báo cáo thí nghiệm vi sinh

Tiến hành thí nghiệm :...2  Dùng cồn rửa sạch tay đến gần hết cánh tay và vô trùng vùng không gian xung quanh nơi làm thí nghiệm...2  Dung dịch môi trường Czapek sau khi hấp vô trùng

BÁO CÁO TỐT NGHIỆP

Báo cáo thí nghiệm

vi sinh

MỤC LỤC

Bài 1 : CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH 1

I Mục đích : 1

 Chuẩn bị môi trường hỗn hợp với các thành phần thích hợp để giúp vi sinh vật phát triển và vô trùng môi trường 1

 Môi trường cần bao gồm carbon hữu cơ ( như glucose,protein ) ,chất khoáng như nitơ,photpho và nước 1

II Chuẩn bị dụng cụ: 1

 ống nghiệm : 2 ống 1

 đĩa Petri : 1 đĩa 1

 pipet 1ml : 1 cái 1

 erlen 100ml : 2 cái 1

 đũa khuấy : 1 cái 1

III Vô trùng dụng cụ làm thí nghiệm 1

 Bước 1 : dùng giấy gói kín các dụng cụ thủy tinh cần thiết cho bài thực hành vd : pipet,erlen,đĩa petri Riêng ống nghiệm và erlen thì dùng bông gòn nút kín miệng 1

 Bước 2 : đem sấy khô các dụng cụ trong lo sấy ở nhiệt độ 100oC trong 30 phút 1

 Bước 3 : sau đó đem hấp vô trùng dụng cụ bằng autoclave với nhiệt độ 150oC trong 2 giờ 1

IV Chuẩn bị môi trường nuôi cấy vi sinh: 1

 Saccharose 3g 1

 NaNO3 0,3g 1

 KH2PO4 1g 1

 MgSO4 0,05g 1

 FeSO4 0.001g 1

 Agar 2g 1

 Nước cất 100ml 1

 Lắc đều cho dung dịch tan hết, nấu môi trường trên bếp điện cho tan hết agar Để nguội dùng bông nút kín erlen sao cho không quá lỏng,cũng không quá chặt,điều chỉnh pH = 6 , khử trùng bằng autoclave với áp suất 1 atm trong 30 phút 1

 Glucose 4g 1

 Pepton 2g 1

 Agar 2g 2

 Nước cất 100ml 2

 Lắc đều cho dung dịch tan hết, nấu môi trường trên bếp điện cho tan hết agar Để nguội dùng bông nút kín erlen sao cho không quá lỏng,cũng không quá chặt,điều chỉnh pH = 6 , khử trùng bằng autoclave với áp suất 1 atm trong 30 phút 2

V Tiến hành thí nghiệm : 2

 Dùng cồn rửa sạch tay ( đến gần hết cánh tay ) và vô trùng vùng không gian xung quanh nơi làm thí nghiệm 2

 Dung dịch môi trường Czapek sau khi hấp vô trùng,dùng găng tay mang ra,để nguội đến nhiệt độ khoảng 40-50oC 2

 Dùng pipet hút khoảng 1ml cho vào ống nghiệm,cho dd vào cẩn thận,tránh để dây dd ra thành ống,sau này khi cấy nấm mốc sẽ dễ dàng bi nhiễm 2

 Nút kín miệng ống bằng nút bông 2

 Để nghiêng ống sao cho dd cách mép bông 2cm 2

 Đợi cho môi trường khô cứng.Gói kín bằng giấy.Mang về bảo quản ở nhiệt độ bình thường 2

 Tất cả các thao tác trong quá trình làm đều phải làm gần ngọn lửa đèn cồn để tránh bị nhiễm khuẩn 2

 Kết quả : sau khoảng 24 giờ,ta sẽ thấy các sợi bông đen và rất nhiều chấm đen nhỏ li ti.Đó chính là nấm mốc và các bào tử 2

