Khảo sát Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy Đến hoạt tính sinh học của nấm cộng sinh Địa y graphis sp

Trong tự nhiên, nắm cộng sinh địa y phát triển khá chậm và lượng sinh khối thu nhận được không ôn định do tác động của ô nhiễm môi trường |4 Người ta nghiên cứu phát hiện nắm cộng sinh

NGUYEN BAO CHAU

KHAO SAT ANH HUONG CUA MOI TRUONG NUOI CAY DEN HOAT TINH SINH HỌC CỦA NÁM CỘNG SINH DIA Y

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

NGUYEN BAO CHAU

KHAO SAT ANH HUONG CUA MOI TRUONG NUOI CAY DEN HOAT TINH SINH HỌC CUA NAM CONG SINH DIA Y

LOLCAM DOAN

Tôi xin cam đoan rằng đây là công trình nghiên cứu của tôi, có sự hỗ trợ tử

giảng viên hướng dẫn là TS Trần Thị Mình Định Các nội dung nghiên cứu và kết trình nghiên cứu nào trước đây Những s liệu rong các bảng biểu phục vụ cho việc

trong phần tài liệu tham khảo.

Tôi xin chân thành cảm ơn cô TS Trần Thị Minh Định - người đã tận tình

giúp đỡ và hướng đẫn tôi trong quá th học tập, nghiên cứu và hoàn thiện khu

luận này

Tôi xin chan thank cảm ơn Trang tân Khoa học và Công nghệ Sinh học

trường Đại học Khoa học tự nhiên đã hỗ trợ tôi thực hiện khóa luận này Tôi xin chân thành cảm ơm Trường, Phòng Đào tạo, các thây cô trong Khoa

Sinh học - Trường Đại hạc Su phạm TP HỖ Chỉ Minh đã tạo điu kiện thuận lợi cho

tôi thực hiện khóa luận mày

“Qua đây, tôi cũng xin bày tỏ lồng cảm ơn đn gi đình, người thân và bạn bè

“đã giúp đỡ tôi trong thôi gian thực hiện khóa luận nay

“hi Minh, ngày 26 thang 04 năm 2024

SINH VIÊN

Nguyễn Báo Châu.

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

MỞ ĐÀU

1 Lí đo chọn đề tài

II Mục tiêu nghiên cứu,

TL Đổi tượng nghiên cứu

` Phạm vỉ nghiên cứu

XI Thời gian và địa điểm nghiên cứu

CHUONG 1, TONG QUAN

1.1 Địa y và hoại tính sinh học của chúng, 1.11.Địa y

1.1.2 Địa y thuộc chỉ Graphis

1.1.3 Hoạt tính sinh học của địa y thude chi Graphs 1.2 Tong quan về hoạt tính sinh học

1.2.1 Tổng quan về hoạt tính kháng khuẩn 1.2.1.1 Tổng quan vì khuẩn Sigplycoccs aureus 1.2.1.2 Tổng quan về môi trường MHA, 1.22 Tổng quan vé hoat tinh te ehé enzyme ø-glucosidase 1.2.2.1 Tổng quan vé enzyme «glucosidase

1.2.22 Téng quan vé cdc chit ic ché enzyme a-glucosidase

1.3 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nắm cộng sinh địa 1.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VẢ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vậtiệu nghiên cứu

2.2 Thiết bị và hoá chất

2.2.1 Thiết bị,

2.2.2 Hóa chất

2.3.1 Phương pháp tách chiết DNA

3.3.2 Phương pháp PCR,

3.3.3 Phương pháp điện di, giải trình tự

2.3.4 Phương pháp nuôi nắm cộng sinh địa y Graphis sp 3.3.5 Phương pháp tao cao thd ethyl acetate

2.3.6 Phương pháp khảo sát hoạt tính sinh học,

2.3.6.1 Phuong pháp khảo sát hoạt tính kháng khuẩn 2.3.6.2 Phương pháp khảo

3.3.7 Phương pháp xử lí số liệu

CHƯƠNG 3 KẾT QUÁ VÀ THẢO LUẬN

ất hoạt tính ức chế enzyme a-glucosidase 3.1 Kết quả định danh nắm cộng sinh địa y Graphis sp bằng sinh học phân từ 3⁄2 gui ni nim céng sinh dia y Graphis sp

