHU N T ĐỊNH DANH CHUỖI CẦU KHUẨN STREPTOCOCCI ẨN STREPTOCOCCI ẨN STREPTOCOCCI Ả 10

1 N i c trú và ơi cư trú và tính gây bệnh: ư trú và tính gây bệnh: điểm và tính gây bệnh:ặc điểm và tính gây bệnh: c tính gây b nh: ệnh: 10

2 Đặc điểm và tính gây bệnh: c tính hình th và nhu m: ểm và tính gây bệnh: ộm: 10

3 Đặc điểm và tính gây bệnh: c tính nuôi c y: ấy: 10

4 nh danh: Định danh: 10

4.1 C y phân l p ấy: ập 10

4.2 Th nghi m huy t thanh ng ng k t ử nghiệm Catalase: ệnh: ết ư trú và tính gây bệnh: ết 11

BÀI 4: NH DANH ĐỊNH DANH CHUỖI CẦU KHUẨN STREPTOCOCCI TR C KHU N M XANH ỰC KHUẨN MỦ XANH ẨN STREPTOCOCCI Ủ XANH 12

1 N i c trú và ơi cư trú và tính gây bệnh: ư trú và tính gây bệnh: điểm và tính gây bệnh:ặc điểm và tính gây bệnh: c tính gây b nh: ệnh: 12

2 Đặc điểm và tính gây bệnh: c tính hình th và nhu m: ểm và tính gây bệnh: ộm: 12

3 Đặc điểm và tính gây bệnh: c tính nuôi c y: ấy: 12

4 nh danh: Định danh: 12

4.1 Th nghi m LDC: ( th nghi m Lysin decarboxylase) ử nghiệm Catalase: ệnh: ử nghiệm Catalase: ệnh: 12

BÀI 5: K THU T NH DANH VI KHU N TH Ỹ THUẬT ĐỊNH DANH VI KHUẨN THƯƠNG HÀN ẬT ĐỊNH DANH VI KHUẨN THƯƠNG HÀN ĐỊNH DANH CHUỖI CẦU KHUẨN STREPTOCOCCI ẨN STREPTOCOCCI ƯƠNG HÀN NG HÀN SALMONELLA TYPHI 13

1.N i c trú và tính gây b nh: ơi cư trú và tính gây bệnh: ư trú và tính gây bệnh: ệnh: 13

2 Đặc điểm và tính gây bệnh: c tính hình th và nhu m: ểm và tính gây bệnh: ộm: 13

3 Đặc điểm và tính gây bệnh: c tính nuôi c y: ấy: 13

4 nh danh: Định danh: 14

Bài 1: ĐỊNH DANH TỤ CẦU KHUẨN STAPHYLOCOCI

1 Đặc điểm và tính gây bệnh:

Tụ cầu khuẩn có hơn 20 loại được phân thành 2 nhóm lớn: coagulase dương và

coagulase âm Trong số này Staphylococcus aureus thuộc loại coagulase dương- tác

nhân chính gây bệnh cho người và thủ phạm của nhiều nhiễm khuẩn trầm trọng Những

loại coagulase âm thường là những vi khuẩn thường trú Tuy nhiên, S.epidermidis đôi khi gây nhiễm khuẩn máu, viêm nội tâm mạc, S.saprophyticus có thể gây nhiễm khuẩn đường tiểu, S homonis, S haemolyticus và S simulans cũng có thể gây bệnh cho người.

Có 3 loại tụ cầu khuẩn quan trọng thường gặp nhất:

Staphylococcus aureus (nhóm coagulase dương) Staphylococcus epidermidis (nhóm coagulase âm) Staphylococcus saprophyticus (nhóm coagulase âm)

2 Đặc tính hình thể và nhuộm:

Hình cầu, đường kính khoảng 1μm, có thm, có thể đứng riêng lẻ, đôi hay chuỗi ngắn (nhưng không quá 4-5 tế bào) Cách sắp xếp chủ yếu là thành hình chùm nho không đều nhau Vi khuẩn bắt màu nhuộm Gram dương, nhưng có thể biến thành Gram âm trong lứa cấy già Không di động, không bào tử