 Dùng cồn rửa sạch tay ( đến gần hết cánh tay ) và vô trùng vùng không gian xung quanh nơi làm thí nghiệm 2

 Dung dịch môi trường Sabouraud sau khi hấp vô trùng,dùng găng tay mang ra,để nguội đến nhiệt độ khoảng 40-50oC 2

 Dùng pipet hút 1ml dd nước thải cho vào dĩa Petri 2

 Đổ dd môi trường Sabouraud vào 1/3 đĩa Petri.Đặt nhẹ nhàng từ cạnh bàn đẩy vào trong.Xoay tròn đĩa nhè nhẹ để trộn đều dd 2

 Đợi cho môi trường khô cứng.Úp ngược đĩa để tránh trong quá trình vi khuẩn hô hấp sẽ đọng hơi nước lên mặt đĩa,nước rớt xuống bề mặt môi trường,sẽ bị nhiễm khuẩn.Gói kín bằng giấy.Nhớ đánh dấu mặt đã lật úp,để sau này tránh bị nhầm.Mang về bảo quản ở nhiệt độ bình thường 2

 Tất cả các thao tác trong quá trình làm đều phải làm gần ngọn lửa đèn cồn để tránh bị nhiễm khuẩn 2

 Kết quả : sau khoảng 24h sẽ thấy các chấm trắng nhỏ như đầu chiếc đũa trên petri,đó chính là khuẩn lạc.Tuy nhiên nếu làm không cẩn thận sẽ nổi những vệt nấm mốc đen 2

VI Hình ảnh khuẩn lạc 2

Bài 2 CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG NHÂN SINH KHỐI VÀ MÔI TRƯỜNG GIỮ GIỐNG A xylinum 8

I Chuẩn bị hóa chất: 8

 (NH4)2SO4 8

 (NH4)2HPO4 8

 MgSO4.7H2O 8

 KH2PO4 8

 K2HPO4 8

 Glucose 8

 Cao nấm men 8

 Axit xitric 8

 Agar 8

 Nước dừa 8

II Chuẩn bị môi trường nhân sinh khối và môi trường giữ giống A xylinum 8

 (NH4)2SO4 0.8g 8

 (NH4)2HPO4 0.2g 8

 Glucose 2g 8

 Cao nấm men 0.2g 8

 Axit xitric 0.1g 8

 Nước dừa 100ml 8

 (NH4)2SO4 0.1g 8

 MgSO4.7H2O 0.1g 8

 KH2PO4 0.05g 8

 K2HPO4 0.05g 8

 Glucose 2g 8

 Cao nấm men 0.5g 8

 Agar 2g 8

 Nước dừa 100ml 8

III Tiến hành thí nghiệm : 8

 Sau khi pha hai môi trường vào trong 2 erlen xong, khuấy đều cho dung dịch tan Với môi trường 2, tiến hành đun nóng môi trường trên bếp điện để agar tan ra Sau đó làm nút bông đậy kín miệng erlen, bọc giấy ngoài Rồi cho vào autoclave hấp khử trùng trong 45 phút 8

 Sau khi hai môi trường này nguội, tiến hành cấy A.xylinum từ trong ống nghiệm giữ giống vào môi trường 1 9

 Đốt đèn cồn, tay phải cầm que cấy giữ thẳng đứng trên ngọn lửa đèn cồn, để que nóng đỏ 9

 Tay trái cầm ống nghiệm giữ giống A.xylinum, ngón út và áp út tay phải mở và giữ nút bông gòn trên miệng ống nghiệm Hơ miệng ống nghiệm trên ngọn lửa đèn cồn 3 ngón tay còn lại của tay phải cầm que cấy đưa nó vào ống nghiệm, lấy một ít dịch nuôi cấy trong ống Sau đó, tay trái cầm ống nghiệm hơ miệng ống nghiệm trên ngọn lửa đèn cồn, nút bông cũng được hơ nóng rồi đậy nút bông vào ống nghiệm, đặt ống nghiệm trên giá 9

