Tuyển chọn, nghiên cứu Đặc Điểm sinh học và tiềm năng Ứng dụng của các chủng vi sinh vật nhân sơ có khả năng phân giải gamma–hexachlorocyclohexane (lindane)

Tuyển chọn, nghiên cứu Đặc Điểm sinh học và tiềm năng Ứng dụng của các chủng vi sinh vật nhân sơ có khả năng phân giải gamma–hexachlorocyclohexane (lindane)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LƯU TRẦN ĐÔNG

TUYỂN CHỌN, NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC

VÀ TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG CỦA CÁC CHỦNG VI SINH VẬT NHÂN SƠ CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI GAMMA-HEXACHOLOCYCLOHEXANE (LINDANE)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội, 2023

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LƯU TRẦN ĐÔNG

TUYỂN CHỌN, NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC

VÀ TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG CỦA CÁC CHỦNG VI SINH VẬT NHÂN SƠ CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI GAMMA-HEXACHOLOCYCLOHEXANE (LINDANE)

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420101.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Kim Nữ Thảo

PGS.TS Phạm Thế Hải

Hà Nội, 2023

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đề tài tốt nghiệp này, ngoài sự cố gắng của bản thân, em còn nhận được rất nhiều sự quan tâm giúp đỡ nhiệt tình của thầy cô, bạn bè và người thân

Trước tiên, em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Kim Nữ Thảo và PGS TS Phạm Thế Hải cùng với ThS Vũ Hà Phương đã tận tình hướng dẫn và đưa ra những ý kiến quý báu cho em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này

Em cũng xin chân thành cảm ơn thành viên phòng thí nghiệm GREENLAB, Trung tâm nghiên cứu Khoa học Sự sống (CELIFE), Bộ môn Vi sinh vật học và Bộ môn Sinh học tế bào, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện cho em tiến hành thực hiện đề tài, phân tích mẫu tại phòng thí nghiệm và cung cấp những tài liệu cần thiết giúp em hoàn thành luận văn

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới gia đình, bạn bè, những người luôn bên cạnh động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu

và thực hiện luận văn

Luận văn này được thực hiện trong khuôn khổ Đề tài Quỹ gene cấp Quốc gia

mã số NVQG-2021/ĐT.02

Xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày 01 tháng 03 năm 2023

Lưu Trần Đông

1.2.2 Tại Việt Nam 6

1.3 Thực trạng của Lindane trong môi trường 7

1.3.1 Lindane trong đất 8

1.3.2 Lindane trong không khí 9

1.3.3 Lindane trong nước 10

1.4 Tác hại của Lindane 10

1.4.1 Ảnh hưởng tới con người 11

1.4.2 Ảnh hưởng tới động vật 11

1.5 Phương pháp xử lý Lindane tồn dư 12

1.5.1 Xử lý bằng phương pháp vật lý, hóa học 12

1.5.2 Xử lý ô nhiễm bằng phương pháp sinh học 14

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Đối tượng nghiên cứu 21

2.2 Nguyên liệu và thiết bị 22

2.2.1 Nguyên liệu và hóa chất 22

2.2.2 Thiết bị 23

2.2.3 Môi trường nuôi cấy 23

2.3 Phương pháp nghiên cứu 24

2.3.4 Đánh giá khả năng phân giải Lindane bằng phương pháp sắc ký khí 27

2.3.5 Đánh giá khả năng sinh enzyme liên quan đến quá trình phân giải Lindane 29

2.3.6 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng vi sinh vật 30

2.3.7 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện môi trường tới khả năng phân giải Lindane của các chủng vi sinh vật 32

2.3.8 Phương pháp xác định sự sinh trưởng của vi sinh vật 33

2.3.9 Phương pháp thu hồi sinh khối 34

2.3.10 Nghiên cứu bước đầu tạo chế phẩm dạng bột và khảo sát mật độ vi sinh vật trong chế phẩm 35

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ 37

3.1 Phâp lập vi sinh vật từ mẫu đất 37

3.2 Kết quả khảo sát khả năng sinh trưởng của các chủng vi sinh vật trên môi trường có Lindane 39

3.2.1 Khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn 39

3.2.2 Khả năng sinh trưởng của các chủng xạ khuẩn 40

3.3 Khả năng sinh enzyme liên quan đến quá trình phân giải Lindane 42

3.3.1 Khả năng sinh enzyme oxy hóa 42 3.3.2 Khả năng sinh enzyme loại ion clorua tự do được giải phóng trong môi

3.4 Định danh sơ bộ các chủng vi sinh vật bằng phân tích trình tự 16S rDNA 44

3.5 Khả năng phân giải Lindane của các chủng vi sinh vật 46

3.7 Đặc điểm sinh học của các chủng vi sinh vật 48

3.7.1 Đặc điểm hình thái 48

3.7.2 Đặc điểm sinh học cơ bản của các chủng vi sinh vật 49

3.8 Ảnh hưởng của điều kiện môi trường tới khả năng phân giải Lindane của các chủng vi sinh vật 52

3.8.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 52

3.8.2 Ảnh hưởng của pH 53

3.8.3 Ảnh hưởng của tỉ lệ chất vi lượng (TE) 54

3.8.4 Ảnh hưởng của nguồn Carbon 56

3.8.5 Ảnh hưởng của nguồn Nitơ 57

3.8.6 Ảnh hưởng của tỉ lệ tiếp giống 58

3.8.7 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất 59

3.9.2 Xác định phương pháp thu sinh khối phù hợp 63

3.9.4 Kết quả tạo chế phẩm dạng bột và khảo sát chất mang phù hợp cho chế phẩm 64

KẾT LUẬN 66

KIẾN NGHỊ 67

TÀI LIỆU THAM KHẢO 68

CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN ĐỀ TÀI 74

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 Công thức cấu tạo của HCH 3

Hình 2 Cấu trúc phân tử các đồng phân phân α – HCH; β – HCH; γ – HCH và δ – HCH 4

Hình 3 Quá trình tích tụ Lindane ở các môi trường 8

Hình 4 Các con đường phân hủy hiếu khí Lindane 18

Hình 5 Con đường phân hủy kỵ khí Lindane 19

Hình 6 Các con đường phân hủy đồng phân HCH của chủng xạ khuẩn Streptomyces sp M7 20

Hình 7 Phân bố khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn được khảo sát bằng phương pháp nuôi lắc so sánh và phương pháp cấy vạch so sánh 40

Hình 8 Số lượng các chủng xạ khuẩn sinh trưởng tốt trong môi trường bổ sung Lindane 41

Hình 9 Kết quả đánh giá khả năng sinh enzyme oxy hóa của 46 chủng vi sinh vật 42 Hình 10 Phân bố số lượng các chủng vi sinh vật có khả năng loại ion clorua vào môi trường 43

Hình 11 Phân bố số lượng các chủng vi sinh vật có khả năng phân giải Lindane thông qua phương pháp sắc ký khí GC – FID 47

Hình 12 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng loại ion clorua từ Lindane của các chủng vi sinh vật 53

Hình 13 Ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng loại ion clorua từ Lindane của các chủng vi sinh vật 54

Hình 14 Ảnh hưởng của yếu tố vi lượng đến khả năng loại ion clorua từ Lindane của các chủng vi sinh vật 55

Hình 15 Ảnh hưởng của nguồn carbon trong môi trường đến khả năng loại ion clorua từ Lindane của các chủng vi sinh vật 57

Hình 16 Ảnh hưởng nguồn Nitơ trong môi trường đến khả năng loại ion clorua từ Lindane của các chủng vi sinh vật 58

Hình 17 Ảnh hưởng của tỉ lệ tiếp giống đến khả năng loại ion clorua từ Lindane của các chủng vi sinh vật 59

Hình 18 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất tới khả năng loại ion clorua từ Lindane của các chủng vi sinh vật 60

Hình 19 Ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng phân giải Lindane của các chủng vi sinh vật 61 Hình 20 Đường cong sinh trưởng của chủng vi khuẩn 63

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 Tính chất vật lý, hóa học cùa các đồng phân HCH 4

Bảng 2 Các phương pháp không đốt hóa lý nhằm loại bỏ HCH khỏi đất 13

Bảng 3 Các chủng vi sinh vật phân hủy Lindane và đồng phân HCH 15

Bảng 4 Các enzyme và chức năng của chúng liên quan đến sự phân hủy Lindane 16 Bảng 5 Danh sách các mẫu đất dùng trong nghiên cứu 21

Bảng 6 Danh mục thiết bị chính dùng trong nghiên cứu 23

Bảng 7 Các chủng vi sinh vật phân lập được từ các mẫu đất 38

Bảng 8 Tỉ lệ tương đồng của các chủng vi sinh vật với các chủng khác trong cơ sở dữ liệu GenBank 45

Bảng 9 Hình ảnh khuẩn lạc và ảnh nhuộm Gram các chủng vi khuẩn 48

Bảng 10 Hình ảnh khuẩn lạc và chuỗi bào tử các chủng xạ khuẩn 49

Bảng 11 Kết quả sinh lý, sinh hóa bằng KIT API của các chủng vi khuẩn 50

Bảng 12 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của 2 chủng A119, LD02 51

Bảng 13 Hiệu suất thu sinh khối bằng 2 phương pháp ly tâm và đông khô 63

Bảng 14 Mật độ tế bào (CFU/g) của các chủng vi sinh vật trong chế phẩm chứa các chất mang khác nhau 65

MỞ ĐẦU

Thuốc trừ sâu là bất kỳ chất hoặc hợp chất nào nhằm ngăn chặn, tiêu diệt, xua đuổi hoặc giảm thiểu mọi loại dịch hại (côn trùng, ve, giun tròn, cỏ dại, chuột…) bao gồm cả thuốc diệt côn trùng, thuốc diệt cỏ, thuốc diệt nấm và nhiều chất khác dùng để kiểm soát sâu hại [4] Trong lịch sử, từ sau năm 1945, các loại thuốc trừ sâu tổng hợp hữu cơ được sử dụng ồ ạt, thiếu kiểm soát như DDT, 2,4–D

và HCH… Lindane là đồng phân ɤ– hexachlorocyclohexan còn được gọi là ɤ –HCH Lindane là một loại thuốc trừ sâu clo hữu cơ phổ rộng, được tổng hợp sau chiến tranh thế giới thứ 2 cho đến những năm 1990 [24] Lindane được sử dụng rộng rãi trên thế giới với mục đích diệt côn trùng gây hại thực vật do tác động của

nó tới hệ thần kinh động vật Lindane có thể dẫn đến tê liệt, co giật thậm chí tử vong [59] Lindane có thể tồn tại trong môi trường do tính hòa tan trong lipid cao và tính ổn định hóa học, chu kỳ bán rã của Lindane tương đối dài [14] Do đó, năm

2005, UNEP (United Nations Environment Programme – Chương trình môi trường Liên hợp quốc) đã quyết định ngăn chặn sự ô nhiễm của Lindane trên toàn thế giới

Ở nước ta, từ năm 2006, Lindane đã bị cấm sử dụng theo quyết định số 31/2006/QĐ–BNN ngày 27 tháng 4 năm 2006 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn

Tuy nhiên, lượng Lindane được tổng hợp và sử dụng trên toàn cầu cũng như nước ta rất lớn, cùng với chu kỳ bán rã của Lindane tương đối lâu nên vẫn có lượng lớn Lindane tồn dư trong môi trường Theo thông tin trong quyết định 1946/QĐ–TTG năm 2010 của Thủ tướng Chính phủ, lượng Lindane còn tồn dư trong đất, nước vẫn tương đối cao trên mức cho phép Hiện trạng này ẩn chứa những nguy cơ tiềm tàng tới sức khỏe con người và ảnh hưởng lớn đến công cuộc phát triển nông nghiệp an toàn hiện nay

Vi sinh vật được nghiên cứu trong vai trò phân hủy sinh học Lindane ngày càng nhiều do tương tác hóa học và vật lý của vi sinh vật làm thay đổi hoặc phá hủy hoàn toàn cấu trúc của Lindane Đã có những nghiên cứu trước đây về khả năng

phân giải Lindane của vi khuẩn như Staphylococcus sp., Pseudomonas sp.,

Sphingomonas sp.… và xạ khuẩn như Streptomyces sp Từ các nghiên cứu trên,

phương pháp sử dụng vi sinh vật phân giải Lindane tỏ ra an toàn, hiệu quả và thân thiện với môi trường hơn các phương pháp hóa học, vật lý khác

Theo báo cáo của Quỹ môi trường toàn cầu Việt Nam (GEF), Việt Nam là đất nước rất đa dạng về vi sinh vật với khoảng 7500 chủng vi sinh vật khác nhau được ghi nhận Đã có những nghiên cứu ứng dụng nguồn vi sinh vật bản địa xử lý tồn dư thuốc trừ sâu trong nông nghiệp như nghiên cứu của Trần Tiến Dũng và cộng sự xử lý tồn dư thuốc bảo vệ thực vật ở Lâm Đồng [2] Điều này chứng tỏ tiềm năng to lớn trong nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học xử lý tồn dư thuốc trừ sâu nói chung và Lindane nói riêng

Chế phẩm sinh học là những sản phẩm được tạo ra từ những nguyên liệu có sẵn trong tự nhiên có nguồn gốc từ thực vật, động vật hoặc vi sinh vật… Chế phẩm sinh học giúp hạn chế tối đa các tác động tiêu cựu đến môi trường, duy trì cân bằng tốt giữa nhu cầu sản xuất nông nghiệp với hệ sinh thái Ngoài ra không gây ảnh hưởng tiêu tới sức khỏe con người, vật nuôi và môi trường Với tất cả những ưu điểm trên, nhu cầu sử dụng chế phẩm sinh học trong nông nghiệp ở nước ta rất lớn

và các địa phương cũng khuyến khích nông dân sử dụng [6]

Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Tuyển chọn, nghiên cứu đặc điểm sinh học và tiềm năng ứng dụng của các chủng vi sinh vật nhân sơ có khả năng phân giải gamma–hexachlorocyclohexane (Lindane)” với các mục tiêu chính sau:

– Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn có khả năng phân

giải Lindane trong đất

– Nghiên cứu khả năng phân giải Lindane và đặc điểm sinh học của các chủng vi sinh vật tuyển chọn được

– Đánh giá được ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên khả năng phân giải Lindane của các chủng tuyển chọn; từ đó chọn ra được những chủng tốt nhất để phát triển chế phẩm sinh học loại bỏ Lindane trong đất

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về Lindane

1.1.1 Nguồn gốc Lindane

Lindane là tên gọi chung của đồng phân γ – hexachlorocyclohexane (γ – HCH) Cấu trúc phân tử của Lindane bao gồm 1 vòng 6 carbon, mỗi carbon liên kết với 1 chlorin và 1 hydrogen, công thức cấu tạo của Lindane được mô tả trong Hình

1 HCH được tổng hợp lần đầu vào năm 1825 bởi Michael Faraday Sau đó, đồng phân γ – HCH được gọi là Lindane theo tên nhà khoa học Hà Lan Teunis van der Linden vào năm 1912 do ông khám phá ra đặc tính sinh học của chất này Đến những năm 1945, Lindane được sử dụng rộng rãi trên khắp thế giới [23]

Hình 1 Công thức cấu tạo của HCH

HCH được sản xuất dưới dạng hỗn hợp các đồng phân thông qua phản ứng clo hóa benzene dưới tác dụng của ánh sáng (tia X, ánh sáng nhìn thấy hoặc tia cực tím) Hỗn hợp thu được bao gồm các đồng phân α – HCH (53% – 70%); β – HCH (3% – 14%); γ – HCH (11% – 18%); δ – HCH (6% – 10%); các đồng phân còn lại (3% – 5%) [46] với cấu trúc được mô tả trong Hình 2 Tuy nhiên chỉ có γ – HCH có đặc tính diệt côn trùng Để thu được Lindane từ hỗn hợp, HCH được cô đặc bằng methanol hoặc acid acetic, sau đó kết tinh phân đoạn từ đó thu được Lindane 99,9% [27] Theo Tổ chức Tiêu chuẩn hóa Quốc tế (ISO), tên gọi “Lindane” được dùng để chỉ những vật chất chứa >99% γ – HCH

Hình 2 Cấu trúc phân tử các đồng phân phân α – HCH; β – HCH; γ – HCH

và δ – HCH [46]

1.1.2 Tính chất hóa học và vật lý của Lindane

Lindane là một chất rắn không màu, có dạng tinh thể màu trắng với mùi nhẹ hoặc không có mùi Nhiệt độ sôi của Lindane là 323,4°C, nóng chảy ở 112,5°C; độ hòa tan trong nước là 7,3 mg/L ở 25°C, hóa hơi ở áp suất 4,2 x 10–5 mmHg tại 20°C Lindane hòa tan vừa phải trong ethanol (6,7%); hòa tan ít trong dầu khoáng, hòa tan hoàn toàn trong acetone và trong các dung môi thơm [55]

Lindane và các đồng phân HCH chỉ khác nhau ở vị trí các nguyên tử Clo dẫn đến sự khác biệt về các tính chất vật lý, hóa học Theo thống kê của WHO và các tổ chức khác, tính chất vật lý, hóa học của các đồng phần HCH được liệt kê trong Bảng 1

Bảng 1 Tính chất vật lý, hóa học cùa các đồng phân HCH [55]

Trọng lượng phân

tử

Trạng thái vật lý Lăng trụ đơn Tinh thể rắn Tinh thể rắn Đĩa mịn

Điểm nóng chảy

(°C)

Điểm sôi (°C) 288 ở 101,3 kPa 60 ở 67 Pa 323,4 ở 101,3 kPa 60 ở 48 Pa

5.6 x 10–3 Pa ở 20°C

4,7 x 10–3 Pa ở 25°C Hằng số Henry

và rau quả; làm bả nhằm kiểm soát các loài gặm nhấm trong bảo quản hạt giống Nhờ có tác dụng tiêu diệt côn trùng, Lindane được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ chấp nhận sử dụng trong y học để sản xuất thuốc điều trị chấy và ghẻ Theo thống kê vào năm 1974, lượng Lindane sử dụng trong nông nghiệp và thuốc trừ sâu chiếm khoảng 270000 kg [58]

gọi khác nhau như Aalindan; Agrocide; Aparasin; Aphtiria; Ben–Hex; Bexol; Celanex; Chlorosene; Gammalin; Gamene Gammexane; Gexane; Hexide: Hortex; Lindator; Lindex; Nexit; Pflanzol; Quellada.… [34] Các sản phẩm này chủ yếu được sử dụng cho cây trồng và trong bảo quản nông sản nhằm kiểm soát sâu bọ ký sinh Lindane cũng được sử dụng trong gia đình để trị chấy và bọ ký sinh [25] Theo thông kê của Voldner và Li năm 1995, lượng Lindane và HCH kỹ thuật được sử dụng trên toàn cầu ước tính đạt 720.000 đến 550.000 tấn mỗi năm Đến năm 1999,

Li đã cập nhật con số không dưới 11.000.000 tấn mỗi năm [42]

Tuy nhiên, do những ảnh hưởng của Lindane tới môi trường, sức khỏe con người nên đến năm 1970, Ủy ban Kinh tế Liên hợp quốc về Châu Âu (UNECE) đã ngừng sử dụng Lindane tại các quốc gia thành viên Phải tới những năm 1978 thì

Cơ quan Bảo vệ Môi trường Hoa Kỳ (EPA) mới cấm sản xuất Lindane Nhờ những quy định cấm vận nên trong những năm 80 của thế kỷ trước, đã có sự sụt giảm đáng

kể lượng Lindane và HCH kỹ thuật sản xuất và sử dụng trên thế giới Trung Quốc là nước đầu tiên cấm sử dụng Lindane vào năm 1983, sau đó là Liên Xô cũ Năm

2003, lệnh cấm hoặc hạn chế sử dụng Lindane đã được ban hành ở 34 quốc gia Cùng với đó, quy định HCH tổng hợp là chất nhập khẩu không hợp pháp ở 98 nước cũng được thông qua Tuy nhiên, khi Lindane được sử dụng cho các mục đích khác

sẽ được miễn trừ thuế [38]

Năm 2005, UNEP (United Nationals Enviromental Progamme – Chương trình môi trường Liên hợp quốc) đã đặt Lindane ở Phụ lục A của Công ước Stockholm về các chất ô nhiễm hữu cơ khó phân hủy nhằm ngăn chặn sử dụng Lindane trên thế giới Đây còn được gọi là “Danh sách đen” ghi các hóa chất cần loại bỏ hoàn toàn trên thế giới [31]

1.2.2 Tại Việt Nam

Việt Nam được biết đến là một nước nông nghiệp lâu đời, do đó việc sử dụng thuốc trừ sâu trong bảo quản và sản xuất là không thể tránh khỏi Giống như hầu hết các nước đang phát triển dựa vào nông nghiệp, dư lượng Lindane trong môi trường

ở nước ta vẫn còn tương đối lớn Trong các nghiên cứu trước đây, mức độ ô nhiễm Lindane ở nước ta chủ yếu trong đất, trầm tích và trong các quần xã sinh vật Trong điều tra của Thao và cộng sự năm 1993 tại các tỉnh, thành phố lớn ở Việt Nam, hàm lượng tồn dư Lindane trong đất đồng ruộng dao động từ 0,15 ng/g đến 55 ng/g, trong đất trên nương rẫy từ 0,09 ng/g đến 2,5 ng/g Mặc dù hàm lượng không lớn nhưng đã chứng tỏ có tồn dư Lindane trong đất nông nghiệp [67]

Tình hình ô nhiễm Lindane trong môi trường đất tại nước ta khá báo động Các mẫu đất được thu thập tại Vịnh Hạ Long được cho thấy có tồn dư 6,06 ng/g [72] Cũng trong báo cáo của Viet và cộng sự năm 2000, lượng Lindane tính được tại các thành phố lớn ở nước ta như Thủ đô Hà Nội, Thành phố Hồ Chí Minh, Thành Phố Việt Trì lần lượt là 0,35 ng/g, 0,68 ng/g và 1,1 ng/g Điều này cho thấy ô nhiễm Lindane cần được quan tâm, xử lý Do đó, năm 2008, Việt Nam đã đưa ra Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia (QCVN 15:2008/BTNMT) về dư lượng hóa chất bảo

vệ thực vật đất nhằm quy định nồng độ Lindane tồn dư trong đất không được quá 0,01 ng/g chất khô

Ngoài tồn dư trong tự nhiên, sự có mặt của Lindane trong các thực phẩm nhập khẩu ở nước ta đã, đang và sẽ trở thành vấn đề cần quan tâm Trong nghiên cứu của Kannan và cộng sự năm 1992 về lượng Lindane có trong thực phẩm nhập khẩu tại Việt Nam Đối với các sản phẩm như bơ nhập khẩu từ Liên bang Nga, nồng

độ Lindane là 81 ng/g trọng lượng ướt Ở cá và các món chế biến từ động vật thủy sinh khác có lượng Lindane thấp hơn [37]

1.3 Thực trạng của Lindane trong môi trường

Lindane có thể tồn tại trong nhiều môi trường do tính hòa tan trong lipid cao

và sự ổn định về mặt hóa học của chúng Lindane có thể tồn tại trong không khí, điều này khiến cho khoảng cách ô nhiễm Lindane rất rộng [14] Với chu kỳ bán rã được báo cáo năm 2001 của Beyer và cộng sự là 708 ngày trong đất và 2292 ngày môi trường nước, Lindane đã có mặt ở rất nhiều loại môi trường khác nhau [17]

Hình 3 Quá trình tích tụ Lindane ở các môi trường [17]

1.3.1 Lindane trong đất

Trong sản xuất nông nghiệp luôn không thể thiếu sự có mặt của thuốc trừ sâu Vì vậy, với khả năng kháng sâu bệnh của mình, Lindane và các đồng phân đã được sử dụng như một loại thuốc trừ sâu trong một khoảng thời gian rất dài Do đó, Lindae đi vào trong đất một cách trực tiếp nhất thông qua các sản phẩm bảo vệ thực vật Khi ở trong đất, các phân tử Lindane bám vào các phân tử đất, khi gặp nhiệt độ cao, chúng bay hơi vào không khí, bám vào lá cây hoặc bị hấp thụ bởi cây trồng Đặc biệt, Lindane có tính liên kết rất mạnh với các chất hữu cơ, do đó khi bám vào các phân tử đất chúng rất khó tách ra Tuy nhiên, khi đất gặp đất nghèo dinh dưỡng hay sau khi chịu một lượng mưa lớn, một phần Lindane sẽ ngấm vào trong mạch nước ngầm gây ra ô nhiễm nguồn nước [76] Tùy thuộc vào điều kiện tự nhiên và nồng độ mà chu kỳ bán rã trong đất của Lindane có thể chỉ vài ngày hoặc lên đến 3 năm

Ngoài ra, vấn đề môi trường đất nhiễm Lindane không chỉ xuất phát từ việc

sử dụng ồ ạt các chế phẩm có nguồn gốc Lindane, mà còn có nguồn gốc từ những kho dự trữ Lindane ở khắp nơi trên thế giới Cho đến nay, chúng ta vẫn có thể đo được Lindane trên khắp các kho, bãi dự trữ phân bón hữu cơ trước đây với nồng độ rất cao Như ở nước ta, tại điểm tồn lưu hóa chất bảo vệ thực vật Long Đồng – Lạng Sơn, nồng độ Lindane trong đất đạt 5,2 mg/kg đất, vượt ngưỡng cho phép hơn 1000 lần; tại Điểm tồn lưu hóa chất bảo vệ thực vật tại Kim Liên – Nghệ An, nồng độ lên tới 10 mg/kg [5]

1.3.2 Lindane trong không khí

Trong quá trình bay hơi từ đất, Lindane và các đồng phân HCH tồn tại như bụi phù du và bị gió thổi từ đất bị ô nhiễm tới nơi khác Thêm vào đó, Lindane có thể bay vào không khí trong suốt quá trình phun thuốc trừ sâu trên đồng ruộng hoặc trong quá trình sản xuất, bảo quản Điều này dẫn đến tình trạng ô nhiễm Lindane trong không khí, đặc biệt Lindane hầu như không có mùi nên rất khó nhận biết sự tồn tại của chúng trong không khí Trong không khí, Lindane và các đồng phân của

nó có thể tồn tại từ 2 – 4 tháng [71] Thời gian tồn tại càng dài thì nguy cơ phát tán rộng của Lindane càng tăng Theo báo cáo của Waite và cộng sự về khả năng bay hơi của Lindane trên một cánh đồng trồng hạt dầu cải đã kết luận rằng: trong 455,3

và 510,4 tấn Lindane sử dụng trong năm 1997 và 1998 có tới 12 – 30% Lindane bay hơi trong 6 tuần sau khi gieo hạt vào đầu đến giữa tháng năm cùng năm Điều này làm cho nồng độ Lindane trong khi quyển tăng cao tới 16,1 ng/m3 đối với không khí trên đồng ruộng [74]

Bên cạnh đó, Lindane và các đồng phân của nó đều có khả năng khuếch tán trong không khí Phần lớn đồng phân γ – HCH và α – HCH được tìm thấy trong không khí trong khi 2 đồng phân này có khả năng bay hơi kém đồng phân β – HCH

và δ – HCH Nồng độ trung bình trong không khí của γ – HCH trên toàn cầu là 589 pg/m3, α – HCH là 1021 pg/m3 Đặc biệt, tại vịnh Bengal và vùng biển Arbian nồng

độ cao nhất đạt 10000 pg/m3 [75]

1.3.3 Lindane trong nước

Lindane là hợp chất ít hòa tan trong nước Theo Bảng 1, mức độ hòa tan của Lindane và các đồng phân HCH trong nước chỉ là 5–10mg/L ít hơn các hợp chất hữu cơ khác Do đó, khi tiến hành kiểm tra mức độ ô nhiễm trong nước, thưởng chỉ phát hiên đồng phân γ – HCH (Lindane) và α – HCH [80] Lindane đi vào đất chủ yếu từ ứng dụng trực tiếp khi kiểm soát sâu bệnh hại và muỗi trong nông nghiệp và lâm nghiệp Sau đó, chúng ngấm vào trong đất gây ô nhiễm bề mặt nước do dòng chảy và sự lắng tụ trong không khí Bên cạnh đó, trong nước thải từ nhà máy sản xuất thuốc trừ sâu cũng thải ra môi trường Nồng độ Lindane đo được tại Ấn Độ lên đến 43 µg/L vượt mức độ cho phép bình thường 0,4 – 155 ng/L Tại một số vùng nước mặt cũng thu được nồng độ Lindane đạt mức 0,01 – 0,1 µg/L, đặc biệt nồng

độ Lindane đáng báo động lên tới 12 µg/L được tìm thấy ở các con sông bị ô nhiễm nước thải tại Ấn Độ năm 1990 cũng được báo cáo trong điều tra của Gustavon và cộng sự [78]

Không chỉ vậy, nồng độ Lindane trong nước ngầm được điều tra lên tới 3 –

163 ng/L vào năm 1989 [78] Điều này ảnh hưởng trực tiếp tới nguồn nước dự trữ cung cấp cho ngành nông, lâm nghiệp khu vực xung quanh Quá trình thủy phân sinh học Lindane đóng vai trò quan trọng trong xử lý ô nhiễm nguồn nước Chu kỳ bán rã của Lindane trong sông từ 3 – 30 ngày, ở hồ từ 30 – 300 ngày còn trong mạch nước ngầm là hơn 300 ngày [80]

1.4 Tác hại của Lindane

Với tác dụng hiệu quả của mình, Lindane đã được ứng dụng rộng rãi trên thế giới trong nhiều thập kỷ, điều này dẫn tới nhiều ảnh hưởng tới con người và hệ sinh thái Do đó, Lindane được coi là một trong những loại thuốc trừ sâu nguy hiểm nhất từng được sản xuất và ứng dụng Tính bền và tính ưa béo của Lindane cho phép nó bám và tích tụ trong sinh vật thuộc các chuỗi thức ăn Vì vậy, ngày 27 tháng 10 năm

2017, tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã công bố Lindane thuộc nhóm 1 các chất gây ung thư [65]

1.4.1 Ảnh hưởng tới con người

Khi con người sử dụng thực phẩm hay nguồn nước có nhiễm Lindane, chúng

sẽ tích tụ và tạo màng sinh học bên trong cơ thể Những tác động ban đầu xuất hiện khi một người tích tụ một lượng Lindane nhất định bao gồm đau đầu, hoa mắt, tiêu chảy, rát da, mũi, họng… Càng để lâu sẽ càng nguy hiểm Khi một người tiếp xúc lâu dài với Lindane có thể gây ra nhiễm độc mãn tính, đặc biệt là ảnh hưởng tới đường tiêu hóa, hệ thống tim mạch và cơ xương [46]

Theo nghiên cứu của Vega và cộng sự năm 2016, Lindane ảnh hưởng trực tiếp tới hệ thần kinh trung ương và hệ nội tiết [46] Chưa hết, Lindane còn đươc cho

là có tác dụng phụ tới sức khỏe con người bao gồm ức chế miễn dịch, ức chế quá trình oxy hóa Các tác động trên đã được báo cáo trong các nghiên cứu của Agency for Toxic Substances and Disease Registry (ATSDR) với kết luận rằng, một người sau khi hít phải Lindane sẽ xảy ra các thay đổi về huyết học như tăng – giảm bạch cầu, rối loạn hormone thậm chí co giật và tử vong [27]

Do có khả năng liên kết với lipid bền, Lindane có thể xâm nhập và tích tụ trọng não, sữa mẹ và các cơ quan giàu chất béo khác trong cơ thể Đã có những nghiên cứu dịch tễ và sức khỏe nông nghiệp báo cáo tình trạng phơi nhiễm Lindane

có thể liên quan đến các bệnh như ung thư vú, ung thư tuyến tiền liệt, phổi, dạ dày… [7] Bằng chứng đầu tiên về tai nạn chết người do nhiễm độc Lindane được báo cáo vào năm 1953 [59]

1.4.2 Ảnh hưởng tới động vật

Lindane là mối đe dọa rất nguy hiểm tới môi trường do có sự tích tụ sinh học

ở vi sinh vật, động vật không xương sống, cá, chim và các động vật có vú từ đó đe dọa tới chuỗi thức ăn Trong báo cáo của WHO năm 1991, nồng độ Lindane có trong vịt trời lên tới 2000 mg/kg, chim trĩ là 561 mg/kg Không những thế, độ dày

vỏ trứng và số lượng trứng trong mùa sinh sản của những con chim phơi nhiễm Lindane giảm rõ rệt Thậm chí, Lindane còn được phát hiện trong lòng đỏ trứng [77] Trong nghiên cứu được tiến hành tại 2 khu vực của Đức, Bednarek và cộng sự

đã xác định được nồng độ các đồng phân HCH trong các loài chim săn mồi là 0,03 – 0,63 mg/kg, trứng chim nhạn thu thập chứa 0,006 mg/kg HCH [12]

Đối với các động vật trên cạn, mức độ phơi nhiễm Lindane cũng rất đáng báo động Theo báo cáo của WHO năm 2004, Lindane là chất độc mạnh nhất ảnh hưởng tới sinh vật trong số các đồng phân HCH của chúng Mức gây độc qua da của chuột cống được báo cáo là 500 – 1000 mg/kg, đối với chuột nhắt vào khoảng

400 mg/kg Lindane được cho là nguyên nhân gây kích ứng da và mắt ở thỏ Động vật càng nhỏ càng nhạy cảm hơn với độc tính của Lindane đặc biệt khi tiếp xúc trực tiếp với da [78]

Không chỉ gây độc cho sinh vật trên cạn, Lindane còn ảnh hưởng tới các sinh vật dưới nước Trong báo cáo của WHO năm 1991, mức độ ô nhiễm bới các đồng phân HCH tại vùng biển Scotland kết luận rằng: tại 118 vị trí khảo sát đều có nồng

độ Lindane trong khoảng 6 – 53 µg/kg đất khô Một số con cá được thu thập ngẫu nhiên tại 15 địa điểm sông, hồ ở Đức chứa nồng độ Lindane trung bình vào khoảng

106 – 696 µg/kg chất béo Sinh vật biển Baltic thường có mức Lindane phơi nhiễm cao hơn so với những cá thể đươc thu từ Biển Bắc nhưng lại thấp hơn cá nước ngọt

ở những khu vực gần nhà máy sản xuất Lindane [77]

1.5 Phương pháp xử lý Lindane tồn dư

Vấn đề phơi nhiễm Lindane đã được nghiên cứu từ những năm 70 của thế kỷ trước Tuy nhiên cho đến nay, Lindane vẫn hiện diện ở khắp nơi trên thế giới và đe dọa đến sức khỏe con người thông qua chuỗi thức ăn Các nghiên cứu cũng đã được thực hiện để loại bỏ Lindane tồn dư trong đất bằng phương pháp vật lý, hoá học và sinh học

1.5.1 Xử lý bằng phương pháp vật lý, hóa học

Các phương pháp hóa – lý để loại bỏ Lindane và các đồng phân HCH của nó trong môi trường chủ yếu được sử dụng là đốt cháy Tuy nhiên, phương pháp này cần nhiệt độ rất cao và cần có quy trình kiểm soát rất chặt chẽ Do tính chất hóa học phức tạp của HCH nên trong một số điều kiện có thể hình thành các polychlorinate

độc hại không mong muốn Điều này khiến phương pháp xử lý trở nên nguy hiểm

do nguy cơ mất kiểm soát chất thứ cấp, đồng thời cần chi phí lớn để xử lý ở nhiệt độ cao [70] Ngoài ra, các công nghệ không đốt hóa – lý nhằm loại bỏ HCH và đồng phân khỏi đất cũng đã được phát triển và được thống kê dưới Bảng 2

Bảng 2 Các phương pháp không đốt hóa lý nhằm loại bỏ HCH khỏi đất [70]

và tăng diện tích bề mặt giúp tăng tốc độ phản ứng Trong hệ thống, sẽ có 2 viên bi va chạm với nhau, một lượng Triboplasma

sẽ được hình thành tạo ra năng lượng cho phản ứng hóa học xảy

ra Lặp lại quá trình đó đến khi các hợp chất tạo ra không còn phản ứng với nhau nữa

Khử hóa học

pha khí

Sự khử hóa học pha khí của các hợp chất hữu cơ dưới xúc tác của hydro ở 850°C hoặc cao hơn Sản phẩm của phản ứng khử là metan và hydrochlorua Hiệu suất được nâng cao khi có thêm nước, đóng vai trò như một chất xúc tác và chất truyền nhiệt

Phá hủy bằng

nhiệt tại chỗ

Lớp đất sâu dưới bề mặt có môi trường chân không Dưới tác dụng của nhiệt độ khoảng 800°C sẽ làm các chất ô nhiễm hóa hơi

và được xử lý sau bay hơi dựa vào các cơ chế:

– Bay hơi vào dòng không khí chân không dưới bề mặt – Chưng cất hơi nước để cô thành dòng

– Oxy hóa hơi – Nhiệt phân phần hơi

Phân hủy bằng

xúc tác base

Mẫu đất được xử lý nhiệt ở 300°C dưới sự có mặt của hỗn hợp thuốc thử gồm hydrocarbon có nhiệt độ sôi cao, NaOH và các chất xúc tác khác Dựa trên nguyên lý của phản ứng cắt hóa học, các chất cặn tạo ra gồm carbon và muối natri của các anion được giải

phóng trong quá trình phân hủy Chúng được tách ra bằng phương pháp ly tâm

Các phương pháp hóa – lý này hiệu quả nhưng lại rất tốn kém Thêm vào đó, hầu hết các phương pháp đều xử lý tại chỗ, điều này gây khó khăn trong quá trình di chuyển máy móc làm tăng chi phí xử lý Vì vậy, những cách này chỉ phù hợp với những trường hợp cấp bách với tính cấp thiết cao

1.5.2 Xử lý ô nhiễm bằng phương pháp sinh học

Xử lý sinh học là quá trình các sinh vật sống phân hủy các chất ô nhiễm hữu

cơ nguy hại trong tự nhiên thông qua các quá sinh học tự nhiên của chúng [44] Bất

cứ quá trình nào sử dụng vi sinh vật hoặc các enzyme và sự trao đổi chất của vi sinh vật được xem như một công cụ xử lý sinh học an toàn và hiệu quả để loại bỏ các chất ô nhiễm môi trường [63] Do đó, biện pháp phân hủy sinh học dựa vào vi sinh vật vật để cải tạo đất ô nhiễm đã được nghiên cứu từ những năm 1980 Trong nghiên cứu của Newcombe và cộng sự năm 1999, nhiều phương pháp xử lý sinh học đã được nghiên cứu và áp dụng thành công để loại bỏ đất bị ô nhiễm bởi hợp chất xenobiotic [56] Các phương pháp xử lý sinh học cần có thể áp dụng được sau khi thu thập mẫu vật tại vị trí ô nhiễm và xử lý trong phòng thí nghiệm, sau đó được

áp dụng tại các điều kiện tự nhiên (in situ)

Sự phân hủy sinh học Lindane và đồng phân HCH của các chủng vi sinh vật khác nhau được báo cáo ở Bảng 3.Tuy nhiên, chỉ có 2 con đường chính phân giải Lindane là phương pháp phân giải trong môi trường hiếu khí và phương pháp phân giải trong môi trường kỵ khí Trong nghiên cứu này, chúng tôi hướng tới đối tượng

xử lý Lindane là vi khuẩn (hiếu khí, kỵ khí) và xạ khuẩn và các quá trình liên quan đến phân hủy sinh học của Lindane

Bảng 3 Các chủng vi sinh vật phân hủy Lindane và đồng phân HCH [60]

1.5.2.2 Phân hủy sinh học Lindane bằng vi khuẩn trong điều kiện hiếu khí

Sự phân hủy sinh học thông qua vi khuẩn hiếu khí đã được quan sát thấy thông qua sự khoáng hóa hoàn toàn Lindane và đồng phân HCH của chúng [10, 35] Các phản ứng chính xảy ra trong quá trình phân hủy Lindane được mô tả trong báo cáo của Cuozzo và cộng sự năm 2017 bao gồm quá trình khử hydro, khử clo, hydroxyl hóa và khoáng hóa Lindane [21]

Nghiên cứu về khả năng phân giải Lindane và đồng phân HCH được tìm

thấy ở chủng Sphingomonas paucimobilis UT26 tại Nhật Bản Sphingomonas

paucimobilis UT26 là một đột biến kháng acid nalidixic của chủng Pseudomonas paucimobilis SS86 được phân lập tại vùng núi Nhật Bản [33] UT26 có khả năng

phân hủy cả 4 đồng phân γ – HCH, α – HCH, β – HCH và δ – HCH Theo nghiên

cứu của Nagasawa và cộng sự năm 1993, Lindane được chủng UT26 sử dụng như nguồn carbon duy nhất [51] Theo sơ đồ Hình 4, trong điều kiện hiếu khí, Lindane được phân hủy nhờ các enzyme LinA, LinB, LinC, LinD, LinE, linF, LinR và LinX Bảng 4 thống kê chi tiết tác dụng và gene mã hóa từng enzyme Nhờ có các enzyme này, Lindane được khoáng hóa cuối cùng tạo sản phẩm maleyacetat và β – ketoadipate là các chất chuyển hóa phổ biến trong con đường vi sinh vật phân giải các hợp chất thơm

Bảng 4 Các enzyme và chức năng của chúng liên quan đến sự phân hủy

Lindane [29]

Các gene linA, linB, linD và linE mã hóa cho các enzyme xúc tác các phản ứng phân hủy Lindane trong khi enzyme linC và linX chỉ xúc tác 1 phản ứng giống

nhau là chuyển hóa 2,5 – DDOL thành 2,5 – dicholorohydroquinone (2,5 – DCHQ) thông qua phản ứng dehydrogenase với sự có mặt của NAD+ [54] Hoạt động của

linC, linX thấp hơn nhiều và trình tự amino acid giống nhau giữa hai protein chỉ

31% Mặt khác, những gene LinD và LinE từ một operon và sự biểu hiện của chúng

có liên quan đến LinR điều hòa phiên mã, trong sự hiện diện của những hợp chất kiểu HQ, chẳng hạn như CHQ, HQ, và 2,5–DCHQ [50]

Trong báo cáo của Nagata và cộng sự, con đường phân giải này dưới tác

dụng của linA, Lindane được chuyển đổi thành 1,4 - TCDN trước khi bị khử 1 gốc

Clo tạo 1,2,4 – trichlorobenzene (1,2,4 – TCB) Mặt khác, 1,4 - TCDN dưới tác

dụng của linB cho sản phẩm là 2,5 – DDOL trước khi bị chuyển hóa thành 2,5 – DCHQ nhờ linC Quá trình phân giải Lindane thành 2,5–DCHQ được gọi phân giải

ngược 2,5–DCHQ được chuyển thành β–ketoadipate bằng quá trình khử bằng

enzyme dechlorinase (linD), sau đó được cắt vòng bởi enzyme dioxygenase (linE)

và maleylacetate reductase (linF) Các nghiên cứu trước đây đã kết luận rằng β–

ketoadipate đóng vai trò là một chất chuyển hóa đánh dấu cho sự phân hủy các hợp chất chứa vòng thơm β–ketoadipate sẽ tiếp tục được chuyển thành succinyl–coenzyme A (CoA) và acetyl–CoA bởi succinyl–CoA: 3–oxoadipate CoA transferase và β–ketoadipyl CoA thiolase Cả hai hợp chất này đều được chuyển hóa trong chu trình acid tricarboxylic (TCA) [53]