3 Đặc tính nuôi cấy:

Staphylococci mọc dễ dàng trên hầu hết các loại môi trường nuôi cấy, trong điều kiện

khuẩn có hình tròn, đường kính khoảng 2 - 4mm, lồi, biên đều, đục, có màu từ trắng, vàng

chanh đến vàng kim ( S aureus cho khóm màu vàng, S epidermidis cho khóm xám hay trắng, S citreus cho khóm màu vàng chanh ) Màu biến mất khi cấy yếm khí và xuất hiện

khi cho lứa cấy tiếp xúc với không khí

Staphylococci tăng trưởng được trên môi trường chứa 7.5% NaCl Trên thạch máu

BA, gốc gây bệnh thường cho phản ứng tiêu huyết

4.Định danh:

4.1 Kháng sinh đồ:

a Phương pháp Kirby Bauer:

Pha dịch khuẩn thử nghiệm (Staphylococcus aureus) trong NaCl 0.85%, so với ống

đục chuẩn 0.5Mac Farland

Thao tác thí nghiệm:

Trải dịch khuẩn lên thạch MHA

Thử nghiệm với 2 enzyme : Vacomycin (Va) (30µg) và Clindamycin (Lc) (2µg)

Đặt đĩa kháng sinh lên mặt thạch MHA đã trải vi khuẩn (2 đĩa kháng sinh/ 1

Kết quả: sau khi ủ 18 giờ, đo được đường kính các vòng vô khuẩn

Va: 20 mm

Lc: 26 mm

Tra bảng ta được kết quả: Va 20 mm : nhạy (S) vì ≥ 15 mm

Lc 26 mm : nhạy (S) vì ≥ 21 mm

b Phương pháp MIC:

Nguyên tắc: Dựa trên sự tương quan giữa nồng độ pha loãng của kháng sinh đối với

sự tăng trưởng của vi khuẩn trong mỗi nồng độ kháng sinh khác nhau mà ta xác định được

nống độ ức chế tối thiểu của kháng sinh có khả năng ngăn chặn sự tăng trưởng của vi khuẩn

Sử dụng kháng sinh Cefotaxime pha loãng bằng một dãy ống nghiệm liên tiếp, có nồng độ 128 µ/ml

Thao tác thí nghiệm:

- Đánh số ống nghiệm từ 1 đến 10

- Cho vào các ống nghiệm từ 2 –10 một lượng là 0.5ml môi trường lỏng NB

- Pha loãng kháng sinh liên tiếp theo tỉ lệ ½ từ ống số 2 đến ống số 9, ống 10 giữ nguyên (không có kháng sinh)

- Cho vào các ống nghiệm từ 1 đến 10 một lượng là 0.5ml huyền dịch vi khuẩn

bào/ml

 Ống 10 : đục do có vi khuẩn mọc và không có kháng sinh

 Ống 1: vi khuẩn không mọc dưới tác dụng của kháng sinh

 Có một loạt ống đục hướng về ống số 10 và một loạt ống trong hướng về ống số

1

 Ống 8 (1µg/ml): nhạy (là ống trong cuối cùng)  Staphylococcus aureus bị diệt

ở nồng độ kháng sinh Cefotaxime tối thiểu là 1µg/ml

4.2 Thử nghiệm Catalase:

Cơ chế: Enzym catalase thường gặp ở vi khuẩn hiếu khí tuyệt đối hay tùy nghi

Vi khuẩn

 Enzyme catalase

H2O2 H2O + O

Thao tác thí nghiệm: Nhỏ một giọt hydrogen peroxide lên lam kính Sau đó đặt một khuẩn lạc vi khuẩn ở ống 1BP10 lên

 catalase dương cocci này là Staphylococci vì Staphylococci có enzyme catalase sẽ phóng thích O2 từ nứơc oxy già tạo hiện tượng sủi bọt

4.3 Thử nghiệm Coagulase:

Cơ chế: một số VSV có khả năng tổng hợp enzym coagulase đặc biệt là các loài

thuộc giống Staphylococcus, enzyme này làm đông huyết tương người hoặc thỏ (enzyme