 Dùng ngón út và áp út tay phải mở nút bông của erlen chứa môi trường 1 đã được khử trùng Tay trái cầm erlen hơ miệng erlen trên ngọn lửa đèn cồn rồi đưa que cấy đã lấy giống vào môi trường 1 Khuấy nhẹ que cấy cho vi sinh rơi khỏi que và phân bố đều trong môi trường Hơ miệng erlen trên ngọn lửa đèn cồn rồi tiếp theo là hơ nút bông Đậy nút bông vào erlen Hơ lại que cấy để giết hết vi sinh vật còn sót lại cho những lần cấy sau 9

IV Kết quả 9

 Sau một tuần, lớp thạch vi sinh bị nhiễm mốc có thể do thao tác không tiệt trùng nên nhiễm mốc từ bên ngoài không khí vào 9

V Trả lời câu hỏi : 9

 Vì nếu pH < 7 ,môi trường axit hay pH > 7 môi trường kiềm sẽ làm ức chế vi sinh vật, có khả năng chết vi khuẩn mình cần nuôi cấy 9

 Vì mỗi loại vsv cần những loại chất dinh dưỡng khác nhau , môi trường sống khác nhau nên cần có môi trường thích hợp để vsv sống và phát triển 9

Bài 3 : QUAN SÁT TẾ BÀO VI SINH VẬT 10

I Chuẩn bị : 10

 Rửa sạch lam kính và lamen ( có thể rửa bằng cồn ) 10

II Tiến hành : 10

 Dùng que cấy cho 1 ít nước thải lên giữa lam 10

 Lấy lamen để nghiêng 450 , thả từ từ che lên giọt nước thải sao cho tránh có bọt khí,sẽ làm cho khó quan sát 10

 Đặt tiêu bản lên giá đỡ 10

 Điều chỉnh tiêu bản hứng lấy ánh sáng thích hợp 10

 Chỉnh nút sơ cấp nâng tiêu bản lên , quan sát cho đến khi thấy được hình ảnh mờ

mờ 10

 Chỉnh nút vi cấp từ từ cho đến khi nhìn thấy rõ vi sinh vật cần quan sát 10

 Chú ý : 10

III Hình ảnh quan sát được: 10

BÀI 5: NHUỘM TẾ BÀO 16

I Chuẩn bị : 16

 Nước thải chứa vi sinh ( gồm hình que, cầu, hình xoắn) 16

 Lam kính 16

 Thuốc nhộm 16

 Giấy thấm 16

 Dầu soi kính 16

 Kính hiển vi 16

 Bộ dụng cụ thí nghiệm ( cồn, nước, đèn cồn, que cấy, bút lông) 16

 16

II Thực hiện 16

 Rửa lam kính thật sạch, lau khô hoặc hơ trên đèn cồn 16

 Dùng bút lông vẽ 1 hình tròn nhỏ và ghi tên người thí nghiệm 16

 Lật mặt sau lam kính dung que cấy nhúng vào nước thải lấy 1 lượng vừa đủ cho vào hình tròn đã vẽ và dàn đều vi sinh 16

 Chờ cho khô hoặc hơ trên đèn cồn 16

 Sau khi khô, ta nhỏ thuốc nhuộm ngập vết bôi bằng Crystal violet 16

 Sau 1 phút rửa lại bằng 16

 Nhỏ tiếp iodine (Lugol) 16

 Để 1 phút rửa iodine bằng nước, thấm bớt nước bằng giấy thấm nhưng không quẹt lên vết bôi 16

 Rửa tiếp bằng cồn 95% bằng cách đặt nghiêng lam kính, để ống xịt cồn sát lam, phun nhẹ đến khi tấy được vết màu cuối cùng ra khỏi vết bôi Không xịt cồn trực tiếp vào vết bôi 16

