Phương pháp nghiên cứu khoa học chuyên Đề tổng hợp vi sinh vật phân giải cellulose

Đã có nhiều nghiên cứu được tiến hành để phân lập dòng vi sinh vật sản sinh enzyme phân giải cellulose và khả năng phân giải cellulose của chúng.. Có ít nhất năm cơ chế riêng biệt được s

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

CHUYÊN ĐỀ TỔNG HỢP

VI SINH VẬT PHÂN GIẢI CELLULOSE

SINH VIÊN THỰC HIỆN

VÕ TÍNH THIỆN

LỚP: CÔNG NGHỆ SINH HỌC A1 K39

MSSV: B1303727

Cần Thơ, 19/9/2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

CHUYÊN ĐỀ TỔNG HỢP

VI SINH VẬT PHÂN GIẢI CELLULOSE

LỚP: CNSH A1 K39

MSSV: B1303727

Cần Thơ, 19/9/2015

i

VI SINH VẬT PHÂN GIẢI CELLULOSE

TÓM LƯỢC

Cellulose là hợp chất phổ biến nhất trong tự nhiên Cellulose có cấu trúc mạch thẳng dạng sợi rất bền, khó bị phân hủy Thủy phân cellulose bởi enzyme từ vi sinh vật là bước quan trọng trong chu trình carbon Hệ thống enzyme cellulase bao gồm ba lớp enzyme là: 1, 4-β-endoglucanase, 1, 4-β-exoglucanase, và β-glucosidase (β-D-glucoside, glucohydrolase hay cellobiase) Đã có nhiều nghiên cứu được tiến hành để phân lập dòng vi sinh vật sản sinh enzyme phân giải cellulose và khả năng phân giải cellulose của chúng Đối tượng được chọn để phân lập dòng vi khuẩn này thường là động vật ăn cỏ như bò, cừu, dê và côn trùng như bọ cánh cứng, mối Các nhóm vi sinh vật phân giải cellulose gồm các vi khuẩn hiếu khí hay kị khí, xạ khuẩn và nấm

ii

MỤC LỤC

TÓM LƯỢC i

MỤC LỤC ii

DANH SÁCH HÌNH iii

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG 2

2.1 PHÂN TỬ CELLULOSE 2

2.2 ENZYME CELLULASE VÀ CƠ CHẾ PHÂN GIẢI CELLULOSE CỦA VI SINH VẬT 2

2.3 VI SINH VẬT PHÂN GIẢI CELLULOSE 5

2.3.1 Vi khuẩn 5

2.3.2 Xạ khuẩn 5

2.3.3 Nấm 6

CHƯƠNG 3: KẾT LUẬN 7

TÀI LIỆU THAM KHẢO 8

iii

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1 Phân tử cellulose [8] 2 Hình 2 Cơ chế tổng quát được đề xuất trong phản ứng thủy phân cellulose bằng phức hệ enzyme C1: Exocellulase; Cx: Endocellulase [12] 3 Hình 3 Sơ đồ mô tả đơn giản cấu tạo của cellulosome [15] 4

1

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU ĐẶT VẤN ĐỀ

Thủy phân cellulose bởi enzyme từ vi sinh vật là bước quan trọng trong chu trình carbon Mặc dù rất có một lượng rất lớn cellulose nhưng chỉ một phần trăm rất nhỏ vi sinh vật có khả năng phân giải, có lẽ vì sự cứng cáp của thành tế bào Có ít nhất năm cơ chế riêng biệt được sử dụng ở những loài vi sinh vật khác nhau nhằm phân giải cellulose với

sự có mặt của enzyme cellulase Vi sinh vật và enzyme phân giải cellulose thì có thể rất khác nhau bởi vì cơ chất tự nhiên của chúng, thành tế bào thực vật, thì rất đa dạng Tại thời điểm này sinh thái học của vi sinh vật phân giải cellulose vẫn chưa được hiểu rõ mặc

dù đã có những thông tin về hệ vi sinh trong dạ cỏ của bò có thể giải quyết vấn đề này Hai vấn đề chính mà ngăn chúng ta hiểu biết về lĩnh vực này là sự đa dạng của vi sinh vật hiện diện trong môi trường phân giải cellulose và chúng ta không có khả năng nuôi cấy hầu hết chúng [1]