Môi trường: Huyết tương người hay thỏ đông khô dạng thương phẩm Hoặc có thể tự

điều chế

Thao tác thí nghiệm: cho 0.5ml huyết tương thỏ đã chống đông pha loãng 1/5 vào

Kết quả: Sau 4 giờ huyết tương có hiện tượng đông đặc  coagulase dương 

S.aureus

5.Quy trình định danh:

Nhuộm Gram: cầu khuẩn Gram [+]

CATALASE [+] CATALASE CATALASE [-]

Staphylococci Coagulase Streptococci

[+] [-]

S aureus

[+] [-]

Kháng Novobiocin

[+]

S.saprophyticus Urease

[-]

S.epidermidis S.capitis

S.simulans S.hemolyticus

S.epidermidis S.saprophyticus S.simulans S.capitis

Bài 2: ĐỊNH DANH CHUỖI CẦU KHUẨN

STREPTOCOCCI

1 Nơi cư trú và tính gây bệnh:

Chuỗi cầu khuẩn có khắp mọi nơi trong thiên nhiên, là một thành phần trong hỗn tạp vi sinh đường hô hấp, ở đường tiêu hóa của người và động vật

Tùy loại và tùy vị trí nhiễm khuẩn, chuỗi cầu khuẩn sẽ là tác nhân gây bệnh hoặc chỉ là vi khuẩn sống hoại sinh

Chuỗi cầu khuẩn có thể gây các chứng nhiễm khuẩn trực tiếp như:

 Viêm cổ họng, viêm amygdale, thanh quản, yết hầu, viêm xoang, viêm tai giữa và có thể gây viêm màng não

 Viêm màng trong tim bán cấp tính, nhiễm khuẩn hậu sản, hậu giải phẩu, nhiễm khuẩn huyết và nhiễm trùng đường tiểu

 Nhiễm khuẩn ở da: nhọt, mụn nước có mủ

Chuỗi cầu khuẩn có thể gây bệnh gián tiếp như viêm hay siêu cảm ứng cho các mô trong chứng phong thấp cấp tính, viêm màng trong tim và viêm cầu thận

Việc phân loại chuỗi cầu khuẩn rất phức tạp Trong chẩn đoán phòng thí nghiệm

người ta thường kết hợp 2 yếu tố: kiểu tiêu huyết và cấu trúc kháng nguyên để xáx định

1 chủng gây bệnh.

2 Đặc tính hình thể và nhuộm:

Hình cầu, đường kính khoảng 0.8- 1μm, có thm,sắp xếp thành hình chuỗi, uốn khúc dài ngắn khác nhau Không di động, không bào tử

3 Đặc tính nuôi cấy:

Streptococci tăng trưởng kém, không mọc trên môi trường thông thường, chỉ

mọc được trong các môi trường có đầy đủ chất dinh dưỡng như: BHI hoặc các môi trường

glutamine, riboflavin, Hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi

Sau 24h nuôi cấy trên môi trường thích hợp, khóm vi khuẩn có hình tròn, đường kính khoảng 1mm hay nhỏ hơn, trong, trắng xám, hơi nhám và lồi

4.Định danh:

4.1 Thử nghiệm Catalase

Dùng phân biệt các nhóm vi khuẩn nghi ngờ là tụ cầu khuẩn với chuỗi cầu khuẩn

Thao tác thí nghiệm: Nhỏ một giọt hydrogen peroxide lên lam kính Sau đó đặt một khuẩn lạc vi khuẩn ở ống nghiệm 3BP10 lên

Kết quả: Sau khi đặt khuẩn lạc vi khuẩn lên, không có hiện tượng sủi bọt  catalase

âm tính  cocci này là streptococci

4.2 Phản ứng tiêu huyết

Cơ chế: Một vài loài vi sinh vật có khả năng sinh enzyme hemolysin làm tan máu

(dung huyết) Khi nuôi cấy trên môi trường giàu dinh dưỡng (MHA), có bổ sung 5 – 10% máu cừu hoặc thỏ, tùy theo loài vi khuẩn ta có 1 trong 3 loại tan máu sau:

 Tan máu : tan máu không hoàn toàn, vùng tan máu hẹp, màu xanh, đục mờ

 Tan máu : tan máu hoàn toàn, vùng tan máu rộng, không màu, trong suốt

 Tan máu : không tan máu

Môi trường: Ðĩa thạch MHA, bổ sung 5% máu cừu, còn gọi là thạch máu BA.