 Rửa ngay lại bằng nước không để cồn quá lâu khi rửa sẽ cuốn trôi hết vi sinh 16

 Nhuộm bằng Fuchsin trong 20-30 giây 16

 Rửa nước, để khô 16

 Khi quan sát, nhỏ 1 giọt dầu soi và dung vật kính 100 để quan sát 16

III Kết quả 16

 Dưới kính hiển vi quan sát thấy 2 màu: màu tím- gram dương, màu hồng-gram âm Hình thái tế bào: tụ cầu, cầu 16

IV Trả lời câu hỏi 16

 Gram âm vẫn bắt màu đỏ, vì sau khi rửa đi crystal gram sẽ không giữ được màu do cấu trúc thành tế bào Nên khi tiếp tục nhuộm bằng Safranin gram âm vẫn bắt được màu đỏ 17

 Vi khuẩn Gram dương có thành tế bào dầy, dạng lưới cấu tạo bởi peptidoglycan, chất này có khả năng giữ phức hợp tím tinh thể-iot Trong khi đó, lớp thành tế bào peptidoglycan của các vi khuẩn Gram âm thì mỏng hơn và thường có thêm lớp màng lipopolysaccharide (LPS) bên ngoài 17

 Sau khi nhuộm với phức hợp tím tinh thể-iot, mẫu được xử lí tiếp với hỗn hợp khử màu, làm mất nước của các lớp peptidoglycan trong thành tế bào Gram dương, từ đó

làm giảm khoảng trống giữa các phân tử và khiến thành tế bào bắt giữ phức hợp tím

tinh thể-iot bên trong tế bào 17

 Đối với vi khuẩn Gram âm, hỗn hợp khử màu đóng vai trò là chất hoà tan lipit và làm tan màng ngoài của thành tế bào Lớp peptidoglycan mỏng không thể giữ lại phức hợp tím tinh thể-iot và tế bào Gram âm bị khử màu 17

 Khi quan sát dưới kính hiển vi, ánh sang từ môi trường sẽ đi qua thấu kính bằng thủy tinh, mà chiết xuất của thấu kính và dầu soi gần như bằng nhau nên áng được truyền thẳng Giảm bớt khúc xạ từ môi trường nên dễ quan sát hơn 17

Bài 6: TỔNG SỐ COLIFORM 18

I Mục đích: 18

II Chuẩn bị: 18

 Môi trường LB 18

 9 ống nghiệm 18

 Đánh dấu ống nghiệm theo 3 dãy nhóm ống nghiệm: 18

 Dãy 1: gồm 3 ống đánh dấu -1 ( tức là tỉ lệ pha loãng 10 lần ) 18

 Dãy 2: gồm 3 ống đánh dấu -2 ( tỉ lệ pha loãng 100 lần ) 18

 Dãy 3: gồm 3 ống đánh dấu -3 ( tỉ lệ pha loãng 1000 lần ) 18

III Tiến hành thí nghiệm 18

 Lật úp ống Durham và cho ống Durham vào 9 ống nghiệm, hút 9ml môi trường cho vào ống nghiệm, lúc này ống Durham nổi lên trên Vặn nắp ống nghiệm Lật ống nghiệm xuống (nắp ống nghiệm nằm dưới) để dung dịch tràn vào ống Durham, sau đó lại lật ống nghiệm lại cho ống Durham chìm hoàn toàn trong dung dịch, nếu không còn bọt khí trong ống Durham thì đạt yêu cầu, còn ống nào có bọt khí trong ống Durham thì phải lật ống qua lại để loại hết khí 18