Không chỉ đóng góp vai trò trong chu trình carbon tự nhiên, vi sinh vật phân giải cellulose còn có tiềm năng lớn trong việc phân hủy cellulose trong nước ô nhiễm [2-4] và chuyển hóa cellulose thành nhiên liệu sinh học thay thế nhiên liệu hóa thạch [5, 6] Chuyển hóa sinh học cellulose thành nhiên liệu sinh học và các hóa chất mang lại các sản phẩm thiết yếu với năng suất cao dẫn đến lợi ích về kinh tế cũng như một giá thành rất thấp cho các sản phẩm này [7]

Trước tiềm năng ứng dụng to lớn của vi sinh vật phân giải cellulose, chúng ta cần có những hiểu biết nhất định về chúng bao gồm các chủng vi sinh vật có khả năng phân giải cellulose cũng như cơ chế của quá trình này Đó chính là nội dung được trình bày trong chuyên đề dưới đây

2

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG 2.1 PHÂN TỬ CELLULOSE

Cellulose là hợp chất cao phân tử được trùng hợp (polyme hóa) từ các gốc β-D-glucose bằng cầu nối β-1,4-glycosid nhờ vào khả năng tự dưỡng dưới ánh sáng của thực vật Vì vậy, cellulose là hợp chất phổ biến nhất trong tự nhiên Cellulose có cấu trúc mạch thẳng dạng sợi rất bền, khó bị phân hủy (Gupta, Pratima et al., 2011)

Hình 1 Phân tử cellulose [8]

2.2 ENZYME CELLULASE VÀ CƠ CHẾ PHÂN GIẢI CELLULOSE CỦA VI SINH VẬT

Phân giải cellulose cơ bản là quà trình sinh học được tạo ra và kiểm soát bởi các enzyme cellulase Cellulase là enzyme đa dạng nhất với chức năng xúc tác cho một phản

3

ứng đơn, nó đóng vai trò trong phản ứng thủy phân cầu nối β-1, 4 giữa hai phân tử glucose cấu tạo nên cellulose Sự đa dạng của enzyme cellulase có lẽ là kết quả của sự cực kỳ đa dạng của cơ chất mà chúng sử dụng - thành tế bào thực vật [1]

Hệ thống enzyme cellulase bao gồm ba lớp enzyme ngoại bào có thể hòa tan là: 1, 4-β-endoglucanase, 1, 4-β-exoglucanase, và β-glucosidase (β-D-glucoside, glucohydrolase hoặc cellobiase) Endoglucanase chịu trách nhiệm trong sự phân cắt ngẫu nhiên liên kết β-1, 4-glycosidic dọc theo chuỗi cellulose Exoglucanase thì cần thiết cho

sự phân cắt đoạn cuối chuỗi không biến đổi và phân tách các sợi cơ bản của tinh thể cellulose, và β-1, 4-glucosidase thủy phân cellubiose và cellodextrin hòa tan thành glucose [9, 10] Trên thực tế, mặc dù đều sử dụng cơ chất cellulose nhưng cơ chế phân giải cellulose của các loài vi sinh vật rất khác nhau [11] Cellulase trải qua các phản ứng thủy phân phức tạp được xúc tác bởi phức hệ enzyme đã nói ở trên, sản phẩm cuối cùng là glucose, cơ chế tổng quát của phản ứng được trình bày ở Hình 2

Hình 2 Cơ chế tổng quát được đề xuất trong phản ứng thủy phân cellulose bằng

phức hệ enzyme C1: Exocellulase; Cx: Endocellulase [12]