Hình 4 Các con đường phân hủy hiếu khí Lindane [53]

1.5.2.3 Phân hủy sinh học Lindane bằng vi khuẩn trong điều kiện kỵ khí

Vi khuẩn phân hủy Lindane trong điều kiện kỵ khí lần đầu tiên được báo cáo

vào năm 1969 là chủng Clostridium sphenoides UQM780 bởi Macrae và cộng sự

[45] Ở điều kiện kỵ khí, quá trình khử clo và khử dichloro là 2 quá trình chính trong quá trình phân hủy Lindane Các gốc clo trong Lindane sẽ được cắt ra khỏi phân tử tạo tetrachlorocyclohexene (TCCH) [41] Hình 5 mô tả con đường phân hủy

kỵ khí của vi sinh vật đối với Lindane và các đồng phân HCH, tùy từng đồng phân khác nhau sẽ có các cách phân hủy khác nhau Tuy nhiên tất cả đều có TCCH làm trung gian và một phần pentachlorocyclohexane (PCCH) nhưng PCCH dễ bị phân

hủy nên rất khó phát hiện Sau đó, 2 gốc clo tiếp tục bị khử tạo 5,6–dichlorocyclohexa–1,2–diene Cuối cùng nếu 1 gốc clo bị khử sẽ tạo clobenzen hoặc 2 gốc clo bị khử sẽ tạo benzene [49]

Hình 5 Con đường phân hủy kỵ khí Lindane [49]

1.5.2.3 Phân hủy sinh học Lindane bằng xạ khuẩn

Hiện nay, có rất ít nghiên cứu về khả năng phân hủy sinh học Lindane cũng như thuốc trừ sâu gốc clo hữu cơ từ các vi sinh vật gram dương đặc biệt là xạ khuẩn được báo cáo Xạ khuẩn đã được đánh giá có tiềm năng to lớn trong việc xử lý sinh học các hợp chất vô cơ độc hại, đồng thời có hiệu quả phân hủy tốt với các loại thuốc trừ sâu clo hữu cơ bằng cách sử dụng chúng như nguồn carbon duy nhất trong môi trường [13] Các chủng xạ khuẩn có thể phân hủy hỗn hợp bao gồm kim loại nặng thuốc trừ sâu hữu cơ với nhiều cấu trúc hóa học khác nhau như organochloride, s–triazines, triazi nones, carbamat, organophosphates, organophosph onates, acetanilid và sulfonylureas [21]

Thuốc trừ sâu hữu cơ gốc clo được phân hủy bởi xạ khuẩn thông qua sự phát triển dạng sợi của xạ khuẩn trong đất [8] Trong báo cáo của Benimeli và cộng sự,

chủng xạ khuẩn Streptomyces sp M7 sử dụng các đồng phân HCH như là nguồn

carbon duy nhất [13] Quá trình phân giải Lindane của chủng xạ khuẩn

Streptomyces sp M7 chủ yếu thông qua hoạt động của enzyme dehalogenase đóng

vai trò chính trong quá trình phân hủy Lindane Quá trình phân hủy Lindane và

đồng phân HCH của chủng xạ khuẩn Streptomyces sp M7 được miêu tả trong Hình

6 Các đồng phân HCH sẽ bị khử một gốc clo tạo chất trung gian pentachlorcyclohexane (PCCH) Sau đó, dưới tác dụng của enzyme dehalogenase, các gốc clo trong phân tử PCCH sẽ bị khử tạo sản phẩm như tetrachlorcyclohexane (TCCH), tetrachlorocyclohexa–1,4–diene (1,4 – TCDN), 1,2,4 – trichlorobenzene (1,2,4– TCB), 1,2 – dichlorobenzene (1,2 – DCB) [21]

Hình 6 Các con đường phân hủy đồng phân HCH của chủng xạ khuẩn

Streptomyces sp M7 [21]

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện tại phòng thí nghiệm GREENLAB – Trung tâm Nghiên cứu Khoa học Sự sống, Khoa Sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Việt Nam

Đối tượng nghiên cứu bao gồm:

– Các chủng vi khuẩn thuộc bộ sưu tập chủng của phòng thí nghiệm GREENLAB có hoạt tính phân hủy các hợp chất có vòng thơm chứa halogen

– Các mẫu đất được ghi nhận tồn dư thuốc bảo vệ thực vật ở Biên Hòa và Nghệ An (bảng 5) Các mẫu đất được thu thập trong các túi zip bạc vô trùng bằng phương pháp lấy mẫu thường quy Các mẫu đất được lưu trữ ở 4oC

Bảng 5 Danh sách các mẫu đất dùng trong nghiên cứu

Ký

M95 Biên Hòa 10° 58′ 37″ B 106° 49′ 6″ Đ Đất có cỏ mọc

M96 Biên Hòa 10° 58′ 37″ B 106° 49′ 6″ Đ Đất cỏ không mọc

M97 Tân Long, Tân Kỳ,

Nghệ An 19° 18' 42'' B 122° 36' 5'' Đ

Khu trồng chè, cỏ không mọc

M98 Tân Long, Tân Kỳ,

rừng cao su

M102 Tân Phú, Nghệ An 19° 12' 31'' B 105° 21' 3'' Đ Đất nền kho thuốc cũ, đất

trồng chè M103 Tân Phú, Nghệ An 19° 12' 31'' B 105° 21' 3''Đ Đất mọc cỏ, rìa rừng cao su M104 Tân Phú, Nghệ An 19° 12' 31'' B 105° 21' 3''Đ Đất trồng sắn

M105 Tân Ký,Tân Phú,

Nghệ An 19° 03' 41'' B 105° 17' 8'' Đ

Đất nền kho thuốc cũ, hiện

là nhà dân, vườn trồng chuối

M106 Hùng Sơn, Anh Sơn,

Nghệ An 18° 59' 43'' B 105° 0' 39'' Đ

Đất nền, kho thuốc trừ sâu

cũ, giữa luống ngô

M107 Hùng Sơn, Anh Sơn,

Nghệ An 18° 59' 43'' B 105° 0' 39'' Đ

Đất nền, kho thuốc trừ sâu

cũ, rìa ruộng ngô

M108 Hùng Sơn, Anh Sơn,

2.2 Nguyên liệu và thiết bị

2.2.1 Nguyên liệu và hóa chất

Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu là các hóa chất tinh khiết, đảm bảo chất lượng và được nhập từ các hãng hóa chất uy tín như Merk, Sigma, Xilong… Hóa chất được sử dụng bao gồm: MgSO4.7H2O; FeSO4.7H2O; K2HPO4; (NH4)2SO4; CaSO4; ZnCl2; MnCl2.4H2O; H3BO3; CaCl2.6H2O; CuCl2.6H2O; NiCl2.6H2O; NaMo4.2H2O; CoCl2.6H2O; [Fe(NH4)(S04)2.12H2O]; Nitricacid; Ethanol; NaCl; Mercuricthiocyanate; peptone; Cao nấm mem; Agar; Agarose… Lindane (ɤ –HCH 99.4%) được mua từ hãng Dr Ehrenstorfer (Đức)

Lindane rắn được hóa tan trong dung môi acetone (1 g Lindane trong 1000

mL acetone) để tạo dung dịch Stock Lindane 1000 ppm

2.2.2 Thiết bị

Bảng 6 Danh mục thiết bị chính dùng trong nghiên cứu

Máy lắc ổn định nhiệt ES – 20/60 Đức

Nồi khử trùng SH – AC – 128L Hàn Quốc

Kính hiển vi quang học Olympus CX23 Nhật

Máy ly tâm tâm Eppendorf 542R Đức

Máy Elisa–microplate reader Plus384 Mỹ

2.2.3 Môi trường nuôi cấy

Thành phần môi trường Mineral Salts Medium (MSM) như sau (g/L):

MgSO4.7 H2O – 0,4; FeSO4.7H2O – 0,002; K2HPO4 – 0,2; (NH4)2SO4 – 0,2; CaSO4

– 0,08; H2O – 1000mL; pH 7.0–7.2, bổ sung 0,01% vi lượng TE, agarose – 15 (đối với môi trường thạch)