Thao tác thí nghiệm: Cấy vi khuẩn ở ống nghiệm 3BP10 lên môi trường thạch máu

Kết quả: sau 1 ngày nuôi cấy xác định được là streptococci tiêu huyết β vì hồng cầu bị ly giải hoàn toàn, tạo nên vòng tiêu huyết rộng, sáng và trong bao quang khóm vi khuẩn trên thạch máu

4.3 Thử nghiệm Taxo A (thử nghiệm nhạy cảm với Bacitracin)

Mục đích: định danh Streptococci tiêu huyết β này là Streptococci tiêu huyết β

nhóm A

Thao tác thí nghiệm: Dùng vòng cấy hay tăm bông vô trùng , lấy 1 quệt vi khuẩn

Streptococci tiêu huyết β đã xác định được ở phản ứng tiêu huyết trên môi trường thạch máu, cấy zic-zac với đường cấy dày và sít nhau trên mặt thạch BA Dùng kẹp vô khuẩn

Kết quả: xuất hiện vòng vô khuẩn quanh đĩa Bacitracin  vi khuẩn nhạy với

Bacitracin  định danh là Streptococci tiêu huyết β nhóm A

4.4 Thử nghiệm nhạy cảm Bactrim

Mục đích: có thể xác định Streptococci thử nghiệm này không phải nhóm A hay B

Thao tác thí nghiệm: Dùng vòng cấy hay tăm bông vô trùng , lấy 1 quệt vi khuẩn nghi ngờ

là Pneumococci mọc không quá 24h trên mặt thạch máu cừu BA, cấy zic-zac với đường cấy dày

và sít nhau trên mặt thạch Dùng kẹp vô khuẩn lấy 1 đĩa Bactrim đặt lên giữa vùng cấy Ủ hộp BA thử nghiệm trong tủ cấy 5% CO2 ở 350C/24h

Kết quả: không xuất hiện vòng vô khuẩn  Streptococci thử nghiệm này là nhóm A

hoặc B.

4.5 Thử nghiệm Bile esculin

Mục đích: xác định Streptococci thử nghiệm này là Streptococci nhóm D.

Thao tác thí nghiệm: Dùng vòng cấy lấy 1 quệt vi khuẩn mọc không quá 24h trên

Kết quả:xuất hiện màu đen trên bề mặt của môi trường  Bile esculin dương tính 

vi khuẩn Streptococci nhóm D

4.6 Thử nghiệm dung nạp NaCl 6.5%

Mục đích: phân biệt Enterococci và Non enterococci trong Streptococci nhóm D

Thao tác thí nghiệm: Dùng vòng cấy lấy 1 quệt vi khuẩn mọc không quá 24h cấy vào

Kết quả: vi khuẩn mọc được trong môi trường  dung nạp NaCl 6.5%  vi khuẩn

S faecalis tiêu huyết β.

5 Quy trình định danh:

Khóm VK trên mt BA

CATALASE [+] CATALASE CATALASE [-]

Staphylococci Streptococci

Tiêu huyết

Α

[+] [-]

S.pneumoniae Streptococci

tiêu huyết

Thử nghiệm nhạy

cảm Optochin

trên BA

 Thử nghiệm nhạy cảm BACTRIM

 Thử nghiệm BILE-ESCULIN

 Thử nghiệm mọc trên TSB có 6.5%

 Thử nghiệm nhạy cảm BACITRACIN

 Thử nghiệm nhạy cảm BACTRIM

 Thử nghiệm CAMP

 Thử nghiệm BILEESCULIN

 Thử nghiệm mọc trên TSB có 6.5% NaCl

Bài 3: ĐỊNH DANH PHẨY KHUẨN TẢ

1 Nơi cư trú và đặc tính gây bệnh:

Dòng Vibrio gồm có loại hoại sinh, hợp sinh gây bệnh cho người và thú Loại gây bệnh dịch tả cho người là Vibrio cholerae thuộc nhóm O1 (Vibrio cholerae type cổ điển

và Vibrio cholerae type eltor)

