Nghiên cứu và phát triển cấu trúc vi lưu tách tế bào dựa trên Điện di Ứng dụng trong y sinhNghiên cứu và phát triển cấu trúc vi lưu tách tế bào dựa trên Điện di Ứng dụng trong y sinh
GIỚI THIỆU VỀ CÔNG NGHỆ VI LỎNG
Giới thiệu về công nghệ vi lỏng
Thuật ngữ microfluidic (vi lỏng) được định nghĩa là việc xử lý và phân tích chất lỏng ở thang đo micromet Microfluidic liên quan đến tất cả các công nghệ có khả năng điều khiển các dòng chất lỏng có thể tích micro hoặc nano lit thông qua các kênh có kích thước micromet trên hệ thống vi cơ điện tử Hình 1 dưới đây cho biết hình ảnh một số kênh dẫn vi lỏng [1]
Hình 1 Hình ảnh một số kênh dẫn vi lỏng khác nhau
Hệ thống kênh vi lỏng bao gồm ba thành phần chính là lối vào (Inlets), lối ra
(Outlets) và buồng phản ứng Hệ thống này có thể được sử dụng cho một loạt ứng dụng như dẫn thuốc, in ấn và đặc biệt là ứng dụng trong lĩnh vực sinh học phân tử như phân tích enzyme, phân tích DNA và proteomic Chất lỏng thường được sử dụng trong các thiết bị vi lưu bao gồm toàn bộ mẫu máu, tế bào vi khuẩn, protein, DNA, hóa chất dùng cho các phản ứng sinh hóa.v.v
Các hệ thống vi lỏng gồm rất nhiều loại khác nhau tương ứng với nhiều ứng dụng khác nhau như: những ứng dụng trong ngành công nghiệp in phun, trong pin nhiên liệu lỏng, nghiên cứu hóa sinh, tổng hợp hóa chất, tách chiết DNA ra khỏi tế bào, phân tích di truyền, phân tích PCR (Polymerase Chain Reaction – Phản ứng chuỗi trùng hợp), bào chế thuốc.v.v Việc điều khiển dòng chảy của chất lỏng ở những kích thước siêu nhỏ phụ thuộc nhiều yếu tố khác nhau như: Sức căng bề mặt của chất lỏng, sự mất mát năng lượng, sức cản chất lỏng, lưu lượng dòng chảy,v.v
Cùng với sự phát triển mạnh mẽ của thiết bị vi lỏng, nhiều loại vật liệu khác nhau đã được nghiên cứu và sử dụng cho mục đích chế tạo hệ vi lỏng, trong đó có các vật liệu được sử dụng phổ biến như silicon, thủy tinh, và các vật liệu Polymers Polymers hay thiết bị vi lưu dựa trên polymer đã được giới thiệu vài năm sau thiết bị silicon/glass Sự đa dạng của các loại polymer mang lại sự linh hoạt cao trong việc lựa chọn vật liệu phù hợp với các đặc tính cụ thể Polymer dễ tiếp cận và không tốn kém so với vật liệu vô cơ
Theo tính chất vật lý, polymer có thể được phân loại thành chất đàn hồi (elastomers),
9 nhựa nhiệt dẻo (thermoplastic), nhựa nhiệt rắn (thermosets) Một số vật liệu polymer đang được sử dụng phổ biến như PDMS, Poly-methylmethacrylate (PMMA), Poly- ethylene glycol diacrylate (PEGDA).
Một số kỹ thuật tách vi lỏng
Tách hạt là một kĩ thuật chiết xuất hay thu thập các hạt mục tiêu từ dung dịch hoặc phân lập chúng với nhau dựa trên sự khác biệt về tính chất vật lý và tính chất hóa học của hạt hoặc dựa vào sự khác nhau về tính chất của hạt và dung dịch chứa hạt đó [2], [3], [4]
Lọc là phương pháp tách hạt được sử dụng hiệu quả và phổ biến dựa trên sự khác biệt về kích thước hạt bằng cách sử dụng môi trường xốp làm bộ lọc Môi trường xốp có thể hiểu là môi trường chứa các chất xốp, các chất này được cấu tạo từ nhiều lỗ nhỏ gộp thành Bằng cách này, các hạt có kích thước nhỏ hơn kích thước lỗ xốp cũng như chất lỏng mang các hạt đó có thể đi qua bộ lọc trong khi những hạt có kích thước lớn hơn kích thước lỗ xốp sẽ bị giữ lại Mặc dù, lọc hiệu quả nhưng khó áp dụng cho vi điều khiển vì bộ lọc có thể bị chặn và giảm thông lượng Lọc cũng đòi hỏi một hệ thống lọc siêu phức tạp hơn để tránh vấn đề này Những nhược điểm này hạn chế việc sử dụng lọc cho các hệ thống lab-on-a-chip (LOC) [5], [6]
Acoustophoresis (nhíp âm thanh), thuật ngữ acoustophoresis bắt nguồn từ hai phần: acousto, chỉ đến sóng âm, và phoresis, có nghĩa là di cư là phương pháp tách dựa trên sóng âm Các hạt có thể được tạo ra để di chuyển về phía các nút áp suất âm hoặc các antinode áp suất trong trường âm đứng bằng lực bức xạ âm Các chuyển động phụ thuộc vào mật độ của các hạt và có thể đạt được chuyển động chính xác bằng cách kiểm soát vị trí của các nút này Tuy nhiên, độ chính xác và thông lượng hạn chế việc áp dụng nhíp âm thanh cho hệ thống LOC [7], [8]
Sắc ký là một kỹ thuật phân tách mạnh mẽ được áp dụng rộng rãi trong các nền tảng vi lỏng, trong đó pha động mang các hạt mục tiêu và đi qua pha tĩnh Các hạt khác nhau trong hỗn hợp di chuyển với tốc độ khác nhau, dẫn đến sự phân tách của chúng
Tuy nhiên, sắc ký trong chip vi lỏng đòi hỏi các cấu trúc phức tạp, bao gồm van, máy bơm và các pha tĩnh, do đó làm tăng độ phức tạp chế tạo của nó Yêu cầu ghi nhãn mẫu và đặc biệt là mất mẫu do độ bám dính không đặc hiệu với diện tích bề mặt lớn của pha tĩnh ngăn cản ứng dụng rộng rãi của nó [9], [10] Điện di là kỹ thuật tách các hạt tích điện trong huyền phù dựa trên điện trường đều và được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu axit deoxyribonucleic (DNA), axit ribonucleic và protein Tuy nhiên, nó chỉ có sẵn cho các hạt tích điện, hạn chế ứng dụng tiềm năng của nó [11], [12]
So với các phương pháp phân tách khác, điện di (DEP) có ưu điểm là độ ổn định và độ nhạy cao, chi phí thấp và đặc biệt là, khả năng dễ dàng sửa đổi các nhóm chức
10 năng hóa học để tạo điều kiện cho việc sửa đổi bề mặt, đó là lý do tại sao nó được áp dụng rộng rãi trong vi lỏng để chẩn đoán phân tử sinh học cũng như nghiên cứu y học và polymer
CƠ SỞ LÝ THUYẾT
Điện di
Điện di (DEP) là phương pháp được sử dụng để tách các hạt lơ lửng khỏi huyền phù hoặc chất lỏng mang bằng cách tạo ra lực phân cực trong điện trường không đồng nhất (NUEF) Ngược lại với điện di, các hạt trong DEP không mang điện tích nhưng chúng phải có khả năng phân cực Những hạt này tiếp xúc với điện trường và trở nên phân cực tạo thành các lưỡng cực điện; lực tác dụng lên những lưỡng cực này được gọi là lực DEP (FDEP) FDEP bằng 0 N (Hình 2A) khi hạt ở trong điện trường đều, trong khi ở NUEF, lực là dương (pDEP) hoặc âm (nDEP) làm cho hạt chuyển động theo một hướng nhất định tùy thuộc vào độ phân cực của nó (Hình 2B) [13]
Hình 2 Sự khác nhau của lực điện di trong môi trường điện trường đều và điện trường không đồng nhất (NUEF)
DEP có thể chia thành hai loại:
• Điện cực (eDEP): Điện cực là một phần tử dẫn điện được sử dụng để tạo tiếp xúc điện của một mạch điện với môi trường cụ thể nào đó, từ đó thực hiện trao đổi điện tử với môi trường Dưới sự tác dụng của điện trường hạt bị phân cực và di chuyển bằng lực hút (pDEP) và lực đẩy (nDEP) dọc theo đường sức và được ưu tiên ứng dụng [14], [15]
• Chất cách điện (iDEP): Chất cách điện là vật liệu không dẫn điện Chúng chủ yếu được chia thành 4 nhóm: các loại men, sơn cách điện; các chất dẻo tổng hợp: cao su, nhựa tổng hợp; chất vô cơ: xi măng, mica, sợi thuỷ tinh; chất hữu cơ thiên nhiên: giấy, vải, lụa Vật liệu cách điện có thể là thể khí, thể lỏng, hoặc thể rắn Mặc dù, iDEP có độ hiệu quả cao nhưng có hiện tượng tích tụ nhiệt và buộc phải sử dụng điện áp cao gây nguy hiểm nên không được ưu tiên ứng dụng [14], [15]
12 Các trường có tần số cụ thể điều khiển hạt với độ chọn lọc cao Điều này là do độ phân cực tương đối của hạt và môi trường phụ thuộc vào tần số Do đó bằng cách thay đổi tần số, có thể chuyển đổi giữa pDEP và nDEP
Trong đó các hạt có những tính chất sau:
• Hằng số điện môi: tỷ số giữa độ thấm điện của vật liệu và độ thấm điện của môi trường Đại diện cho mức độ phân cực của vật liệu bởi điện trường
• Độ dẫn: khả năng cho dòng điện chạy qua phụ thuộc vào số lượng và khả năng di chuyển của hạt mang điện trong điện trường
• Độ phân cực: mức độ mà các điện tích trong vật liệu bị dịch chuyển bởi điện trường Nó ảnh hưởng đến lực điện di tác dụng lên hạt
• Điện dung màng: khả năng lưu trữ điện tích của màng tế bào phụ thuộc vào độ dày và thành phần của màng
NUEF được cấp nguồn bằng dòng điện một chiều (DC) hoặc dòng điện xoay chiều (AC) và được tạo ra bằng đế hình trụ cách điện kết hợp với kênh thẳng và dẹt
Trong kênh vi lỏng còn được gọi là AC/DC-iDEP Các chip vi lỏng dựa trên DC-iDEP có cấu trúc đơn giản, không tạo ra bọt khí trong quá trình tách hạt Tuy nhiên, sự mất điện tích trong điện trường DC dẫn đến sinh nhiệt Joule, làm tăng nhiệt độ bên trong thiết bị quá mức So với điều này, AC-DEP được sử dụng rộng rãi hơn vì quá trình sinh nhiệt Joule bị ức chế rất nhiều Độ chọn lọc của thiết bị khi đó phụ thuộc vào tần số AC cũng như cường độ trường; do đó, các tham số của cả hai nên được tối ưu hóa [16]
Trong mô hình lý thuyết này, các hạt được giả định là những quả cầu đồng nhất được bao quanh bởi một dây dẫn môi trường điện môi Tính chất điện của môi trường bao gồm: độ dẫn σ m và độ thẩm ε m và hạt: độ dẫn σ p và độ thẩm ε p , bán kính của hạt (R), tần số (𝜔) của điện trường ứng dụng (E) được liệt kê là 3 yếu tố chính quyết định đặc điểm của DEP Biên độ FDEP của hạt hình cầu trong huyền phù tuân theo phương trình (1) và (2) [17]:
Công thức tính lực DEP:
• Re(f CM ) là phần thực của hệ số Clausius–Mossotti (hệ số CM), nó được gọi là độ phân cực hiệu quả tích chất của hạt đối với môi trường và nằm trong giá trị từ -0.5 đến +1.0 [18]
• ∇|E⃗⃗ rms | 2 là độ dốc bình phương của điện trường và lực DEP không bị ảnh hưởng khi cực của điện trường tác dụng bị đảo ngược
13 Liên quan đến hệ số CM, đây là thông số quan trọng cho biết hướng của DEP tác động lên hạt như một hàm của tần số góc 𝜔, tùy thuộc vào độ thấm 𝜀 của hạt và môi trường xung quanh, được cho là: f CM = ε p ∗ − ε m ∗ ε p ∗ + 2ε m ∗ (2)
• Dấu * trên đầu thể hiện độ phức tạp của tham số, công thức này tính đến sự dẫn điện và tổn thất năng lượng điện chuyển thành năng lượng nhiệt của hạt và môi trường trong quá trình làm việc
• Do đó, độ thẩm phức tạp của hạt và môi trường tương ứng: ε p ∗ và ε m ∗ được tính theo công thức sau: ε ∗ = ε − jσ w trong đó j là đơn vị ảo
Vì tế bào sinh học có tính chất điện môi mà tế bào chất và màng tế bào đều có vai trò quan trọng trong tổng điện tích cảm ứng của tế bào Vì vậy một số mô hình lý thuyết đã được xây dựng dựa trên sự nhận biết này, chẳng hạn như mô hình tế bào có vách (vỏ đơn hoặc nhiều vỏ) và cấu trúc tế bào không đồng nhất, trong số đó protoplast là mô hình điện môi đơn giản cho nhiều ứng dụng tế bào sinh học ngày nay Trong mô hình này, lớp điện dung mỏng bao quanh chất lỏng dẫn điện bên trong tương ứng với cấu trúc của tế bào trong đó tế bào chất được bao quanh bởi màng Giả định rằng độ dẫn của màng là không đáng kể, sau đó hệ số CM có thể được tính theo phương trình sau [19], [20]: f CM (ω) = − ω 2 (τ m τ c ∗ ) + jω(τ m ∗ − τ m − τ c ∗ ) − 1 ω 2 (2τ m τ c ∗ + τ c τ m ∗ ) − jω(τ m ∗ + 2τ m + τ c ∗ ) − 2 (3) Trong đó:
• Các hằng số τ m , τ m ∗ được tính bằng công thức: τ m =ε m σ m và τ m ∗ =c m R σ m
• với σ m và ε m lần lượt là độ dẫn điện và độ thấm của môi trường, c m là điện dung màng và R là bán kính tế bào
• Các hằng số τ c, τ c ∗ được tính bằng công thức: τ c =ε c σ c và τ c ∗ =c m R σ c
• trong đó σ c và độ thẩm ε c là độ dẫn điện và độ thấm của tế bào chất tương ứng.
Nguyên lý hoạt động của chip vi lỏng
Trong nghiên cứu này, sự kết hợp giữa DEP để tách các tế bào mục tiêu với phương pháp bắt giữ dựa trên tương tác hóa học sử dụng aptamer đã được sử dụng, đây là vật liệu có khả năng liên kết đặc biệt với các tế bào ung thư phổi A549, từ đó giải quyết các vấn đề liên quan đến tính chọn lọc thấp của ứng dụng DEP đơn lẻ Để nắm được nguyên lý hoạt động của chip vi lỏng, trước hết cần phải nắm rõ được ung thư được hình thành từ sự phát triển không bình thường của các tế bào không tuân theo quá trình phân chia thông thường gọi là tế bào ung thư Các tế bào ung thư gộp lại thành một khối u Khối u có tính chất xâm lấn và khả năng lan rộng gọi là di căn
Quá trình di căn xảy ra trong máu
Các tế bào ung thư di chuyển tuần hoàn trong máu gọi tắt là CTC (Circulating
Tumor Cells) CTC được sử dụng như một dấu hiệu sinh học (biomarker) để theo dõi sự tiến triển của bệnh ung thư và hiệu quả của liệu pháp điều trị Việc phát hiện và đếm số lượng CTC trong máu có thể giúp các bác sĩ đánh giá mức độ nghiêm trọng của bệnh, dự đoán khả năng sống sót và đáp ứng với điều trị của bệnh nhân [21]
Tuy nhiên, việc phát hiện CTC là một thách thức lớn do số lượng của chúng rất ít so với số lượng tế bào máu Các mẫu CTC có nồng độ tế bào thấp dưới 1000 tế bào/1ml Để xác định được ung thư thì dựa vào xác định CTC Có thể xác định CTC dựa vào việc bắt tế bào mục tiêu bằng phương pháp vật lý (độ đặc hiệu thấp) hoặc phương pháp hóa học (độ đặc hiệu cao) Để giải quyết vấn đề của cả hai phương pháp trên, một phương pháp mới tối ưu những điểm mạnh của hai phương pháp đơn lẻ trên trên một thiết bị chip vi lỏng
Hình 3.Tế bào ung thư CTC di căn
Chip vi lỏng áp dụng kỹ thuật tách hạt bằng điện di (DEP) kết hợp với phương pháp phân tách từ tính (IMS) Phân tách từ tính miễn dịch (IMS) là phương pháp sử dụng hạt nano vàng để biến đổi kháng thể/aptamer để bắt giữ các tế bào mục tiêu, sau đó phân lập dựa trên các liên kết đặc tính từ tính Trong đó, aptamer là các phân tử oligonucleotide hoặc peptide chuỗi đơn, ngắn, có khả năng gấp thành các cấu trúc xác định để nhận dạng được nhiều mục tiêu, chẳng hạn như các phân tử nhỏ, protein và tế bào, với ái lực và độ chọn lọc cao
Hạt nano vàng là những hạt có kích thước ở giới hạn nano từ 1nm đến 10nm theo tiêu chuẩn của American Society for Testing and Materials (ASTM) Thông thường, nano vàng là các hạt, que nano từ kim loại vàng có kích thước 1/1000mm đến 1/10mm
Hạt nano vàng được tìm ra và tổng hợp từ thế kỷ 19 bởi nhà vật lý Faraday Tuy nhiên, bản thân hạt nano vàng mà không gắn với kháng thể hay thuốc nào thì nó vô dụng và thậm chí gây độc, mức độ độc tùy thuộc vào kích thước Do đó, trong phương pháp này, các hạt nano vàng được ủ bằng aptamer, khi mẫu chứa các tế bào mục tiêu tiếp xúc với hạt này, các kháng thể/aptamer trên hạt từ tính sẽ liên kết với các tế bào Sau đó một điện trường được đưa vào sẽ hút các tế bào mục tiêu ra khỏi mẫu Vì hạt có từ tính nên chúng và tế bào kèm theo sẽ bị hút ra bởi điện trường [22] Điện di được tạo ra bằng bộ tạo hàm với dải tần số 4MHz Khi tăng tần số thì lực DEP tăng dẫn đến độ phân cực của hạt lớn tạo ra lực pDEP hoặc nDEP, lực này hút các hạt nano vàng phủ aptamer liên kết với tế bào A549 tới các vùng có điện trường cao và được aptamer giữ lại tại đó Để quan sát được sự phân bố điện trường có tác động như thế nào đến việc bắt giữ tế bào, phần mềm COMSOL Multiphysics được sử dụng để mô phỏng sự phân bố của điện trường Hình 4 là kết quả mô phỏng bởi phần mềm cho thấy
16 điện trường tăng cực đại ở mức 2𝑥10 5 V/m tại các vùng sát với điện cực và điện trường thấp đối với các vị trí góc của lớp SAM của AuNPs [23]
Hình 4 Kết quả mô phỏng điện trường được tính toán bằng phần mềm COMSOL
CẤU TẠO VÀ PHƯƠNG PHÁP CHẾ TẠO ĐIỆN CỰC
Cấu tạo chip vi lỏng
Trong nghiên cứu này, ta sử dụng tế bào ung thư phổi A549 đưa vào chip vi lỏng áp dụng phương pháp diện di với liên kết aptamer để xác định và bắt giữ tế bào A549
Trong đó, chip vi lỏng được cấu tạo từ một kênh PDMS thẳng chứa dung dịch sucrose (wt 8.62%) và một lớp điện cực xen kẽ (IDE) Hình 5 dưới đây cho thấy cấu tạo chi tiết của thiết bị chip vi lỏng
Hình 5 Chip vi lỏng để thu giữ các tế bào A549 bằng cách sử dụng sự kết hợp giữa lực điện di (DEP) và sự tương tác cụ thể của các aptamer
PDMS, hay còn được gọi là Polydimethylsiloxane, thuộc về một nhóm các hợp chất silicone thường được gọi là silicone PDMS là polyme dựa trên silicon được sử dụng rộng rãi nhất Nó có nhiều ứng dụng từ kính áp tròng và thiết bị y tế đến chất đàn hồi Trong công nghệ vi lỏng, PDMS thường được sử dụng để tạo các vi kênh (micro- channel) trên nền vật liệu Các đặc tính cơ học của PDMS làm cho polymer này phù hợp với nhiều bề mặt khác nhau Vi kênh PDMS có các tính chất cơ học đặc biệt như sau:
• Độ trong suốt: PDMS có độ trong suốt cao, cho phép quan sát trực tiếp các quá trình diễn ra bên trong vi kênh
• Độ linh hoạt: PDMS có độ linh hoạt tốt, cho phép nó thích ứng với các biến dạng cơ học
• Khả năng thẩm thấu không khí: PDMS có khả năng thẩm thấu không khí, điều này rất quan trọng trong các ứng dụng y tế và sinh học
• Độ đàn hồi: PDMS là một loại elastomer, có khả năng phục hồi hình dạng ban đầu sau khi bị biến dạng
• Độ cứng và tỷ số Poisson: Kích thước lỗ của PDMS gần như không ảnh hưởng đến độ cứng và tỷ số Poisson cho một số tỷ lệ lỗ nhất định Tuy nhiên, tỷ lệ lỗ của PDMS có ảnh hưởng đáng kể đến cả hai thông số cơ học này
18 Dung dịch Sucrose (wt 8.62%) hay còn gọi là đường saccarôzơ, là một loại đường disaccharide, được tạo thành từ một phân tử glucose và một phân tử fructose Trong các ứng dụng vi lỏng, dung dịch Sucrose có thể được sử dụng để điều chỉnh độ đẳng trương của môi trường Độ đẳng trương là tình trạng mà áp suất thẩm thấu (hoặc nồng độ chất tan) giữa hai bên của một màng bán thấm là như nhau Trong sinh học, một số tế bào sống phải được duy trì trong môi trường hằng định là dung dịch đẳng trương để tạo điều kiện thuận lợi cho các chức năng của tế bào Vì vậy, dung dịch Sucrose có thể được sử dụng để tạo ra một môi trường đẳng trương trong kênh vi lỏng, giúp duy trì sự sống và hoạt động của các tế bào Để chế tạo chip vi lỏng, bước đầu tiên là tạo các vi kênh dẫn mở trên bề mặt của một chất nền, bước tiếp theo là làm kín vi kênh bằng một chất nền khác (kỹ thuật bonding) Chất lượng liên kết giữa hai chất nền rất quan trọng, nó ảnh hưởng trực tiếp hiệu quả làm việc của vi chip Kỹ thuật bonding trong kênh vi lỏng là kỹ thuật sử dụng cảm biến điện dung để phát hiện các đối tượng hoặc vi hạt trong kênh vi lỏng
Một hệ thống cảm biến được đề xuất bao gồm một cấu trúc tụ gồm ba vi điện cực vàng phẳng tích hợp trong kênh vi lỏng và được cách ly để tránh các điện cực tiếp xúc trực tiếp với chất lỏng trong kênh dẫn bởi một lớp điện môi Điện cực vàng là một dải vàng song song được phủ lên chất nền thủy tinh bằng phương pháp quang khắc Khi có đối tượng đi qua một cặp điện cực, sẽ làm thay đổi môi trường giữa 2 bản cực xuất hiện chênh lệch điện dung giữa hai tụ điện Chênh lệch điện dung giữa hai tụ được phát hiện từ đó có thể xác định kích thước và tính chất của đối tượng Ngoài ra, lớp điện cực này có thể được cấu tạo từ nhiều các vật liệu khác nhau như silicon, cacbon, kim loại,…
Lớp điện môi được phủ trên kênh vi lỏng được sử dụng là SU-8 (một loại hợp chất epoxy) Lớp điện môi SU-8 là một loại vật liệu polymer phổ biến được sử dụng trong công nghệ vi cơ điện tử và công nghệ vi điện tử SU-8 có nhiều ưu điểm như khả năng chịu được nhiệt độ cao, độ cứng tốt và khả năng chống hóa chất Nó thường được sử dụng như một lớp cách điện trong các thiết bị vi điện tử Để bắt giữ các tế bào mục tiêu trong kênh vi lỏng, ta sử dụng một loại liên kết hóa học, liên kết SH-aptamer SH-aptamer là chuỗi peptide đơn có cấu trúc xác định liên kết với tế bào mục tiêu được ủ trên bề mặt vàng của lớp SAM của AuNP thông qua liên kết Au-S và có vai trò nhận diện và bắt giữ tế bào mục tiêu Trong đó, SAM (self-assembled monolayer) của AuNPs là lớp đơn tự lắp ráp của hạt nano vàng được cố định trên bề mặt thủy tinh thông qua APTES (một loại amino) thông qua liên kết siloxan (Si−−O−−Si) Ở vùng điện cực vàng được quang khắc trên đế thủy tinh được phủ lưu huỳnh Các hạt nano và lớp điện cực được ủ bằng aptamer thông qua liên kết Au-S Hình 6 dưới đây cho thấy chi tiết về quá trình liên kết chất nền trong kênh vi lỏng [24], [25], [26]
Hình 6 Quá trình liên kết các lớp trong kênh vi lỏng
Một loạt các thiết bị vi lỏng DEP đã được phát triển để sử dụng trong việc tách hạt sinh học Độ dốc của điện trường là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu suất DEP
Hình dạng của các điện cực có tác động đến điện trường không đồng nhất (NUEF) trong chip vi lỏng, do đó hình dạng và sự phân bố của các điện cực rất quan trọng đối với biên độ NUEF Do đó, đã có rất nhiều những nghiên cứu được đưa ra để tối ưu hiệu suất làm việc của chip vi lỏng thông qua các điện cực khác nhau được áp dụng trong các phương pháp tiếp cận vi lỏng, chẳng hạn như DEP được thực hiện bởi các điện cực bên ngoài và các điện cực 2D và 3D Để đánh giá hiệu suất của điện cực ảnh hưởng đến quá trình bắt giữ tế bào mục tiêu của chip vi lỏng ta dựa vào những yếu tố, bao gồm:
• Hiệu suất lượng tử: Đây là tỷ lệ giữa số electron quang điện (n) và số photon chiếu tới (N)
• Điện trở của tế bào và mô: Điện trở hoặc độ dẫn điện của các đối tượng sinh vật có giá trị hằng định trong cùng một điều kiện xác định Việc xác định giá trị điện trở xuất, điện dẫn xuất, tính dẫn điện hay nói chung là các thông số điện của tế bào và mô cho phép ta đánh giá được trạng thái sinh lý và chức năng hoạt động của các đối tượng khảo sát
• Sự phụ thuộc độ dẫn điện vào tần số: Đây là đại lượng đặc trưng biểu diễn cho đối tượng là tế bào hoặc mô sống.
Điện cực ngoài
Các nhà nghiên cứu đã phát triển một con chip iDEP từ polydimethylsiloxane (PDMS) được đậy bằng nắp thủy tinh Con chip này dùng để tách huyết tương từ máu
20 Cấu trúc chip bao gồm: một cổng vào và một cổng ra Một kênh chính dài 1cm, sâu 50 àm với 38 nhỏnh cụt phõn bố đều 2 bờn của kờnh chớnh với kớch thước mỗi nhỏnh
200x50 àm (chiều rộng x chiều sõu) Hai điện cực Pt để tạo ra điện trường (1 đầu dương và 1 đầu âm) [27]
Một mẫu máu có thể tích ≈ 2 μL được tiêm vào kênh chính và được bơm qua nó bằng lực mao mạch bên trong Các nhánh giữ lại các tế bào hồng cầu (RBC) bằng phương pháp thủy động Sau đó, nguồn điện DC được kích hoạt để thiết lập lực DC- DEP, ngăn chặn nhiều hồng cầu bị mắc kẹt bên trong các kênh cụt gần cổng vào
Ngoài ra, dòng điện thẩm thấu được tạo ra bởi điện trường DC đã loại bỏ hồng cầu khỏi các điểm nối chéo được hình thành tại các kênh và nhánh Kết quả là huyết tương được tách ra khỏi máu, tạo thành một vùng huyết tương không có hồng cầu
Phương pháp này thu được độ tinh khiết huyết tương là 99% Thiết bị iDEP thực hiện tách huyết tương mà không làm loãng mẫu máu Thiết bị này được sử dụng với điện áp thấp hơn so với các thiết bị iDEP khác [28]
Hình 7 Cấu trúc chip iDEP và kết quả tách huyết tương từ máu
Bên cạnh đó, một chip vi lỏng PDMS khác được thiết kế để tách các giọt dầu ra khỏi hỗn hợp chứa hạt Janus (một loại hạt kị nước) Cấu trúc chip bao gồm: một kênh thẳng PDMS được in bằng kĩ thuật in thạch bản mềm có chiều dài và độ sâu lần lượt là
≈ 1 mm và ≈ 250 àm, kết nối cỏc đầu vào và đầu ra Hai đầu vào và hai đầu ra trong đú một đầu vào chứa mẫu (5 mm x 150 àm) và một đầu vào chứa chất lỏng (1 mm x250
21 àm) Chiều dài của cả hai đầu ra là ≈ 9 mm và chiều rộng của chỳng lần lượt là ≈ 120 àm và ≈ 180 àm Bốn buồng chứa mẫu và chất lỏng (6 mm x 6 mm) cú độ sõu ≈ 80 àm được nối với mỗi đầu vào và đầu ra của chip Bốn điện cực được lắp vào bốn buồng [29]
Trước tiên, nước khử ion làm ướt kênh, sau đó các giọt Janus được bao phủ bởi các giọt dầu được bơm vào buồng giam và được đẩy đến gần kênh chính bởi chất lỏng từ đầu vào chất lỏng vỏ bọc Sau đó, nguồn điện DC được cấp vào kênh, Janus và các giọt dầu dần dần được tách ra khỏi nhau với sự trợ giúp của 𝐹 𝐷𝐸𝑃 và di chuyển vào các buồng khác nhau Quá trình tách phụ thuộc vào biên độ của điện áp đặt vào và kích thước giọt Quá trình chế tạo khá đơn giản vì các điện cực được đưa vào chip chứ không được tích hợp nguyên khối vào thiết bị.
Điện cực 2D
Một thiết bị vi lỏng khác đã được đề xuất để tách protein huỳnh quang màu xanh lá cây có nhãn MDA-MB-231 và các loại tế bào ung thư khác khỏi các tế bào khỏe mạnh Đầu tiên, phần điện cực được chế tạo bằng cách sử dụng một tấm wafer thủy tinh làm chất nền, được phún xạ và phủ một lớp Cr/Au xen kẽ Lớp kim loại xen kẽ này sau đó được tạo khuôn bằng quy trình khắc ướt để tạo thành dãy điện cực phẳng được số húa Nú bao gồm 20 cặp điện cực cú chiều rộng và khoảng cỏch lần lượt là ≈ 39 àm và
≈ 36 àm, nhụ vào kờnh từ ≈ 2 àm đến ≈ 3 àm, cung cấp NUEF mạnh mẽ Tiếp theo, cấu trúc vi lỏng được hình thành bằng PDMS và kỹ thuật in thạch bản mềm Độ rộng của
22 kờnh là ≈ 50 àm và được mở rộng lờn ≈ 250 àm Cuối cựng, cỏc điện cực và cấu trỳc vi lỏng, được liên kết với nhau nhờ sự hỗ trợ của plasma oxy [30]
Mẫu được bơm vào kênh và NUEF được hình thành bằng nguồn điện xoay chiều có biên độ đặt từ đỉnh đến đỉnh (Vpp) 15 V ở tần số đặt là 40 kHz, đạt được độ chính xác và độ tinh khiết tách ≈ 100% và ≈ 81% tương ứng
Hình 9 Cấu tạo chip tách protein màu xanh lá cây có gán nhãn và các tế bào ung thư ra khỏi các tế bào khỏe mạnh
Một con chip vi lỏng đã được chế tạo để kết hợp các hạt và DEP nhằm thực hiện việc tách liên tục các tế bào nấm men khỏi các hạt silica bằng mô-đun ICEO hay Induced Charge Electroosmosis Đây là hiện tượng điện hóa học trong đó sự di chuyển của chất lỏng được gây ra bởi điện tích bề mặt được tạo ra do điện trường áp dụng Điều này thường được sử dụng trong các ứng dụng vi điều khiển và vi xử lý hóa học, sử dụng một phiến kính kính hiển vi làm chất nền của thiết bị [31]
Kính được phủ một lớp mỏng Indium Tin Oxide (ITO) – một loại oxit thiếc indium
Sau đó, nó được tạo hình thành các điện cực song song Các kênh, một đầu vào và bốn đầu ra, được chế tạo trong PDMS và liên kết với đế thủy tinh bằng phương pháp kích hoạt bề mặt plasma oxy Chip vi lỏng có ba vùng: tập trung, chuyển tiếp và phân tách
Huyền phù bao gồm các hạt silica, tế bào nấm men và chất lỏng mang được bơm vào chip và mô-đun ICEO tập trung các hạt vào vùng tập trung Các nhánh bên, với kích thước được tối ưu hóa trong vùng chuyển tiếp, đảm bảo dòng hạt chảy vào vùng phân tách theo đường thẳng
Hiệu suất tách là > 96% với nguồn điện xoay chiều ở giá trị cài đặt là 225 Vpp ở tần số 1 MHz Con chip vi lỏng DEP đa năng này có tiềm năng lớn trong chẩn đoán phân tử trong các hệ thống LOC vì nó cho thấy thông lượng cao Việc tích hợp mô-đun ICEO đã đơn giản hóa cấu trúc chip vì không cần mô-đun điều khiển tốc độ dòng chảy phức tạp và kênh vi lỏng hẹp để tập trung hạt Nó cung cấp một phương pháp thay thế để tập trung các hạt, tạo ra một thiết bị tích hợp
Hình 10 Cấu tạo chip vi lỏng dùng để tách hạt nấm men khỏi các hạt silica
Song song với đó, một nền tảng vi lỏng khác với hệ thống quán tính DEP đã được phỏt triển để tỏch cỏc hạt Cấu tạo của chip bao gồm: kờnh rộng ≈ 200 àm và sõu ≈ 40 àm, bao gồm 15 đoạn hỡnh chữ U đối xứng với chiều dài ≈ 700 àm và được tạo khuụn trong PDMS bằng kỹ thuật in thạch bản mềm Các lỗ đầu vào và đầu ra cũng được đục lỗ trong PDMS Kỹ thuật nâng lên tạo khuôn cho các điện cực Ti (50 nm)/Pt (150 nm) màng mỏng trên một phiến kính Khoảng cách và chiều rộng của các điện cực đều ≈ 20 àm Liờn kết giữa PDMS và phiến kớnh được thực hiện bằng plasma oxy Một dũng huyền phự của cỏc hạt polystyrene cú đường kớnh ≈ 5 àm và ≈ 13 àm được bơm vào từ đầu vào, và dòng vỏ bọc từ phía trên đẩy các hạt dọc theo đáy kênh, giữ chúng trong NUEF Cường độ điện trường của nguồn điện xoay chiều được tối ưu hóa thành ≈ 27
Vpp ở ≈ 1 MHz, đạt được hiệu suất tỏch lần lượt là ≈ 13 àm và ≈ 5 àm cỏc hạt ≈ 100% và ≈ 96% [32]
Sự phân tách kích thước hạt đa dạng đã đạt được bên trong con chip này bằng cách điều chỉnh điện áp mà không cần thiết kế lại bố cục chip Việc thực hiện dòng vỏ bọc trên cùng đã cải thiện hiệu quả phân tách vì các hạt bị buộc xuống đáy kênh và không bị ảnh hưởng bởi sự phân rã điện trường dọc theo hướng thẳng đứng
Hình 11 Cấu tạo chip vi lỏng áp dụng lực quán tính và lực điện di polystyrene có đường kớnh ≈ 5 àm và ≈ 13 àm
Các nhà nghiên cứu cũng đã phát triển một thiết bị vi lỏng DEP đẳng hướng để phân tách các tế bào nấm men sống và chết Thiết bị bao gồm ba phần: ba đầu vào, một phần tách biệt và hai đầu ra Các điện cực cho DEP được làm bằng một miếng kim loại Ti/Pt/Au có độ dày lần lượt là ≈ 50 nm, ≈ 50 nm và ≈ 300 nm trên đế thủy tinh Chiều rộng điện cực và khoảng cỏch giữa chỳng đều là ≈ 10 àm Cỏc kờnh chất lỏng được tạo khuụn trờn đầu cỏc điện cực bằng chất điện mụi SU-8 cú độ dày ≈ 100 àm và sau đú được bịt kín bằng lớp phủ thủy tinh Chiều dài và chiều rộng của kênh chính lần lượt là
≈ 600 àm và ≈ 100 àm Mặt của lớp phủ đối diện với buồng được phủ Indium Tin Oxide (ITO) – một loại oxit thiết indium, đóng vai trò là điện cực nối đất Mạng phân cực điện cực được hình thành bằng cách sử dụng mảng điện trở bên cạnh kênh chính và được kết nối với các điện cực để thực hiện DEP đẳng hướng [33]
Huyền phù chứa các tế bào nấm men được bơm vào kênh chính từ cửa vào giữa và các tế bào trong huyền phù được tập trung để di chuyển một cách hợp lý với sự trợ giúp của dòng vận chuyển được tạo ra bởi bộ đệm từ hai kênh bên còn lại Các tế bào nấm men sống và chết được phân tách trong phần DEP dưới điện trường đẳng hướng không đồng nhất Hiệu suất của thiết bị được đánh giá bằng cách sử dụng nguồn điện xoay chiều có giá trị cài đặt là 14 Vpp ở các tần số khác nhau
Hình 12 Cấu trúc vi lỏng DEP đẳng hướng dùng mạng điện trở để tách tế bào nấm men sống và chết 3.3.2 Điện cực đúc
Một thiết bị vi lỏng kết hợp chất cách điện với điện cực 2D được phát triển để tập trung và tách các hạt Cấu tạo của chip này bao gồm: 30 điện cực đặt song song 2 bên của đế thủy tinh Pyrex Các lớp kim loại Ti/Pt đặt song song 2 bên của đế thủy tinh
Pyrex và xen kẽ giữa các điện cực Cấu trúc chất lỏng được tạo thành trong lớp SU-8 có độ dày ≈ 20 àm, tạo thành cấu trỳc đỳc Một lắp PDMS được đục lỗ gắn phớa trờn cấu trúc chất lỏng để bịt kín nó [34]
Điện cực 3D