Cellulase có hoạt tính rất thấp đối với cellulose dạng tinh thể nhưng chúng có sự tăng cường xúc tác rất cao là do chu kỳ bán rã dài của tinh thể cellulose Enzyme này cũng rất khác biệt so với hầu hết các enzyme khác, vì chúng phân giải cơ chất không hòa

4

tan Điều này buộc chúng phải khuếch tán đến cơ chất và mang những mẫu cơ chất không hòa tan ấy đến tâm hoạt động, trong khi các cơ chất hòa tan thì khuếch tán và gắn vào tâm hoạt động của những enzyme khác [1]

Trong những vi sinh vật được tìm thấy có khả năng phân giải cellulose, vi khuẩn kị khí có hiệu quả sử dụng enzyme hơn các vi khuẩn hiếu khí Trong khi các vi khuẩn hiếu khí sản sinh lượng lớn enzyme, vi khuẩn kị khí thì lại tiết kiệm hơn Điều này là do ở vi khuẩn kị khí có hình thành một cơ quan bên ngoài tế bào của chúng, thể này giúp phân giải celluloe được gọi là cellulosome [13] Quá trình phân giải cellulose phức tạp, đòi hỏi

sự hiệp đồng chặt chẽ giữa các enzyme cellulase, hiệu quả của sự hiệp đồng được tạo ra bằng cách kết hợp chúng lại trong cellulosome Cellulosome được xem là cỗ máy cấp độ nano có cấu tạo phức tạp nhưng hiệu quả nhất trong thế giới tự nhiên [14]

Hình 3 Sơ đồ mô tả đơn giản cấu tạo của cellulosome [15]

Tương tác giữa các tiểu phần cấu tạo nên cellulosome được mô tả trong Hình 3 Các enzyme cellulase được liên kết vào phức hệ bởi các Dockerin tạo nên tiểu phần enzyme, trong khi đó cơ chất gắn vào CBM CBM nằm trong tiểu phần Scaffoldin, tiểu phần được kết nối với tiểu phần enzyme và protein anchoring thông qua tương tác dạng

“ổ cắm điện” giữa Dockerin và Cohensin Protein anchoring là protein neo đậu trên màng

tế bào vi sinh vật bằng mô đun SLH

5

2.3 VI SINH VẬT PHÂN GIẢI CELLULOSE

Đã có nhiều nghiên cứu được tiến hành để phân lập dòng vi sinh vật sản sinh enzyme phân giải cellulose và khả năng phân giải cellulose của chúng Các vi sinh vật phân giải cellulose chủ yếu được phân lập từ hệ tiêu hóa động vật ăn cỏ như bò, cừu, dê [16], và côn trùng như bọ cánh cứng, mối [17, 18] Ngoài ra chúng còn được tìm ra trong phân ủ, phân hữu cơ, bùn từ nước thải [13]

2.3.1 Vi khuẩn

Vi khuẩn phân giải cellulose bao gồm Clostridium, Bacteroides sucinogenes, Butyrivibrio fibrisolvens, Ruminococcus albus, Methanobrevibacter ruminatium, Siphonobacter aquaeclarae, Cellulosimicrobium funkei, Paracoccus sulfuroxidans, Ochrobactrum cytisi, Ochorobactrum Haematophilum, Kaistia adipata, Desvosia riboflavia, Labrys neptuniae,Ensifer adhaerens, Shinella zoogloeoides, Citrobacter freundii, and Pseudomonas nitroreducens Các loài này phần lớn thuộc nhóm

vi sinh vật kị khí, chúng được phân lập chủ yếu từ ruột của những loài động vật sử dụng

gỗ làm nguồn thức ăn [17, 19, 20]

Trong lòng đất người ta cũng phân lập được các dòng vi khuẩn Gram (+)

hiếu khí như Brevibacllus, Paenibacillus, Bacillus, và Geobacillus Đối với các dòng ưa

