Nghiên cứu sự Đa dạng về di truyền của quần thể cây cóc Đỏ lumnitzera litorea jack voigt Ở cần giờ và phú quốc bằng chỉ thị issr

Vì vậy, một nghiên cứu đi truyền của quần thể Cée 46 Lamnitreca linorea s® cung cắp những dữ liệu về sự đa dạng của loài góp phin đánh giá lịch sử nguồn gốc và phát triển các chiến lược

BỘ GIÁO DỤC VA ĐÀO TẠO

TRUONG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

BAO CAO TONG KET

DE TAI KHOA HQC VA CÔNG NGHỆ CAP TRUONG

NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG VE DI TRUYEN CUA QUAN THE CAY COC ĐỎ (LUMNITZERA LITTOREA (JACK) VOIGT) 6 CAN GIO VA PHU QUOC BANG

CHi THI ISSR

MA SO: CS.2018.19.21

Co quan chủ trì: KHOA SINH HỌC TRƯỜNG ĐHSP TPHCM

Chủ nhiệm dé tai: THS QUACH VAN TOAN EM

THÀNH PHÓ HỖ CHÍ MINH - 7/2020

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

‘TRUONG DAI HOC SU PHAM THÀNH PHÓ HỖ CHÍ MINH

BAO CAO TONG KET

DE TAI KHOA HQC VA CONG NGHE CAP TRUONG

NGHIEN CUU SY DA DANG VE DI TRUYEN CUA QUAN THE CAY COC DO (LUMNITZERA LITTOREA (JACK) VOIGT) 6 CAN GIO VA PHU QUOC BANG

CHi THI ISSR

MA SO: CS.2018.19.21

Xác nhận của cơ quan chủ trì (8ÿ, họ tần) Chủ nhiệm đề tài (ý, họ tên)

THANH PHO HO CHi MINH ~ 7/2020

TRUONG ĐH SƯ PHẠM TP.HCM Độc lập — Tự do = Hạnh phúc

THONG TIN KET QUA NGHIÊN CỨU

1 Thong tin chung

- Tên đề tải: °Nghiên cứu sự đa đạng vỀ di truyền của quần thể cây Cúc Đô

) ở Cần Giờ và Phú Quốc bằng chỉ thị ISSR”

(Lumnitzera litorea (Jack)

= Ma s6: CS.2018.19.20

- Chủ nhiệm: ThS Quách Văn Toàn Em

- Cơ quan chủ tủ: Trường Bai hoe Su phym TP.HCM

- Thời gian thực hiện: 12 thang (từ tháng 12/2018 đến tháng 12/2019)

2 Mục tiêu

Xác định mức độ phân hóa về di truyền của quần thể Cóc đỏ (/amnifzera

litorea (lack) Voigh) phn b6 tw nhién ở Cần Giờ và Phú Quốc Góp phần din

hướng cho công tác thu thập và bảo tồn nguồn gen Cóc đỏ và làm cơ sở cho việc

ảnh giá khả năng thoái hỏa giống của một số quần th Cúc đỏ trong tự nhiên

3 Tính mới và sáng tạo

Đính giá sự đa dạng của các mẫu lá óc đồ (Lumnizcra iuorea) ở Cần Giờ và Phú Quốc bằng kĩ thuật PCR- ISSK

-4 Kết quả nghiên cứu

- Tích chiết được DNA tổng số từ 20 mẫu lá Cóc đỏ thu tại Cần Giờ, Phú

Quốc và Côn Đảo Thực hiện tích chiết theo quy trình đã hiệu chỉnh cho thấy lá bánh tẻ thu vào mũa mưa và bảo quản lạnh cho tỉ lệ tỉnh sạch của DNA tổng số thủ nhận được cao, tiên 5000 ngýụl,

~ Thu nhận được 4 trong 15 mỗi ISSR sử dụng khảo sát qui trình PCR -

ISSR với 16 mẫu DNA tổng số của 20 lá Cóc đỏ 4 mỗi ISSR (HI, H8, H9,

H112) dat lệ khuyếch đại 100%

5,

sy da dang di tryna ota gun thé Ce d® (Lumnitzeraliorea (Tack) Voigt)

ở Nam b9 bing chi th ISSR

6 Higu quả, phương thức chuyển giao kết quả nghiên cứu và khả năng áp dạng:

Khu vực có bảo tồn cây Cóc đỏ; Trung tâm nghiên cứu Công nghệ sinh học

HM CITY UNIVERSITY OF EDUCATION Independence - Freedom — Happiness INFORMATION ON RESEARCH RESULTS General information:

ity of Lumnitzera littorea (Jack) Voigt i

Project ite: “Study on genetic dive

Gio and Phu Quoc by ISSR analysis”

Determination of genetic differentiation of Lumnitzera litorea of populations naturally

distributed in Can Gio and Phu Quoc Contributing to orienting the eolleetion and conservation

of L litorea genetic resources and serving as a basis for assessing the ability of seed degradation those populations in nature

3 Newness and innovativeness:

Determined diversity of Lumnitzera lttorea of leat samples in Can Gio and Phu Quoc by R= PCR technigh

5 Products:

(1 scientific paper:

Lumnitzera litorea Jack (Voigt) of populations in Southern Vier Nam mangrove by ISSR

Biotechnology Industry, Van Lang University ISBN

6 Effects, transfer altern ives of research results and appli

The area with Llitorea tree conservation or Biotechnology Research Center

Bảng 2.1 Dụng cụ sử dụng

Băng 2.2 Các thiết bị sử dụng trong quá trình thực hiện để tài

Bảng 23, Hóa chất sử dụng trong quá tình thực hiện để ả Bang 2.4 Thông tin va kí hiệu của 20 mẫu lá Cóc đỏ tại Cần Giờ (CG), Phú Quốc (PQ) và Côn Đảo (CĐ) dùng để PCR - ISSR

Bảng 2.5, Tình tự mỗi được sử dụng trong kĩ thuật ISSR -PCR Bang 26, Các thành phần cổ trong phản ứng ISSR ~ PCR Bảng 27 Quy tình nhiệt được sử dụng trong kĩ thuật ISSR = PCR Băng 38 Kết quả đo quang phổ DNA tổng số trong các mẫu nghiên cứu Bảng 39 Kếtquả do đường kính n cây của mỗi mẫu (em)

‘Trang Hin 1.1.Cée d8 (Lumnitzera litorea ack.) Voigt) 3 Hinh 2.2.ia diém thu miu " - 2 Hình 2.3.Hình thi lá Có đỏ bảnh tệ 26 Hình 34 Sản phẩm ISSR — PCR eta m6i HI 3 Hình 35 Sản phẩm ISSR - PCR của mỗi Hồ 35 Hình 36 Sản phẩm ISSR - PCR của mỗi H9 36 Hình 37 Sin phim ISSR - PCR của mỗi HI2 36

Hình 38 Sơ đồ cây quan hệ di tuyển của 16 mẫu Cóc đỏ Hong nghiên

1 LÍ DO CHỌN ĐÈ TÀI

“Trong các loài thực vật phân bố rừng ngập mặn, Cóc đỏ ([umnirreza literea (Iack.)Voigt) là một trong những loài cây chính thức của rừng ngập mặn Loài Cée 46 (Lummi

hiện tượng thái sinh phân bổ ở Châu A và Châu Úc thuộc vùng nhiệt đối, cụ thể ra litorea) là loài cây ngập mặn (CNM) không có

a litorea

ột Nam, Trung Quốc, Srlanca, Myanma, 6 Vigt Nam, Luni

là loài có tên trong Sách đỏ với cấp độ V (Bộ Khoa học Công nghệ và Môi

trường, 2007) Cóc đỏ chính thức được phát hiện ở Cần Giờ - TP.HCM, Phú Quốc, Rạch Giá - Kiên Giang, Côn Đảo — Bà Rịa - Vũng Tâu Tuy nhiên, hiện

nay vì sự phát triển kinh tế xã hội, con người đã khai thác thực vật rừng ngập

tổn trong quan thé thye vit (Moritz, 1995) Olafeld va cộng sự (1998) đã nghiên

.cứu và nhận thấy có hơn 8.000 loài cây bị đe dọa tuyệt chúng trên thể giới Việc

nghiên cứu vỀ các dữ diệu di truyền được đánh giá cao rằng những phân tích di

truyền có thể cung cấp những hiểu biết có giá trị về các quá trình đang diễn ra

của quần thể nguy cơ tuyệt ching (Clarke and Youne, 2000) Vì vậy, một nghiên

cứu đi truyền của quần thể Cée 46 (Lamnitreca linorea) s® cung cắp những dữ liệu về sự đa dạng của loài góp phin đánh giá lịch sử nguồn gốc và phát triển các

chiến lược bảo tổ loài

Hiện nay, kỹ thuật sinh học phân tử đang được áp dụng rộng rãi, có hiệu

quả trong nghiên cứu da dang di truyền quần thể Các chi thi AFLP, ISSR,

ISSR hay duge Iya chon vi tương đối đơn giản, ễ thục hiện mà lại hiệu quả ĐỂ

góp phần vào việc định hướng cho công tác thu thập và bảo tổn nguồn gen Coe

dang về di truyền của quần thé cay Cie dé (Lumnitzera litorea (Jack) Voigh)

`ở Phú Quốc, Cần Giờ bằng chỉ thị ISSR”

2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

“Xác định mức độ phân hóa về di truyén eiia Cée 46 (Lumnitzera littorea

(Jack) Voigt) phân bố tự nhiên ở Phú Quốc, Cần Giờ Qua đó, phần định hướng cho công tác thu thập và bảo tồn nguồn gen Cóc đỏ tại Việt Nam

3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

~ Phân tích đặc điểm hình thải lá của các cây tiền hành nghiên cứu về đa dạng đi truyền trong quản thể cây Cóc đỏ ở Cần Giờ và Phú Quốc

= PCR - ISSR cho mẫu lá Cóc đỏ ở Cần Giờ, Côn Đảo và Phú Quốc góp phần cung cắp dữ liệu di truyền của loài Cóc đô ở Việt Nam

~ Xây dựng và đánh giá cây phân loại từ chỉ thị ISSR của 20

1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VẺ CÂY CÓC ĐỎ

1.1.1 Vị trí trong hệ thống phân loại

Bộ: Sim ~ Myriales

Ho: Bang —Combretaceae

Chi: Cée ~ Lumnitzera

Loài: Lumnitzera litorea (ack.) Voigt 1845 (Bộ Khoa học Công nghệ và Mỗi trường, 2007)

Hinh 1.1 Coe 46 (Lumnitzera littorea Jack.) Voigt.)

1.12, Phân bố

Loài Cóc 46 (Lumnitzera littorea) 1a loai CNM không có hiện tượng thai

sinh phân bổ ở Châu A và Châu Úc thuộc vùng nhiệt đối, cụ thể ở Việt Nam, Phillippines, New Guinea, Flt

6 Vigt Nam, Limnitzera littorea (Jack.) Voigt la loai có tên trong Sách đỏ

với cấp báo động V (Bộ Khoa học Công nghệ và Môi trường, 2007) Hiện nay,

Cöe đỏ chính thức được phát hiện ở Cần Giờ - TP—ICM Phú Quốc, Rạch Giá -

Kiên Giang, Côn Đảo nhưng số lượng không nhiều

Cây gỖ, cao 10 - 20 m, đường kính 40 - 50 cm, vỏ màu nâu thẫm có vết

đỏ, phẫn giác màu vàng, lõi màu nâu thẳm, Tán lá

nứt, mặt trong võ màu n

phát tiển, phân cành thấp, thân cành có nhiều mắt do những vết seo của lá rụng

để lại, nhánh non đỏ nhạt

Lá đơn mọc cách, phiến lá dày hình trúng ngược, dày, mong nước, dễ gãy

Dầu tròn, khía tai bèo, đôi khi nhọn; gốc lá hình nêm, đài 6 em, rộng 2 cm, ít gân: cuống dài 0,5 — 1 em Mặt trên lá bóng, dai 2 — 8 em, rộng 1 ~ 2,5 cm, lá tích nhiều muối

RỄ thường không lộ trên mặt đất nhưng trong môi trường âm tới thì xuất hiện những rễ đầu gối nhô trên mặt đt

Cụm hoa bình chùm ở đỉnh cành, dai 1,5 - 3 em Hoa có cuống ng

15 - 2 mmm Đâi hình ông tạo thành đĩn chữa một Trăng 5 thùy, hình bầu dục

thuôn, đài 5 - 6 mm, màu đỏ Nhị 5 - 10, chỉ nhị dài gdp đôi cánh hoa, Nhụy hơi

nhồ ra khí hoa nổ, vời nhụy dài và đầi bên Bằu 1 ô, 5 lá noãn hợp, noãn nhỏ 3 -

những loài ăn mật

Quả hạch, 1 hat, hình trứng dài 3 — 4 em, với nhiều sợi cương mô của vỏ

quả nằm rải rác, vỏ quả trong cứng Quả non màu nâu đỏ, quả chín rụng, mùa ra

hon: tháng 6 ~ 8, mùa quả chí: tháng 8 ~ 10 (Bộ Khoa học Công nghệ và Môi

trường, 2007) (Lê Đức Tuan va es, 2002) (Pham Văn Quy và Viên Ngọc Nam,

2005) (Chapman V.1,1975)

1.1.4 Sinh thái

Cñy mọc & RNM ven sông, ven biển, nơi chỉ ngập tiểu cao hoặc ít ngập

nước mặn, đấ ớt hơi chật thường mọc ẫn với loài Giá (Exeoecariu agalocla),

DA (Ceriops spp) 66 Khi moe thành quẫn xã ưu thể hoặc gẵn như thuẫ loại (iữa Mỹ Ngọc 2011)

LL& Giá trị

Hoa do, đẹp, được dùng làm cảnh, trang trí soài ra, hoa có chứa mật nên

bắp dẫn các loài ong, vì vậy người a có (hể nuôi ong trong khu vực có nhiễu Cóc

đỏ Gỗ tốt, có thé nim trong bùn và nước mặn lâu ngày mà không bị mục nên

để lấy than do chứa nhiều tannin Lá được dùng để chữa bệnh tiêu chảy, loét miệng, viêm ruột (Bộ Khoa học Công nghệ và Môi trường, 2007) (Lê Đức Tuần

và cs, 2002) (Phạm Văn Quy và Viên Ngọc Nam, 2005) (Chapman V.J.1975) 1.2 GIỚI THIỆU VẺ QUI TRÌNH TÁCH CHIẾT DNA TÓNG SÓ Mới nghiên cứu va ứng dụng sinh học phân tử đều bắt đầu bằng việc thu nhận một lượng lớn Acid Nueleic và đủ tỉnh sạch để tiến hành các thí nghiệm kế tiếp Mỗi quan tâm hàng đầu của các kĩ thuật tách chiết là thu nhận được các phân tử này ở trạng thái nguyên vẹn tối đa không bị phân hủy bởi các tác nhân cơ thấp để ức chế hoạt động của các enzyme ndi bào (desoxyribonuclease ~ Dnase

và ribonuclease ~ Rnase) (Hỗ Huỳnh Thùy Dương, 2008) DNA la phân tử có kích thước lớn, do đồ trong thao tác cần trắnh mọi tác nhân cơ học hay hóa học quá mạnh có thể làm đứt gãy phân tử DNA Phương pháp tách chiết DNA cơ bản gồm 3 bước:

“Bước 1: Phé ming tế bào và màng nhân Nghiền t bảo, mô trong hỗn hợp chit tấy (như SDS, sarcosyl) và proteinase (proteinase K) Hỗn hợp này sẽ phá hủy các protein liên kết với DNA

“Bước 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu chủ yếu là protein Mẫu được lắc trong dung dich P:C:1 để biển tinh protein đồng thời không hòa tan Acid Nucleic Protein khi bị biến tinh không côn hia tan trong pha nước

có chứa Acid Nucleie và sau khi li tâm sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nước

vi pha P:C:L Pha nước có chữa acid nucleic được thụ nhận lại Bude 3: Twa Acid Nucleic Mục địch của việc tủa là nhằm thu nhận Acid Nucleic duéi dạng cô đặc, một mặt nhằm bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy là các enzyme, mặt khác để có thể hòa tan chúng lại trong dung dịch theo nông đội mong muốn Có thể tủa Acid Nueleie trong ethanol hay isopropanol Sau khi li

tm, cfin ta duge rita li trong ethanol 70% để lại bỏ các muổi (Hỗ Huỳnh Thủy

Duong, 2008) (Chase MW va C.R, 2007) (Keb — Llanes, 2002)

ih tach chiét DNA có một si

DNA bi ditt gấy nhiều, có lẫn RNA trong DNA hay lẫn tạp protein, sur dung không đủ để loại bổ các tạp chất trên

1.3 GIỚI THIEU VE KI THUAT PCR

Vige triển khai các ứng dụng của sinh học phân tử thưởng gặp trở ngại về

số lượng vật chất đĩ truyền cần có Các phương pháp tạo dòng in vivo tuy giải quyết được vẫn dé về số lượng nhưng đòi hỏi thao tác phúc tạp và thời gian dài

Sự ra đời của nhiều phương pháp khuếch đại in viro có chọn lọc, trong số đó nỗi dong cổ điễn, mở ra những rn vọng ứng dụng to lớn (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2008)

1.1.1 Khái niệm kĩ thuật PCR

Vào năm 1985, K, Mullis đã phát mình ra phương pháp đơn giản khuếch đại nhanh nhiều bản sao (Amplification) của các đoạn DNA mà không qua tạo đông Kĩ thuật này được gọi là Polymerase Chain Reation, viết tắt là PCR, được

hiểu là phản ứng polymerase dây chuyển Kĩ thuật này được ứng dụng nhanh và

có ý ngÌ ích mạng đối với sự phát triển của sinh học phân tử và kĩ thuật di

truyền (Phạm Thành Hỗ, 2008)

1.3.2 Nguyên tắc thực hiện

PCR là quá trình khuch dại của một đoạn trình tự DNA đặc hiệu in vio

dưới sự xúc tắc của enzyme DNA polymera Sự khuếch đại này được thực hiện nhờ các chu kì nhiệt lặp lại (35 ~ 40 chu ki) Nhờ vậy | mach kép DNA sau phản nhân (Hỗ Huỳnh Thùy Dương, 2008) (Phạm Thành Hổ, 2008) (White T.J etal, 1990)

Mỗi chủ kỉ nhiệt bao gồm các bước:

Bước 1: Giai dogn bign tin (Denaturation), Trong mt dung dich phin ứng sồm cách thành phần cằn thiết cho sự sao chép (ni, taq - polymease, dung dich

đệm), phân tử DNA được bị {DNA kép sẽ tách thành 2 mạch DNA đơn) ở

nhiệt độ cao hơn T„, của phân tử, thường là 94 - 95” trong 30 ~ 60s

Bước 2: Giai đoạn lai (Hybridization) Nhiệt độ được hạ thắp (thấp hơn T„,

của các mỗi) cho phép mỗi bắt cặp với khuôn, nhiệt độ này trong khoảng 40 —

TC, tùy thuộc vào Tụ, của mỗi sử dụng và kéo dai từ 30 — 60s

Bước 3: Giai đoạn tổng hợp hay kéo di (Elongation), Nhigt d6 được tăng lên đến 72'C giúp cho DNA polymerase sit dung vốn là polymease chịu nhiệt khuếch dai, thường kéo dii trong khoảng 30s đến vải phút (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2008)

Ở mỗi đối tượng khác nhau như động vật, thực vật, vỉ khuẩn, to, ẽ có

các thành phần dung dịch đệm, enzyme khác nhau và chu kì nhiệt lặp lại khác

nhau Trong quá trình PCR, chủ kì nhiệt lặp lại không vượt quá 40 chủ kỉ v: về sau, quá tỉnh sao chép sẽ có những sai sót do hiệu quà khuếch đại giảm dần

Nguyên nhân là do sự phân hủy và cạn kiệt các thành phân của phản ứng, sự xuất

hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng và các bản sao vừa được tổng hợp không kết hợp với mỗi mã bắt cặp với nhau

1-33 Các cầu phần của phan dmg PCR

Các phản ứng PCR được thực hiện trong ống eppendort nhỏ, trong đó có các thình phần chủ yếu như sau

~ ĐN4 khuôn mẫu (Template): DNA mẫu được ly trích từ tế bảo và mô, có

độ tỉnh sạch cao thì phản ứng khuếch đại tối ưu Tuy nhiên, nhiều kĩ thuật chuẩn

đoán bằng PCR vin dạt kết quả tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ địch chiết tế

bào hay những mẫu DNA không bảo quản tốt như các vết máu đẻ lâu ngày, tóc,

hóa thạch,

= Cie polymerase chịu nhiệt (Thermmostable): Enzyme sit dung đầu tiên

trong phản ứng PCR là đoạn klenow của DNA polymerase I, nhưng enzyme

không chịu nhiệt nên thao tác phúc tạp và mang lại hiệu quả thấp Khi tag

-polymerase duge phit hig thi ki thuật PCR bước sang bước ngoặc mới Enzyme

phá hủy bởi nhiệt độ biển tính

— Các mồi (Oligonucleotide primer, Nhân tổ khuếch dại, Ampliier,

Primer): Đây là thành phần quan trọng nhất đẻ đạt được sự khuếch đại đặc trưng

và có hiệu quả cao Trình tr các mỗi cần có kích thước hợp lý (IE - 25

nucleotide) Khi chọn mỗi cần quan tâm đến nhiệt độ Tạ, thành phần nuleotide

các mỗi cân bằng trậnh các cặp GC lặp đi lặp lạ nhiều lẫn

“Các thành phần khác như dung dich dém (Buffer) tao môi trường thích hợp cho Taq - polymerase thye hign, các Nucleotide tự do (ANTP) va ion Mg™ (HO Hujnh Thay Dương, 2008) (Phạm Thành Hồ, 2008)

1.3.4 Ứng dụng của kĩ thuật PCR

"Tử khi ra đời cho đến nay, kĩ thuật PCR đã giúp mở ra con đường mới cho

việc nghiên cứu cấu trúc và chức năng của gene, kĩ thuật này ngày cảng được

hoàn thiện và được ứng dụng rộng rải trong các lình vực khác nhau cả trong cho nhiều phương pháp như giải trình tự, tạo đồng, hay sản xuất mẫu đồ trong lai phân tử,

Hiện nay, những thành tựu PCR góp phần làm phong phú cho sinh học

1.4 ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG ACID NUCLEIC

Sau khi tích chiết DNA từ mẫu lá, người ta tiến hành phân tích định tính, định lượng chúng bằng các phương pháp như đo mật độ quang và điện di nhằm

nhận biết độ tỉnh sạch và khối lượng DNA phủ hợp cho quá trình PCR được diễn

ra thiận lợi

"Phương pháp định tình bằng quang phổ kỂ

Phương pháp này cho phép ước lượng tương đối nỗng độ Acid Nuceic

trong mẫu, thường đáp ứng đủ yêu cầu nghiên cứu

1OD;,,„, = 50 pg/ml (dung dich DNA sợi đôi)

101 0 u/ml (dang dịch DNA soi don hay RNA)

Để kiểm tra độ tỉnh sạch của dung dịch, ta đo thêm giá tị OD ở 280nm (ODs,o,).280nm là bước sóng mà protein hấp thụ cao nhất

Một dung dich Acid Nucleic duge xem la tinh sạch, không lẫn tạp nhiễm khi tỷ số ODz„„„„/ OD›sa„„ nằm trong khoảng 1,8 — 2.0

"Phương pháp điện di

Điện di là hiện trợng địch chuyển của các vật thể mang điện tích dưới tác động của điện trưởng,

Điện di hay điện di rên gel (Eleerophoresis hay Gel elecrophoss) áp dụng

trong sinh học phân tử, lả ki thuật phân tích DNA, RNA hay protein dựa trên các

đặc điểm vật ý của chúng, vỉ dụ: kích thước, hình đạng, hay điểm đảng điện tích

(Isoelectric point), Kĩ thuật nay sử dụng một dung dịch dgm (Buffer) đẻ dẫn điện,

tạo điện trường đều, bản gel (gel Agarose hay gel Polyerylamid) c6 vai trỏ phân tách các phân tử, các chất nhuộm (Ethidium bromide, Gel red) bit miu với ta

UV hay ánh sáng xanh (Blue lighQ để nhận ii

điện di

và phát hiện các phân tử sau khi

Nguyên lý điện d Dựa vào đặc tỉnh cấu trúc của các Acid Nueleie Đó là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động của

một điện trường sẽ di chuyển về cực dương của điện trường Khi tra mau clin

điện di và thuốc nhuộm vào các giống trong gel, đưới tác động của đệ trường,

các phân tử có kích thước khác nhau sẽ di chuyển trong gel với vận tốc khác nhau, các phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm trong bản gel nên nà

trên, các phân từ có kích thước nhỏ sẽ đi chuyỂn nhanh rong bản gel và nằm,

bay ánh sáng xanh (Blue light) sẽ nhận biết được các phân tử DNA có khối

“Thùy Dương, 2008)

Vige chọn loại gel cũng như nồng độ các chất tạo thành gel tủy thuộc vào kích thước trung bình của các đoạn Acid Nuleic cần phân tách (Hỗ Huỳnh Thủy Dương, 2008)

1.5 CÁC KĨ THUẬT CHỈ THỊ DNA TRONG NGHIÊN CỨU VÀ CHỌN LỌC THYC VAT

“Từ những năm 80 của thể kỉ XX, các kĩ thuật chỉ thị DNA được bắt đầu và

phát triển nhanh chóng trở thành lĩnh vực quan trọng trong sinh học phân tử Ở

Việt Nam, một số kĩ thuật chỉ thị DNA được bắt đầu sử dụng từ cuỗi những năm,

90 của thể kỉ XX Các kĩ thuật chi thị DNA được xây dựng để phát triển các chỉ

thị DNA cho nghiên cầu đi truyền, phát sinh loài, phân loại đánh dấu và xác

inh gen Tùy vào vấn để nghiên cứu mà người nghiên cứu có thé chon trong các

kĩ thuật chỉ thị DNA phủ hợp (Nguyễn Đức Thanh, 2014)

CChi thi di truyền là các chỉ thị sự khác biệt giữa các cơ thể hoặc các loài

khác nhau Chỉ thị di truyền bao gồm chỉ thị hình thải (những tính trạng như mảu

hoa, đặc điểm sinh trưởng ) và chỉ thị phân từ (DNA) Tắt cả chỉ tị d truyền

đều chiếm một vị trí đặc biệt trong nhiễm sắc thể gọi là locus, thường liên kết với gon va di truyền theo qui luật đ tru

Chỉ thị phân tử thường được hiểu là chỉ thị DNA, chỉ thị DNA là những chỉ

thị dựa trên bản chất đa DNA, được sử dụng giúp xác định mỗi quan

các cá thể trong cũng một loài hoặc giữa các loài, dùng để phát hiện loài mới và

xác định mỗi tiến hóa giữa các loài (Nguyễn Cảm Dương, 2010)

Các chỉ thi DNA dug sir dung rng rai nhất vỉ số lượng chỉ thị không hạn

chế, đặc biệt là ứng dụng trong nghiên cứu quan hệ di truyền, phát sinh chủng

loại và phân loại phân tử, lập bản đồ gen đi truyền và trong chọn giống như đảnh

Đức Thành, 2014)

“Các kĩ thuật chỉ thị DNA được chỉa thành các nhóm chính là: CCác kĩ thuật không sử dụng phản ứng PCR như: Đa hình độ dài cắt hạn chế (RFLP — Restriction Flagment Length Polymorphism), lấy dấu cất hạn chế ( REE

—Restieton Endonuclease Fingerprining)

“Các kĩ thuật sử dụng phản ứng PCR như: DNA da hinh được nhân bản ngẫu nhiên (RAPD - Randomly Ampllified Polymorphic DNA), độ di đa hình bản chon loc (AFLP — Amplified Fragment Length Polymorphism), chudi lip lai don gin (ISSR — Inter-Simple Sequenee Repeats), các chuỗi lặp lại đơn giản (SSR ~ Transcribed Spacer) v

Ngoài ra, cần phải kể đến một số công nghệ hỗ trợ hết sức hiệu quả cho phát triển chỉ thị và nhận biết đa hình chỉ thị DNA như công nghệ sắp xếp sự đa dang (Disversity array Technology) vả công nghệ giải trình tự thể hệ thứ hai (Next — Generaion sequencing) (Nguyễn Đức Thành, 2014) 1.6 GIGI THIEU KI THUAT ISSR

1.6.1 Gidi thigu ky thudt ISSR

ISSR ta ky thuật chuỗi giữa lặp lại đơn giản ~ Inter simple sequence

xepeats, là những chỉ thị được nhân bản bằng PCR với một mỗi bổ trợ với

Vệ tỉnh (microsatellite) đích Mỗi băng tương ứng với chuỗi DNA được giới hạn bởi các tiểu vệ sinh đảo ngược Kết quả dẫn đến đa locus, có sự đa hình cao va tạo ra các chỉ thị tội

1SSR ~ PCR là kỹ thuật đánh giá kiểu gen nhanh, không đất tiên; sự đa

hình đựa trên sự thay đổi trong các vùng nằm giữa cúc iu vệ tỉnh Kỹ thuật

và to mà chi th ti (Lin X C, 2010)

Kỹ thuật ISSR là kỹ thuật nhân bản đoạn DNA nằm giữa hai vùng lặp hi iống hột nhau và ngược chiều nhau Kỹ thuật ISSR sử dụng các vệ tỉnh như

chủ yếu các chuỗi lặp lại đơn giản với độ dài khác nhau Các vệ tỉnh này có thé là 2, 3, 4 hoặc 5 nucleotide Kỹ thuật này sử dụng mỗi dài (15 đến 30 nueleotide) vì nhiệt độ cao dẫn đến độ ổn định cao của phản ứng Sản phim polyacrylamide

Kỹ thuật này só tu điểm là có thể phân biệt được các kiéu gen gin và không cần thông tin vỀ ình tự gen của cây nghiên cứu Ngoài ra, ISSR Ih ky

thuật nhanh, dễ tiển hành

1.6.2 Ứng dụng của kỹ thuật ISSR:

Kỹ thuật ISSR được sử dụng rất rộng rãi trong nghiên cứu đa dạng di

truyền nghiên cứu đặc y

gen, xác định cây trồng, phân tích nguồn gốc, xác định sự thay đổi genome và lễm di truyền trong quần thể, lấy dầu di truyền đánh dấu đánh giá con lại

1.7 GIỚI THIỆU VE DA DANG DI TRUYEN

Khái niệm đa dang di truyén duge nhiều tài liệu để cập, theo công ước da dạng sinh học năm 1992 đa dạng di truyền được nêu như sau: Đa dạng đi truyền các cá thể bên rong loài hoặc giữa cóc loài, những biến dị di truyền bên trong hoặc giữa các quan thé

"Ngoài ra, da dang di truyền còn được các nhà khoa học đưa ra khái niệm như sau: Đa dang di truyén (Genetic diversity) la nhigu gen trong một loài, mỗi loài có các cá thể là tổ hợp gene đặc thủ của chúng, điều này có nghĩa là loài có các quần thể khác nhau, mỗi quần thể có tổ hợp dĩ truyền khác nhau Do vậy để bảo tôn da dạng di truyền phải bảo tốn các quản thể khác nhau của loài (Mohd Said Saad và V Ramanatha Rao, 2001) (Wanda W Colins và Cahin O Qualset, 1999)

'Đa dạng di truyền được hình thành trong quá trình phát triển của quản thẻ,

nó là kết quả của sự tương tác giữa kiểu gene và môi trường Đa dạng đi truyền

kiểu đa dạng di truyền trong một loài va giữa các loài trong phạm vỉ tự nhiên cũm

nó Sự thay đội đa dạng di tuyển của một loài trong tự nhiên đã ạo ra sự thúc

Mô hình toán thống kê dựa trên khoảng cách Ở — Ki (Euelidean Distance) của Dissimilarity) (1978 và 1983) (Vũ Văn Liết, 2009)

1.8 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÈ CÂY CÓC ĐỎ VÀ ĐA DẠNG DI TRUYEN SU DUNG ISSR - PCR, RAPD-PCR 1.8.1 Tình hình thể giới

Hiện nay, các chỉ thị DNA được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu

phân loại, phân tích đa dạng sinh học, xác định khoảng cách di truyền, đặc trưng

cho cá thể và quần thể thực vật nhằm mục đích bảo tổn và chọn giống Trong đó, việc sử dụng RAPD - PCR, ISSR - PCR đặc biệt có hiệu quả trong các nghiên ngập mặn, cụ thể

Năm 2001, Kathiresan và cộng sự nghiên cứu đặc điểm sinh học và hệ

sinh thấi rừng ngập mặn, đã kết luận loài Cóc đỏ (Pumnizera limorea (Jack) Voi) phân bổ nhiều ở Nam Á, Tay A va dic bgt la Malaysia (Kathiresan vi es 2001)

Femández và cộng sự (2002) Sử dụng chỉ tị ISSR vai RAPD phat hign da dang DNA, nhin dang kiéu gene và da dạng dĩ tuyền giữa các giống lúa mach mỗi quan hệ giữa 16 giống lúa mạch từ các địa điểm khác nhau và đều biết đồ

ra có thể nhận biết đủ có các đoạn DNA khác nhau “Trên thể giới Cóc đỏ là loài phân bổ nhiều tại vùng rừng ngập mặn ven biển

vùng nhiệt đới ở Nam A, Tay A, Bac Ue, dio Hai Nam, Malaysia vi Srilanka

(theo Guohua Su et al, 2007) Theo Tan Kim Hool et al (2007) 43 nghiên cứu về:

tính da dang của rừng ngập mặn Đông ~ Nam và Đông Á đã kết uận Cóc đỏ là

loài cây chính thức của rừng ngập mặn (Tan Kim Hool va es, 2007)

của 5 Guohua Su và cộng sự (2006) đã nghiên cứu sự đa dạng di truy quần thể edy Cée 46 (Lumnitzera lidorea) từ phía đông Thái Bình Dương của

quần dio Indo (Nam Trung Quốc, bán đảo Malay, Sri Lanka, Nam Australia),

5,57 %, He = 0,240, Ne

mức độ biến động di troyễn tương đổi cao (P

-303) loài cây Cóc đỏ (Guohua Su và cv, 2006)

Guohua Su et al (2007) đã nghiên cứu về sự bảo tồn nguồn gene của loài

Ce d& (Lumnitzeralinorea (Jack.) Voigt) ở phía tây vùng biển Indonexia bing

‘inh giá chỉ thị phân tử ISSR Nghiên cứu sử dụng 12 mỗi ISSR để phân tích sự 4a dang di truyén eta 82 mẫu Cóc đỏ được th từ quần thể khảo sắt và có 221

băng được tạo ra Kích cỡ của các mảnh ISSR dao động từ 200 - 2000 bp Ở

sắp độ loài, sự dị hợp trùng bình dự kiến (He) à 0,24 với 75,6% loeus đã hình (P) Tuy nhiên, biến động di truyền ở quẫn thẻ thấp hơn nhiều với P 37,1% và

He = 0,188 Sự khác biệt v8 gen Gxt = 0.515 và ông độ gen Nm = 0,47 cho thấy sự khác biệt có

2007) nghĩa di truyền giữa các quần thể (Guohua Su và es,

Theo HaihengLi và GuizhuChen (2009), khí nghiên cứu về Biến thể di

ngập mặn có nguy cơ tuyệt chủng như Sonneratia

triyễn trong các loi cây

paraciseolais(Sonneraiascas) ở Trung Quốc được phát hiện bằng ISSR, Kết

quả cho thấy, ở cắp độ loài, sự đa dạng đi truyền tương đối cao (P = 81,37%, He

03501) Sự da dạng di truyền cia S paracaseolaris được bảo tồn ở các quần thể được giới thiệu ở một mức độ nào đồ, ty nhiền, do các quần

thể tr nhiên nhỏ và các mối đe đọa mà chúng gặp phải, nên trồng nhiễu cây hơn

“để mở rộng và khôi phục quẩn thể

“Theo Shao-Bo Chen et al (2010), Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của 7

Wg Kt that ISSR Có S0 mỗi được

sang loc, trong đó có 9 mỗi đã được lựa chọn để xác định quan hệ di truyền

quần thé Kandelia obovate ở Trang Qué

ISSR duge ign hinh tn 140 cd thé tr 7 quan th, 88 locus da hinh dure phat

hiện trén ting s6 106 locus

Shu-GuangJian, TianTang, YangZhong, Su-HuaShi (2010), nghién cứu về

Di tuyển bảo tổn của loi cây Cui biển (Herliera litoralis), một loài cây ngập mặn bị đe đọa ở Trung Quốc, dựa trên các dầu hiệu AFLP va ISSR, KẾt quả cho thấy mức độ biến đổi gen từ trung bình đến cao ở loài này (P = 63,69%, HT" 0,20 d6i voi AFLP; P 16,07%, HT = 0.22 đối với ISSR) và mức độ khác biệt di

truyền tương đối cao giữa các quần thể (GST = 0.24 cho AFLP và 027 cho

ISSR) Đặc điểm lịch sử sự sống, phát tán hạt dài và môi trường có thẻ đóng vai trồ quan trọng trong việc hình thành sự đa dang đi truyền và cấu trúc di truyền

tự nhiên của H lidoralis thấp, tỷ lệ nảy mầm và tỷ lệ chuyển đổi từ con non sang trưởng thành H litoralis đang bị đe doa nghiêm trọng và đang cần bảo tồn khẩn cấp ở Trung Quốc

“Theo nghiên cứu của Janine Caynap va Katsuhiko Kondo (201 1), sử dựng phương pháp ISSR trong nghiên cứu da dang di truyén giữa quần thề rừng tring và hai quần thể tự nhiên của cây Trang Kandelia obovate, Liu & Yong kết

ba quấn thể, Kết quả cho thấy sự đi tryŠ tương đối cao ở độ loài (

12788) giáp cho việc phân ích ISSR tử thành một

công cụ để đánh giá tính đa dang di truyền của loải

Abdul Kader et al (2012), Đính giá sự đu dang di tmyễn của lơ

Awieenniaceae ở Ấn Độ bằng chỉ thị RAPD VÀ ISSR, 10 RAPD và 10 ISSR đã

được sử dụng đễ phân ích sự đa dạng d truyền trên ba loài khác nhau của chỉ

Avicennia, Nghign cứu cho thấy các dẫu ISSR hiệu quả hơn các dâu RAPD để

phát hiện đa hình, hàm lượng dãi đa hình trên mỗi mỗi và tổng số không phát

hiện loeus trên mỗi mỗi vi chúng là 75,53%, 11,9% và 15,6%, đối với ISSR và

69/040, 9,6% và 137% tương ứng Tuy nhiên, không quan sắt thấy các slen, Shannon (1) cao hơn đổi với RAPD ((ẫn lượt là 1.6087, 1.6087, 0.3043 và

0.4219) so với ISSR (lần lượt là 1.5357, 1.4357, 0.2345 và 0.3357) Yahya AF, Hyun JO, Lee JH, Kim YY, Lee KM, Hong KN, Kim SC n thể Đước đổi

(3014), nghiền cứu về Biết thé di tuyễn và cu tríc đi truyễnqm

phoraceae ở quin div Greater

phora apiculate) thuộc họ Đước Ki

sn cứu đã tìm thấy 38

Sunda, Indonesia bằng cách sử đụng ch thi phin ti, Ne alen trén nam locus trong 15 quan thé Su khác biệt di truyền quần thể (E (ST) =

0,381) tương tự như các loài cây ngập mặn khác Sự đa dạng di truyền của quản

thé apiculata dọc the bờ bin bên trong quần đảo (ví du, Buleleng Donggala Mamuju và Takslar) cao hơn so với dân số dọc theo bờ biển bên ngoài quần đảo,

khoảng cách và hướng dong biển cũng như khả năng kết nỗi của chúng có thể

kết nỗi hơn bởi ảnh hưởng đến dòng gen và trao đi Càng bị cô lập vị

đồng hãi lưu, đồng gen nhỏ hơn và trao đổi gen được quan sắt giữa các quản thể

Sự trao đổi gen cao hơn, ngược lạ, xây ra khi vị tí đân cư gẵn với điểm gặp gỡ

đồng biển đường như đã ảnh hưởng đến cụm quần thể di truyền rơi vào ba nhóm

chinh (Sunda Ké Mangroves) và một quản thể bị cô lập (Ring ngập mặn New Guinea)

Nirjhar Dasgupta et al (2018), Biển đổi độ muyễn liên quan đến khả năng

thích ứng của ba loài iy ngập mặn từ Sundarbans Ấn Độ được đảnh giá bằng

các marker RAPD va ISSR, da hình đi truyền của ba loài cây ngập mặn

Xylocarpus granatim, Excoecaria agallocha, Phoenix palodusa age din gis

di truyền ít nhất (14,56% trong phn tích RAPD vi 12,92% trong ISSR) Sự đa

di truyễn tương đổi cao hơn đã được ghí nhận đổi với loài E agallocha và

P paludosa phit tién dBi dio (24.66% và 264% trong RAPD; 24.87% và

toán từ dữ liệu RAPD và ISSR, cũng phù hợp với 00637 và 0.0583 cho X

khmatum, tương ứng, thắp hơn nhiễu so với 00794 và 00818 đối với E

agallocha và 0,0799 va 0,0688 đổi với P paludosa Mức độ đa hình đối lập này

số th là đo E agallocha phát tiển và P paludosa i tinh trang bap bệnh của X

granatwm trong suốt Sundarbans của Ấn Độ

Các chỉ thị phn tr da va dang gp phẫn mở ra cuộc cách mạng mới cho

ngành sinh học phân tử phát triển Nhờ đó các nghiên cứu về phân tử được ứng dụng để xác định được độ đa đạng của loài thực vật nói chung và thực vật rừng

ngập mặn nói riêng, đã góp phần giải thích được sự đa dạng về các loài thực vật

trong thế giới sống Tuy nhiên, thực vật rừng ngâp mặn chưa được áp dụng

nhiều về các chỉ thị phân từ này để đánh giá sự da dạng di truyền, đặc biệt là Cóc đỏ

1.8.2 Tình hình tại Việt Nam

Ở Việt Nam có một số nghiên cứu về loài cây Cóc đỏ và có các nghiên cứu

sử dụng các chỉ thị phân tử, một số công tình tiê biểu như:

Lâm Vỹ Nguyên (2006), Nghiên cứu sự đa dạng di truyén của cây Đước

đôi (Rhizaphora apiculata Blume.) ở khu Dự trữ sinh quyễn rằng ngập mặn Cần

Kết quả chạy RAPD với mỗi 11 cho lượng băngimẫu không cao nhưng lạ thể hiện rõ sự

Giờ bằng kĩ thuật RAPD, kết quả cho tÌ

trung bình 3,5 băng/mẫu

.đa hình giữa các mẫu Chúng tôi thu đuợc 8 băng đa hình chiếm tỷ lệ 88,9% và 1

ấm t lệ 11,1% Kết quả phân tích tên phần mềm NTSYS

băng đồng hình chỉ

(Numercial Taxonomy System) phiên bản 2.1, 7 mẫu đước được khảo sát được

chía làm 2 nhóm chính với khoảng cách phân nhóm là 0,41 Nhóm Ì gồm 6 mẫu: TRRAOI, 78RA02, 79RA0I, Ä0RA01, 80RA02, 9IRA0I, Đây là những mẫu

giống lại Cả Mau, Cúc cây này có hệ

đước được lấy từ những cây trồng tử nại

số đồng dạng di truyền cao từ 0,66 = 0.9, Cúc cây trồng cùng năm cổ hệ

ên là 0,89 Nhóm 2 chỉ có 1 mẫu 96RA01 đơjợc trồng từ nguồn giống

dang di tn

tai Cin gi,

Quách Văn Toàn Em (2008) khí nghiên cứu về sinh trưởng của cây Cóc

4 (Lumnitzeralivorea (Jack.) VoieL) với chế độ muỗi khác nhau ở giai đoạn

vườn ươm kết luận khả năng sinh trưởng của loài có giá trị cao nhất ở môi

trường nước ngọt và lợ ( 0% đến 0% độ mặn nhân tạo), biển độ sinh trưởng

tốt và sinh trưởng chậm khi sống trong môi trường có độ mặn cao (75% đến

100% độ mặn nhân tạo) Quách Văn Toàn Em, Viên Ngọc Nam (2010) khi

nghiên cứu một số nhân tổ sinh thái ảnh hưởng đến khả năng tái sinh tự nhiên

của cây Cóc đỏ ở khu dự trữ inh quyển RNM Cần Giờ, tác giá đã kết luận khả mưa cao hơn mùa khô

Nguyễn Cảm Dương (2010), Phản ch du đụng dĩ truyền nguần tài

chi thị DN4 đã bước đà

nguyên một số loài cây được liệu ở Việt Nam

đánh giá được mức độ đa dạng di truyỄn của các loài cây thuốc nghiên cứu

Các loài thuộc chỉ Panax có mức đồng hình rắt cao: Hệ số trơng đồng tương

0,89 — 1 va trong loai Tam thất boang là 0,89 — 1 Trong khi đó, các loài Ngũ

gia bì gai, Ngũ gia bì hương, Hồi hương, các loài Hồi núi và Ba kích thể hiện tính đa hình cao, hệ số trơng đồng di truyền tương ứng là 062 ~ 0,92; 0.67 0.95; 0,59 ~ 0,96; 0.56 ~0,78 và 0.49 ~ 0,95

‘Vai Thi Thu Hid

và công sự (2011), Sơ sánh hiệu quả của hai chỉ tị ISSR và RAPD trong nghiên cứu đu dang di yên của loài C khe! (Dalbergia

dạng cho kết quả có dé tin cdy cao Chi thi ISSR cho kết quả 22/25 chỉ thị đa

hình, trong số 102 phân doạn được phân bản thì có 6Š phân đoạn đa hình chiếm

nhân bản có 40 đoạn đa hình chiếm 56,34%

Vũ Thị Thu Hiển và Đỉnh Thị Phòng (2011) nghiên cứu da dang di

ru én ADN của 5 loài cây gỗ quý thuộc chỉ Tri (Dalbergia) bj de dog tuyệt

ching bing chit ISSR vo RAPD Kis quà, rong số 120 chỉ thị phân tử (S7 chỉ

loài) th có 67 chỉ thị nhân bản được phân đoạn DNA (36 chi thi RAPD va 31 chỉ thị ISSR) với giá trị PIC (Polymorphic Information Content ~ hảm lượng thông tin đa hình) dao động từ 0 (RAPD-OPB05) đến 0,740 (ISSR-IS9) Tính

đa được thể hiện ở sự xuất hiện hay không xuất hiện phân đoạn DNA khi phân tích với cùng một chỉ thị phân tứ (V.T.THiễn và Ð.T Phòng, 201 1)

Đỉnh Thị Phòng (2014), Nghiên cứu đơ dạng di truyễn quẩn thể tự nhiên loài Kăm giao núi đắt bằng chỉ thị ISSR K&t qua, 30 chi thi ISSR dB duge sử úvöhŠ (mỗi mẫu là một cá thể) của loài Kim giao núi đắt được lấy ngẫu nhiên

từ 264 cá thể thuộc năm quần thẻ Xã Hiểu (Kon Tum), Tả Nung và Đa Chay

(Lim Lite) va A Yun (Gia Lai) Kết quả phân tích đã chỉ

a 29/30 chỉ thị có tính đa hình Tổng cộng đã nhân bản được 169 phân đoạn truyền thể hiện cao nhất ở quần thể Xã Hiểu, tỉnh Kon Tum [ = 0,350; h

trong cùng quần thể là 59.93, Biểu để phân nhóm chỉa

có hệ số tương đồng đi truyền dao động trong khoảng từ 62% (Nw5 và N68)

đến 100% (Ng36 và NwấT), Kết quả phân tích phân từ cho thấy loài Kim giao

2014)

Vũ Văn Hiểu (2015), Nghiên cứu da dạng di truyền các mẫu giống

Cam sành ở Hà Giang bằng chí thị ISSR và RAPD đã kết luận 25 mỗi RAPD

và 3 mỗi ISSR sử dụng nghiên cứu đa dang di truyền 40 mẫu cam đu cho đa

hình với số băng đa hình trung bình tương ứng 1,72 và 2,17 băng mẫu thông qua các phân tích chỉ thị RAPD và ISSR cho thấy các mẫu cam có sự đa dạng

về mặt dĩ truyền cao với hị

Trong đó, hai mẫu cam VT31 vả VH23 có mức độ tương đồng cao nhất 98% tương đồng đi truyền dao động từ 0,62 ~ 0.98.

Mẫu cam Vinh và hai mẫu cam sinh VT31 và VH23 có sự khác biệt dĩ truyền lớn nhất (Vũ Văn Hiểu, 2015)

Bui Thị Cảm Hường và cộng sự (2016) Kháo sát đa dạng di truyền của

một số giống Nghệ ở miễn Nam Việt Nam dựa trên chỉ tị phân tử RAPD và

ISSR Sau nghiên cứu đã kết luận: Sử dụng 10 đoạn mỗi RAPD vả 10 đoạn mỗi

ISSR để phân tích da dạng đi truyền trên 20 giống Nghệ ở miễn Nam Việt Nam

cho tỉ lệ đa hình cao Tỉ lệ băng đa hình trên 10 đoạn mỗi RAPD là 140/156

(chiém 89,7%) với khoảng cách liên kết trung bình là 6.&7 và được chỉa thành

5 nhóm Tỉ lệ băng đa hình trên 10 đoạn mỗi ISSR là 132/136 (chiếm 97,1%)

với Khoảng cách liên kết trung bình là 6.75 và cũng được chỉa thành 5 nhóm

Sự kết hợp ha chỉ thị phân tử RAPD và ISSR có 272/292 băng da hình (chiếm

93,2%) với khoảng cách liên kết trung bình là 9,65 và được chia thành 4 nhóm

Kết quả nghiên cứu góp phần đánh giá sự đa dạng đi truyền của 20 giống nghệ

2016),

Lê Ngọc Triệu và công sự (2016), Nghiên cứu dư dơng nguén gen tude một số đồng bơ đã qua chon loc trong dia ban tinh Lâm Đồng Với đặc trưng điện di trên gel đễ tin hành phân ch da dạng di truy tập hợp 11 mẫu khảo s

4ai dign cho 11 dong trên, kết quả cho thấy: tập hợp mẫu có mức dị hợp trông

.3073,chỉsổShamnonđạt I=0.4608,tÿlệ

đợi (chỉ số đa dạng gene) đạtH

bảng da hình: PPB =91.84% sử dụng 10 mdi ISSR như trên, từ đặc trưng nhận dạng DNA cia 18 mẫu đại điện cho 6 dòng bơ tiềm năng (mỗi dòng 3 mẫu), cđựa trên sự xuất hiện hay thiểu vắng các băng đặc trưng đã xác lập được 9 chỉ thị phân tử đơn và 25 chỉ thị phân tử kép đề nhận dạng 06 dỏng bơ này (L.N.Trigu

dược chọn từ 44 vườn điều tra Khảo sắt cho kết quả trong 15 du chỉ thị phân

tử ISSR có 10 dấu chỉ thị cho kết quả nên 10 dầu này được dùng để khảo sát

mỗi tương quan di ruyễn của các mẫu Thanh Trà Kết quả khảo sát bằng 10 dân

đạt tí lệ 95,29% Chỉ số PIC dao động từ 0,26 - 0,37 cho thấy mức độ đa

nghiên cứu này Kết quả

nh trung bình của quần thể được sử dụng trong bị

phân tính sơ đồ nhánh dựa vào phương pháp UPGMA đã chứng minh các mẫu

Thanh Trà có sự đa dạng về liễu gen rất cao và có hệ số tương đồng dao động

từ 0448 — 0,8 và trung bình là 0,65 Trong nghiên cứu nảy cũng đã chỉ ra rằng có

sue biển đối về mặt di truyễn đáng kể ong số các mẫu mà về quan sắt hình thái học khó có thể phân biệt được, (Lê Y Phụng và cộng sự 2018)

Củng với sự phát triển của sinh học phân tử trên thế giới, tại Việt Nam cũng

áp dụng những chỉ thị DNA để nghiên cứu độ đa dạng về loài thực vật ti Việt

Nam Các công trình nghiên cứu đều sử dụng các chỉ thị phân tử thực hiện trên

các loài cây ăn quả Tuy nhiên, việc áp dụng các lẽ thuật này chưa phổ biển đối

với các loài thực vật rừng ngập mặn nói chung, loài Cóc đỏ nói riêng

CHUONG 2 VAT LIEU VA PHUONG PHAP NGHIEN CUU

2,1 THỜI GIAN VA DIA DIEM NGHIEN CUU

2.1.1 Thời gian

“Tiến hành từ tháng 1/2019 đến tháng 12/2019

3.12 Địa điểm

Cần Giờ, Phú Quốc và Côn Đảo

Phong thí nghiệm Di truyền — Thực vật G102, khoa Sinh học, Trường Đại học Sự phạm Thành phố Hỗ Chí Minh

Phòng thí nghiêm Sinh hóa - Sinh học phân tir A403, Khoa Sinh học,

“Trường Dai hoe Sai Gon,

Mình 2.2 Dịa điểm thu miu