Các điện cực màng mỏng được làm theo khuôn trên thành bên của kênh chính có thể được sử dụng làm điện cực 3D So với các điện cực phẳng ở đáy kênh, các điện cực được đúc theo khuôn trên cả hai thành bên cung cấp NUEF mạnh hơn nhiều và ngăn chặn sự suy giảm cường độ trường dọc theo chiều cao của kênh, dẫn đến sự tập trung và phân tách tế bào Tế bào thận HEK293/tế bào thần kinh N115 và tế bào thận HEK293/hạt polystyrene được sử dụng để xác minh hiệu suất của chip bằng cách sử dụng nguồn điện xoay chiều có điện áp và tần số được tối ưu hóa [37], [38]
Hình 16 Điện trường được tạo ra bởi điện cực 3D được in trên thành kênh chính
Một thiết bị vi lỏng được thiết kế dựa trên phương pháp đúc PDMS kết hợp với sóng âm và điện di để rửa và tách hỗn hợp các hạt latex được phủ nhôm và các hạt latex khụng phủ cú đường kớnh ≈ 5 àm bằng kĩ thuật “Acoustophoresis” [39]
Acoustophoresis là một kỹ thuật sử dụng sóng âm để thao tác và di chuyển các hạt Trong acoustophoresis, các hạt treo trong một môi trường được tiếp xúc với một trường sóng âm đứng Nếu các thuộc tính âm thanh của các hạt khác biệt so với môi trường xung quanh, một lực bức xạ ảnh hưởng đến các hạt, khiến chúng di chuyển trong trường âm thanh Hướng và độ lớn của sự di chuyển phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm kích thước của hạt, biên độ áp suất âm thanh, tần số của sóng âm, và mật độ và khả năng nén của hạt và môi trường chất lỏng Acoustophoresis là một kỹ thuật thao tác hạt mạnh mẽ và tìm thấy ứng dụng tăng cường trong các ứng dụng phân tích sinh học và lâm sàng của việc xử lý và thao tác tế bào Tuy nhiên, đáng chú ý là việc chế tạo các điện cực 3D được sử dụng trong acoustophoresis có thể gặp khó khăn
Các kênh vi lỏng được gia công bằng đồng thau có độ sâu và chiều dài lần lượt là ≈ 200 àm và ≈ 61 mm Hai phiến đầu dũ gốm ỏp điện làm bằng chỡ-zirconate-titanate (PZT) và các điện cực kim loại được đặt cạnh nhau và siết chặt ở hai bên của kênh trên khuôn đồng thau Tiền chất PDMS lỏng sau đó được đổ vào khuôn và xử lý Cuối cùng, PDMS đã xử lý, được tạo hình với các cấu trúc gắn với PZT và điện cực, được bóc ra khỏi khuôn và liên kết với một phiến kính bằng quy trình kích hoạt bề mặt plasma oxy
Con chip bao gồm hai bộ phận chính, một bộ phận để rửa và một bộ phận để tách
Huyền phù chứa các hạt mục tiêu, có hàm lượng ≈ 1 × 107 hạt.𝑚𝐿 −1 và chất đệm được bơm vào kênh từ hai đầu vào khác nhau Sóng dọc do PZT tạo ra trong buồng rửa của chip khiến các hạt di chuyển từ chất mang sang dung dịch đệm có độ dẫn điện thấp, triệt tiêu hiệu quả biên độ của hiệu ứng gia nhiệt Joule Sau đó, giải pháp đã đạt đến bộ phận tách 3D của chip, trong đó 𝐹 𝐷𝐸𝑃 tách các hạt không được phủ và được phủ một nửa bằng nguồn điện AC có giá trị cài đặt là 16 Vpp ở tần số 3 MHz Việc tích hợp các bộ phận rửa và tách đã cung cấp một hệ thống có giá trị để tách tế bào trong chẩn đoán lâm sàng
Tuy nhiên, việc chế tạo các điện cực 3D là một quá trình đầy thách thức Ngoài ra, quá
29 trình siết chặt ốc vít vào khuôn đồng thau cũng là một thách thức khác vì khả năng rò rỉ chất lỏng cao
Hình 17 Cấu tạo của chip vi lỏng sử dụng điện cực 3D kết hợp sóng âm và điện di
Ngoài các điện cực kim loại, các điện cực làm bằng cacbon cũng được sử dụng trong các thiết bị vi lỏng DEP vì cacbon có nhiều ổn định về mặt điện hóa hơn kim loại, dẫn đến việc sử dụng điện áp cao hơn mà không cần điện phân dung dịch Chi phí vật liệu và quy trình cũng thấp hơn so với điện cực kim loại vì điện cực carbon được hình thành trực tiếp từ chất quang dẫn Những ưu điểm này được các nhà nghiên cứu phát triển điện cực carbon để thực hiện DEP trong vi lỏng
Một hệ thống điện cực carbon 3D đã được đề xuất để cô đặc λ-DNA Các điện cực carbon được chế tạo bằng cách cacbon hóa vật liệu cảm quang SU-8 Chất nền silica nung chảy được phủ SU-8, sau đó SU-8 được tạo khuôn, tiếp xúc với nhiệt độ ≈ 900 ◦C và được cacbon hóa Các cột điện cực carbon này có chiều cao và đường kính lần lượt là ≈ 95 àm và ≈ 58 àm Sau đú, chỳng được kết nối với cỏc tấm carbon bằng cỏch phõn
30 phối indi Cỏc kờnh vi lỏng, cú độ sõu và chiều rộng lần lượt là ≈ 100 àm và ≈ 2 mm, được chế tạo trờn một chồng băng dớnh hai mặt nhạy ỏp lực cú độ dày ≈ 100 àm và sau đó được bao phủ bởi một lớp polycarbonate (PC) Cuối cùng, cả hai chất nền, silica nung chảy với các điện cực carbon và chồng các lớp PC, được kết dính với nhau và bịt kín bằng máy ép lăn [40]
Huyền phự chứa λ-DNA được bơm vào kờnh cú tốc độ dũng chảy ≈ 2 àLã𝑚𝑖𝑛 −1 Biên độ nguồn điện AC được đặt thành 16 Vpp với các tần số khác nhau để mô tả hiệu suất của hệ thống Kết quả cho thấy λ-DNA bị giữ lại bởi pDEP và nDEP ở tần số đặt trong khoảng 10 kHz hoặc 250 kHz đối với pDEP là 75 kHz và 250 kHz đối với nDEP
Hình 18 Một hệ thống điện cực carbon 3D đã được đề xuất để cô đặc λ-DNA 3.4.3 Điện cực Polyme
Hỗn hợp PDMS-Ag là một giải pháp thay thế khác để chế tạo điện cực Khác với việc chế tạo điện cực kim loại, nó loại bỏ quá trình phún xạ và quang khắc được áp dụng trong các điện cực màng kim loại, đơn giản hóa quá trình chế tạo và cấu trúc thiết bị
Các điện cực 3D được phát triển dựa trên PDMS Các dây dẫn ITO lần đầu tiên được tạo hình trên đế thủy tinh bằng phương pháp quang khắc Sau đó, kỹ thuật quang khắc thứ hai được áp dụng để tạo thành khuôn điện cực 3D Các điện cực Ag-PDMS 3D được làm bằng cỏc tiểu cầu bạc cú đường kớnh ≈ 1 àm và hỗn hợp tiền chất PDMS với
31 tỷ lệ 85% được đổ lên trên các đầu dây dẫn ITO và tiền chất PDMS sau đó được liên kết chộo Chiều rộng và khe hở của cỏc điện cực đều ≈ 200 àm Lớp PDMS được tạo đỳc thành khuôn với các đầu vào, đầu ra và kênh được tạo bằng kỹ thuật in thạch bản mềm được căn chỉnh với các điện cực và liên kết với đế thủy tinh bằng phương pháp kích hoạt plasma oxy Đường kính của hai cửa vào và cửa ra lần lượt là ≈ 6 mm và ≈ 5 mm Độ rộng của cỏc kờnh được kết nối với đầu vào A và đầu vào B lần lượt là ≈ 100 àm và ≈ 200 àm Độ rộng của kờnh chớnh là ≈ 200 àm Cú ba điện trường hỡnh vũm dọc theo kờnh chớnh với cao độ và bỏn kớnh lần lượt là ≈ 400 àm và ≈ 100 àm [41]
Một dòng huyền phù chứa các tế bào nấm men và các vi cầu polystyrene hay còn gọi là hạt polystyrene, là một loại hạt nhựa nhiệt dẻo được tạo thành từ phản ứng trùng hợp stiren phủ vàng có đường kính ≈ 25 μm được bơm vào kênh nối với đầu vào A
Huyền phù đang di chuyển dọc theo thành phía trên của kênh chính nhờ dòng hội tụ động do bộ đệm tạo ra từ kênh được kết nối với đầu vào B Nguồn điện xoay chiều được sử dụng với các biên độ Vpp khác nhau ở tần số 1 MHz để nghiên cứu hiệu suất tách ở các tốc độ dòng chảy khác nhau Kết quả cho thấy > 90% tế bào nấm men và ≈ 100% vi cầu polystyrene phủ vàng được phân tách bằng cách đặt điện áp ≈ 18,75 Vpp và ≈ 12,5 Vpp ở tần số 1 MHz với tốc độ dòng chảy ≈ 300 𝜇𝑚 ∙ 𝑠 −1
Hình 19 Cấu tạo chip vi lỏng tách tế bào nấm men và vi cầu polystyrene
Một thiết bị vi lỏng điện cực 3D Ag-PDMS khác đã được phát triển để tách các tế bào vi tảo trong nước dằn hay “Water Ballast” là nước ngọt hoặc nước mặn được chứa
ĐÁNH GIÁ VỀ CHIP VI LỎNG
Bố trí thí nghiệm và kết quả
Sau khi ủ aptamer qua đêm, chip được rửa sạch bằng cách bơm dung dịch sucrose ở dũng chảy với tốc độ 1àL/phỳt trong 30 phỳt để loại bỏ lượng dư thừa ko liờn kết của aptamers và tránh sự kết dính ko đặc hiệu của tế bào Sau đó, một bộ tạo hàm với dải tần số quét tối đa 4MHz để tạo lực DEP bên trong dòng chảy chất lỏng
Dung dịch sucrose (wt 8.62%) là một dung dịch chứa 8.62% khối lượng sucrose
Sucrose, còn được gọi là đường saccarose, là một loại đường được tách ra chủ yếu từ mía đường hay củ cải đường Sucrose được sử dụng như môi trường nuôi cấy cho vi khuẩn hoặc nấm, hoặc làm chất điều chỉnh áp suất thẩm thấu (osmotic pressure) trong các thí nghiệm về tế bào Các dung dịch tế bào A549 được chuyển từ môi trường nuối cấy sang dung dịch sucrose (wt 8.62%) sau đó nhuộm xanh bằng thuốc nhuộm AM xanh calcein ở nồng độ nhất định rồi được bơm vào dòng chảy với tốc độ dòng cố định là 2àL/phỳt
Khi mẫu tế bào được đưa vào chip, bộ tạo hàm tạo pDEP tác dụng lên tế bào đích (A549) Quá trình này được hình thành trong suốt tgian thí nghiệm và quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang đảo ngược kết hợp với máy ảnh CCD cho ra kết quả trên máy tính chạy phần mềm Olympus DP Controler
Hình 22 Bố trí thí nghiệm để thu thập nhắm mục tiêu các tế bào A549 dựa trên sự hỗ trợ điện di (DEP)
Sau khi thao tác với DEP, PDMS được rửa tiếp bằng dung dịch sucrose với tốc độ dũng chảy 2àL/phỳt trong 10 phỳt để loại bỏ chất hấp thụ khụng đặc hiệu trờn bề mặt điện cực Bởi vì DEP tăng khả năng tiếp xúc giữa A549 với aptamer thông qua liên kết
36 SH-aptamer Dựa vào công thức (3) và bảng 1 ta có thể tính được hệ số CM phụ thuộc vào tần số và dùng MATLAB để vẽ được đồ thị như Hình 23 [46], [47]
Bảng 1 Đặc tính điện môi của tế bào A549 và môi trường sucrose (8,62%)
Hình 23 Đồ thị của hệ số Clausius–Mossotti bao gồm các thành phần thực và ảo như là một hàm tần số của A549 tế bào trong môi trường sucrose
Kết quả cho thấy đối với các tần số trên 10 3.5 Hz (crossover frequency), phần thực của hệ số CM trở nên dương Còn từ tần số 10 6.5 Hz thì phần thực của hệ số CM giảm dần sau đó giữ giá trị tuyến tính dương Từ đồ thị trên ta có thể thấy sự phụ thuộc của hệ số CM vào tần số Khi tần số tăng thì điện trường tăng dẫn đến hệ số CM tăng hay độ phân cực của hạt càng nhiều Điều này liên quan đến việc điều chỉnh lực điện di sang pDEP để hút các hạt nano phủ aptamer liên kết với tế bào A549 tới vùng điện
37 trường cao Tuy nhiên, việc hệ số CM giảm dần có thể được hiểu là do vượt quá giới hạn của tần số xác định của điện trường Vì các trường có tần số cụ thể để điều khiển hạt với độ chọn lọc cao.
Đặc điểm của chip vi lỏng
4.2.1 Hiệu ứng điện áp và thời gian áp dụng bẫy tế bào Điện áp và thời gian được thực hiện trong các nghiên cứu riêng biệt, trong đó ba điện áp cực đại đến cực đại được chọn là 5, 10 và 15 V trong khi thời gian khảo sát kéo dài trong 45 phút Phép đo dựa trên giá trị mật độ tích hợp (IntDen) hay tổng giá trị của các pixel trong hình ảnh hoặc vùng chọn, được tính bằng tích của diện tích và giá trị xám trung bình đã được thực hiện để đánh giá định lượng hiệu quả bẫy của các tế bào A549 Do đó, mật độ tích hợp tỷ lệ thuận với số lượng tế bào bị mắc kẹt, được tính trên toàn bộ khu vực giữa kéo dài dọc theo các điện cực
Hình 24 Việc bẫy các tế bào A549 bằng lực điện di dương (pDEP) ở các điện áp và thời gian áp dụng khác nhau
Như có thể thấy trong hình 24, ta có thể chia ra làm 3 giai đoạn khảo sát với các giá trị thời gian và điện áp khác nhau Ở điện áp 5V, số lượng tế bào được bẫy là không đáng kể ở 15 phút đầu, hiệu suất bẫy tế bào là tương đối thấp sau 30 phút và sau 45p ta có thể kết luận rằng số lượng nhỏ tế bào được bắt ở mức 5 Vpp cho thấy lực pDEP không đủ để bẫy tế bào trong trường hợp này Ở điện áp 10V, số lượng tế bào được bẫy nhỉnh hơn so với điện áp 5V nhưng cũng không đáng kể, nhưng có sự tập trung đáng kể của các tế bào ở khu vực giữa sau 30 và 45 phút Ở điện áp 15V, số lượng tế bào lớn hơn 1,7 lần so với điện áp 10 Vpp và gấp 8 lần điện áp 5 Vpp về mặt bẫy mật độ
38 Kết quả chỉ ra rằng, lực DEP tăng đáng kể khi tăng điện áp đặt vào Mặc dù cùng một lượng tế bào được đưa vào kênh, điều kiện điện áp cao hơn cho thấy hiệu suất vượt trội so với điện áp thấp hơn Tuy nhiên, khi tăng điện áp lên cao có hiện tượng bong bóng khí ở khu vực có điện trường cao Nguyên nhân là hiệu ứng Joule-Lenz Hiệu ứng này được phát biểu là nhiệt được tạo ra khi dòng điện chạy qua một vật dẫn làm cho cách điện tử và nguyên tử trong vật dẫn va chạm với nhau dẫn đến quá trình chuyển hóa một phần điện năng thành nhiệt năng Khi nhiệt đủ cao thì sẽ dẫn đến hiện tượng bọt khí Bọt khí này ảnh hưởng đến hiệu suất bẫy tế bào bởi sau khi bẫy xong thì mẫu sẽ được rửa bằng dung dịch sucrose để loại bỏ đi các phần không đặc hiệu, dung dịch sẽ đẩy bóng khí đi kèm theo một lượng tế bào mục tiêu ra ngoài Cho nên cần phải duy trì điện áp ở mức vừa phải [48]
4.2.2 Khả năng bắt giữ của aptamer