ấm, pH và nhiệt độ tối thích cho enzyme carbonmethyl cellulase của chúng hoạt động là 5,5 và 550C, còn đối với các dòng ưa nhiệt là pH 5,0 và nhiệt độ 750C [21]

2.3.2 Xạ khuẩn

Xạ khuẩn (Actinomycetes) là vi khuẩn Gram (+) có dạng sợi như nấm Chúng là vi sinh vật hiếu khí có mặt khắp nơi trong tự nhiên ADN của xạ khuẩn rất giàu G+C chiếm 57-75 % [22] Chúng chiếm ưu thế trong đất phèn khô [23] Xạ khuẩn còn được biết đến nhiều bởi các sản phẩm chuyển hóa bậc hai, nổi bật là các loại kháng sinh như streptomycin, gentamicin, rifamycin và erythomycin Ngoài ra, xạ khuẩn còn có vai trò quan trọng trong công nghiệp dược phẩm cũng như trong nông nghiệp

6

Streptomyces là giống chủ đạo trong xạ khuẩn, đây cũng là vi sinh vật sản

sinh cellulase được quan tâm nghiên cứu Một số loài đáng chú ý thuộc giống này như

Streptomyces reticuli, Streptomyces drozdowiczii, Streptomyces lividans [24-26]

Thermoactimnomyces được tìm thấy trong trầm tích đại dương, Streptosporangium trong quặng apatit cũng là những loài có khà năng phân hủy cellulose

[27-29]

2.3.3 Nấm

Nấm là sinh vật có cơ chế sinh hóa độc đáo trong phân giải cơ chất tạo những sản phẩm bậc hai đặc biệt, đây là nhóm được nghiên cứu nhiều nhất trong lĩnh vực phân hủy cellulose [30] Các cellulase từ nấm thường có hoạt lực cao và dường như không có các dạng vật lý phức tạp như enzyme này từ vi khuẩn

Acremonium spp., Chaetomium spp., Trichoderma reesei, Trichoderma viride, penicillium pinophilum, Phanerochaete chrysosporium, Fusarium solani, Talaromyces emersonii, Trichoderma koningii, Fusarium oxysporium, Aspergillus niger, Aspergillus terreus and Rhizopus oryzae có vai trò quan trọng trong quy trình phân hủy

cellulose ở nhiều môi trường khác nhau [7, 30]

7

CHƯƠNG 3: KẾT LUẬN

Cellulose là hợp chất khá bền vững nên cơ chế phân giải chúng rất phức tạp đòi hỏi một phức hệ enzyme tham gia Tuy vậy vẫn có nhiều loài vi sinh vật có khả năng sinh phân giải cellulose đã được khám phá Vi sinh vật sản sinh enzyme phân giải cellulose bao gồm vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm Các loài vi sinh vật yếm khí có hiệu quả phân giải cellulose cao hơn so với các hiếu khí nhờ vào sự có mặt của cellulosome

8

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Anh

1 Wilson, D.B (2011) Microbial diversity of cellulose hydrolysis Current opinion in microbiology 14,

259-263

2 Hubbe, M.A., et al (2012) Cellulosic substrates for removal of pollutants from aqueous systems: A review 2 Dyes BioResources 7, 2592-2687

3 Hubbe, M.A., et al (2011) Cellulosic substrates for removal of pollutants from aqueous systems: A review 1 Metals BioResources 6, 2161-2287

4 Hubbe, M.A., et al (2013) Cellulosic substrates for removal of pollutants from aqueous systems: A Review 3 Spilled oil and emulsified organic liquids BioResources 8, 3038-3097

5 Falter, C., et al (2015) Glucanocellulosic ethanol: the undiscovered biofuel potential in energy crops and marine biomass Scientific reports 5

6 Wang, A., et al (2011) Integrated hydrogen production process from cellulose by combining dark fermentation, microbial fuel cells, and a microbial electrolysis cell Bioresource Technology 102,