3.2.1 Nim mudi rên môi trường Mix

3122 Nắm môi trên môi trường Sabouraud

3.3 Kết quả tạo cao thô cty] acette từ nắm cộng inh địa y Graphis sp

3.4 Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học

3.4.1 Kết quả khảo sắt hoại tính khẩng khuẩn đổi với Š.aureus

3.4.2 Kết quả khảo sắt hoạt tính ức chế enzyme a-glucosidase

Chữ viết tắt Chữ viết day đủ

ABTS azinobis-(S-ethyibenzothiazoline-6-sulfonic ack)

Basic Local Alignment Search Tool BLAST (Công cụ m kiếm các vị tí tương đồng cục bộ giữa các tình tự) : "

‘Colony Forming Unit

Thermal transcribed spacer

Inhibition of xanthine oxidase

‘Minimum Inhibitory Concentration Mic (âtồng độ ức chi thiểu) ` TỰ Game

‘National Center for Biotechnology Information NCBI (Trung tâm Thông ỉn Công nghệ Sinh học Quốc gia) ,

National Cooperative Bank Limited NCBL Ngân hàng Hợp tác Giới hạn Quốc gi) "

Polymerase Chain Reaction

TBE

Bảng 2.1 Các thiết bị sử đụng trong để là 1b Bảng 22 Các hóa chất sử dụng tạo môi trường môi cấy “ Bảng 2.3, Các hóa chất sử dụng định danh nắm bằng sinh học phân tử, “ Bang 3.1 Bing tinh bay sinh khối cao chit ethyl acetate cia cia nim cong sinh địa

Y Graphi sp ở các môi trường và hồi gian nuôi cẤy khác nhan 26 Bang 3.2 Tite ehé enzyme w-glucsidase ea cao chit ethyl acetate tr nim c6ng

Bang 3.3, Ti Ig ức chế ehzame øralueosidas của cao chiết từ sinh khối nắm được

DANH MUC CAC RINH

Hình 1.1 Cấu trúc của hoạt chit acarbose, migtitol 10 Hinh 2.1 Phucmg php dinh danh nim bing sinh hoe phan ie 1s Hình 2.2 Phương pháp khảo sát hoạt tính sinh học 16, Hình 2.3 Chu tình nhiệt dự kiến sử đụng rong phản ứng PCR " Hình 24 Minh họa vịtrí các đoạn mỗi phổ thông ITSI và ITS4 [50] Is

Hình 26 Hình chụp sinh khối nim ngim trong dung mi ethyl acetate 19 Hình 3.1 Hình chụp két qué dign di sin phim PCR ving ITS của nắm, 21 Hình 32 Hình chụp kết quả giải tình tự sản phẩm PCR sử dụng mỗi [TSI 22

Hình 3.4 Hình chụp nắm nuôi trên môi trường Mix 6 tuần 2

Hình 35 Hình chụp nắm muỗi trên mỗi trường Mix 8 uẫn 23 Hình 36 Hình chụp nắm mi trên môi trường Mix I0 tuần 24 Hình 3/7 Hình chụp nắm nuổi trên môi trường Mix I2 tuẫn 24 Hình 38 Hình chụp nắm nuôi trên mỗi trường Sabouraud 6 twin 35 Hình 39 Hình chụp nắm nuổi trên môi trường Sabouraud 8 tuẫn + Hình 3.10, Hình chụp nắm mùi trên môi trường Sabonrand 10 tu 3 Hình 3.11 Hình chụp nắm môi trên mỗi trường Sabouraud 12 tuần 2s Hình 3.12 Hình chụp kết quả khảo sắt hoạt ính kháng khuẩn của nắm cộng sinh địa

Hình 3.13 Hình chụp kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của nắm cộng sinh địa

Hình 3.14 Hình chụp đổi chứng âm (DMSO) 27

Hình 3.15 Đỗ thị thể hiện sự tương quan giữa tỉ lúc ché enzyme arglucosidase véi

legarit nồng độ cao từ sinh khối nắm Graphis sp nuôi trên môi trường Sabouraud 6 tần 31 Phụ lục 1 Hình chụp khảo sát hoạt tính ức chế enzyme ø-glueosidase ở 8 loại cao chigt ethyl acetate a