 Đem ống nghiệm hấp thanh trùng ở nhiệt độ 1500C trong 2h 18

 Sau khi hấp thanh trùng, dùng tay phải cầm pipet, tay trái cầm bóp cao su hút 1ml dung dịch nước thải, giữ dung dịch nước thải trong pipet bằng ngón trỏ phải Tay trái cầm ống nghiệm có ghi (-1), ngón út và áp út của tay phải cầm nắp ống nghiệm còn tay trái xoay ống nghiệm để mở nắp Sau đó tay trái cầm ống nghiệm để hơ miệng ống trên ngọn lửa đèn cồn rồi tay phải đưa pipet vào ống nghiệm thả 1 ml nước thải vào ống Cuối cùng hơ lại miệng ống và vặn nắp vào, lắc đều ống nghiệm Làm tương tự cho 2 ống nghiệm có ghi (-1) 18

 Sau đó mở nắp ống nghiệm (-1) hút 1ml dung dịch trong hệ thống ống (-1) bằng pipet đem truyền theo thứ tự qua hệ thống ống (-2), quá trình làm cũng tương tự như rút 1 ml nước thải cho vào hệ thống ống (-1), sau đó đậy nắp và lắc đều các ống (-2).18  Tiếp tục hút 1ml dung dịch trong hệ thống ống (-2) đem truyền theo thứ tự qua hệ thống ống (-3), sau đó đậy nắp và lắc đều các ống (-3) 18

 Đem ủ ở nhiệt độ 370C 18

IV Kết quả 18

 Sau 2 ngày, đếm số ống sinh ra bọt khí theo thứ tự hệ thống ống ta được kết quả sau: 2 1 0 19

 Theo bảng MPN thì số lượng vi khuẩn là 15 MPN/ 100 ml Tuy nhiên đây là số lượng vi sinh vật nếu ta cho 10ml mẫu vào hệ thống ống nghiệm đầu tiên Thực tế, ta chỉ hút 1 ml mẫu nên kết quả chính xác cho mẫu nước thãi trên là 15 x 10 = 150MPN/100ml nước thải hay 15000 MPN/1ml nước thải 19

Bài 7 QUAN SÁT VI SINH BẰNG BUỒNG ĐẾM HỒNG CẦU 20

I Mục đích: 20

 Tập quan sát vi sinh trên buồng đếm hồng cầu bằng kính hiển vi 20

II Chuẩn bị: 20

 Kính hiển vi 20

 Buồng đếm 20

 Mẫu nước thải 20

III Mô tả buồng đếm: 20

 Buồng đếm làm bằng thủy tinh, ở giữa có hai khu vực nhỏ để đặt mẫu, mỗi khu vực là một hình vuông được rạch bằng tia laze Trong mỗi hình vuông có một khu trung tâm, trong khu trung tâm có tất cả 25 ô vuông lớn, mỗi ô vuông lớn như vậy lại có 16 ô vuông nhỏ Diện tích mỗi ô vuông nhỏ là 0.0025mm2 chiều sâu 0.1mm2 20

IV Cách thực hiện: 20

 Lấy mẫu bỏ lên khu vực đặt mẫu của buồng đếm Sau đó lấy lame đè lên Đặt dưới kính hiển vi Ban đầu dùng vật kính 4 để quan sát, điều chỉnh sao cho quan sát được các vạch chia trong khu vực đặt mẫu Sau đó tăng vật kính lên 10, điều chỉnh sao cho quan sát được ít nhất là 1 ô lớn, sau đó tiến hành đếm vi sinh vật 20

V Cách đếm: 20

Khi quan sát thấy ô lớn, ta sẽ thấy có 16 ô nhỏ trong đó, tiến hành đếm vi sinh vật theo đường ziczac 20

 Lưu ý :khi đếm tránh phải đếm hai lần cho một con vi sinh vật, cho nên phải tự mình đặt ra quy tắc đếm để tránh nhầm lẫn Ví dụ như dùng quy tắc sau 20

 Trường hợp 1: giả sử có hai vi sinh vật ở vị trí như hình vẽ ta sẽ đếm chúng cho ô thứ nhất 20

 Trường hợp 2: 21

 Trường hợp 3: 21

VI Kết quả: 21

Bài 1 : CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG NUÔI

CẤY VI SINH

I Mục đích :

Chuẩn bị môi trường hỗn hợp với các thành phần thích hợp để giúp vi sinh vật phát triển và vô trùng môi trường.