Phẩy khuẩn tả xâm nhập cơ thể bằng đường tiêu hóa, tăng trưởng mau lẹ tại niêm mạc ruột, không xâm nhập vào đường máu, các vi khuẩn bị tiêu bào phóng thích nội độc

tố, phá hoại thượng bì ruột gây ra triệu chứng thổ tả, đưa đến tình trạng cơ thể mất nước nhanh và mất thăng bằng các chất điện giải

Bệnh nhân chết nếu không phục hồi lại lượng nước đã mất Phẩy khuẩn tả có thể tìm thấy trong phân bệnh nhân, trong chất nôn mửa và thực phẩm bị nhiễm khuẩn Phân của người bị nhiễm khuẩn tả rất đặc biệt, phân như nước đục như nước vo gạo, chứa những hạt lợn cợn như hạt gạo

2 Đặc tính hình thể và nhuộm:

Là những trực khuẩn cong hay còn được gọi là phẩy khuẩn, ngắn, mảnh, kích thước khoảng 0.5 x 3μm, có thm, Gram âm Tính chất phẩy biến mất sau nhiều lần cấy truyền

Di dộng nhanh, không sinh nha bào

3 Đặc tính nuôi cấy:

Phẩy khuẩn tả mọc dễ dàng trong môi trường nuôi cấy bình thường, không đòi hỏi yếu tố tăng trưởng đặc biệt, nhưng cần 5 -15mmol/l NaCl kích thích vi khuẩn mọc tốt hơn

Thuộc loại hiếu khí

Vibrio cholerae chết nhanh trong môi trường acid, dễ bị diệt bởi các chất tẩy uế, đặc

biệt nhạy cảm với sự khô, chỉ tồn tại 10min ở 550C Tuy nhiên có thể sống được 4 – 7 ngày trên rau trái tươi để ở mát và ẩm

Trong môi trường peptone pH= 8: phẩy khuẩn tả tăng trưởng nhanh sau 6-8h/370C, làm đục đều và có váng nổi trên mặt môi trường

Trên môi trường MacConkey (MC): khóm vi khuẩn tròn, biên đều, phẳng hay lồi, màu hồng nhạt do không lên men đường Lactose

Trên môi trường TCBS: khóm vi khuẩn tròn, biên đều, lồi tròn, màu vàng do lên men đường Succrose

4.Định danh:

4.1 Cấy phân lập

Cấy trực tiếp

Lấy trực tiếp từ bệnh phẩm cấy lên bề mặt môi trường MC hoặc TCBS

Lấy trực tiếp từ bệnh phẩm cấy vào môi trường peptone

Sau khi môi trường peptone mang đi ủ, vi khuẩn mọc, lấy từ váng trên môi trường peptone cấy lại trên môi trường MC hoặc TCBS

TÍNH CHẤT SINH HÓA CỦA PHẨY KHUẨN TẢ

- ( V cholerae type cổ điển)

-4.2 Thử nghiệm huyết thanh ngưng kết

Thao tác:

Chọn các khóm vi khuẩn nghi ngờ trên môi trường TCBS hoặc MC, làm huyền dịch với nước muối sinh lý trong ống nghiệm sạch

Lấy lame kính chia thành 3 ô bằng bút chì mỡ Nhỏ vào mỗi ô 1 giọt huyền dịch vi khuẩn

Nhỏ lần lượt mỗi ô 1 giọt huyết thanh Ogawa, Inaba và nước muối sinh lý

Dùng mỗi ô 1 que cấy riêng biệt, trộn 2 giọt cho đều nhau, quan sát sự ngưng tụ dưới ánh sát thích hợp

Kết quả: