Nghiên Cứu Tuyển Chọn Vi Khuẩn Nội Sinh Trên Cây Dương Xỉ Nhằm Tăng Cường Khả Năng Hấp Thụ Asen Của Cây Góp Phần Giảm Thiểu Ô Nhiễm Kim Loại Nặng Trong Đất.pdf

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --- Trần Thu Trúc NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN VI KHUẨN NỘI SINH TRÊN CÂY DƯƠNG XỈ NHẰM TĂNG CƯỜNG KHẢ NĂNG HẤP THỤ ASEN CỦA CÂY GÓP

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Trần Thu Trúc

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN VI KHUẨN NỘI SINH TRÊN CÂY DƯƠNG XỈ NHẰM TĂNG CƯỜNG KHẢ NĂNG HẤP THỤ ASEN CỦA CÂY GÓP PHẦN

GIẢM THIỂU Ô NHIỄM KIM LOẠI NẶNG TRONG ĐẤT

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2022

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Trần Thu Trúc

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN VI KHUẨN NỘI SINH TRÊN CÂY DƯƠNG XỈ NHẰM TĂNG CƯỜNG KHẢ NĂNG HẤP THỤ ASEN CỦA CÂY GÓP PHẦN

GIẢM THIỂU Ô NHIỄM KIM LOẠI NẶNG TRONG ĐẤT

Chuyên ngành: Môi trường và phát triển bền vững

Mã số: 8440301.04

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Nguyễn Kiều Băng Tâm

TS Phan Thị Hồng Thảo

Hà Nội – Năm 2022

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng: số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn

là trung thực

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và thông tin trong luận văn đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2022

Người thực hiện luận văn

Trần Thu Trúc

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới TS Phan Thị Hồng Thảo và các đồng chí trong Bộ môn Vi sinh Đất, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi về cơ sở vật chất, trang thiết bị, tạo điều kiện giúp đỡ tôi học hỏi kinh nghiệm và chuyên môn trong thời gian thực tập Tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của thầy cô và các bạn Với lời tri ân sâu sắc và chân thành nhất, tôi xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể các thầy cô giáo Khoa Môi trường, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những người thân đã luôn bên cạnh động viên, khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập

Hà Nội, ngày tháng năm 2022

Người thực hiện luận văn

Trần Thu Trúc

iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN I LỜI CẢM ƠN II MỤC LỤC III DANH MỤC BẢNG V DANH MỤC HÌNH ẢNH VI DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VII

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về ô nhiễm Asen 3

1.1.1 Tình hình ô nhiễm Asen trên thế giới và ở Việt Nam: 4

1.1.2 Một số phương pháp xử lý truyền thống 7

1.2 Xử lý đất ô nhiễm kim loại nặng bằng các phương pháp sinh học 9

1.2.1 Công nghệ thực vật xử lý ô nhiễm KLN trong đất 9

1.2.2 Vi sinh vật nội sinh và tiềm năng xử lý ô nhiễm 12

1.3 Tiềm năng công nghệ xử lý Asen bằng thực vật kết hợp vi sinh vật nội sinh 14

1.3.1 Xử lý Asen bằng cây dương xỉ 14

1.3.2 Xử lý Asen bằng thực vật kết hợp vi sinh vật: 17

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu: 21

2.2.Vật liệu và thiết bị: 22

2.2.1 Hóa chất 22

2.2.2 Thiết bị 22

2.3 Phương pháp nghiên cứu 22

2.3.1 Phương pháp lấy mẫu đất và cây tại khu vực nghiên cứu 22

2.3.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn nội sinh 23

iv

2.3.3 Xác định số lượng vi khuẩn bằng phương pháp pha loãng tới hạn 23

2.3.4 Phương pháp kiểm tra sự chống chịu Asenit và Asenat ở vi khuẩn 24

2.3.5 Phương pháp xác định khả năng sinh IAA của các chủng phân lập 25

2.3.6 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái và tế bào 25

2.3.7 Phân loại chủng vi khuẩn theo phương pháp 16S rDNA 27

2.3.8 Phương pháp phân tích và xử lý dữ liệu 30

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 Khảo sát địa điểm lấy mẫu: 31

3.2 Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật nội sinh trong cây dương xỉ thu thập tại Thái Nguyên 32

3.3 Kết quả nghiên cứu sự chống chịu Asenit và Asenat ở vi khuẩn 44

3.3.1 Khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu với As (V) của vi khuẩn tuyển chọn 44

3.3.2 Khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu với As (III) của vi khuẩn tuyển chọn 47

3.4 Xác định khả năng sinh IAA của các chủng vi khuẩn nội sinh có khả năng chống chịu As 47

3.5 Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại các chủng vi khuẩn nội sinh chống chịu Asen và có khả năng sinh tổng hợp IAA cao 49

3.5.1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái và đặc điểm nuôi cấy 49

3.5.2.Khả năng sinh tổng hợp một số enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn lựa chọn ……… 54

3.5.3 Khả năng đồng hóa các nguồn cacbon của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 55

3.5.4 Định danh các chủng vi sinh vật nội sinh được lựa chọn bằng sinh học phân tử 57 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 62

TÀI LIỆU THAM KHẢO 64

v

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các dạng tồn tại của As 3

Bảng 2 1 Trình tự đoạn mồi được sử dụng trong phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rDNA 29

Bảng 2 2 Phản ứng PCR được thực hiện trong hỗn hợp: 29

Bảng 3.1 Vị trí địa điểm lấy mẫu 31

Bảng 3.2 Kết quả phân tích mẫu đất ở vùng lấy mẫu 32

Bảng 3.3 Kết quả phân lập vi khuẩn nội sinh trên đĩa LB có bổ sung 5 mM As (III) 33 Bảng 3.4 Kết quả phân lập vi khuẩn nội sinh trên đĩa LB có bổ sung 5 mM As (V) 37

Bảng 3.5 Khả năng chống chịu As (V) của các chủng vi khuẩn nội sinh trên cây dương xỉ 44

Bảng 3.6 Khả năng chống chịu As (III) của vi khuẩn nội sinh trên cây dương xỉ 47

Bảng 3.7 Đặc điểm nuôi cấy của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 50

Bảng 3.8 Đặc điểm hình thái tế bào vi khuẩn tuyển chọn 51

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của nồng độ muối đến khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 52

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 53

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 53

Bảng 3.12 Khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào của vi khuẩn tuyển chọn 54

Bảng 3.13 Khả năng đồng hóa các nguồn cacbon của vi khuẩn tuyển chọn 55

Bảng 3.14 Kết quả so sánh trình tự gen mã hóa 16S rDNA của chủng L3.2.2 với gen tương ứng của các chủng được đăng ký trên GenBanK 59

Bảng 3.15 Kết quả so sánh trình tự gen mã hóa 16S rDNA của chủng S2.2.1 với gen tương ứng của các chủng được đăng ký trên GenBanK 59

Bảng 3.16 Kết quả so sánh trình tự gen mã hóa 16S rDNAcủa chủng R3.8.5 với gen tương ứng của các chủng được đăng ký trên GenBanK 60

vi

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 2 1 Hình thái một số mẫu dương xỉ trong quá trình thu thập 21

Hình 2 2 Quá trình tách chiết DNA 28

Hình 2 3 Chu trình nhiệt trong kỹ thuật PCR 30

Hình 3 1 Hình ảnh trong quá trình xử lý bề mặt mẫu dương xỉ và đồng hóa sinh khối thực vật để phân lập vi khuẩn nội sinh 33

Hình 3 2 Ảnh một số đĩa phân lập trên môi trường có bổ sung As III và As V 33

Hình 3 3 Tỷ lệ khuẩn lạc thu được trên các bộ phận của cây 43

Hình 3 4 Thí nghiệm xác định MIC và MBC của chủng S.3.4.1 46

Hình 3 5 Kết quả đo OD của axit Indole-3-Acetic (IAA) 48

Hình 3.6 Phản ứng màu nhận biết axit Indole-3-Acetic (IAA) bằng thuốc thử Salkowski 48

Hình 3.7 Ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 54

Hình 3.8 Khả năng đồng hóa các nguồn cacbon của chủng vi khuẩn tuyển chọn 56

Hình 3.9 Điện di đồ DNA tổng số (a) và sản phẩm PCR của các chủng vi khuẩn lựa chọn trên gel agarose 1% 57

Hình 3.10 Cây phát sinh loài dựa trên trình tự 16S rDNA của VKNS S3.4.1 và các loài vi khuẩn họ hàng gần 58

MBC Minimal Batericidal Concentration

MIC Minimal Inhibitory Concentration

MMA Monomethyl- arsenate

PCR Polymerase Chain Reactin

1

Mở đầu

Ngày nay, ô nhiễm kim loại nặng (KLN) trong đất đã trở thành mối quan tâm đặc biệt của nhiều quốc gia trên thế giới, không chỉ vì mức độ độc hại của chúng mà còn là tác nhân khó phân hủy trong môi trường Bên cạnh đó, sự tích lũy KLN vượt quá tiêu chuẩn cho phép sẽ gây ảnh hưởng xấu đến con người, sinh vật và môi trường đất Ô nhiễm KLN trong đất gây ra sự suy thoái chất lượng đất, suy giảm số lượng vi sinh vật (VSV) và đa dạng sinh học trong đất, ngộ độc cây trồng

Với sự phát triển của các ngành công nghiệp, nông nghiệp và khai thác khoảng sản như hiện nay, quy mô và cường độ ô nhiễm KLN trong đất ngày càng gia tăng

Vì vậy việc nghiên cứu và tìm kiếm các phương pháp xử lý KLN trong đất là hết sức cần thiết, nhằm cải tạo và góp phần nâng cao chất lượng đất trong xu thế tài nguyên đất trên thế giới cũng như nước ta hiện nay đang dần thu hẹp về diện tích cũng như chất lượng bị đe dọa bởi các nguồn ô nhiễm

Đến nay, đã có rất nhiều công nghệ xử lý KLN trong đất bằng phương pháp hóa học hay vật lý, các phương pháp này hầu như tốn kém về kinh phí hay giới hạn về kỹ thuật và hạn chế về diện tích, vì vậy công nghệ khử độc bằng phương pháp sử dụng thực vật (phytoremediation) đang thu hút sự quan tâm lớn bằng những

ưu điểm nổi bật: Đây là công nghệ xanh, thân thiện với môi trường, ít tốn kém hơn

so với các phương pháp truyền thống khác Chỉ có những loài thực vật đã biến đổi

để thích nghi mới có thể tồn tại ở điều kiện môi trường có hàm lượng KLN cao Trong những cơ chế hấp thụ chất ô nhiễm bằng thực vật, sử dụng cây dương xỉ siêu tích lũy được biết đến và đánh giá cao như một công nghệ khắc phục tại chỗ hiệu quả, thân thiện với môi trường và chi phí thấp

Hiện nay các loài dương xỉ đang là đối tượng rất được quan tâm trong nghiên

cứu nhằm loại bỏ kim loại nặng ra khỏi vùng đất ô nhiễm Trên thế giới, các công

bố về sự tương tác giữa thực vật và vi sinh vật có ý nghĩa quan trọng trong quá trình thực hiện biện pháp khử độc bằng thực vật đã được khẳng định

Mỗi cây chủ đều có một hoặc nhiều loài vi sinh vật nội sinh cư trú Vi khuẩn nội sinh thúc đẩy thực vật tăng trưởng, tăng năng suất và đóng vai trò là một tác

2

nhân điều hòa sinh học, cũng như sản xuất hàng loạt các sản phẩm tự nhiên có lợi cho thực vật ký chủ mà ta có thể khai thác những tác nhân đó để ứng dụng trong y học, nông nghiệp hay công nghiệp

Sử dụng cây trồng trong khử độc KLN đã được nghiên cứu nhiều tại Việt Nam, bên cạnh đó một số nghiên cứu về vi sinh vật hấp thụ KLN và xử lý KLN cũng đã được tiến hành Tuy nhiên, nghiên cứu về vi sinh vật nội sinh phân lập từ cây dương xỉ ở vùng ô nhiễm và phối hợp chúng với cây chủ trong việc thử nghiệm khử độc ô nhiễm As vẫn còn hạn chế

Dựa trên những thành quả nghiên cứu đã thu được từ việc hấp thụ chất ô nhiễm bằng thực vật hay sử dụng VSV vào quá trình xử lý kim loại nặng trong đất, mục đích của nghiên cứu này hướng đến chọn lựa được được các chủng vi khuẩn nội sinh cư trú trên cây dương xỉ nhằm kích thích sinh trưởng của thực vật và tăng khả năng tích lũy As Mục đích hướng tới một giải pháp công nghệ xanh, hấp thu

As bằng tổ hợp sinh vật bản địa (thực vật và VSV), nâng cao hiệu quả hấp thu As so với công nghệ xử lý đơn lẻ hoặc bằng thực vật, hoặc bằng VSV

Mục tiêu nghiên cứu đề tài bao gồm:

1 Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn nội sinh trên cây dương xỉ có khả năng chống chịu với As

2 Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của các chủng phân lập

3 Định danh các chủng được lựa chọn

Để thực hiện mục tiêu đã đặt ra, các nội dung nghiên cứu của đề tài bao gồm:

- Nội dung 1: Thu thập mẫu đất, mẫu cây và phân lập vi khuẩn nội sinh trên cây dương xỉ

- Nội dung 2: Tuyển chọn các chủng vi khuẩn nội sinh trên cây dương xỉ và đánh giá khả năng sinh tổng hợp chất kích thích sinh trưởng IAA và khả năng chống chịu As hiệu quả

- Nội dung 3: Nghiên cứu đặc điểm sinh học và định danh các chủng vi khuẩn nội sinh được lựa chọn

3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về ô nhiễm Asen

Asen (As) là á kim trong nhóm V-A có có khối lượng riêng 5,37 g/cm3, phân

bố tự nhiên trong vỏ Trái Đất đá mẹ, đất, trầm tích, nước và vi sinh vật (VSV) với hàm lượng trung bình khoảng 5mg/kg Khi kết hợp với các nguyên tố khác As có thể có các hóa trị khác nhau +5, +3, 0, và -3 As tham gia liên kết cộng hóa trị với nhiều kim loại và nhiều hợp chất hữu cơ ổn định Tuy vậy, As vẫn được xem như là kim loại nặng (KLN) vì các nhà độc tố học cho rằng, KLN là những kim loại và á kim có liên quan đến vấn đề ô nhiễm môi trường và có độc tính cao đối với cơ thể sống như Cd, Cu, Cr, Hg, Ni, Pb, Zn, As, [ 2], [10], [9] Trong đất, As và các KLN khác thường bị khóa chặt trong cấu trúc của một số loại đá nên vô hại trong điều kiện bình thường của tự nhiên As có mặt trong hơn 368 khoáng vật khác nhau, bao gồm 213 khoáng vật hydroarsenat và arsenat, 73 khoáng vật sunfuarsenat và 40 khoáng vật intemtallit…[81] Asen được tìm thấy trong tự nhiên ở nguồn nước ngầm trên toàn thế giới Asen có thể tồn tại ở dạng vô định hình và dạng tinh thể

Bảng 1.1 Các dạng tồn tại của As

Arsenite/ As (III) Vô cơ H2AsO3−, HAsO32−, AsO33−Arsenate/ As (V) Vô cơ H2AsO4−, HAsO42−, AsO43−Monomethylarsonic acid (MMA) Hữu cơ CH3AsO(OH)2

Dimethylarsinic acid (DMA) Hữu cơ (CH3)2AsO(OH)

As trong môi trường được tạo ra từ hai nguồn chủ yếu là nguồn tự nhiên (các hoạt động của núi lửa, lắng đọng từ khí quyển, sự phong hoá của đá mẹ và khoáng vật) và nguồn nhân tạo (hoạt động nông nghiệp, công nghiệp, khai khoáng, giao thông, ) Con người là nguyên nhân chủ yếu làm tăng lượng As trong môi trường Hoạt động khai thác khoáng sản và luyện kim (các kim loại mầu) cũng như việc tiêu thụ nhiên liệu hóa thạch là những hoạt động công nghiệp chủ chốt gây ra

sự ô nhiễm As trong không khí, nước và đất As có trong thành phần của hơn

4

200 loại quặng và thường có hàm lượng cao trong một số loại quặng asenua của Cu,

Pb, Ag hoặc tồn tại cùng với các sunfua Một số quặng có hàm lượng As cao nhất là asenopirit (FeAsS), realgar (As4S4) và orpinen (As2S3) Do quá trình phong hoá hay phun trào núi lửa, As trong các loại quặng bị rửa trôi theo nước, thấm vào đất và gây ô nhiễm đất và nước [7]

As được biết đến là chất gây độc đối với con người và cũng có tác động mãn tính đối với sức khỏe, cũng như gây độc gen và gây ung thư, nguy hiểm gấp 5 lần chì [71] Các tác động mãn tính đến con người của As bao gồm: rối loạn tiêu hóa, thiếu máu, bệnh thần kinh ngoại biên, tổn thương da, tăng sắc tố, hoại tử tứ chi, tổn thương mạch máu, tổn thương gan, thận và sẩy thai tự nhiên [69], [30] Việc hít phải các hợp chất chứa As thường đến từ những tiếp xúc nhỏ, như công nhân trong các ngành công nghiệp luyện kim, sản xuất thuốc trừ sâu, và trong các nhà máy điện đốt than giàu As [48]

Bên cạnh đó As còn ảnh hưởng đến thực vật như một rào cản trao đổi chất, gây ảnh hưởng xấu đến sự phát triển và giảm năng suất, đặc biệt trong môi trường thiếu photpho Các tác động của As đến thực vật là do ức chế hệ thống hấp thụ phosphat /As có ái lực cao gây ra các rối loạn sinh lý khác nhau ở thực vật, ức chế

sự phát triển của cây và cuối cùng làm chết cây As (III) phản ứng với các nhóm sulfhydryl của enzym và protein mô, ức chế chức năng tế bào, gây chết As được tích lũy chủ yếu trong hệ thống rễ và nó gây ra nhiều thay đổi sinh lý, cản trở quá trình trao đổi chất, ức chế tăng trưởng thực vật, và cuối cùng là giảm năng suất cây trồng Nồng độ As thường thay đổi từ dưới 10 mg/kg ở đất không bị ô nhiễm, đến cao tới 300 mg/kg ở đất bị ô nhiễm [29]

1.1.1 Tình hình ô nhiễm Asen trên thế giới và ở Việt Nam:

Tại các khu vực phát triển ở Việt Nam và trên thế giới, số điểm đất bị ô nhiễm KLN rất lớn Có nhiều nguyên nhân khác nhau dẫn đến ô nhiễm KLN trong đất, đáng kể nhất là do sự tích lũy từ chất thải của các ngành công nghiệp có liên quan đến kim loại và hoạt động khai thác khoáng sản Các tác nhân gây ô nhiễm là axít,

5

kim loại nặng, xianua, các loại khí độc, Trong những năm gần đây, ô nhiễm As đã trở thành một vấn đề rất được quan tâm bởi độc tính cũng như sự phân bố rỗng rãi của nó trong các hợp phần khác nhau của tự nhiên như trong nguồn nước ngầm và nước mặt

* Tình trạng As trong đất trên thế giới:

Các nhà khoa học của Viện nghiên cứu Địa lý và Tài nguyên thiên nhiên ở Viện Hàn lâm Khoa học Bắc Kinh, Trung Quốc [19-22] đã phát hiện đất ở nhiều khu vực có chứa As ở mức cao như ở vành đai vàng là 1342 mg/kg và ở vành đai thủy ngân là 509 mg/kg Kết quả nghiên cứu của C.Chen cho thấy hàm lượng As ở vùng khai thác khoáng sản Dexing cao hơn giới hạn cho phép là 60 lần Các hoạt động khai thác mỏ vàng đã làm cho đất và nước ở bang Minas Gerais của Brazil bị ô nhiễm As Các nghiên cứu cho thấy, hàm lượng As trong đất lớn hơn

100 mg/kg cao hơn tiêu chuẩn cho phép của FAO/WHO về hàm lượng As trong đất nông nghiệp nhiều lần [37] Tại Thái Lan, các chất thải có chứa As từ quá trình khai thác thiếc như arsenopyrite đã gây ô nhiễm môi trường đất và nước ngầm Hàm lượng As trong các giếng nước khoan chịu ảnh hưởng của quá trình khai thác thiếc

có nơi lên tới 5000 µg/l Năm 1996 tại quận Ron Phibun (tỉnh Nakorn Si Thammat)

là nơi bị ảnh hưởng bởi ô nhiễm As đã có khoảng hơn 1000 người đã mắc các chứng bệnh về da [76]

Tích tụ As trong đất là một trong các nguồn chính làm tăng nguy cơ ô nhiễm nước mặt và nước ngầm, sự hấp thu do thực vật và sự hấp thu trực tiếp hay gián tiếp đối với con người Về tình hình ô nhiễm As, rất nhiều nơi trên thế giới đang

bị ô nhiễm As nghiêm trọng đó là một số vùng ở các nước như Ác-hen-ti-na, la- đet, Ấn độ, Pa-kit-stan, Mê-xi-cô, Mông Cổ, Đức, Thái Lan, Trung Quốc, Chi-

Băng-lê, Mỹ, Canada, Hungary, Ru-ma-ni, Việt Nam [40], [49]

 Tình hình ô nhiễm As trong đất ở Việt Nam

Hiện nay ở Việt Nam có tổng diện tích đất tự nhiên là hơn 33 triệu ha Trong

đó có 68,83% tức khoảng hơn 22 triệu ha diện tích đất đang được sử dụng, còn lại

As trong đất tồn tại ở nhiều dạng hợp chất với lưu huỳnh như: As4S4, As2S3, FeAsS… hoặc hợp kim với đồng hoặc antimon Nó gây ra những tác động nguy hại khi chất độc này bị rửa trôi vào tầng nước ngầm và nước mặt, và thậm trí nó còn được tích lũy trong sinh khối của các loài sinh vật sống tại vùng khai thác và chế biến quặng [75] Vì vậy nếu không được kiểm soát, chúng sẽ đi vào chuỗi thức ăn, gây tích lũy sinh học và để lại những hậu quả nghiêm trọng cho con người và hệ sinh thái

Hiện nay ở nước ta, sự phát triển nhanh của các hoạt động nông nghiệp và công nghiệp đang làm gia tăng sự tích lũy KLN từ chất thải vào các lớp đất gây nên

ô nhiễm môi trường đất nghiêm trọng Tại xã Hà Thượng, Đại Từ -Thái nguyên, chất thải từ khu vực mỏ khoáng đang khai thác có nồng độ As cao nhất, đo được trong đất là 841 – 3.809 mg/kg

7

Sử dụng cây trồng trong khử độc KLN đã được nghiên cứu nhiều tại Việt Nam, bên cạnh đó một số nghiên cứu về vi sinh vật hấp thụ KLN và xử lý KLN cũng đã được tiến hành Tuy nhiên, nghiên cứu về vi sinh vật nội sinh phân lập từ cây dương xỉ ở vùng ô nhiễm và phối hợp chúng với cây chủ trong việc thử nghiệm khử độc ô nhiễm As vẫn còn hạn chế

1.1.2 Một số phương pháp xử lý truyền thống

- Phương pháp đào và chuyển chỗ

Đào và chuyển chỗ là phương pháp xử lý cơ học nhằm di chuyển các chất độc hại đến một nơi khác an toàn hơn Với phương pháp này, các chất ô nhiễm không được loại bỏ khỏi đất ô nhiễm mà đơn giản chỉ là đào lên và chuyển đất ô nhiễm đi chỗ khác với hy vọng là không bị ô nhiễm ở những nơi cần thiết

Trên thực tế, phương pháp này không có khả năng loại bỏ hoàn toàn As, chi phí cao, cần diện tích lớn, đất không còn khả năng tái sử dụng mà còn gây nguy hiểm trong quá trình vận chuyển [3]

- Phương pháp cố định hoặc cô đặc

Cố định hoặc cô đặc chất ô nhiễm có thể là phương pháp xử lý tại chỗ hoặc chuyển chỗ Phương pháp này liên quan đến hỗn hợp các chất đặc trưng được thêm vào đất, hoặc là các thuốc thử, các chất phản ứng với đất ô nhiễm để làm giảm tính linh động và hoà tan của các chất ô nhiễm

Các tác nhân liên kết được sử dụng bao gồm tro (fly-ash), xi măng (cement) hoặc rác đốt (kiln dust) Mặc dù quá trình này đã được chứng minh là hiệu quả với chất ô nhiễm là kim loại nặng nhưng lại có khả năng tác nhân liên kết hoặc thay đổi

pH đất Phương pháp cố định hoặc cô đặc không xử lý được chất ô nhiễm từ ma trận đất (soil matrix) nhưng nó có thể nén các chất ô nhiễm lại trong môi trường đất [27]

- Phương pháp thuỷ tinh hoá (Vitrification)

Phương pháp thuỷ tinh hoá là quá trình xử lý bởi nhiệt, có thể được sử dụng để

xử lý đất tại chỗ hay chuyển chỗ Đây là quá trình chuyển chất ô nhiễm thành dạng thuỷ tinh cố định (Stable glassy form) [27]

8

Đối với phương pháp này, cho dòng điện chạy qua một dãy điện cực than chì, làm nóng chảy đất ở nhiệt độ rất cao (1500 – 2000oC) Thuỷ tinh bền được hình thành, kết hợp chặt chẽ và cố định kim loại khi đất được làm lạnh

Một nắp đậy khí thải được lắp đặt trên vùng xử lý Nắp này được sử dụng để thu thập và xử lý các khí thải (các kim loại bay hơi) được thải ra trong suốt quá tình

xử lý Hiện nay phương pháp này được sử dụng khá rộng rãi nhưng chỉ được áp dụng trên diện tích nhỏ, chi phí giá thành cao, yêu cầu kỹ thuật hiện đại nên người

ta cần tìm kiếm những phương pháp khác có hiệu quả kinh tế cao hơn, thân thiện hơn với môi trường

- Phương pháp rửa đất (Soil washing) [63]

Rửa đất là công nghệ xử lý đất chuyển vị (Ex- situ) có thể đuợc sử dụng để xử

lý đất ô nhiễm KLN Quá trình này dựa vào cơ chế hút và tách vật lý để loại bỏ chất

ô nhiễm ra khỏi đất Quá trình vật lý loại bỏ những hạt kim loại có kích thước lớn

và vận chuyển các chất ô nhiễm vào pha lỏng Dung dịch làm sạch đất có thể trung tính hoặc chứa các yếu tố hoạt tính bề mặt Các chất thường dùng trong các dung dịch làm sạch đất là HCl, EDTA, HNO3 và CaCl2 Quá trình này sẽ làm giảm nồng

độ kim loại trong đất và tạo ra một dịch lỏng với nồng độ kim loại cao và tiếp tục

xử lý

Ở những nơi có nhiều chất ô nhiễm hỗn hợp, phương pháp này sẽ gặp khó khăn vì khó xác định dung dịch rửa thích hợp Hơn nữa đất ô nhiễm với nhiều phức chất khác nhau sử dụng phương pháp này sẽ rất tốn kém [5]

Nhìn chung, các phương pháp hóa lý và cơ học nói trên có hiệu quả xử lý cao nhưng chi phí đầu tư lớn Đất sau xử lý vẫn còn chứa một lượng kim loại nhất định

và có thể ảnh hưởng tới môi trường Hơn nữa, phương pháp này còn tỏ ra kém hiệu quả khi nồng độ ô nhiễm As trong đất thấp và mức độ phân tán ra một vùng rộng lớn Trong những trường hợp này thì sử dụng biện pháp sinh học là một giải pháp tối ưu

9

1.2 Xử lý đất ô nhiễm kim loại nặng bằng các phương pháp sinh học

Các biện pháp vật lý và hoá học trên chỉ thích hợp với những chất nguy hại có

độ độc hại cao, tại những điểm nóng như những kho hoá chất bảo vệ thực vật, kho thuốc diệt cỏ tồn đọng từ hồi chiến tranh, còn đối với những chất ô nhiễm tản mạn như dư lượng hoá chất bảo vệ thực vật, sự cố tràn dầu, chất diệt cỏ, ô nhiễm KLN

do khai thác khoáng sản, thì các biện pháp kể trên vừa ít hiệu quả lại tốn kém Do vậy, biện pháp hợp lý và khả thi nhất hiện nay là biện pháp sinh học [13]

1.2.1 Công nghệ thực vật xử lý ô nhiễm KLN trong đất

Công nghệ thực vật xử lý ô nhiễm (phytoremediation) là phương pháp sử dụng thực vật để hấp thụ, chuyển hoá, cố định hoặc phân giải các chất ô nhiễm trong đất

và nước [32] Công nghệ thực vật xử lý ô nhiễm có thể dùng để xử lý các chất như KLN, thuốc trừ sâu, dung môi, thuốc súng, dầu mỏ, các hợp chất hữu cơ đa vòng thơm, nước rỉ rác nước thải nông nghiệp, chất thải khai khoáng và các chất ô nhiễm phóng xạ,…

Cho đến nay, việc sử dụng thực vật để xử lý các chất ô nhiễm đã được ứng dụng ở nhiều nơi và áp dụng cho nhiều loại chất ô nhiễm Giải pháp công nghệ này bao gồm một số quá trình cơ bản như [25]: Chuyển hoá chất ô nhiễm (Phyto-transformation); Xử lý bằng vùng rễ (Rhizosphere remediation); Công nghệ cố định các chất ô nhiễm (Phytostabilization); Công nghệ chiết suất bằng thực vật (Phytoextraction); Công nghệ bay hơi qua lá cây (Phytovolatilization) Có 3 cách tiếp cận cơ bản nhất để xử lý ô nhiễm KLN trong đất là công nghệ cố định các chất

ô nhiễm, chiết bằng thực vật và hóa hơi bằng thực vật

Trong đó quá trình chiết suất KLN nhờ thực vật (Phytoextraction) hay còn gọi

là quá trình tích luỹ nhờ thực vật (Phytoacumulation) đang được quan tâm và ứng dụng phổ biến Đây là quá trình hấp thụ và chuyển hoá các KLN trong đất thông qua rễ vào các cơ quan khí sinh của thực vật Các loài thực vật có khả năng này được gọi là các loài thực vật siêu tích tụ (hyperacumulator), chúng có khả năng hấp thụ một lượng lớn các KLN một cách không bình thường so với các loài thực vật

10

khác [38] Thực vật “siêu tích tụ” là những loài cây có thể sống tốt trong môi trường đất bị ô nhiễm KLN và tích tụ kim loại với hàm lượng cao bất thường trong thân lá của mình Các loài thực vật sử dụng tốt nhất cho phương pháp này phải kết hợp được 2 yếu tố là có thể tích luỹ kim loại cao trong thân và cho sinh khối cao

Có rất nhiều loài đáp ứng được điều kiện thứ nhất nhưng không đáp ứng được điều kiện thứ hai Vì vậy, các loài có khả năng tích luỹ thấp nhưng cho sinh khối cao cũng rất cần thiết để đánh giá

Quá trình tích lũy nhờ thực vật sử dụng các loài thực vật siêu tích tụ để loại bỏ các KLN trong đất bằng cách hấp thụ từ rễ chuyển lên thân, sau đó các chất ô nhiễm trong thân sẽ được thu hoạch, xử lý tiếp như đem thiêu đốt hoặc ủ để thu hồi KLN Nếu cần thiết thì quá trình này có thể lặp lại để loại bỏ các chất ô nhiễm đến dưới giới hạn cho phép [44] Cũng có thể sử dụng nhiều loài thực vật trên cùng một vị trí hoặc là trồng cùng 1 lúc hoặc trồng theo thứ tự thời gian để loại bỏ nhiều hơn 1 chất

ô nhiễm Nếu thực vật được thiêu đốt, tro phải được xử lý như đối với chất thải nguy hại Tuy nhiên, lượng tro mang đi xử lý sẽ ít hơn so với phương pháp chôn lấp đất ô nhiễm thông thường [23], [38]

Theo tài liệu nghiên cứu, thế giới có ít nhất 400 loài thuộc 45 họ thực vật có khả năng hấp thụ kim loại Các loài này là thực vật thân thảo hoặc thân gỗ, có khả năng tích luỹ và không có biểu hiện về mặt hình thái khi nồng độ kim loại trong thân cao hơn hàng trăm lần so với các loài bình thường khác [55], [13]

 Tiềm năng của công nghệ thực vật xử lý kim loại nặng trong đất

Trong những năm gần đây, người ta quan tâm rất nhiều về công nghệ sử dụng thực vật để xử lý môi trường bởi nhiều lý do: diện tích đất bị ô nhiễm ngày càng tăng; các kiến thức khoa học về cơ chế, chức năng của sinh vật và hệ sinh thái; áp lực của cộng đồng, sự quan tâm về kinh tế và chính trị, Khoảng hai thập kỉ trước đây, các nghiên cứu về lĩnh vực này còn rất ít, nhưng ngày nay, nhiều nhà khoa học đặc biệt là ở Mỹ và châu Âu đã có rất nhiều đề tài nghiên cứu cơ bản và ứng dụng công nghệ này như một công nghệ mang tính chất thương mại Hạn chế của công

11

nghệ này là ở chỗ không thể xem như một công nghệ xử lý tức thời và phổ biến ở mọi nơi Tuy nhiên, chiến lược phát triển các chương trình nghiên cứu cơ bản có thể cung cấp được các giải pháp xử lý đất một cách thân thiện với môi trường và bền vững Năm 1998, Cục môi trường Châu Âu (EEA) đánh giá hiệu quả kinh tế của các phương pháp xử lý KLN trong đất bằng phương pháp truyền thống và phương pháp sử dụng thực vật tại 1.400.000 vị trí bị ô nhiễm ở Tây Âu, kết quả cho thấy chi phí trung bình của phương pháp truyền thống trên 1 hecta đất từ 0,27 đến 1,6 triệu USD, trong khi phương pháp sử dụng thực vật chi phí thấp hơn 10 đến 1000 lần [40], [53] Và nếu không chỉ quan tâm ở khía cạnh môi trường mà kể cả các khía cạnh về kinh tế như trồng rừng, tận thu kim loại quý trong chất thải khai khoáng thì công nghệ thực vật trong xử lý ô nhiễm cũng được xem là giải pháp khả thi

 Phương pháp sử dụng thực vật giảm thiểu ô nhiễm Asen

Sự hiện diện của As trong môi trường tạo ra các nguy cơ liên quan đến sức khỏe con người và hệ sinh thái Vì vậy việc triển khai các chiến lược xử lý truyền thống để làm sạch các địa điểm bị ô nhiễm đã được tiến hành Tuy nhiên các phương pháp này đều tốn kém về kinh phí và hiệu quả không cao, nên ngày nay phương pháp xử lý sinh học bằng thực vật đã được coi là một phương pháp xử lý tại chỗ ít tốn kém hơn và có lợi cho môi trường đối với đất ô nhiễm [53] Công nghệ này sử dụng các loại thực vật siêu tích lũy có tốc độ sinh trưởng nhanh, chịu được nồng độ kim loại nặng lớn và khả năng tích tụ hàm lượng kim loại nặng cao trong các bộ phận trên mặt đất của chúng (trên 100 - 1000 mg/kg tùy thuộc vào kim loại) Các loài thực vật có tiềm năng xử lý kim loại trong đất thường có các đặc trưng sau: (1) siêu tích lũy kim loại trong phần trên mặt đất của cây; (2) sinh khối lớn, sinh trưởng nhanh và chống chịu sâu bệnh; (3) tỷ lệ nồng độ kim loại nặng giữa

rễ và chồi (yếu tố vận chuyển, TF) trên 1 và tỷ lệ nồng độ kim loại nặng giữa rễ và trong đất (hệ số tập trung sinh học, BC) cũng vượt quá 1; (4) phân bố rộng rãi và có

bộ rễ phát triển nhiều nhánh; (5) dễ trồng và phân bố phổ biến tại nhiều khu vực khí hậu khác nhau; và (6) dễ thu hoạch [66] Các loài siêu tích lũy As là những loài có

1.2.2 Vi sinh vật nội sinh và tiềm năng xử lý ô nhiễm

Vi sinh vật nội sinh (endophytes) là các vi khuẩn, vi nấm có thể khu trú bên trong tế bào cây trồng khỏe mạnh mà không gây ra bất kì triệu chứng bệnh nào [35]

Vi sinh vật nội sinh được tìm thấy trong hầu hết ở các loài thực vật, chúng cư trú ở trong nội mô của thực vật ký chủ và giữa chúng hình thành một loạt các mối quan

hệ khác nhau như cộng sinh tương hỗ, cộng sinh dinh dưỡng, hội sinh …Hầu hết các dạng nội sinh này bắt đầu xuất hiện từ vùng rễ hay bề mặt lá, tuy nhiên, một số loại có thể ký sinh trên hạt Kể từ khi phát hiện ra các vi sinh vật nội sinh ở Đức vào năm 1904, các nhà nghiên cứu đã định nghĩa vi sinh vật nội sinh theo nhiều cách khác nhau, thường là tuỳ thuộc phương pháp vi sinh vật nội sinh được phân lập và đánh giá [35]

Mối quan hệ giữa vi sinh vật nội sinh và thực vật trong xử lý ô nhiễm:

Vi khuẩn nội sinh thúc đẩy thực vật tăng trưởng, tăng năng suất và đóng vai trò là một tác nhân điều hòa sinh học Vi sinh vật nội sinh sản xuất hàng loạt các sản phẩm tự nhiên có lợi cho thực vật ký chủ mà ta có thể khai thác những tác nhân đó

để ứng dụng trong y học, nông nghiệp hay công nghiệp Ngoài ra nó còn có tiểm năng loại bỏ các chất gây ô nhiễm trong đất bằng cách tăng cường khả năng khử

13

độc trên thực vật và làm cho đất trở nên màu mỡ thông qua chu trình photphat và cố định đạm [14], [31] Ngày càng có nhiều quan tâm trong việc phát triển các ứng dụng tiềm năng công nghệ sinh học của vi sinh vật nội sinh để phát triển các giống cây trồng có khả năng khử độc đồng thời có khả năng sản xuất sinh khối và nhiên liệu sinh học

Cùng với việc phát triển những nghiên cứu mới, nhiều vi sinh vật nội sinh đã cho thấy khả năng làm giảm các chất ngoại sinh (xenobiotic) hay có thể hoạt động như các xúc tác mở đầu cho quá trình đó Chúng có khả năng kháng kim loại nặng, kháng khuẩn và làm giảm các gốc hữu cơ thông qua tiếp xúc với các hợp chất trong thực vật và đất nơi chúng cư trú Khả năng làm giảm những chất ngoại sinh đang được nghiên cứu cẩn thận để cải tiến kỹ thuật khử độc bằng thực vật [51], [65] Một số nghiên cứu đã chỉ ra tiềm năng của vi sinh vật nội sinh [8] như:

- Kích thích sinh trưởng thực vật: Vi sinh vật (VSV) nội sinh đóng vai trò quan trọng giúp cây lấy dinh dưỡng từ môi trường (đất, nước, không khí); cố định dinh dưỡng từ hoạt động cộng sinh; và sản xuất các chất kích thích sinh trưởng thực vật như auxin( Indole-3-acetic acid), cytokinin và gibberellic acid

- Sản xuất enzyme: Nhiều enzyme quan trọng được thương mại hoá bởi quá trình sản xuất VSV nội sinh

- Hoạt chất sinh học và hợp chất mới: VSV nội sinh có khả năng tổng hợp các hoạt chất sinh học có thể phòng chống bệnh hại và một số hoạt chất đã được chứng minh rất hữu ích và là dược liệu mới

- Chu trình tuần hoàn dinh dưỡng: Chu trình tuần hoàn dinh dưỡng là một quá trình rất quan trọng mà xảy ra liên tục để cân bằng dinh dưỡng cho cây và tái cấu trúc các thành phần trong hệ sinh thái Trong đó sự phân huỷ các sinh khối sinh vật

là một bước chính quan trọng

- Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng VSV nội sinh có vai trò quan trọng trong phân huỷ rác thải và của cây trồng, thông qua sự tương tác với các VSV hoại sinh và vì vậy tăng cường khả năng phân huỷ chất hữu cơ

14

- Cải tạo môi trường: VSV nội sinh có khả năng rất mạnh làm bẻ gãy/phân huỷ các hợp chất phức tạp; cải tạo môi trường loại trừ các chất gây ô nhiễm và chất thải trong môi trường

- Các nghiên cứu đã chứng minh nhiều VSV nội sinh có khả năng cố định N2, tổng hợp indole-3-acetic acid, tổng hợp kích thích tố auxin [62] sản sinh siderophore, ACC deaminase và phân giải phosphate khó tan

Tuy nhiên, việc xử lý thực vật hiệu quả trên đất nhiễm kim loại / kim loại nặng

đòi hỏi sự hiểu biết chi tiết về các tương tác phức tạp trong sinh quyển, bởi vì vi

sinh vật trong đất ảnh hưởng đến sinh khả dụng của kim loại [57] Ví dụ, vi khuẩn xúc tác các phản ứng oxy hóa khử dẫn đến sự thay đổi tính linh động của kim loại

và các ion của chúng, và vì vậy tăng hiệu suất làm giảm tính khả dụng của kim loại [61] Do đó, vi sinh vật đóng một vai trò quan trọng trong chu trình địa hóa của As thông qua quá trình biến đổi sinh hóa như sự khử, oxy hóa và metyl hóa

Từ đây mở ra hướng đi mới cho phương pháp xử lý ô nhiễm As trong đất bằng thực vật kết hợp vi sinh vật nhằm tăng cường hiệu quả tích lũy KLN vào sinh khối của thực vật, kết hợp sử dụng VSV nội sinh thúc đẩy tăng trưởng thực vật Đây là một hướng tiếp cận thân thiện với hệ sinh thái và có nhiều tiềm năng Việc lựa chọn các loài cây chịu được ô nhiễm cùng với sự trợ giúp của các vi khuẩn phân lập từ các loài cây bản địa, dễ sinh trưởng và thích nghi tốt xem như biện pháp thích hợp nhất để thực hiện công nghệ thực vật xử lí ô nhiễm

1.3 Tiềm năng công nghệ xử lý Asen bằng thực vật kết hợp vi sinh vật nội sinh

1.3.1 Xử lý Asen bằng cây dương xỉ

Trong khi một số loài thực vật có khả năng siêu tích tụ và khử độc với hàm lượng kim loại nặng đặc biệt cao, chỉ một số loài thực vật được biết đến là những

loài siêu tích tụ (Pteris vittata, Pteris criteca, Pteris longifolia, Pteris umbrosa,

Pitrogram macalomelanos, và Isatis cappadocica) Hai trong số những loài này, P.Vittata và I cappadocica được coi là những mô hình hiệu quả để giải mã các cơ

chế liên quan đến khả năng tích tụ và chống chịu As của thực vật [66]

15

Mặc dù nhiều loài thực vật đã được xác định là có khả năng kháng As nhưng chúng chỉ tích lũy As trong rễ, hiện tượng siêu tích tụ As chỉ được phát hiện gần

đây, ban đầu ở cây dương xỉ Pteris vittata (PV), đây không phải là loài thực vật đầu

tiên chống chịu được As, nó là loài siêu tích lũy As đầu tiên được phát hiện vào năm 1998 và được báo cáo trong tài liệu vào năm 2001 [46] Dương xỉ bụi Trung Quốc có nguồn gốc ở Trung Quốc, Nam Phi, Madagascar, Nhật Bản, Malaysia,

New Guinea và Úc PV được tìm thấy đang phát triển trên một khu vực ở trung tâm

Florida bị ô nhiễm chất bảo quản gỗ, arsenate-đồng-crom (CCA) [46] Trong số 14

loài thực vật được sàng lọc tại địa điểm này, chỉ có P vittata có nồng độ As cao

(5000 mg/kg) trong lá, tại khu vực đất có nồng độ As trung bình là 184 mg/kg Cây dương xỉ này có thể tích lũy tới 22630 mg As/kg trọng lượng khô của chồi (lá) Hơn nữa, hệ số tập trung sinh học, được định nghĩa là tỷ lệ giữa nồng độ As của lá và nồng độ As trong đất, lớn hơn 10 Cây dương xỉ này cũng sở hữu một đặc điểm khác điển hình của các loài siêu hấp thụ kim loại/á kim: một hệ thống vận chuyển hiệu quả cao kim loại/á kim từ rễ lên chồi, dẫn đến tỷ lệ lớn nồng độ As giữa chồi

và rễ [30] Những đặc điểm này trái ngược trực tiếp với những đặc điểm của nhiều cây kháng As khác, chúng đạt được khả năng chống chịu As chủ yếu thông qua việc giảm hấp thu As bằng cách ức chế hệ thống hấp thụ photphat/asenat có ái lực cao [79]

Việc phát hiện ra PV dẫn đến nhiều nghiên cứu và khám phá khác về thực vật siêu tích lũy As Sau khi phát hiện ra PV, Pityrogramma calomelanos cũng được

phát hiện từ một cuộc khảo sát thảm thực vật trên vùng đất bị ô nhiễm As ở Thái

Lan Ba loài dương xỉ khác thuộc chi Pteris là P cretica, P longifolia và P

umbrosa cũng được báo cáo cùng năm [79] [73]

Theo kết quả nghiên cứu về khả năng hấp thụ As của thực vật, chỉ có hai loài

dương xỉ P.vittata và P.calomelanos tại các khu vực mỏ quặng huyện Đại Từ, Thái Nguyên cho thấy khả năng tích lũy rất cao As Hàm lượng As trong thân và rễ của

P.vittata tương ứng là 5876,5±99,6 mg/kg và 2642,5±72,3 mg/kg Trong khi đó,

hàm lượng As trong thân của P.calomelanos là 2426,3±104,5 và trong rễ của nó là

16

2256±123,4 mg/kg Kết quả này thu được tương đồng với các kết quả nghiên cứu

trên thế giới về khả năng siêu tích luỹ As của hai loài dương xỉ P.vittata và

P.calomelanos [1]

Chuyển vị và chuyển hóa As ở cây dương xỉ

Có hai cơ chế chung để hấp thụ As trong thực vật: loại bỏ và tích tụ Một số thực vật có khả năng chịu được As vì chúng tránh hoặc ngăn cản sự hấp thụ trong khi các cây siêu tích tụ sẽ tích tụ As nhưng tìm cách giảm độc tính của nó bên trong

tế bào thực vật Thực vật có khả năng tránh hoặc loại trừ thường tích tụ As trong rễ của chúng trong khi thực vật siêu tích tụ có thể vận chuyển As vào sinh khối trên mặt đất Việc xác định As rất quan trọng trong thực vật siêu tích tụ vì nó quyết định

sự chuyển vị và phân bố của As trong thực vật As được cho là được hấp thụ bởi hệ thống hấp thụ phosphat, có nghĩa là As (V) và P đều cạnh tranh để cây hấp thụ Vì

As (III) không bị ảnh hưởng bởi sự cạnh tranh này, sẽ có nhiều As hấp thụ hơn khi

As ở dạng As (III) Tuy nhiên, As (III) không bền trong môi trường hiếu khí, có thể chuyển thành As (V) [29]

Asen được cung cấp dưới dạng As (V), nồng độ As (III) trong lá cao hơn (47–80%) so với trong rễ (8,3%) Do đó, As (V) được chuyển đổi thành As (III) trong quá trình chuyển vị từ rễ sang lá [15] Kết quả này phù hợp với một số nghiên cứu tiếp theo cho thấy khoảng 60-90% As trong lá ở trạng thái oxy hóa As (III) và phần còn lại là As (V) As chủ yếu hiện diện trong lá dưới dạng As (III) trong khi As (V) chủ yếu ở rễ [3] Theo Kertulis-Tartar và cộng sự báo cáo rằng As được lưu trữ dưới dạng As (III) trong lá cây dương xỉ nhưng được vận chuyển dưới dạng As (V) hoặc dưới dạng metyl hóa (hữu cơ) trong nhựa cây Nếu As được vận chuyển dưới dạng

As (V) trong PV, thì quá trình khử từ As (V) thành As (III) xảy ra trong thực vật

chủ yếu ở thân rễ và lá của cây [29]

Kết quả phân tích quá trình khử As xảy ra 1 ngày sau khi tiếp xúc với As cho thấy rằng quá trình khử asen không diễn ra ngay lập tức ở các cây trồng siêu tích tụ

As Nhưng sau 15 ngày, 83% As tồn tại dưới dạng As (III) trong lá của PV, bất kể

Một nghiên cứu đã được thực hiện để xác định đặc điểm của As trong rễ và

nhựa cây của PV sau khi chúng tiếp xúc với các dạng khác nhau của As (As (V), As

(III), MMA, DMA) trong 2-3 ngày trong hệ thống thủy canh [28] Khi cây dương

xỉ được xử lý MMA, DMA đã được phát hiện trong cả dịch tiết ra từ rễ và nhựa cây, cho thấy rằng quá trình metyl hóa có thể đã diễn ra trong cây Việc chuyển đổi DMA hoặc MMA thành As (III) hoặc As (V) cũng được quan sát thấy Dương xỉ hấp thụ nhiều As với MMA hơn so với As (III), mặc dù có sự chuyển vị và tích lũy sinh học cao hơn trong các lá được xử lý bằng As (III), cũng báo cáo sự chuyển vị

As (III) nhanh hơn As (V) trong PV Sự chuyển vị As (V) thấp hơn có thể là do sự

cạnh tranh giữa As (V) và phốt pho (P) để cây hấp thụ [29]

Lomby và công sự đã nghiên cứu sự phân bố của As trong cây dương xỉ và báo cáo rằng phần lớn As được tìm thấy trong lá (96% tổng As) Sử dụng phương pháp quang phổ tia X phân tán năng lượng (EDXA) cho thấy, As được phân chia chủ yếu thành các tế bào biểu bì trên, dưới và As có lẽ đã được lưu trữ trong không bào Dạng phân bố của kali (K) tương tự như của As, trong khi các nguyên tố khác (canxi (Ca), clorua (Cl), magiê (Mg), phốt pho (P) và lưu huỳnh (S) có sự phân bố khác [45]

18

vật bao gồm sự phát triển của thực vật nhờ các chất chuyển hóa của vi khuẩn, chẳng hạn như tăng cường tổng hợp kích thích tố sinh trưởng thực vật auxin (IAA), tăng hàm lượng các chất khoáng, giúp cố định đạm sinh học, phân giải lân khó tan, hoặc gián tiếp thông qua tăng năng suất và bảo vệ cây trồng, kiểm soát ô nhiễm & phân hủy sinh học [36], [6], [47] Ngoài ra, chúng còn có thể giúp loại bỏ các chất gây ô nhiễm [59] Trong một số trường hợp chúng có thể đẩy mạnh tốc độ nẩy mầm của hạt, thúc đẩy sự hình thành cây con trong điều kiện bất lợi [18]

Vi khuẩn vùng rễ cư trú ở vùng lân cận của rễ tăng tốc độ di chuyển kim loại

và khả năng tiếp nhận của cây bằng nhiều quá trình khác nhau, bao gồm trao đổi oxy hóa khử và giải phóng proton và axit hữu cơ, trong khi vi sinh vật nội sinh cư trú trong các mô bên trong của cây và thúc đẩy sự phát triển của cây thông qua các

cơ chế như quá trình hòa tan photphat, sản sinh IAA và sản xuất siderophore, hoặc cung cấp các vitamin thiết yếu cho thực vật Ngoài khả năng chống chịu với stress kim loại nặng, VSV liên kết với thực vật có thể hoạt động như tác nhân kiểm soát sinh học chống lại một số sinh vật gây bệnh và đảm bảo cố định nitơ và sản xuất các chất điều hòa sinh trưởng [58]

So với vi khuẩn vùng rễ, vi sinh vật nội sinh có lợi hơn trong việc xử lý vì các đặc điểm độc đáo của chúng là khu trú bên trong cây Cho đến nay, nhiều loài vi sinh vật nội sinh thuộc các chi khác nhau đã được phân lập và xác định Một số vi sinh vật nội sinh đã được báo cáo là đóng góp vào sự phát triển của thực vật và thể hiện khả năng chống chịu kim loại đối với các kim loại khác nhau Khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật của những vi khuẩn này có tương quan với việc sản xuất IAA, phosphatase, siderophore, ACC (1-amino cyclopropane-1-Carboxylate) hoạt động deaminase, v.v [70]

Trong xử lý ô nhiễm As, hoạt động của vi sinh vật nội sinh trong thực vật có thể tác động đến quá trình hấp phụ, tích tụ và giải hấp As, khả dụng sinh học, khả năng di chuyển và chuyển dịch của thực vật trong đất bằng cách làm thay đổi các đặc tính hóa học của As trong bản thân cây chủ [33] Các vi sinh vật nội sinh có thể

19

chuyển As (III) và As (V) sang các dạng ít độc hơn và do đó có khả năng chuyển hóa hoặc cố định As trong hệ thống đất-thực vật [68] Sự biến đổi sinh học của vi sinh vật nội sinh trong cây ký chủ đóng một vai trò quan trọng trong hoạt động sinh hóa của asen và là chìa khóa trong các nghiên cứu đánh giá rủi ro và xử lý [12] Các nghiên cứu khác nhau đã phân lập và báo cáo các loài vi khuẩn khử độc

As (III) trong môi trường hiếu khí nghiêm ngặt và kỵ khí As (V) khác nhau từ các

vị trí bị ô nhiễm As [68] Các vi khuẩn như Thermus thermophiles, T aquaticus, P

arsenitoxidans, Crysiogenes arsenates, Bacillus arsenic oselenatis, Desulfutomaculum auripigmentu, Geospirillum barnesi và Geospirillum arsenophilus có khả năng tổng hợp arsenite oxidase và oxy hóa As (III) [54] Tương

tự, vi sinh vật cũng có thể khử As (V) thành As (III) thông qua quá trình hòa tan Trong quá trình này, vi sinh vật nội sinh sử dụng As (V) làm chất nhận electron cuối cùng cho quá trình hô hấp kỵ khí Các vi khuẩn có khả năng khử As (V) bao

gồm: Bacillus arsenic, Geospirillum arsenophilus, G barnesi, Crysiogenes

arsenatis, Sulfurospirillum barnesii, Sulfurospirillum arsenophilum, Oselenatis và Desulfutomaculum auripigmentu [72]

Một số nghiên cứu mới cũng đã báo cáo sự gia tăng hoặc giảm khả năng hấp thụ asen của thực vật trong đất sau khi cấy vi sinh vật [39] Sự tăng hoặc giảm khả năng này với As thường được cho là do quá trình chuyển hóa oxy hóa khử của vi sinh vật hoặc vi sinh vật nội sinh đối với As giữa As (V) và As (III) trong hệ thực vật -đất khác nhau rất nhiều về tính sẵn có của chúng: As (V) ít ứng dụng sinh học hơn As (III) vì As (V) được các thành phần trong đất giữ lại mạnh mẽ hơn As (III) [34] Stazi và cộng sự đã báo cáo rằng vi sinh vật đất và vi sinh vật nội sinh trong thực vật siêu tích lũy làm tăng sinh khả dụng của asen bằng cách hỗ trợ tích tụ asen, giải phóng / chuyển đổi sang các dạng As khác di động hơn hoặc hòa tan trong nước (As III) [67] Ví dụ, ở dương xỉ, (As V) trong đất được chuyển hóa tích lũy thành (As III) trong lá [33]

Tuy nhiên, việc phân lập vi khuẩn nội sinh từ thực vật được trồng trên đất giàu kim loại và đánh giá vai trò của chúng đối với sự hấp thụ kim loại của thực vật

20

chưa được chú ý nhiều [70] Vi khuẩn nội sinh giúp xúc tiến sự sinh trưởng của cây chủ, tăng cường sự sinh trưởng của cây bằng cách tổng hợp kích thích tố auxin (IAA) [62] có thể giúp loại bỏ các chất gây ô nhiễm làm tăng hàm lượng các chất khoáng, tăng khả năng kháng bệnh của cây, giúp cố định đạm sinh học, giảm tính mẫn cảm với mầm bệnh và sự thay đổi của thời tiết gây tổn hại cho cây

Tiềm năng công nghệ xử lý ô nhiễm Asen bằng vi khuẩn nội sinh trên cây dương xỉ

Bên cạnh các đặc điểm thúc đẩy tăng trưởng thực vật, vi khuẩn nội sinh thể hiện khả năng chống chịu áp lực kim loại cao, giúp giảm bớt độc tính của kim loại đối với thực vật và cải thiện sự phát triển của cây trồng [70] Tuy nhiên cho đến nay

đã có một số ít nghiên cứu tập trung vào vi khuẩn nội sinh từ P Vittata phát triển

trong môi trường đất sạch Các nghiên cứu đã chỉ ra thành phần và sự đa dạng của

vi sinh vật bị ảnh hưởng bởi nguồn ô nhiễm As trong đất Hơn nữa, vi khuẩn nội sinh từ các chất siêu tích tụ phát triển trong đất bị ô nhiễm có thể chịu đựng được kim loại tốt hơn so với những sinh vật từ đất sạch Zhu và cộng sự đã phát hiện ra

rằng khả năng khử As(V) và oxy hóa As(III) của PV có liên quan đến khả năng chịu

As của chúng [80] Tuy nhiên, số lượng nghiên cứu trên PV còn hạn chế Ngoài ra,

vi khuẩn ở vùng rễ của PV đã được nghiên cứu về khả năng kháng As và biến đổi

As của chúng, một số vi khuẩn ở vùng rễ cho thấy chức năng kép là oxy hóa As (III) và khử As (V) [32] Tuy nhiên, có rất ít nghiên cứu về VSV nội sinh kết hợp

với PV và vai trò của chúng trong khả năng chịu đựng và biến đổi As

Với những ưu điểm nổi trội của công nghệ xử lý ô nhiễm bằng vi sinh vật nội sinh trong thực vật và khả năng hấp thụ As trên cây dương xỉ, từ đây mở ra con đường mới cho nghiên cứu kết hợp vi khuẩn nội sinh trên cây dương xỉ nhằm tăng khả năng hấp thụ As, giảm thiểu ô nhiễm KLN trong đất Nghiên cứu này được đánh giá là hướng đi mới, tối ưu cũng như góp phần phát triển một cách bền vững, hiệu quả

21

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

 Đối tượng: vi khuẩn nội sinh phân lập trên hai loài dương xỉ Pteris vittata

(PV) và Pityrogramma calomelanos (mọc tại khu vực huyện Đại Từ, tỉnh Thái

Hình 2 1 Hình thái một số mẫu dương xỉ trong quá trình thu thập

 Phạm vi nghiên cứu: 3 khu vực xung quanh địa điểm mỏ đa kim Núi Pháo, huyện Đại Từ, tỉnh Thái Nguyên

- Vị trí lấy mẫu 1 (S1): Quốc lộ 37, xóm 2, xã Tân Lĩnh, huyện Đại Từ, tỉnh Thái Nguyên, Việt Nam; 21o38'54 "B - 105o41'4" Đ, độ cao: 50m

- Vị trí lấy mẫu 2 (S2): xóm 4, xã Hà Thượng, huyện Đại Từ, Thái Nguyên, Việt Nam; 21o38'15 "B - 105o40'35" Đ; độ cao: 90m

- Các loại cao: cao thịt, cao nấm men, cao malt, peptone… của hãng Merck (Đức)

2.2.2 Thiết bị

Kính hiển vi quang học Olympius (Model CHD, Nhật Bản) Kính hiển vi điện

tử quét S-4800 (Đức) Máy đo pH (Mettler Toledo, Thụy Sỹ) Cân điện tử (Mettler Toledo, Thụy Sỹ) Nồi hấp khử trùng (ALP M-40DP, Nhật Bản) Tủ ấm (Trung Quốc) Lò vi sóng (Hàn Quốc) Máy li tâm (Đức) Tủ lạnh sâu (Sanyo, Nhật Bản) Máy lắc ổn nhiệt (Hàn Quốc) Máy PCR (Applied Biosytem, Mỹ) Bộ điện di agarose Máy soi gen (Bio-Rad, Mỹ) Kính hiển vi huỳnh quang Axioplan 2 (CarlZeiss, Germany), camera Optika B5 (Italia), máy cắt lát mỏng Microtome (Germany)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp lấy mẫu đất và cây tại khu vực nghiên cứu

Mẫu đất tại các khu vực nghiên cứu được lấy ở tầng mặt có độ sâu từ 0 - 20cm, trên diện tích đất sau khai thác Các mẫu đất sau khi lấy được đựng vào các túi riêng, có ghi kí hiệu ngoài bao bì

23

Thực vật được chọn lấy mẫu là cât dương xỉ phát triển ưu thế tại các khu vực nghiên cứu Các mẫu cây được đựng vào các túi riêng và ghi kí hiệu tương ứng với các mẫu đất tại các khu vực đó

2.3.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn nội sinh

Lấy mẫu: Các mẫu cây dương xỉ được lấy và lưu giữ trong túi nilon riêng rẽ Mỗi mẫu cây được đựng trong túi nilon sạch có ghi địa điểm và đặc điểm lấy mẫu Mẫu được bảo quản trong tủ lạnh ở 4oC cho đến khi xử lí và phân tích trong vòng 7 ngày

Xử lí bề mặt: Mẫu cây dương xỉ được chia thành các phần riêng rẽ (rễ, cành hoặc lá) được rửa sạch bề mặt Sau đó, mẫu lá được cắt thành các mẩu nhỏ (kích thước 1 x 1 cm), mẫu cành hoặc rễ được cắt thành các đoạn dài 1 cm Các mẫu đã cắt được ngâm ngập trong dung dịch 5 % sodium hypochlorite (NaClO) trong 1 phút, tiếp đó được xử lý với cồn 70 % trong 5 phút rồi được rửa bằng nước cất khử trùng 5 lần [64]

Phân lập: Các mẫu thực vật sạch này được giã nhỏ và ủ trong bình Erlenmeyer

250 ml đựng 100ml môi trường lỏng có mặt 2 mM As và bổ sung chất kháng nấm hoặc chất kháng khuẩn Các chủng được nuôi lắc 200 rpm trong 2 tuần ở 27oC trong bóng tối Để phân lập được các chủng vi khuẩn nội sinh, cần pha loãng ở các nồng

độ thích hợp các mẫu nhân nuôi và trang trên môi trường đĩa thạch, ủ trong 5 ngày

ở 27oC Các khuẩn lạc có hình thái khác nhau được chọn từ các đĩa và các chủng phân lập thuần khiết được lưu trữ trong glycerol 30% (w / v) tại – 80oC [41]

2.3.3 Xác định số lượng vi khuẩn bằng phương pháp pha loãng tới hạn

Mẫu được pha loãng đến nồng độ pha loãng tới hạn để xác định số lượng vi sinh vật có trong mẫu Sau khi nuôi cấy vi khuẩn, các đĩa Petri được đưa vào tủ cấy

ở nhiệt độ thích hợp trong 48 giờ Sau đó đếm số khuẩn lạc hình thành trên bề mặt thạch

Số lượng vi khuẩn trong mẫu ban đầu được tính bằng đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) trên ml hoặc gam (CFU/ml hoặc CFU/g) theo công thức sau:

24

N= ∑

( )

Trong đó:

∑ : tổng số khuẩn lạc đếm được trên đĩa

a: số đĩa đếm được ở độ pha loãng đầu tiên

b: số đĩa đếm được ở độ pha loãng thứ hai

f1: số pha của pha tốt nhất của lần đầu tiên

V: thể tích chất pha loãng cấy vào đĩa (ml)

2.3.4 Phương pháp kiểm tra sự chống chịu Asenit và Asenat ở vi khuẩn

Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) được định nghĩa là nồng độ thấp nhất của chất kháng khuẩn sẽ ức chế sự phát triển có thể nhìn thấy của vi sinh vật sau khi ủ qua đêm và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) là nồng độ thấp nhất của chất kháng khuẩn sẽ ngăn cản sự phát triển của vi sinh vật sau khi nuôi cấy phụ trên môi trường không có kháng sinh [11]

Xác định khả năng kháng As bằng phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu MBC

- Xác định nồng độ chất ức chế tối thiểu (MIC) của As với vi sinh vật

Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của As được đánh giá để xác định khả năng kháng lại As của các chủng phân lập Các chủng phân lập được nuôi cấy trong môi trường LB mới chuẩn bị trong 48 giờ ở 300C và lắc 150 vòng /phút (với Asenat);

200 vòng/ phút (vói Asenit) Sau đó, 100 µl dung dịch nuôi vi khuẩn được cấy vào môi trường LB một lần nữa, bổ sung với các nồng độ khác nhau của As (40-320 mM) dưới dạng dinatri hydro Asenat (Na2HAsO4.7H2O) và nuôi cấy trong 72 giờ ở

300C, lắc ở tốc độ như ban đầu [11] Sự phát triển của vi sinh vật được ghi lại bằng máy quang phổ UV-Visible ở bước sóng 600 nm

- Xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) của As đối với vi sinh vật

2.3.5 Phương pháp xác định khả năng sinh IAA của các chủng phân lập

Các chủng phân lập được nuôi cấy trong 5 ngày trong môi trường phân lập R2A chứa 0,5 mg/ml tryptophan, tiền chất của IAA Sau 2 và 5 ngày ủ, 1 ml huyền phù được trộn với 2 ml thuốc thử Salkowski và ủ ở nhiệt độ phòng trong 20 phút để kiểm tra sự xuất hiện của màu hồng, cho thấy sự hiện diện của IAA [16], [17.] Hàm lượng IAA được xác định bằng cách đo cường độ hấp thu màu (OD) ở bước sóng 530 nm Dựa vào phương trình đường chuẩn (y = 47,217*x + 0,3315) và giá trị OD của mẫu tính ra hàm lượng IAA trong các mẫu vi khuẩn

2.3.6 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái và tế bào

2.3.6.1 Quan sát hình thái khuẩn lạc

Quan sát hình dạng khuẩn lạc, các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường LB ở nhiệt độ 28 - 30o

C Sau 24-48 giờ, lấy ra và quan sát màu sắc, bề mặt, kích thước và kết cấu khuẩn lạc

2.3.6.2 Phương pháp nhuộm Gram

Các chủng vi khuẩn được nuôi trong môi trường LB ở 37oC trên máy lắc với tốc độ 200 vòng / phút trong 20-24 giờ Vi khuẩn trong dung dịch nuôi cấy được cố định trên lam kính ngọn lửa đèn cồn bằng phương pháp nhuộm Gram và quan sát hình dạng dưới kính hiển vi quang học Tiếp tục:

- Lấy một đầu của đầu dò đưa vào phiến kính để làm phiến kính vi khuẩn

- Cố định vết bôi bằng dung dịch tím Gentian Giữ trong 1-2 phút

- Lấy hết thuốc nhuộm ra ngâm trong cồn 95oC trong 30 - 40 giây

- Rửa sạch với nước

26

- Lau khô vết bẩn

- Nhuộm bổ sung bằng fusin 1% trong 1-2 phút

- Rửa sạch bằng nước, đợi khô rồi quan sát dưới kính hiển vi

- Nếu chủng Gram (+) có màu tím thì chủng Gram (-) có màu hồng

2.3.6.3 Cấu trúc của bề mặt tế bào vi khuẩn được quan sát dưới kính hiển

vi điện tử

Hình dạng và cấu trúc của bề mặt tế bào vi khuẩn được quan sát dưới kính hiển vi điện tử (SEM) tại Viện Vật liệu, Viện Hàn Lâm KH và CN Việt Nam

2.3.6.4 Khả năng sinh enzyme ngoại bào

Vi khuẩn được nuôi cấy trên thạch đĩa ISP2 Sau khi sinh trưởng hoàn toàn, phía trên các đĩa petri có chứa môi trường Gause I có bổ sung 1% các cơ chất cụ thể như: tinh bột để xác định hoạt độ amylase, casein để xác định hoạt độ protease, chitin để xác định hoạt độ chitosanase, CMC (carboxyl methylcellulose) để xác định hoạt tính cellulose Sau 5 ngày nuôi cấy ở 28oC, xác định sinh tổng hợp các amylase bằng thuốc thử Lugol, protease bằng thuốc thử acid trichloroacetic, chitosanase với 0,5% congo đỏ Sản xuất enzyme được xác định bằng giá trị D-d (mm), trong đó D

là đường kính của vòng phân hủy cơ chất và d là đường kính khuẩn+ lạc [52]

2.3.6.5 Khả năng sử dụng các nguồn carbon

Vi khuẩn được nuôi trên môi trường ISP9có bổ sung 1% các nguồn đường khác như D-Glucose, L-Arabinose, D-Xylose, D-Manitolse, D-Fructose, D-Cellulose, D-Rafinose, D Asparagine, và Sucrose Khử trùng ống nghiệm chứa môi trường thạch theo phương pháp Pasteur Kiểm tra sự tăng trưởng sau 24-48 giờ ở 28-30oC Môi trường có glucose được coi là đối chứng dương tính, môi trường không có đường được coi là đối chứng âm tính [77]

2.3.6.6 Xác định độ pH, nhiệt độ và nồng độ muối:

Để xác định độ pH tối ưu cho sự phát triển của chủng phân lập 0,5 ml chủng

vi khuẩn được cấy vào 10 ml môi trường LB được điều chỉnh pH trong khoảng

3-27

12, ở 30oC, lắc 180 vòng/ phút trong 24 giờ Kiểm tra khả năng sinh trưởng của vi khuẩn bằng đo mật độ quang học ở bước sóng 600 nm bằng máy quang phổ (Evolution 201, ThermoScientific) [50] Tất cả các thí nghiệm được thực hiện lặp

Để xác định nồng độ muối tối ưu cho sự phát triển của dò chủng phân lập, 10

ml môi trường LB được bổ sung một trong các nồng độ muối ở 0,1; 0,5: 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 5,0; 10,0 (%) NaCl được cấy với 0,5 ml dịch giống, lắc 180 vòng/phút Sau thời gian nuôi cấy 24 giờ, độ hấp thụ được đo ở bước sóng 600 nm bằng máy quang phổ[50] Các thí nghiệm được lặp lại ba lần

2.3.7 Phân loại chủng vi khuẩn theo phương pháp 16S rDNA

2.3.7.1 Tách tổng số DNA của vi khuẩn

Trong nghiên cứu này, DNA tổng số được chiết xuất từ các mẫu bằng cách

sử dụng kit chiết xuất axit nucleic RIO-prep trên thiết bị Fermentas Bao gồm các bước sau:

Bước 1: Thu sinh khối và bổ sung TE 1X, sau đó ly tâm ở tốc độ 8000 vòng / phút trong 5 phút, lặp lại 3 lần Sau đó giữ nguyên kết tủa và 100 µl dung dịch

Bước 2: Thêm 300 µl dịch ly giải, ủ ở 65oC trong 7 phút

Bước 3: Thêm 400 µl kết tủa, sau đó ly tâm với tốc độ 13000 vòng / phút trong 5 phút, loại bỏ dung dịch

Bước 4: Cho 500 µl rửa 3 (lật đều), ly tâm với tốc độ 13000 vòng / phút trong

2 phút, gạn bỏ dung dịch

Bước 5: Thêm 200 µl rửa 4 vòng, sau đó ly tâm với tốc độ 12000 vòng / phút trong 2 phút, loại bỏ dung dịch Sau đó, làm khô bằng máy sấy quay

28

Bước 6: Thêm 100 µl rRNA ủ ở 55oC trong 10 phút, sau đó tạo ảo giác ở

13000 vòng / phút trong 2 phút Sau đó, thu thập bản dịch

Quá trình tách chiết DNA tổng số được thực hiện với các bước chính sau (hình

30 phút, lấy lược ra và cho gel vào bồn tắm điện di Đổ dung dịch đệm 1X TAE vào

bể sao cho dung dịch ngập 1-2 mm so với bề mặt gel

- Tra mẫu ADN: Lấy khoảng 5 - 10 mẫu ADN trộn đều với 2 dung dịch đệm tải màu nhuộm (chất này có tác dụng tạo màu cho mẫu quan sát và giúp mẫu ADN lắng xuống đáy giếng trước khi chạy điện di) và đưa vào các giếng nhỏ trong gel

Sử dụng các chất đánh dấu tỷ lệ chuẩn 100 bp hoặc 1kb tùy thuộc vào kích thước đoạn hạt nhân làm chỉ thị phân tử

29

- Chạy điện di ở điện áp 100V trong 30 phút DNA di chuyển từ cực âm sang cực dương Quan sát sự chuyển động của màu xanh lam của bromophenol để biết khi nào thì dừng điện di

- Nhuộm bằng EtBr: nhẹ nhàng lấy gel ra khỏi khuôn và ngâm trong dung dịch EtBr nồng độ 2 µl / mL khoảng 10 phút trên máy lắc nhẹ Sau đó lấy gel ra, rửa sạch với nước, quan sát và chụp ảnh dưới tia cực tím của máy soi gel (Bio-Rad)

Trong nghiên cứu này, DNA tổng số được thực hiện tách chiết từ sinh khối vi sinh vật bằng bộ kit chiết xuất axit nucleic RIO-prep của hãng Fermentas Các bước thực hiện theo yêu cầu của đơn vị sản xuất Sản phẩm DNA tổng số được tiến hành điện di kiểm tra sản phẩm trên gel agarose 1%

2.3.7.3 Nhân gen vi khuẩn đã chọn bằng phương pháp PCR

Thành phần và phản ứng PCR sử dụng cặp trình tự 27F và 1492R được trình bày trong bảng 2.1 và bảng 2.2

Bảng 2 1 Trình tự đoạn mồi được sử dụng trong phản ứng PCR khuếch đại gen

30

Hình 2 3 Chu trình nhiệt trong kỹ thuật PCR

Chu trình nhiệt trong kỹ thuật PCR được thực hiện thông qua 3 giai đoạn: Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% Kích thước của đoạn DNA thu được sau phản ứng PCR được so sánh với thang chuẩn DNA (Fermentas) Sản phẩm PCR được làm sạch bằng bộ công cụ PureLinkTM - DNA Purification (Invitrogen) và giải trình tự tự động trên Máy phân tích gen ABI PRISM®3100-Avant (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) tại Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Sự tương đồng của trình tự 16S rDNA của các chủng vi khuẩn được so sánh với trình tự 16S rDNA trên Ngân hàng gen Sự giống nhau về di truyền của các chủng được xây dựng bằng phần mềm ClustalX 2.0.11

2.3.8 Phương pháp phân tích và xử lý dữ liệu

- Hàm lượng các KLN trong đất được so sánh với QCVN 03:2008/BTNMT – Quy chẩn kỹ thuật quốc gia về giới hạn cho phép của kim loại nặng trong đất

- Các số liệu thí nghiệm và phân tích được xử lý trên phần mềm Micosoft Excel

31

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1 Khảo sát địa điểm lấy mẫu:

Mẫu cây dương xỉ nghiên cứu được thu tại 3 vị trí (xóm 2, xóm 4, xóm 11) xung quanh mỏ quặng đa kim Núi Pháo, xã Hà Thượng, huyện Đại Từ, tỉnh Thái Nguyên Tổng số mẫu cây dương xỉ lấy tại 3 địa điểm là 20 mẫu Các mẫu đất được lấy xung quanh vùng rễ, cách mặt đất 10 cm

Bảng 3.1 Vị trí địa điểm lấy mẫu