4137-4143

7 Yang, B., et al (2011) Enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass Biofuels 2, 421-449

8 Cellulose http://www.chemwiki.ucdavis.edu

9 Shewale, J (1982) β-Glucosidase: its role in cellulase synthesis and hydrolysis of cellulose International

Journal of Biochemistry 14, 435-443

10 Wiseman., J.W.a.A (1983) Fungal and other β-dglucosidases: their properties and applications

Enzyme and

Microbial Technology 4 73–79

11 Wilson, D.B (2008) Three microbial strategies for plant cell wall degradation Annals of the New York

Academy of Sciences 1125, 289-297

12 Schurz, J., et al (1985) Reaction-mechanism and structural-changes at enzymatic degradation of cellulose by Trichoderma-reesei-Cellulase Acta Polymerica 36, 76-80

13 Bayer, E.A., et al (2004) The cellulosomes: multienzyme machines for degradation of plant cell wall polysaccharides Annu Rev Microbiol 58, 521-554

14 Fontes, C.M and Gilbert, H.J (2010) Cellulosomes: highly efficient nanomachines designed to

deconstruct plant cell wall complex carbohydrates Annual review of biochemistry 79, 655-681

http://www.weizmann.ac.il/Biological_Chemistry/scientist/Bayer/cellulosome_systems

16 Oyeleke, S and Okusanmi, T (2008) Isolation and characterization of cellulose hydrolysing

microorganism from the rumen of ruminants African Journal of Biotechnology 7

9

17 Huang, S., et al (2012) Isolation and identification of cellulolytic bacteria from the gut of Holotrichia parallela larvae (Coleoptera: Scarabaeidae) International journal of molecular sciences 13, 2563-2577

18 Hu, X., et al (2014) Cellulolytic bacteria associated with the gut of Dendroctonus armandi Larvae (Coleoptera: Curculionidae: Scolytinae) Forests 5, 455-465

19 Milala, M., et al (2005) Studies on the use of agricultural wastes for cellulase enzyme production by Aspergillus niger Res J Agric Biol Sci 1, 325-328

20 Schwarz, W (2001) The cellulosome and cellulose degradation by anaerobic bacteria Applied

microbiology and biotechnology 56, 634-649

21 Rastogi, G., et al (2009) Isolation and characterization of cellulose-degrading bacteria from the deep subsurface of the Homestake gold mine, Lead, South Dakota, USA Journal of industrial microbiology &

biotechnology 36, 585-598

22 Lo, C., et al (2002) Actinomycetes isolated from soil samples from the Crocker Range Sabah ASEAN

Review on Biodiversity and Environmental Conservation

23 Jeffrey, L (2008) Isolation, characterization and identification of actinomycetes from agriculture soils

at Semongok, Sarawak African Journal of biotechnology 7

24 Kluepfel, D., et al (1986) Characterization of cellulase and xylanase activities of Streptomyces lividans

Applied microbiology and biotechnology 24, 230-234

25 Semêdo, L., et al (2004) Streptomyces drozdowiczii sp nov., a novel cellulolytic streptomycete from soil in Brazil International journal of systematic and evolutionary microbiology 54, 1323-1328

26 Schrempf, H and Walter, S (1995) The cellulolytic system of Streptomyces reticuli International

journal of biological macromolecules 17, 353-355

27 Chang, C.-C., et al (2009) Activity of cellulase from Thermoactinomycetes and Bacillus spp isolated from Brassica waste compost Scientia Agricola 66, 304-308

28 Mba, C.C (1997) Rock phosphate solubilizing Streptosporangium isolates from casts of tropical

earthworms Soil Biology and Biochemistry 29, 381-385

29 Veiga, M., et al (1983) Isolation of cellulolytic actinomycetes from marine sediments Applied and

environmental microbiology 46, 286

30 Shahriarinour, M., et al (2011) Screening, isolation and selection of cellulolytic fungi from oil palm empty fruit bunch fibre Biotechnology 10, 108-113