Môi trường cần bao gồm carbon hữu cơ ( như glucose,protein ) ,chất khoáng như nitơ,photpho và nước

đũa khuấy : 1 cái

III Vô trùng dụng cụ làm thí nghiệm

Bước 1 : dùng giấy gói kín các dụng cụ thủy tinh cần thiết cho bài thực hành vd : pipet,erlen,đĩa petri Riêng ống nghiệm và erlen thì dùng bông gòn nút kín miệng.Bước 2 : đem sấy khô các dụng cụ trong lo sấy ở nhiệt độ 100oC trong 30 phútBước 3 : sau đó đem hấp vô trùng dụng cụ bằng autoclave với nhiệt độ 150oC trong 2 giờ

IV Chuẩn bị môi trường nuôi cấy vi sinh:

1 Môi trường czapek : nuôi cấy nấm mốc

2 Môi trường Sabouraud : nuôi cấy vi khuẩn hiếu khí

V Tiến hành thí nghiệm :

Dùng pipet hút khoảng 1ml cho vào ống nghiệm,cho dd vào cẩn thận,tránh để dây

dd ra thành ống,sau này khi cấy nấm mốc sẽ dễ dàng bi nhiễm

Nút kín miệng ống bằng nút bông

Để nghiêng ống sao cho dd cách mép bông 2cm

Đợi cho môi trường khô cứng.Gói kín bằng giấy.Mang về bảo quản ở nhiệt độ bình thường

Tất cả các thao tác trong quá trình làm đều phải làm gần ngọn lửa đèn cồn để tránh bị nhiễm khuẩn

Kết quả : sau khoảng 24 giờ,ta sẽ thấy các sợi bông đen và rất nhiều chấm đen

nhỏ li ti.Đó chính là nấm mốc và các bào tử

2 Nuôi cấy vi sinh hiếu khí:

Dùng cồn rửa sạch tay ( đến gần hết cánh tay ) và vô trùng vùng không gian xung quanh nơi làm thí nghiệm

Dung dịch môi trường Sabouraud sau khi hấp vô trùng,dùng găng tay mang ra,để nguội đến nhiệt độ khoảng 40-50oC

Dùng pipet hút 1ml dd nước thải cho vào dĩa Petri

Đổ dd môi trường Sabouraud vào 1/3 đĩa Petri.Đặt nhẹ nhàng từ cạnh bàn đẩy vàotrong.Xoay tròn đĩa nhè nhẹ để trộn đều dd

Đợi cho môi trường khô cứng.Úp ngược đĩa để tránh trong quá trình vi khuẩn hô hấp sẽ đọng hơi nước lên mặt đĩa,nước rớt xuống bề mặt môi trường,sẽ bị nhiễm khuẩn.Gói kín bằng giấy.Nhớ đánh dấu mặt đã lật úp,để sau này tránh bị

nhầm.Mang về bảo quản ở nhiệt độ bình thường

Tất cả các thao tác trong quá trình làm đều phải làm gần ngọn lửa đèn cồn để tránh bị nhiễm khuẩn

Kết quả : sau khoảng 24h sẽ thấy các chấm trắng nhỏ như đầu chiếc đũa trên

petri,đó chính là khuẩn lạc.Tuy nhiên nếu làm không cẩn thận sẽ nổi những vệt nấm mốc đen

VI Hình ảnh khuẩn lạc

Bùi Thị Mỹ Phượng 90701906

Số khuẩn lạc : 9

Huỳnh Trung Hiếu 90700736

Số khuẩn lạc : 7

Đặng Ngọc Hòa 90700878

Số khuẩn lạc : 6

Nguyễn Thảo Vi 90702918

Số khuẩn lạc :10

Bùi Thế Bảo 90700121

Số khuẩn lạc: 8