Phụ lục 3 Hình chụp Khảo sát hoạt tính ức chế Cw enzyme a-plucosidase eta eao

6 tuần °

MG DAU

1-.Lí đo chọn đề tài

Hiện nay, các căn bệnh do nhiễm khuẩn, nhiễm trìng là nguyễn nhân gây tử ong cho hàng triệu người trên thể giới [1] Các bệnh do nhiễm khuẩn thông thường được điều tr bằng khẳng sinh Tuy nhiên, điều này vô tỉnh gây ra én tượng kháng kháng sinh Để kháng với kháng sinh ở vi khuẩn ngày cảng trở nên phổ biển khiến nguy hại cho sức khỏe và tính mạng con người [2]

Đái tháo đường (ĐTD) là bệnh rối loạn chuyển hóa do các tế bào beta của tuyến tuy sản xuất insulin không đủ cho cơ thể, hoặc cơ thể có dit insulin nhưng té bào

mã còn ở các nước đang phát triển, trong đô có Việt Nam [3]

Ở những bệnh nhân mắc bệnh ĐTĐ tuýp 2, sau bữa ăn đường huyết thường có

xu hướng tăng vọt, khó kiểm soát do host dong cia enzyme a-glucosidase Acarbose

‘enzyme o-glucosidase Tuy nhiên, điều trị bệnh bằng acarbose ít nhiều gây ra những

tác dụng phụ không mong muốn [3] Vĩ vậy, các nghiên cứu hiện nay tập trung nghiên cứu những hợp chất có nguồn gốc tử tự nhiên với mong muốn tối ưu trong điều trị bệnh ĐTĐ tuýp 2

Địa y - một dạng sống cộng sinh giữa tảo hoặc vĩ khuẩn lam và nắm cộng sinh,

Các hợp chất được tạo ra bởi địa y gồm các chất chuyển hóa sơ cắp (protein, amino

acid, polyol, carotenoid, polysaccharide, vitamin) và thứ cấp (depside, depsidone,

y Trong tự nhiên, nắm cộng sinh địa y phát triển khá chậm và lượng sinh khối thu

nhận được không ôn định do tác động của ô nhiễm môi trường |4) Người ta nghiên

cứu phát hiện nắm cộng sinh địa y có thể sinh trưởng độc lập trên các môi trường nhân tạo Đến thời mhiệntại nhiễu công trình nghiên cứu công bổ các chất chuyển

hóa thứ cấp từ nắm cộng sinh địa y có hoạt tính sinh học như ức chế enzyme œ-

lueosidase, kháng khuẩn, kháng nắm 56] [7Ì

Chỉ Graplis với hơn 400 loài - chiếm số lượng lớn nhất họ địa y Graphidaceae

[8] [9] Nhận thấy chỉ nắm nảy chưa có nhiều nghiên cứu thực hiện khảo sát hoạt tính

kháng khuẩn đối với Staphylococcus aureus vi hoạt tính ức chế enzyme a-

glucosidase h đến tháng 4 năm 2024 vẫn chưa có nghiên cứu nào được thực hiện nhằm khảo sắt ảnh hướng của môi trường mui cấy đến hoạt tỉnh kháng khuẩn và ức

ch enzyme a-glucosidae ia nim e6ng sinh dia y Graphis sp

.Vï những lý do trên để tài "Khảo sát ảnh hướng của môi trường nuôi cấy đến

ho ính inh học của nắm cộng sinh đị y Graphis sp lược thực hiện TỊ- Mi tiêu nghiên cứu

Khảo sắt ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến hoại ính kháng khuẩn đối với

Staphylococcus aureus vai hoạt tinh ức chế enzyme œ-glueosidase của nắm cộng sinh dia y Graphis sp

m1 tượng nghiên cứu

"Nắm cộng sinh địa y Graphis sp được phân lập và lưu trữ ở phòng thí nghiệm Sinh hoá ~ Vì sinh với mã số UE-MYOS Loài nắm này được phân lập từ mẫu địa y

Thị Phi Giao, Khoa Sinh học ~ Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phổ Hồ Chí Minh với mã số UE-L0I4

IV Nhiệm vụ nghiên cứu

- Định danh nắm cộng sinh địa y Grapis sp bằng sinh học phân từ

- Nuôi n Graphis sp với số lượng lớn trên mỗi trường Mix và Sabouraud,

~ Thu sinh khối nắm vào các thời điểm 6 tuằn, 8 tuần, 10 tuần và 12 tuần

- Tao cao tho ethyl acetate tr sinh khối nắm thu được

~ Khảo sát hoại tính sinh học:

+ Hoat tinh kháng khuẩn

+ Hogt tinh ức ché enzyme a-glucosidase

Đề tải khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến hoại tính kháng khuẩn

và hoại tính ức chễ enzyme ø-glucosidase của loài nim cộng sinh địa y Graphis sp

VI Thời gian và địa điểm nghiên cứu

= Thời gian: 6 tháng (10/2023 - 03/2024)

- Địa điểm: Các thí ngh được thực hiện tại phòng thí nghiệm Sinh hóa — Vi

ố Hồ Chí Minh sinh, Khoa Sinh học, Trưởng Đại học Su pham Thanh pl

1.1 Địa y va hoat tính sinh học cũa chúng

LI Biay

Địa y được hình thành từ mỗi quan hệ cộng sinh giữa 2 thành phần gồm nắm (myeobiont) và một số các sinh vật có khả năng quang hợp (photobion) [I0], Thành

nắm có khả năng cộng sinh với tảo phát triển thành địa y Nắm được ước tính khoảng

tiên 1.5 triệu loài Từ đó nhận thấy, tảo cộng sinh với nắm có thể cho ra tối thiểu

250.000 loài địa y [L1] Thành phần thứ hai là các sinh vật có khả năng quang hợp

hiện nay phân loại được khoảng 100 loài trên tổng số địa y đ biết [12] Tảo lục dinh

dưỡng bằng cách quang hop to ra carbohydrate va chit how ev Hinh thie din khác, nắm tổng hợp các hợp chất tự nhiên và bảo vệ tảo khỏi các tác nhân gây hại

như tỉa UV, sâu bọ, động vật ăn thực vật, | 10]

Địa y được phân lại thành 3 dang ow bin: dang Khim, dang soi, dang phiến

(10] Đạng khẩm (crustose) bám chặt vào bề mặt của giá thẻ Giá thể có thể là đá hoặc

vách đá, thân cây khác Dạng phiển (foliose) phát triển nhiễu cành, nhánh giống với

cấu trúc của lá cây Dạng sợi (ruticose) cấu trúc hình sợi, với nhiều sợi hợp lại tạo

thành hình dáng giống dạng cây bụi nhỏ [II], Địa y phân bổ trên 8% bề mặt đất liền

của trái đ chủ yếu ở các vùng Bắc Cục, Nam Cực,

Da dang vé hinh thai và môi quan hệ cộng sinh độc đáo giữa nắm và tảo là lý do khiến

diay sin trường, phân bổ ở rắt nhiễu nơi, kỄ cả ở những mỗi trường khắc nghiệt nhất

trên thể giới [I0]

nguyên, các vùng núi [13]

Tên địa y được đặt theo tên loài nắm thay vì the tên loài tảo vì nắm là thành phần đễ quan sắt hơn tảo Thực nghiệm quan sắt được, địa y có nhiều màu sắc như phú bên ngoài của địa y giúp bảo vệ chúng khỏi diều kiện chiếu sáng cao hoặc nhiệt

độ thấp, tạo độ ẩm để địa y sinh trưởng tốt Hơn 700 hợp chất hóa học hữu cơ đã được

cô lập địa, Mỗi loài địa y sẽ tổng hợp các hợp chất chuyển hóa có thành phần hóa

học khác nhan, Do đó, dựa vào việc xác định thành phần hóa học của những hợp chất

chuyễn hóa này giúp phân biệt các loài địa y khác nhau nhưng hình thái tương tự

nhau Môi trường bị ô nhiễm gây ảnh hướng rắt lớn đến sự sinh trưởng, phat trién, nhiễm môi trường [11]

Šn thống

“Trong nhiều năm qua, địa y được sử dụng như một phương thuổ

chữa bệnh ở các nước Châu Âu Địa y có thể được dùng chữa bệnh ho, bệnh tiểu đường, bệnh lao phí làm lành vết thương, bệnh da liễu Ngoài ra, địa y còn là nguồn

nguyên liệu cho san xuất thuốc nhuộm, rượu, tỉnh dẫu thơm (14] [15]