Vi lượng (TE) Trace Element solution (g/L): FeSO4.7H2O – 1; ZnCl2 – 0,07; MnCl2.4H2O – 0,1; H3BO3 – 0,006; CaCl2.6H2O – 0,13; CuCl2.6H2O – 0,002; NiCl2.6H2O – 0,024; NaMo4.2H2O – 0,036; CoCl2.6H22O – 0,238; H2O – 1000; pH7,0-7,2

Thành phần môi trường Lysogeny Broth (LB) như sau (g/L): Yeast extract –

5, Pepton – 10, NaCl – 10, Agar – 16 (đối với môi trường thạch)

Thành phần môi trường YS như sau (g/L): Tinh bột – 10, Yeast extract – 2, Agar – 16 (đối với môi trường thạch)

Thành phần môi trường SC agar(g/L): Tinh bột – 10, Casein – 1, K2HPO4 –

2.3.1.1 Phương pháp phân lập trực tiếp

Phương pháp phân lập trực tiếp các chủng vi sinh vật dựa theo phương pháp của Manickam [47] Các mẫu đất được cân 10 g cho vào 100 mL nước muối sinh lý 0,85%, lắc ở 150 rpm, 30°C trong 30 phút Sau đó dịch huyền phù được thu và trải trên đĩa chứa môi trường MSM bổ sung Lindane đến nồng độ cuối là 10 ppm và 50 ppm Theo dõi liên tục trong 7 ngày, các khuẩn lạc vi khuẩn trên đĩa phân lập được nhặt để tinh sạch bằng cách cấy ria 3 pha trên đĩa petri có chứa môi trường thạch

LB đồng thời, các khuẩn lạc xạ khuẩn trên đĩa phân lập được nhặt để tinh sạch bằng cách cấy ria 3 pha trên đĩa petri có chứa môi trường thạch YS Đĩa được giữ ở 30°C, sau 7 ngày quan sát hình thái khuẩn lạc, nhặt những chủng có hình thái khác nhau

và tiếp tục được tinh sạch bằng cách ria 3 pha trên đĩa LB agar và YS agar

2.3.1.2 Phương pháp phân lập thông qua làm giàu pha loãng

Phương pháp phân lập thông qua làm giàu pha loãng, các chủng vi sinh vật dựa theo phương pháp của Kaur và cộng sự [40] Các mẫu đất sẽ được cân 10 g cho vào 100 mL nước muối sinh lý 0,85%, lắc ở 150 rpm, 30°C đến khi tan hết đất 1

mL dịch huyền phù được thu cho vào bình tam giác 250 mL chứa 100 mL môi trường MSM lỏng với nồng độ Lindane 10 ppm Bình được nuôi ở 30°C, 200 rpm

trong 7 ngày Sau 7 ngày, 100 µL dịch trong bình được cấy chuyển vào bình tam

giác 250 mL chứa 100 mL môi trường MSM lỏng với nồng độ Lindane là 20 ppm;

100 µL dịch huyền phù khác trong bình được trải trên đĩa MSM agarose bổ sung 10 ppm Lindane Đĩa được ủ ở 30°C, theo dõi liên tục trong 7 ngày các khuẩn lạc vi khuẩn trên đĩa phân lập được nhặt để tinh sạch bằng cách cấy ria 3 pha trên đĩa petri

có chứa môi trường thạch LB, còn các khuẩn lạc xạ khuẩn trên đĩa phân lập được nhặt để tinh sạch bằng cách cấy ria 3 pha trên đĩa petri có chứa môi trường thạch

YS Đĩa được giữ ở 30°C, sau 7 ngày quan sát hình thái khuẩn lạc Lặp lại các bước thí nghiệm cho đến khi nồng độ Lindane đạt 50ppm

2.3.1.3 Phương pháp phân lập định hướng xạ khuẩn

Các chủng xạ khuẩn được phân lập từ các mẫu đất dựa theo phương pháp của Amoroso [9] Các mẫu đất sẽ được cân 10 g cho vào 100 mL nước muối sinh lý 0.85%, nuôi bình ở 30°C, 150 rpm trong 30 phút Sau đó, 1 mL dịch huyền phù được thu và trải trên đĩa chứa môi trường SC agar Theo dõi liên tục trong 14 ngày, các khuẩn lạc xạ khuẩn trên đĩa phân lập được nhặt để tinh sạch bằng cách cấy ria 3 pha trên đĩa petri có chứa môi trường thạch MM có nồng độ Lindane 10 ppm Đĩa được giữ ở 30°C, sau 14 ngày quan sát hình thái khuẩn lạc, nhặt những chủng có hình thái khác nhau và tiếp tục được tinh sạch bằng cách ria 3 pha trên đĩa YS agar

2.3.2 Phương pháp khảo sát khả năng sinh trưởng của vi sinh vật trên môi trường có Lindane

2.3.2.1 Khảo sát khả năng sinh trưởng các chủng vi khuẩn

a Phương pháp cấy vạch so sánh

Khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn được khảo sát trên môi trường MSM agarose có nồng độ 10 ppm Lindane, MSM agarose có nồng độ 50 ppm Lindane với đối chứng MSM agarose Bộ chủng vi khuẩn đã phân lập được nuôi lắc trong môi trường LB Sinh khối được thu bằng phương pháp ly tâm, rửa và hoà tan bằng nước muối sinh lý theo tỉ lệ 1:1 (v/v) để tạo dịch huyền phù Sử dụng tăm bông đã khử trùng để cấy vạch 200 µL dịch huyền phù được nhỏ lên đĩa petri chứa

các môi trường đã chuẩn bị Sau 7 ngày ủ đĩa ở 30°C, các chủng có tiềm năng được xác định thông qua quan sát sự khác biệt về khả năng sinh trưởng của mỗi chủng ở trên môi trường bổ sung Lindane với đối chứng (mỗi môi trường lặp lại 3 đĩa)

b Phương pháp nuôi lắc so sánh

Khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn được khảo sát trong các ống nghiệm chứa MSM có nồng độ 10 ppm và MSM có nồng độ Lindane 50 ppm và môi trường MSM lỏng không bổ sung Lindane làm đối chứng Dịch huyền phù của

bộ chủng vi khuẩn được chuẩn bị như trên và được tiếp giống 10% vào ống nghiệm bằng dịch huyền phù, nuôi ống nghiệm ở 30°C, 200 rpm, mỗi chủng 3 ống nghiệm Sau 7 ngày, dịch nuôi lắc được đo mật độ quang OD600 để khảo sát khả năng sinh trưởng Khả năng sinh trưởng của các chủng được xác định thông qua so sánh giá trị

OD600 của dịch nuôi lắc vi sinh vật trong môi trường bổ sung Lindane và đối chứng

2.3.2.2 Khảo sát khả năng sinh trưởng các chủng xạ khuẩn

a Phương pháp cấy vạch so sánh

Khả năng sinh trưởng của các chủng xạ khuẩn được khảo sát trên môi trường MSM agarose có nồng độ 10 ppm Lindane, MSM agarose có nồng độ 50 ppm Lindane và MSM agarose làm đối chứng Bộ chủng xạ khuẩn đã phân lập được nuôi lắc trong môi trường YS Thu và rửa sinh khối bằng nước muối sinh lý Sinh khối được hòa bằng nước muối sinh lý theo tỉ lệ 1:1 (v/v) để tạo dịch huyền phù Sử dụng tăm bông đã khử trùng để cấy vạch 200 µL dịch huyền phù được nhỏ lên đĩa petri chứa các môi trường đã chuẩn bị Sau 7 ngày ủ đĩa ở 30°C, các chủng có tiềm năng được xác định thông qua quan sát sự khác biệt về khả năng sinh trưởng của mỗi chủng ở trên môi trường bổ sung Lindane với đối chứng (mỗi môi trường lặp lại 3 đĩa)

2.3.3 Định danh sơ bộ các chủng vi sinh vật bằng phân tích trình tự 16S rDNA

Các chủng vi khuẩn được xác định trình tự 16S rDNA, đoạn gen 16S rDNA được nhân lên bằng phản ứng PCR sử dụng mồi 27F và 1492R theo phương pháp của Vingataramin và cộng sự [73] Các chủng quan tâm được nuôi cấy qua đêm trên

môi trường LB lỏng Sau đó, 100µL dịch nuôi của mỗi chủng được thu vào ống eppendorf Thêm 500µl EtNa, hỗn hợp được ủ ở 80°C Sau 10 phút, ly tâm thu sinh khối ở 10000 rpm, 10 phút Sinh khối được tách theo KIT DNA & Blood cung cấp bởi Qiagen

Đối với các chủng xạ khuẩn, sau 48h được nuôi trên môi trường YS, 30°C,

150 rpm, đoạn gen 16S rDNA được nhân lên bằng phản ứng PCR sử dụng mồi 27F

và 1492R với trình tự DNA của các chủng xạ khuẩn được tách bằng KIT Powersoil được cung cấp bởi Qiagen