Một thử nghiệm đối chứng có và không có sự cố định aptamer đã được tiến hành để xác định ảnh hưởng của sự có mặt của aptamer đến hiệu suất bắt giữ cuối cùng của thiết bị Hai loại chip vi lỏng đã được sử dụng để xác minh, cả hai đều được cố định bằng AuNPs ở khu vực giữa và đặt một điện áp kích thích vào các điện cực để tạo pDEP
Tuy nhiên, một trong số chúng đã được sửa đổi bằng aptamer trên lớp AuNPs, trong khi cái còn lại thì không
Hình 25 Hiệu ứng bắt giữ của chip khi có và không có sự hiện diện của SH-aptamer
Kết quả thu được chỉ ra rằng mặc dù lực DEP có thể hỗ trợ tốt trong việc kéo các tế bào mục tiêu từ dòng chảy xuống vùng AuNPs nhưng điều đó là chưa đủ để giữ chặt các tế bào trên AuNPs Về cơ bản, các tế bào sẽ bị cuốn trôi khỏi khu vực bẫy miễn là điện áp kích thích cho thao tác DEP bị tắt trong khi dung dịch sucrose tiếp tục chảy để rửa kênh
4.2.3 Độ đặc hiệu Để nghiên cứu tính đặc hiệu của SH-aptamers, một thí nghiệm đã được tiến hành trên một mẫu tế bào hỗn hợp, bao gồm tế bào A549 và tế bào MCF-7, là dòng tế bào liên quan đến ung thư vú ở người, một trong những bệnh ung thư phổ biến nhất ở bệnh nhân nữ Hai loại tế bào được điều chế với cùng nồng độ Các tế bào A549 được nhuộm bằng AM màu xanh lá cây calcein và thuốc nhuộm AM màu cam được sử dụng cho các tế bào MCF-7 Quy trình được triển khai tương tự như thử nghiệm đối chứng với thời gian 45 phút thao tác DEP và sau đó rửa bằng dung dịch sucrose trong 15 phút
Hình 26 (A) Chụp ảnh huỳnh quang chọn lọc của các tế bào A549 mục tiêu trong một mẫu hỗn hợp; (B) ngưỡng hình ảnh của các ô sau khi được aptamer chụp bằng phần mềm ImageJ để xác định độ đặc hiệu chụp của thiết bị
Kết quả cho thấy phần lớn MCF-7 bị rửa trôi và A549 được giữ lại bởi aptamer
Sau đó, phần mềm ImageJ xử lý hình ảnh chuyển từ 8 bit sang thang độ xám để tính mật độ tích hợp Kết quả cho thấy độ đặc hiệu quả của việc bẫy lên tới 80.4% và có tính ứng dụng cao với nhiều loại tế bào ung thư (chỉ cần sửa aptamer phù hợp với việc bắt giữ tế bào mục tiêu) [49]
4.2.4 Biến dạng tế bào và khả năng sống sót
Như đã biết màng tế bào sẽ co lại do suất điện động gây ra khi tiếp xúc với điện trưởng Để nghiên cứu những thay đổi của tế bào trong quá trình thao tác với DEP với điều kiện được nghiên cứu ở điện áp 15 Vpp trong 45 phút, hình ảnh được ghi lại bằng kính hiển vi quang học có tích hợp huỳnh quang Một lượng nhỏ mẫu tế bào A549 đã được tiêm vào thiết bị và được phép ổn định Sau đó, DEP được vận hành để bắt giữ các tế bào lân cận khu vực điện cực bằng điện áp 15 Vpp liên tục trong 45 phút để quan sát [50]
Hình 27 Hình ảnh của các tế bào A549 được chụp bằng kính hiển vi huỳnh quang tích hợp ở các chế độ khác nhau trước và sau khi thao tác điện di (DEP): (A) hình dạng bình thường của tế bào sau khi thu hoạch từ đĩa nuôi cấy; (B) các ô bị kẹt khi bắt đầu ứng dụng DEP; (C) các tế bào bị giữ lại sau 45 phút xử lý DEP; (D) nhuộm calcein AM của các tế bào bị bẫy sau 45 phút DEP để kiểm tra khả năng sống của tế bào
Kết quả cho thấy làm việc với DEP trong thời gian dài đã gây ra những thay đổi về hình thái của tế bào A549 Hình dạng ban đầu của tế bào trước và khi bắt đầu ứng dụng DEP tương đối tròn và đồng nhất; tuy nhiên, sự co rút được quan sát thấy khi thời gian tăng lên dưới tác động của lực DEP (Hình 27A–C) Để nghiên cứu khả năng tồn tại của các tế bào A549 bị mắc kẹt sau thao tác DEP, quy trình nhuộm calcein AM đã được thực hiện Thuốc nhuộm Calcein AM được biết đến là chất nền phát huỳnh quang tương tác với các enzyme nội bào của tế bào sống để tạo ra huỳnh quang Tuy nhiên, quá trình này diễn ra do sự phân cắt các nhóm AM bởi các esterase hoạt động trong các tế bào sống sót, tuy nhiên, điều này không thể xảy ra ở các tế bào chết Như có thể thấy trong hình 27D, phần lớn các tế bào thu được được nhuộm rõ ràng bằng thuốc nhuộm AM màu xanh lá cây calcein, cho thấy khả năng sống sót cao của tế bào trong suốt thí nghiệm
Qua những đặc điểm trên, ta có thể đưa ra kết luận về việc kết hợp phương pháp điện di với liên kết aptamer đã khắc phục được những nhược điểm riêng lẻ nếu áp dụng hai phương pháp riêng lẻ như độ đặc hiệu thấp của phương pháp điện di hay khả năng xác định còn hạn chế của aptamer Từ các thí nghiệm trên, có thể thấy tính ứng dụng cao của phương pháp khi có thể áp dụng đến hầu như các loại tế bào ung thư với độ đặc hiệu khi xác định tế bào ung thư phổi lến đến 80.4%, từ đó có thể xác định sớm bệnh và phác đồ điều trị cho bệnh nhân
Trong đề tài "Nghiên cứu và phát triển cấu trúc vi lưu tách tế bào dựa trên điện di ứng dụng trong y sinh", tôi muốn nhấn mạnh vào việc khám phá và áp dụng các tiến bộ trong kỹ thuật tách vi lỏng để tạo ra cấu trúc vi lưu mạnh mẽ cho quá trình tách tế bào Đặc biệt là tách tế bào ung thư A549 bằng phương pháp phân tách từ tính (IMS) kết hợp với kỹ thuật tách điện di dựa trên tương tác hóa học aptamer Nội dung chính của nghiên cứu xoay quanh cấu tạo và ứng dụng của các loại điện cực với các kỹ thuật tách vi lỏng khác nhau, đồng thời đánh giá hiệu suất của chip vi lỏng ứng dụng sự kết hợp giữa điện di và aptamer Đầu tiên, nghiên cứu tập trung vào cấu tạo của các điện cực, đặc biệt là các loại điện cực 2D và 3D Hiểu rõ về tính chất và đặc điểm của từng loại điện cực là quan trọng để đảm bảo hiệu suất tối ưu trong quá trình tách tế bào Sự chọn lựa kỹ càng của cấu trúc điện cực là yếu tố quyết định đối với khả năng tương tác với tế bào và hiệu quả của quá trình tách
Phần quan trọng tiếp theo của nghiên cứu liên quan đến sự kết hợp giữa điện di và aptamer để tách tế bào ung thư A549 Aptamer là vật liệu có khả năng chọn lọc đặc biệt với tế bào ung thư, được tích hợp để tăng cường khả năng chọn lọc tế bào Đánh giá hiệu suất của chip vi lỏng dựa trên các yếu tố như hiệu ứng điện áp và thời gian bẫy tế bào, khả năng bắt giữ của aptamer, độ đặc hiệu, biến dạng tế bào và khả năng sống sót là quan trọng để đảm bảo sự hiệu quả và chính xác của phương pháp
Sự đánh giá chi tiết của chip vi lỏng thông qua các chỉ số kỹ thuật như hiệu ứng điện áp và thời gian bẫy tế bào cung cấp thông tin quan trọng về hiệu suất của hệ thống