Phân lập nắm cộng sinh địa y người ta m thấy các hợp chất có hoạt tính sinh

học như usnie, acid lichesterinic và atranorin [14] Bên cạnh đó, địa y tổng hợp các

hợp chất chuyên hóa thứ cấp: đepide, epdidone, dibenzofuran, dn xuất xamhone

và tepene Địa y cùng các hợp chất này có những hoạt tính inh học như: khẳng

virus, kháng khuẩn (hiệu quả nhất đối với vi khuẩn gram đương), ức chế enzyme,

XMột vài ví dụ điễn hình về công dung chữa bệnh ở một số loài nắm cộng sinh địa y

g6m Lobaria pulmonaria va P sulcata được dùng trong điều trị các bệnh liên quan

đến phổi và thần kinh Xonmhori parierina được dùng điều tị bệnh vàng da và suleala và Pamnclia saxaniis có hoạt tính e chế ung thư khá cao với gi tri ICs dao động trong khoảng 9.55 - 2295 ngýmL [16] [171

1.1.2, Bjay thuge chi Graphis

Graphis la met chi dia y được tim thấy chủ yếu ở vùng nhiệt đói bao gbm 330

loài đã biết [18] Các loài địa y thuộc chỉ Graphis có thể được phân loại dựa vào so sánh đặc điểm hình thái, giải phẫu, sinh lý, sinh hóa Mặt khác, phân loại các loài

sinh vật quang hợp (tảo) Các hợp chắt chuyển hóa như acid nonsieúe hoặc sieie đến màu sắc tản địa y (vàng nhạ) [19]

1.1.3, Hogt tink sink học cia dja y thuộc chỉ Graphis

sự biển tính

.G-ajarekarii có hoạt ính ức chế đông mắu, kháng viêm và ức protein cũng như sự phát triển của các dòng tế bảo ung thư (MCF-7, DUIS va K- kháng viêm, e chế tế bảo ung thư [21] 122]

G garoana, G glauconigra, G hossei, G inamoena, G inquinara, G panvardhanii, G persicina, G persulcata, G pyrrhocheiloide, G scripta, G xanthine oxidase, kháng oxy h6a, 22]

G schicograpta, G guimarna, G nakanishiana Abu cho thấy hoạt tính ức chế

fin lượt là 28,8%, 58,4, 69,3% khi được nuôi cấy trên

n (4) Bên cạnh đó, G assamensis, G nakanishiana, đã cho enzyme xanthine oxidase

môi trường Bold cải

thấy khả năng ức ché enzyme tyrosinase trong khoảng 30 - 78% [23]

Các hoạt chất được cô lập có hoạt tính sinh học cao như norstictic, stictic, cconstictic, salazinie, trace stiete từ các loài nắm cộng sinh địa y: G- yunnanensis, G assamensis, G guimarana, G inquinata, G longiramea, G nakanishiana Bên cạnh tyrosinase tit 50% trở lên [24] [25]

Các cao chiết methanol từ các loài nắm cộng sinh dia y: G assamensis, G imarana, G patwardhanti G lhimensi cho thấy khả năng loại bỏ gốc tự do từ pyyrhocleloides cồn có khả năng ức chễ enzyme xanthine oxidase với lệ ức chế

30% [25]

G handelii ¢6 hoạt tính ức chế nhiều loại enzyme, bao gồm ức ché enzyme a-

slucosidase, enzyme phign mã ngược HIV-l, ức chế enzyme protease chính (M") ở

Virus SARS-CoV-2 Bén canh dé, G hanh còn có khả năng chống viêm và gây

độc tế bảo đối với một số dòng tế bảo ung thư [26]

1.2 Tổng quan về hoạt tính sinh học

1.2.1 Tang quan về hoạt tính kháng khuẩn

1.2.1.1 Tổng quan vi khuẩn Siqplycoccus aureus

Staphylococcus aureus ka mt loai ta edu khuin gram dương được phân loại trong ho Mierococeacene (Stackebrandt vi Woese, 1979; Schleifer, 1986) (271

S.aureus là vi khuẩn ta ni ii, một số chủng tụ cầu khuẩn có thể phát triển ở nhiệt độ

thấp tới 6,7°C Nhìn chung, S.aurews sinh trưởng trong nhiệt độ dao động trong

khoảng 7 đến 47,8 °C và nhit độ tối ưu cho sự phát triển ở $ aurers là 35 5C

Người ta đã chứng mình rằng S aureus có khả năng sản xuất ít nhất 34 loại protein

noi ào khác nhau và không có chúng vĩ khuẩn nào có khả năng sản xuấLtắt cả các loại protein niy [28]

S3 anrews có nhiều yêu tổ độc lực khác nhau có thể dẫn đến nhiễm trùng năng Catalase duge sin xuit bai S aureus, fa mst enzyme cho phép vỉ khuẩn này tồn ti S.aureus bao gim coagulase (chất xúc ác tạo ra fibrin tir fibrinogen) va cdc you t8 gây tan mầu (iêu diệt hồng cẳu), letkocidin (sây hoạ tử da) độc ổ một B và C lan truyền phản ứng viêm toàn thân [29]

Chúng § aurews có khả năng kháng kháng sinh penicillin ngay sau khi kháng

sinh ra đồi vào đầu những nim 1940 (Lowy 2003; Peacock va Paterson 2015; Walsh

thuốc [30]

Qua thứ nghiệm nhận thấy nắm cộng sinh dia y Parmelia sulcata e6 chứa thành

phần acid salzinie có khả năng kháng S aureus (31) Cao chiét hexane eta nim

tối thiểu - MIC 1a 21 ug/mIL [32] Cao chiết ehtyÌ acetate từ 2 loài nắm cộng sinh địa

y 18 Graphis ajarekarii va Paramoirena tnetorum có khả năng khẳng vì khuẩn gram

fm nhs Escherichia coli va Salmonella typhi va vi khuin gram dương như: Micrococcus tens va Bacillus subtilis [33]

hin thiy diay thuGe chi Graphis 66 kh năng khẳng một số vi khuẩn gram dương nhưng Ít nghiên cứu thực hiện khảo sát hoạt tính kháng khuẩn đối với 5

‘aureus Vì vậy đỀ ti tiễn hành khảo sát hoạt ính kháng khuẩn 8 dreus từ cao chiết chyl aceute của nắm cộng sinh địa y Graplis sp

1.2.12, Téng quan về mỗi trading MHA

Môi trường Muller Hinton Agar (MIA) duge phat tri boi J Howard Mueller

và Jane Hinton tai đại học Havard vào năm 1941 MHA là môi trường giàu dinh

dưỡng và thường đăng để thực hiện kiểm tra sự nhạy cảm với khang sinh cia vi hyởrolysat (cung cấp nhiều acid amin và các chất khoáng cần thiết cho sự sinh trưởng) tỉnh bột và thạch với pH của môi trường ôn định trong khoảng 7.4 ~ 7.6 [34l

vay MHA tùy thuộc Hiện nay môi trường MHA được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu, cược sản xuất với dạng bột pha sẵn các thành phần với nhan Tuy nhỉ

vào công ty sản xuất mà thành phần và định lượng các chắt có thể sẽ có sự thay đổi nhưng vẫn đảm bảo đặc tính nguyên thủy của môi trường

1.42 Tắng quan về hoạt tinh ire ché enzyme acelucosidase 1.2221 Tổng quan vé enzyme a-glucosidase

Enzyme a-glucosidase (EC 32.120, maltase) là một enzyme thuộc nhóm slycosidase Enzyme này được tìm thấy nhiều trong ruột non và gồm một nhóm các enzyme nhu maltase, glucoinvertase, glocosidosurase, maltase-glucoamylase, a-

se hydrolase, «= glucopyranosidase, glucosidoinvertase, «-D-glucosidase, «-glucos

1 4-glucosidase [35] [36] Enzym a-glucosidase tn tai trong hẳu hắt các sinh vật Ở người, enzym ø-glucosidase được tìm thấy trên vi nhung mao đường ruột, tham gia

trong bước cuối cùng của quá tình chuyển hóa carbohydrte 37] Enzym a-glacosidase la mg rong những enzymethuộc lớp giycoside hydrolase

(GH) có khả năng tách các liên kal glycoside ita 2 phan Ur carbohydrate, Khả năng,

phân cắt các iên két glycoside cia enzyme a-glicosidase nhanh hom 10-17 lin so véi

phản ứng không có enzyme xúc tác [37],

Carbohydrte là chất định dưỡng đa lượng chính trong chế độ ăn của con người chúng ta Khi đưa thức ăn vào cơ th, các phân tử cartbohydrae sẽ được thủy phân carbohydrate niy di vio cơ thé và bị thủy phân thành những phân từ đường đơn và

thâm thấu bởi hệ các enzyme trong ruột non như enzyme a-amylase 6 tuy va enzyme:

a-glueosidase Do vậy, bằng việc ức chế hoạt động của enzyume a-glucosdas có thể

máu, giảm đường huyết [37]

12 2 Téing quan vé cdc chdt ite ché enzyme a-glucosidase

Cc chit te ché enzyme a-glicosidase ~ AGIs (a-glucosidase inhibitors) chậm quá tình tiêu hóa và hắp thú aroohydrae Kết quả là lượng đường trong mu sau bữa ăn có thể được ám soát Do 4, re ché enzyme a-glucosidase duge coi Ia

mục tiêu điều trị quan trọng để điều tị các bệnh liên quan dén carbohydrate như bệnh

ĐTĐ rợp 2 [35]

“Theo các nghiên cứu trước đây, các lại thuốc AGIs điễn hình như migltolvà earbose,có thé tng euing tit GLP- (Glucagon like peptie-1) Iam giảm cảm giác

thêm ăn [37], Hign nay có nhiều AGI nỗi tiếng được sản xuất bởi các hợp chất hữu

cơ để điều tị bệnh tiêu đường như acatbose, igliGl, nojidmycin, voglibose [38]

Acarbose làm chậm quá trình tiêu hóa carbohydrate bằng cách ức chế cạnh tranh với

enzyme arglicosidase ở một non, dẫn đến làm giảm đường huyết sau ăn [37] Do trực tiếp trong hip tha catbohydrte từ thúc ăn vào mẫu mà còn có vi rd gin tgp

lượng hormone insutin [39]

HO, AN gio Ne HO, A ~LOH

acarbose mgitol

Hình 1 Cầu trúc của hoạt chất acarbose, miglitol Tuy nhiên, điều tả ĐTD tuƒp 2 từ AGI có một số tác dụng phụ như: đau bụng

chướng bụng, đầy hơi, tiêu chảy và chuột rút Vì vậy, việc sàng lọc những hợp chất

tư nhiên với mon muốn hạn chế tác dụng phụ từ các loại thuốc tổng hợp ngày càng

được quan tâm [38] Và trong số những sản phẩm từ tự nhiên, địa y đang là một đối

tượng đầy tiềm năng đáng để quan tâm nghiên cứu vẻ hoot tinh ức chế enzyme ø- glucosidase

1.4, Ảnh hưởng của mỗi trường nuôi cẤy đến nắm cộng sinh địa y

nitrogen) Dung môi methanol được sử dụng tạo cao nhằm tiến hành khảo sát các

hoạt tính như: úc chế enzyme tyrosinase, te ché enzyme xanthine oxidase, logi bb sốc tự do [4]

G schizograpta th hiện hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase cao nhất khí nuôi trên môi trường Bold ải tiến với lệ ức chế là 17,3 và thấp nhất khi nuôi trên môi

là 23% Hoat

trường Murashige và Skoog véi ti Ig ức c ức chế enzyme xanthine oxidase cao nhất khi nuôi trên môi trường Bold cải tiến với tỉ lệ ức chế là

28,8% và thấp nhất khi nuôi trên môi trường MalL-yeast, Bischoff va Bold với ti lệ

ức chế là 4,8 Khả năng loi bỏ gốc tự do cao nhất khi nuôi trên mỗi trường Bold

‘Skoog voi ti Ig the chế là 0,3 % |4]

6 guimama thể hiện hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase cao nhất kh nuôi tên

môi trường Bold cải tiến với tỉ lệ ức chế là 62,5% và thấp nhất khi nuôi trên môi

là 78%, Hoạt

trường Murashige và Skoog với tỉ lệ ức of ức chế enzyme

ức chế là

xanthine oxidase cao nhất khi nuôi trên môi trường Bold cải tiến với tỉ

58,4% và thấp nhất khi nuôi trên môi trudng Bischoff và Bold với tí lệ ức chế là 5,8

4, Kha năng loại bỏ gốc tự do cao nhất khi nôi trên mỗi trường Bold cai tiến với ti

lệ

ức chế là 2,4% [4]

G nakanishiana thể hiện hoạt tinh te ché enzyme tyrosinase cao nhất khi nuôi

.44.2% và thấp nhất khi nuôi trường Murashige vi Skoog với tỉ lệ ức chế là 6,3% Hoạt

chế là 77,2% và thấp nhất khi nuôi trên môi trường trường Malt-yeast với tỉ lệ

trên môi trường Bold cải tiền với t lệ ức c n moi

are ché enzyme

xanthine oxidase cao nhất khi nuôi trên môi trường Bold cải tiến với tỉ lệ ức chế là

69.3% và hấp nhất khỉ nuôi trên môi trường Marachise va Skoog vei lệ ứe chế là

10/7 % Khả năng loại bỏ gốc tự đo cao nhất khi nuôi trên môi trường Bold cải tiến

ới lệ ứe chế là 66,2 % và thấp nhất khi muôi trên môi trường trường Murashige va

kháng khuẩn Mycobacterium tuberculosis —trye khuẩn chủ yếu gây bệnh lao, với giá

tr nông độ ức ch tố thiểu (MIC) là 100-200 g/mL (40) [Nam 2018, nghiên cửu xác định được thành phẫn chất chẳng oxy hóa (DPPH,

ABTS và gốc tự do), chống độc tế bào thứ nghiệm ở chuột bạch tạng đực, hạ đường

huyết qua thử nghiệm dung nạp giucose đường uống ở chuột và thuốc ị đãi tháo

dường Sueptozotocin (STZ2 gây ra bệnh ễu đường ở chuột được im thấy ở loài nắm

mg sinh dja ý G ajarekarii [41]

Năm 2018, một nghiên cứu chỉ m rằng cao chiết methanol từ nắm cộng sinh địa y Usnea schadenbergiana e6 kha ning te ché enzyme a — glucosidase git ICs 1875.23 ypiml cao nhit rong 11 loài địa ý được phân lập tại Việt Nam [14] Năm 2020, nghiên cứu đã tiễn hành phân lập thành công 5 depsidone mi từ loài địa y Parmotrema tsavoense Cie hop chit thể hiện khả năng ức chế cnzyme ø-

4 tri ICs) nim trong khoảng từ 107 đến 176 pM gắp nhiều lần so

449 WM) [42]

Năm 2022, nghiên cứu thấy chiết nuit polyphenol cia 0, subpaltescens, P

glueosidase với

với đối chứng dương acarbose (ICa

saxatilis, V viridula và G- scripa cho thấy khả năng ức chế rất mạnh đổi với

Pseudomonas aeruginosa (94.52%, 96.08%, 90.1%) va Escherichia coli (90.55%) [43], Loti diay Parmotrema tsavoense qua nghitn cin 44 phan lip duge cht méi tén goi Ia Parmosidone K thể hiện khả nding Ge ehé enzyme a-glucosidase v6i giá tị ICs a0 fa 3,12 uM 44]

Việt Nam có số lượng và thành phẳn địa vô cùng đa dạng và phong phú Tuy hiền địa y chưa thật sự được quan tâm vỀ hoạt tính nh học, cũng như những đóng

sốp to lớn mã địa y mang lại 45]

2.1 Vat ligu nghiên cứu

Nắm công sinh địa y Graphis sp duge dinh danh bai Tién sĩ Võ Thị Phi Giao

Hiện nay loài nắm này được lưu trữ ở phòng thí nghiệm Sinh hoá — Vi sinh với mã

số UE-AMY§ và tại Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phổ

Hồ Chí Minh với mã số UE-L0I4

-22 Thiết bị và hoá chất

2.2.1 Thiết bị

Các thiết bị sử dụng trong đề tài được thể hiện ở Bảng 2.1 Bảng 2.1 Các thiết bị sử dụng trong đề tài

Mấy cô quay chân không Heidolph (Mỹ) May do OD ‘Thermo Genesys 20 (Mỹ) Pipetman 5000 ul VITLAB (Đức)

Hóa chất sử dụng tạo cao Ia ethyl acetate 99,5% (AR, Trung Quốc)

“Các hóa chất được sử dụng tạo môi trường nuôi cầy và định danh nắm bằng sinh học phân tử được thể hiện ở Bảng 2.2, Bang 2.3

Bảng 2.2 Các hóa chất sử dụng tạo môi trường nuôi cấy Môi trường Tiến chất

Sq peptone from meat

‘Tach chiét DNA

(ting thé tich 25 pL, còn lại 2 wl DNA)

Điện di

cthidium bromide