Sau đó, phản ứng PCR được thực hiện bằng máy PCR Thermocycler (Hoa Kỳ) với thành phần hỗn hợp phản ứng sau: (µL) Taq PCR master mix – 12,5, mồi P27F – 1, mồi P1492R – 1, DNA – 1, nước PCR – 9 PCR được thực hiện theo chu trình nhiệt như sau: 96˚C – 3 phút, 35 chu kỳ (95 ˚C – 45 giây, 55 ˚C – 45 giây, 68

˚C – 2 phút), 68 ˚C – 7 phút Trình tự của đoạn 16S rDNA được giải trình tự và sử dụng để tìm loài gần gũi bằng công cụ Extaxon Trình tự của chủng vi khuẩn và trình tự các chủng chuẩn tương đồng được tải về từ Genbank

2.3.4 Đánh giá khả năng phân giải Lindane bằng phương pháp sắc ký khí

Để đánh giá hiệu quả phân giải Lindane, chúng tôi dựa theo phương pháp sắc

ký khí GC–FID theo Manickam Misra công bố năm 2008 với khí mang Heli [47] Mẫu được phân tích bằng máy GC (Agilent 7890), cột glass capillary HP–5 (ID: 0,2

mm, length: 30 m; film thickness: 0,25 μm), và khí mang: N2 ở tốc độ 1,2 mL/min, chế độ tra mẫu (injector mode: split of 1:10), thể tích tra mẫu: 1 μL, chương trình nhiệt như sau: nhiệt độ injector: 250°C; nhiệt độ lò (oven): bắt đầu 180°C (giữ ở 5 phút), sau đó tăng 30°C/phút, tới 300°C (giữ 3 phút); nhiệt độ detector (flame ionization detector): 300°C Dựa trên mẫu chất chuẩn, peak của Lindane xuất hiện ở khoảng phút thứ 6.8 Đường chuẩn mỗi lần đo được dựng bằng cách đo tín hiệu từ các mẫu: dịch lỏng MSM (1 mL mỗi mẫu) và thạch rắn MSM agarose ( 1 cm3 mỗi mẫu) chứa nồng độ Lindane (10, 30, 50 ppm)

Các chủng vi khuẩn được nuôi trong môi trường LB lỏng ở 30°C, 150 rpm trong 2 ngày; các chủng xạ khuẩn được nuôi trong môi trường YS lỏng trong 5 ngày

ở 30°C, 150 rpm Sau đó, 1.5 mL dịch nuôi lắc được hút vào ống eppendorf, ly tâm thu sinh khối ở 10000 rpm, 4°C trong 10 phút Sinh khối vừa thu được rửa 2 lần theo quy trình: Hòa tan sinh khối bằng 1,5 mL môi trường MSM lỏng có nồng độ Lindane 50 ppm, ly tâm thu sinh khối ở 10000 rpm, 4°C trong 10 phút Sinh khối được hòa tan trở lại trong MSM có nồng độ Lindane 50 ppm – hỗn hợp được sử dụng làm nguyên liệu đầu vào cho thí nghiệm Để đánh giá khả năng phân giải Lindane, các chủng vi sinh vật sẽ được khảo sát trên môi trường lỏng và môi trường thạch rắn

có nồng độ Lindane 50 ppm không có vi sinh vật, Sau các thời điểm 2 tuần, 4 tuần

và 8 tuần, 1 cm3 thạch được chiết bằng dung môi n–hexane theo tỷ lệ 1:1 (v/v)

Dịch chiết được phân tích bằng phương pháp sắc ký khí GC–FID để xác định hàm lượng Lindane còn lại Kết quả được tổng hợp và phân tích bằng phần mềm Microsoft Excel để đánh giá khả năng phân giải Lindane của chủng theo thời gian

2.3.5 Đánh giá khả năng sinh enzyme liên quan đến quá trình phân giải Lindane

2.3.5.1 Đánh giá khả năng sinh enzyme oxy hóa

Khả năng sinh enzyme oxy hóa của các chủng vi sinh vật được đánh giá gián tiếp thông qua so sánh nồng độ oxy trong môi trường lỏng trại các mốc thời gian dựa trên phương pháp xác định nồng độ oxy trong môi trường lỏng của Ninnekar và cộng sự [36] Các chủng vi khuẩn được hoạt hóa trên môi trường LB lỏng với nồng

độ Lindane 10 ppm (nuôi ống nghiệm với các chủng vi khuẩn hiếu khí, ống nghiệm nắp vặn với các chủng vi khuẩn kỵ khí), còn các chủng xạ khuẩn được hoạt hóa trên môi trường YS lỏng với nồng độ Lindane 10 ppm, nuôi ở 150 rpm, 30°C Sau 2 ngày đối với vi khuẩn và 3 ngày đối với xạ khuẩn, dịch nuôi lắc các chủng vi sinh vật được thu vào các ống eppendorf, bổ sung đệm phosphate 0.5 M theo tỉ lệ 3 : 1 (v/v) Hỗn hợp được xử lý siêu âm (sonicate) 5 phút, ly tâm loại bỏ sinh khối ở

15000 rpm, 4°C, 45 phút Dịch thu được điều chỉnh nồng độ mol Lindane đạt 1 µmol Lindane, đối chứng là môi trường LB có nồng độ Lindane tương tự Đo DO theo các mốc thời gian bằng máy đo DO HACH HQ3d (Mỹ) Kết quả được tổng hợp và phân tích bằng phần mềm Microsoft Excel để đánh giá khả năng sinh enzyme oxy hóa của chủng theo thời gian thông qua so sánh giá trị DO (mg/L) theo các mốc thời gian của từng chủng

2.3.5.2 Đánh giá khả năng sinh enzyme loại ion clorua tự do được giải phóng trong môi trường

Khả năng sinh enzyme loại clorua của các chủng xạ khuẩn được đánh giá dựa vào phương pháp xác định sự có mặt của ion clorua trong môi trường thông qua đánh giá khả năng tạo phức với các ion kim loại của Bergman và Sanik [16] Các chủng vi sinh vật được nuôi lắc trong môi trường MSM lỏng có nồng độ Lindane 50 ppm và môi trường MSM lỏng không bổ sung Lindane làm đối chứng, ở 30°C, 150

rpm Sau 7 ngày, hút 200 µL dịch nuôi lắc vào giếng trong đĩa 96 giếng Bổ sung 20

µL dung dịch 0,25 M Ferric ammonium sulfate [Fe(NH4)(SO4)2.12H2O] trong 9 M Nitric acid cùng với 20 µL dung dịch bão hòa Mercuric thiocyanate trong Ethanol Trộn đều hỗn hợp, sau 10 phút, đo độ hấp phụ của phức clorua tạo ra ở bước sóng

OD460 bằng máy quang phổ ELISA – microplate reader Plus384 (Hoa Kỳ)

Đường chuẩn mỗi lần đo được dựng bằng cách đo tín hiệu từ các mẫu ở bước sóng 460 nm bằng máy quang phổ Microplate reader Plus384 (Hoa Kỳ): Nước cất (1 mL mỗi mẫu) chứa 0, 2, 5, 10, 20, 30, 50, 70, 100 mg/L NaCl

Kết quả được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel trên máy tính Tốc độ loại ion clorua ra môi trường được xác định thông qua đường chuẩn được trình bày trong Phụ lục 3 với phương trình y = 5,2496x + 0,0095 trong đó, x là giá trị OD460

cuối cùng của tửng chủng, y là tốc độ loại ion clorua (mMol/tuần) với độ tin cậy R2

= 0,9876 Giá trị x được xác định thông qua công thức:

x = ODmôi trường có Lindane - ODmôi trường không bổ sung Lindane

2.3.6 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng vi sinh vật

2.3.6.1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái

a Đặc điểm hình thái các chủng vi khuẩn

Hình thái các chủng vi khuẩn được xác định thông qua kỹ thuật nhuộm gram [19] Kỹ thuật nhuộm gram thông qua màu tế bào vi khuẩn sau nhuộm để phân biệt

2 nhóm vi khuẩn Gram dương (máu tìm) và Gram âm (màu hồng) Tế bào vi khuẩn được quan sát dưới kính hiển vi quang học Olympus CX23 (Nhật Bản) ở vật kính dầu 100X

b Đặc điểm hình thái các chủng xạ khuẩn

Đặc điểm hình thái các chủng xạ khuẩn được xác định thông qua hình thái bào tử, sợi bào tử và cuống sinh bào tử theo phương pháp của Tresner và Backus [69] Các chủng xạ khuẩn được nuôi trên đĩa chứa môi trường YS agar Lamen đã khử trùng được cắm nghiêng 45° lên đĩa đã cấy các chủng xạ khuẩn, ủ đĩa ở 30°C